CN108456197B - 用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents

用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针及其制备方法与应用。该用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的结构式如式I所示。该探针的制备方法主要是以Cy7‑Cl为原料通过亲核取代，克脑文盖尔缩合反应，氨基叠氮化反应得到探针。本发明克服了荧光探针在活体检测中荧光信号的散射和组织吸收的问题，制得的探针具有光声信号穿透深度大，实现深层组织的成像，反应速度快，特异性好，比率检测更准确的优点，可用于活体检测硫化氢，或用于水体、食品中的硫化氢检测。

Description

用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于肿瘤标志物检测与成像领域，特别涉及一种用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
硫化氢是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体，硫化氢还是继一氧化氮和一氧化碳之后的第3种生物合成的气体递质，硫化氢在很多生物的生理过程中都有重要作用，例如血管平滑肌的松弛神经传递的调节胰岛素信号的抑制炎症的调控以及氧气的感知作用等等；其在人体内还具有对心脏和神经的保护作用，且是有效的神经调节物质，H2S生理相关浓度的范围从纳摩尔级到毫摩尔级水平不等。在生理浓度水平下，H2S参与一系列的生理调控过程，例如调节血管张力、心肌收缩神经传导和胰岛素分泌等。细胞一旦不能维持其正常的H2S浓度便会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。[G.D.Yang,L.Y.Wu,B.Jiang,W.Yang,J.S.Qi,K.Cao,Q.H.Meng,A.K.Mustafa,W.T.Mu,S.M.Zhang,S.H.Snyder,R.Wang,Science2008,322,587]此外，H2S也可清除活性氧和活性氮物种。许多研究还表明三个气体递质硫化氢、一氧化氮和一氧化碳之间还通过各种交互作用调控着人体的健康与疾病。硫化氢在直肠结肠癌肿瘤中高表达，能促进癌细胞增殖，可以作为一种直肠结肠癌的肿瘤标志物[(a)C.Szabo,C.Coletta,C.Chao,K.M′odis,B.Szczesny,A.Papapetropoulos and M.R.Hellmich,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013,110,12474.(b)B.Wu,H.Teng,G.Yang,L.Wu and R.Wang,Br.J.Pharmacol.,2012,167,1492；(c)K.Zhao,S.Li,L.Wu,C.Lai and G.Yang,J.Biol.Chem.,2014,289,20824.]。因此，活体生物***中硫化氢的检测对于更好地了解其生物学功能显得相当重要。
目前，对于检测硫化氢的检测和成像主要最常用的是亚甲基蓝法和硫离子选择性电极检测法，其缺点在于都具有破坏性且需要样本的匀浆，对于硫化氢更多生理功能细节的研究，则需要有新的检测方法随着荧光成像荧光探针等无损检测技术的快速发展，许多新颖的检测方法应运而生[a)Li,H.D.；Yao,Q.C.；Fan,J.L.；Jiang,N.；Wang,J.Y.；Xia,J.；Peng,X.J.Chem.Commun.2015,51,16225-16228.b)C.Liu,J.Pan,S.Li,Y.Zhao,L.Y.Wu,C.E.Berkman,A.R.Whorton and M.Xian,Angew.Chem.,IntEd.,2011,50,10327–10329c)H.Peng,Y.Cheng,C.Dai,A.L.King,B.L.Predmore,D.J.Lefer and B.Wang,Angew.Chem.,Int.Ed.,2011,50,9672–9675d)K.Sasakura,K.Hanaoka,N.Shibuya,Y.Mikami,Y.Kimura,T.Komatsu,T.Ueno,T.Terai,H.Kimura and T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.2011,133,18003–18005]。
此类方法的主要缺点是在活体检测中，生物组织对人体的生理组织对对超声信号的散射要比一般的光学信号低3～4个数量级，也就是说光声成像能提供更深成像深度和更高的成像分辨率。因此，合成一种特异性的H2S光声探针能够检测深层组织中H2S，将实现了对生理组织中H2S更精确，无损，高分辨的检测具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针。
本发明的另一目的在于提供所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法。
本发明的又一目的在于提供所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针，其结构式如式I所示：
所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)前体的制备：
①将间氨基苯酚溶于有机溶剂中，然后加入二碳酸叔丁酯，搅拌均匀后于80℃条件下进行回流反应，再将获得的溶液进行真空浓缩，得到化合物A；
②在保护性气体氛围下，将步骤①中得到的化合物A和氢化钠加入到DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，搅拌均匀，再加入Cy7-Cl，搅拌反应，反应结束后减压除去溶剂，得到化合物B；
③在0℃、保护性气体氛围下，将步骤②中得到的化合物B加入到无水二氯甲烷中，搅拌均匀，得到混合溶液I；将三氟乙酸溶于二氯甲烷中，得到混合溶液II；然后将混合溶液II加入到混合溶液I中进行反应，得到化合物C；
④将步骤③中得到的化合物C和氢化钠加入到DMF中，混合均匀后加水，搅拌反应，待反应结束后减压去除溶剂，得到前体化合物D；前体化合物D的结构式如式II所示：
(2)探针的制备
⑤将步骤(1)④中得到的前体化合物D加入盐酸溶液中，冰浴条件下搅拌均匀，得到混合溶液III；
⑥将亚硝酸钠溶于冰水后滴加到步骤⑤中得到的混合溶液III中，在0～5℃条件下搅拌反应，得到混合溶液IV；
⑦将叠氮化钠溶于冰水后滴加到步骤⑥中得到的混合溶液IV中，在0～5℃条件下搅拌反应，得到用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针。
步骤①中所述的有机溶剂为乙醇；优选为无水乙醇。
步骤①中所述的间氨基苯酚的用量为按每毫升有机溶剂配比24～33.5mg间氨基苯酚计算。
步骤①中所述的间氨基苯酚和二碳酸叔丁酯的摩尔比为1:1～2；优选为1:1.5。
步骤①中所述的加入二碳酸叔丁酯优选为通过如下步骤实现：先将二碳酸叔丁酯溶于有机溶剂中，搅拌均匀后再逐滴加入。
步骤①中所述的搅拌的时间优选为5分钟。
步骤①中所述的回流反应的时间为5～8h；优选为5h。
步骤②中所述的化合物A、氢化钠和Cy7-Cl的摩尔比为1：1～2：4；优选为1:1：4。
步骤②中所述的搅拌的条件优选为：室温下搅拌10～15分钟。
步骤②中所述的Cy7-Cl优选为通过如下方法制备得到：
a、在氮气保护下，将DMF溶于二氯甲烷中，得到DMF溶液；
b、将三氯氧磷溶于冰浴下的二氯甲烷中，然后将获得的三氯氧磷溶液加入到步骤a中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌均匀，得到混合溶液V；
c、将环己酮加入步骤b中得到的混合溶液V中，于80℃条件下进行回流反应，再将反应后获得的混合物倒入冰水中过夜，得到化合物E；
d、将2,3,3-三甲基吲哚和碘乙烷溶于甲苯中，于100℃条件下搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤，得到化合物F；
e、将步骤c中得到的化合物E、步骤d中得到的化合物F，以及乙酸钠溶于乙酸酐中，于60℃条件下搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥，得到Cy7-Cl。
步骤a中所述的DMF优选为冰冻的DMF。
步骤a中所述的DMF与二氯甲烷的体积比优选为1:1。
步骤b中所述的三氯氧磷与二氯甲烷的体积比优选为1.05:1。
步骤b中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比优选为1.05:2。
步骤b中所述的搅拌的时间优选为30min。
步骤c中所述的环己酮与所述三氯氧磷的体积比优选为1:2。
步骤c中所述的回流反应的时间优选为3h。
步骤d中所述的2,3,3-三甲基吲和碘乙烷的体积比优选为1:0.9。
步骤d中所述的2,3,3-三甲基吲用量为按每毫升甲苯配比0.2ml 2,3,3-三甲基吲计算。
步骤d中所述的搅拌反应的时间优选为20h。
步骤d中所述的洗涤为采用乙酸乙酯进行洗涤。
步骤e中所述的化合物E、化合物F和乙酸钠的摩尔比为0.6：1.3：0.6。
步骤e中所述的化合物E用量为按每毫升乙酸酐配比0.2mmol化合物E计算。
步骤e中所述的搅拌反应的时间优选为3h。
步骤e中所述的洗涤为依次用饱和碳酸氢钠溶液和水进行洗涤；优选为通过如下步骤实现：先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，直至无气泡出现，然后再用水洗涤两次。
步骤②中所述的搅拌反应的条件优选为：25℃反应2～3h。
所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，在步骤②之后还包括将得到的化合物B进行分离纯化的步骤。
所述的分离纯化为采用硅胶柱进行分离纯化。
步骤②和③中所述的保护性气体优选为氮气。
步骤③中所述的化合物B的用量为按每毫升无水二氯甲烷配比10mg化合物B计算。
步骤③中所述的搅拌的时间优选为20～30min。
步骤③中所述的混合溶液II加入到混合溶液I中优选为通过如下方法实现：将混合溶液II通过注射器加入到混合溶液I中。
步骤③中所述的三氟乙酸与化合物B的摩尔比为20:1。
步骤③中所述的三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:2～4；优选为1:3。
步骤③中所述的反应的时间优选为6～8h。
所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，在步骤③之后还包括将得到的化合物C进行萃取、干燥、去除溶剂以及分离纯化的步骤：向步骤③得到的化合物C中加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷进行萃取，再用无水硫酸镁进行干燥，加压去除溶剂，得到的粗产物用硅胶色谱柱进行分离纯化，得到纯化后的化合物C。
所述的萃取的次数优选为三次。
步骤④中所述的化合物C与氢化钠的摩尔比为1:1～2；优选为1:1.2。
步骤④中所述的水与所述化合物C的摩尔比为20～10：1；优选为20：1。
步骤④中所述的搅拌反应的条件优选为：50℃反应5～7h。
所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，在步骤③之后还包括将得到的化合物C进行纯化的步骤。
所述的纯化为采用氧化铝柱进行纯化。
步骤④中所述的反应优选为采用点板监控反应，若出现蓝绿色点且极性大与原料即为产物。
步骤⑤中所述的搅拌的时间优选为30～60min；优选为30min。
步骤⑤中所述的前体化合物D的用量为按每毫升盐酸溶液配比6mg前体化合物D计算。
步骤⑤中所述的盐酸溶液为浓盐酸与冰水按体积比1:4配比得到的溶液。
所述的浓盐酸为质量分数37％的浓盐酸。
步骤⑥和⑦中所述的滴加为采用恒压滴液漏斗进行滴加。
步骤⑥中所述的亚硝酸钠的用量按亚硝酸钠与所述前体化合物D的摩尔比为3～5:1配比计算；优选为按3:1配比计算。
步骤⑥中所述的搅拌反应的时间优选为30min。
步骤⑦中所述的叠氮化钠的用量按叠氮化钠与所述前体化合物D的摩尔比为3～5:1配比计算；优选为按3:1配比计算。
步骤⑦中所述的搅拌反应的时间优选为3～3.5h。
所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，在步骤⑦之后还包括将得到的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针进行分离纯化的步骤：先用二氯甲烷进行萃取，再用硅胶柱进行分离纯化。
所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针在检测领域中的应用。
所述的检测为水体检测或食品检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明克服了荧光探针在活体检测中荧光信号的散射和组织吸收的问题，提供了一种光声比率成像探针用于检测活体肿瘤中的硫化氢。该探针的响应机理基于叠氮和硫氢根离子的特异性的氧化还原反应，让叠氮基团还原为氨基，使探针整体的共轭体系电子云密度增大，从而导致探针反应前后吸收光谱发生红移，因此利用其反应前后吸收光谱变化的性质，将其设计为一种光声比率成像探针。
2、本发明获得的探针的具有如下优点:光声信号穿透深度大，实现深层组织的成像，反应速度快，特异性好，比率检测更准确。该探针可以用于活体检测硫化氢，还可以用于体外检测，如水体中的硫化氢检测，食品中的硫化氢检测等。
附图说明
图1为本发明实施实例1中用于活体检测肿瘤内硫化氢的光声比率探针的制备合成路线图。
图2为本发明实施实例1中所述探针前体化合物D的核磁共振氢谱图。
图3为本发明实施实例1中所述探针前体化合物D的电感耦合等离子体质谱图。
图4为本发明实施实例1中所述探针的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施实例1中所述探针的电感耦合等离子体质谱图。
图6为本发明实施实例2中所述探针与硫氢化钠反应前后的吸收光谱图。
图7为本发明实施实例2中所述探针与硫氢化钠反应前后的荧光光谱图。
图8为本发明实施实例3中所述探针与不同浓度硫氢化钠反应后的光声成像图和光声信号强度图以及光声比率值统计图；其中，图a为探针与不同浓度硫氢化钠反应后的光声成像图；图b为探针与不同浓度硫氢化钠反应后的光声信号强度图；图c为探针与不同浓度硫氢化钠反应后的光声比率值统计图。
图9为本发明实施实例4中所述探针静脉注射小鼠体内后，小鼠活体光声成像图和光声信号强度图；其中，图a为光声成像图；图b为光声信号强度图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：一种用于活体检测肿瘤内硫化氢的光声比率探针的制备。
1、本发明所提供的一种用于活体检测肿瘤内硫化氢的光声比率探针的具体合成步骤如图1所示，具体如下：
(1)①Ⅰ前体的制备：将间氨基苯酚(436mg，4mmol)溶于13ml无水乙醇中，二碳酸叔丁酯(1.3g，6mmol)溶于5ml无水乙醇后逐滴加入，搅拌5分钟，80℃回流5h，溶液真空浓缩，得到白色固体A。
②将白色固体A(81.9mg，0.39mmol)与氢化钠(9.36mg，0.39mmol)加入装有2mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺)的圆底烧瓶中，混合物在氮气保护下室温搅拌10min，将Cy7-Cl(100mg，0.156mmol)溶于1ml DMF后加入到上述圆底烧瓶中，在25℃下搅拌2h，减压除去溶剂，硅胶柱分离(二氯甲烷与甲醇的体积比＝100：3.5)得到墨绿色固体B。其中，Cy7-Cl的制备过程如下：
a、将冰冻的DMF 20ml在氮气保护下溶于20ml二氯甲烷中；
b、将10.5ml三氯氧磷溶于冰浴下的10ml二氯甲烷中，然后将三氯氧磷的二氯甲烷溶液逐滴加入步骤a中得到的DMF中，氮气保护下搅拌30min；
c、将5.26ml环己酮加入步骤b中得到的混合溶液中，混合物在80℃搅拌，回流3h；
d、然后将步骤c中得到的混合物倒入冰水中，过夜，过滤得到黄色固体；
e、将2,3,3-三甲基吲哚2ml和1.8ml碘乙烷溶于10ml甲苯中，在100℃下搅拌20h；
f、反应冷却至室温后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤得到粉色固体；
g、取0.21g 1.2mmol步骤d中得到的黄色固体，和0.81g 2.6mmol步骤f中得到的粉色固体，以及0.1632g 1.2mmol乙酸钠，溶于6ml乙酸酐中；
h、将步骤g中得到的混合物在60℃下搅拌3h；
i、冷却至室温，过滤，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，直至无气泡出现，然后将固体用水洗涤两次，真空干燥得到墨绿色固体I；
j、将墨绿色固体I过硅胶柱(二氯甲烷与甲醇的体积比＝100：5)，纯化得到产物Cy7-Cl。
③将墨绿色固体B(50mg)加入无水二氯甲烷中(5ml)，在0℃氮气保护下搅拌30min，得到墨绿色固体B与二氯甲烷的混合物；然后将三氟乙酸1ml溶于3ml二氯甲烷后通过注射器缓慢加入混合物中，让反应恢复至室温，搅拌6h。反应结束后将反应后的混合物加入到50ml的饱和碳酸氢钠溶液中，用50ml二氯甲烷萃取三次，有机相合并，用无水硫酸镁干燥，溶剂通过加压除去，粗产物用硅胶色谱柱分离得到墨绿色固体C。
④将化合物C(35mg，0.05mmol)和氢化钠(1.44mg，0.06mmol)加入到带圆底烧瓶中，加入2ml DMF作为溶剂，搅拌5min后加入100μl水(提供Knoevenagel缩合反应过程中的氢离子)，在50℃搅拌5h，点板监控反应过程，待反应完全后减压出去溶剂，用氧化铝柱(二氯甲烷与甲醇的体积比＝10：1)分离得到Ⅰ前体化合物D。
表征数据：
1HNMR(图2)(500MHz,CDCl3)δ＝8.54(d,J＝4.0Hz,1H),7.45(d,J＝6.9Hz,1H),7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.26-7.17(m,2H),7.08(d,J＝7.8Hz,1H),7.02(s,1H),6.79(s,1H),5.92(d,J＝14.2Hz,1H),4.09(dd,J＝13.3,6.1Hz,2H),2.82-2.70(m,2H),2.68-2.59(m,2H),1.94(s,2H),1.77(s,6H),1.46(t,J＝6.8Hz,3H)
LC-MS图(3):calcd.for[M+]397.54,,found:397.20.
(2)探针Ⅰ的制备
将上述得到的Ⅰ前体化合物D(30mg，0.076mmol)加入配制好的盐酸溶液(1ml 37％浓盐酸：4ml冰水)中，冰浴下搅拌30min，溶液变为紫黑色。取亚硝酸钠(0.226mmol，15.5mg)溶于冰水中，用恒压滴液漏斗逐滴加入上述紫黑色溶液中，保温0～5℃，搅拌30min，得到混合溶液。取叠氮化钠(14.69mg)溶于冰水(1ml)中，用恒压滴液漏斗逐滴加入上述混合溶液中，保温0～5℃，搅拌30min。室温搅拌3h，用二氯甲烷萃取。最后过硅胶柱(二氯甲烷与甲醇的体积比＝25：1洗脱)分离得到蓝紫色固体探针Ⅰ。
表征数据：
1HNMR(图4)(500MHz,CDCl3)δ＝8.54(d,J＝4.0Hz,1H),7.45(d,J＝6.9Hz,1H),7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.26-7.17(m,2H),7.08(d,J＝7.8Hz,1H),7.02(s,1H),6.79(s,1H),5.92(d,J＝14.2Hz,1H),4.09(dd,J＝13.3,6.1Hz,2H),2.82-2.70(m,2H),2.68-2.59(m,2H),1.94(s,2H),1.77(s,6H),1.46(t,J＝6.8Hz,3H)
LC-MS(图5):calcd.for[M+]423.54,,found:423.10.
实施例2:探针Ⅰ与硫氢化钠反应前后的吸收，荧光光谱。
配置实施例1中获得的探针Ⅰ溶液以及硫氢化钠水溶液，然后将探针Ⅰ溶液与硫氢化钠水溶液混合反应五分钟后测定其吸收；其中，反应体系中探针Ⅰ的浓度为10μM，硫氢化钠的浓度为50μM。吸收光谱如图6所示，荧光光谱如图7所示，从图中可以看出探针在与硫氢化钠反应前后是有荧光响应的。
实施例3:探针Ⅰ与不同浓度硫氢化钠反应后光声成像图及比率成像图。
配置浓度为20μM探针Ⅰ溶液共6组，以及浓度为0，20，40，60，80，100μM的硫氢化钠水溶液，然后将探针Ⅰ溶液与硫氢化钠水溶液混合后进行反应(探针Ⅰ溶液的用量为40μl，硫氢化钠水溶液的用量分别为1，2，3，4，5μl)，每组各自反应5分钟后，用光声计算机断层扫描仪测定6组溶液的光声信号，以及光声二维图(图8)。从图中可以看出光声信号随浓度的增加532nm的光声信号强度逐渐减弱，700nm的光声信号强度逐渐增强，两波段光声信号强度比率值随硫氢化钠的浓度逐渐增大，表明探针可以作为检测硫化氢的比率光声探针。
实施例4:探针Ⅰ在活体中的光声成像图及比率成像图。
将探针Ⅰ(2mg/kg)尾静脉注射到小鼠(3～4周BABc鼠，平均2体重20g，购买于南方医科大学)体内后1，4，8，12，24h后利用光声计算机断层扫描仪对小鼠肿瘤部位进行成像，分别在532nm和700nm两个波段进行成像。结果如图9所示，从图中可以看出随着探针在小鼠体内代谢到肿瘤部位后对内源性硫化氢的光声比率成像。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针，其特征在于结构式如式I所示：
2.权利要求1所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)前体的制备：
①将间氨基苯酚溶于有机溶剂中，然后加入二碳酸叔丁酯，搅拌均匀后于80℃条件下进行回流反应，再将获得的溶液进行真空浓缩，得到化合物A；
②在保护性气体氛围下，将步骤①中得到的化合物A和氢化钠加入到DMF中，搅拌均匀，再加入Cy7-Cl，搅拌反应，反应结束后减压除去溶剂，得到化合物B；
③在0℃、保护性气体氛围下，将步骤②中得到的化合物B加入到无水二氯甲烷中，搅拌均匀，得到混合溶液I；将三氟乙酸溶于二氯甲烷中，得到混合溶液II；然后将混合溶液II加入到混合溶液I中进行反应，得到化合物C；
④将步骤③中得到的化合物C和氢化钠加入到DMF中，混合均匀后加水，搅拌反应，待反应结束后减压去除溶剂，得到前体化合物D；其中，前体化合物D的结构式如式II所示：
(2)探针的制备
⑤将步骤(1)④中得到的前体化合物D加入盐酸溶液中，冰浴条件下搅拌均匀，得到混合溶液III；
⑥将亚硝酸钠溶于冰水后滴加到步骤⑤中得到的混合溶液III中，在0～5℃条件下搅拌反应，得到混合溶液IV；
⑦将叠氮化钠溶于冰水后滴加到步骤⑥中得到的混合溶液IV中，在0～5℃条件下搅拌反应，得到用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针。
3.根据权利要求2所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤②中所述的Cy7-Cl通过如下方法制备得到：
a、在氮气保护下，将DMF溶于二氯甲烷中，得到DMF溶液；
b、将三氯氧磷溶于冰浴下的二氯甲烷中，然后将获得的三氯氧磷溶液加入到步骤a中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌均匀，得到混合溶液V；
c、将环己酮加入步骤b中得到的混合溶液V中，于80℃条件下进行回流反应，再将反应后获得的混合物倒入冰水中过夜，得到化合物E；
d、将2,3,3-三甲基吲和碘乙烷溶于甲苯中，于100℃条件下搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤，得到化合物F；
e、将步骤c中得到的化合物E、步骤d中得到的化合物F，以及乙酸钠溶于乙酸酐中，于60℃条件下搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥，得到Cy7-Cl。
4.根据权利要求3所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤b中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比为1.05:2；
步骤c中所述的环己酮与所述三氯氧磷的体积比为1:2；
步骤d中所述的2,3,3-三甲基吲和碘乙烷的体积比为1:0.9；
步骤e中所述的化合物E、化合物F和乙酸钠的摩尔比为0.6：1.3：0.6。
5.根据权利要求3所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤c中所述的回流反应的时间为3h；
步骤d中所述的搅拌反应的时间为20h；
步骤d中所述的洗涤为采用乙酸乙酯进行洗涤；
步骤e中所述的搅拌反应的时间为3h；
步骤e中所述的洗涤为依次用饱和碳酸氢钠溶液和水进行洗涤。
6.根据权利要求2所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤①中所述的间氨基苯酚和二碳酸叔丁酯的摩尔比为1:1～2；
步骤②中所述的化合物A、氢化钠和Cy7-Cl的摩尔比为1：1～2：4；
步骤③中所述的三氟乙酸与化合物B的摩尔比为20:1；
步骤④中所述的化合物C与氢化钠的摩尔比为1:1～2；
步骤④中所述的水与所述化合物C的摩尔比为20～10：1；
步骤⑥中所述的亚硝酸钠的用量按亚硝酸钠与所述前体化合物D的摩尔比为3～5:1配比计算；
步骤⑦中所述的叠氮化钠的用量按叠氮化钠与所述前体化合物D的摩尔比为3～5:1配比计算。
7.根据权利要求2所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤①中所述的有机溶剂为无水乙醇；
步骤⑤中所述的盐酸溶液为浓盐酸与冰水按体积比1:4配比得到的溶液；所述的浓盐酸为质量分数37％的浓盐酸。
8.根据权利要求2所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤①中所述的回流反应的时间为5～8h；
步骤②中所述的搅拌反应的条件为：25℃反应2～3h；
步骤③中所述的反应的时间为6～8h；
步骤④中所述的搅拌反应的条件为：50℃反应5～7h；
步骤⑥中所述的搅拌反应的时间为30min；
步骤⑦中所述的搅拌反应的时间为3～3.5h。
9.根据权利要求2所述用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针的制备方法，其特征在于，在步骤⑦之后还包括将得到的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针进行分离纯化的步骤：先用二氯甲烷进行萃取，再用硅胶柱进行分离纯化。
10.权利要求1所述的用于活体检测硫化氢的光声比率纳米探针在检测领域中的应用，其特征在于：所述的检测为水体检测。
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