CN108441523A - （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 - Google Patents
（3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108441523A CN108441523A CN201810239859.6A CN201810239859A CN108441523A CN 108441523 A CN108441523 A CN 108441523A CN 201810239859 A CN201810239859 A CN 201810239859A CN 108441523 A CN108441523 A CN 108441523A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucose
- product
- conversion
- conversion process
- method described
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 36
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 28
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 25
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 17
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 claims description 12
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 claims description 10
- XQGPKZUNMMFTAL-UHFFFAOYSA-L dipotassium;hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[K+].[K+].OP([O-])([O-])=O XQGPKZUNMMFTAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical class [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N carbocromen Chemical compound CC1=C(CCN(CC)CC)C(=O)OC2=CC(OCC(=O)OCC)=CC=C21 KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000000306 component Substances 0.000 claims 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- BZDIAFGKSAYYFC-UHFFFAOYSA-N manganese;hydrate Chemical compound O.[Mn] BZDIAFGKSAYYFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 abstract description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 3
- 235000015141 kefir Nutrition 0.000 abstract description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 abstract description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 abstract 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- KGMNHOOXYBNYQT-UHFFFAOYSA-N [Mg].O.S(O)(O)(=O)=O Chemical compound [Mg].O.S(O)(O)(=O)=O KGMNHOOXYBNYQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000009876 asymmetric hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种(3R,5S)‑6‑ 氯 ‑3,5‑ 二羟基己酸叔丁酯的制备方法，本发明使用开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)作为全细胞生物催化剂，从(S)‑CHOH开始不对称合成，能够实现反应的一步合成，并在发酵液不浓缩的情况下获得较高的转化率。
Description
技术领域
本发明属于制药工业生物技术领域，具体涉及一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法。
背景技术
具有光学活性的β，δ-二羟基酯已经在天然产品、多羟基化合物以及手性药物的合成中得到了广泛的运用。(3R,5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯是一种重要的药物中间体，可用于合成HMG-CoA还原酶的抑制剂(他汀类药物)，这类药物可以有效的防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。
目前合成(3R,5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法主要有化学方法和生物方法。WolbergM等将(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称加氢还原成(3R,5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯需要低温催化合成，对反应器的要求较高，而且催化剂的价格昂贵，成本较高，因此运用生物法进行催化合成具有良好的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，使用开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)作为全细胞生物催化剂，从(S)-CHOH开始进行不对称合成。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养L.kefirATCC 35411全细胞菌株；
(2)在发酵液中添加底物(S)-CHOH、葡萄糖和MgCl2，进行催化转化；
(3)产物分离提取。
本发明的方法，所述步骤(1)中，富集培养的培养基成分为酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L,一水合硫酸镁0.05g/L，吐温801g/L；发酵培养基成分为酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L，发酵pH6.0，温度30℃。
所述步骤(2)中，在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入氮气，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。
或将发酵液浓缩至OD660＝100，后在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用NaOH调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入氮气，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。
所述步骤(3)中，取出转化液，加入1:1乙酸乙酯，混匀，8000rpm离心10min分离菌体细胞，取上清用乙酸乙酯：水＝1:1萃取三次，取出产物(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯后，去除水层，产物留在乙酸乙酯层，加入30g/L无水硫酸钠干燥1-2h，干燥后将溶剂进行旋蒸，45℃，压力从大气压降至150mPa，直至将溶剂旋干，旋蒸后将产物放入真空干燥箱进一步干燥，获取所需产物。
本发明的方法使用L.kefirATCC 35411作为全细胞生物催化剂，从(S)-CHOH开始进行不对称合成，反应产物转化率高，且在发酵液不浓缩的情况下可获取较高的转化率。
附图说明
图1为本发明技术路线图；
图2为不同pH对转化率影响的曲线图；
图3为(3R,5S)-CDHH标准样品的液相色谱图；
图4为本发明制备方法产物的液相色谱图。
具体实施方式
本发明开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)菌株购自ATCC菌种保藏中心，菌株型号为ATCC 35411。
实施例1
发酵培养全细胞菌株
(1)将冷冻的L.kefir细胞(-20℃)在室温下解冻，并用磷酸钾缓冲液(200mM，pH6.5)洗涤。以4500rpm离心10分钟，除去上清液。然后将细胞沉淀物悬浮于培养基(酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸镁0.05g/L，吐温801g/L)中富集培养，装液量：200ml/500mL，接种量：2％(v/v)，摇床150rpm，温度30℃，培养24h。(培养指标：OD660>1.5)。
(2)在5L的发酵罐中进行发酵，装液量：1.8L/5L，接种量10％，接入发酵培养基(酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸镁0.05g/L，吐温801g/L，pH 6.0)温度30℃，发酵pH 6.0，通空气，通气速度0.6VVM，转速100-200rpm。当葡萄糖浓度＜5g/L时，开始补料，补料速率：5mL/L/h补料12h后，加大速率至9mL/L/h，同时进行葡萄糖浓度的实时监控，补料培养基(酵母粉160g/L，葡萄糖400g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，一水合硫酸镁0.125g/L)，培养72h。(培养指标：最后OD660≈20)。
实施例2
全细胞催化
将发酵液分不浓缩和浓缩两种方式进行全细胞催化；
(1)发酵液不浓缩，直接进行催化转化。按底物浓度20mM、40mM、60mM、100mM进行四组实验，反应体系为3L发酵罐，转化条件分别为:
实验组1：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，20mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。
实验组2：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，40mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。
实验组3：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，60mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。
实验组4：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，100mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。
(2)发酵液浓缩至OD660＝100，将发酵液在4100rpm离心15min，去上清后用200mM，pH6.5的磷酸钾缓冲液将菌泥重悬，进行催化转化。反应体系为0.6L发酵罐，转化条件如下：
实验组5：10mM氯化镁，400Mm葡萄糖，100mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。
实施例3
本实施例基于摇瓶培养，说明不同的pH对转化效率的影响
100mL摇瓶培养，添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，20mM(S)-CHOH底物，分别配制pH为5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸盐缓冲液，27℃进行磁力搅拌转化。反应结果如图2所示，pH6.0～7.0时转化率较高，在pH6.5时转化率最高。
实施例4
本实施例说明产物分离提取和检验的方法。
(1)取出转化液，加入1:1乙酸乙酯，混匀，8000rpm离心10min(分离菌体细胞)，取上清，用乙酸乙酯：水＝1:1萃取三次，取出产物(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯后，去除水层，产物留在乙酸乙酯层，加入30g/L无水硫酸钠干燥1-2h，干燥后将溶剂进行旋蒸(45℃，压力从大气压降至150mPa，直至将溶剂旋干)，旋蒸后将产物放入真空干燥箱进一步干燥，即得所需产物，放于零度以下保存，(乙酸乙酯分相后蒸发回收，55℃，-0.1Mpa)。
(2)转化率及e.e.计算
利用液相进行计算，检测波长220nm，柱温40℃，流动相A(纯水)：B(乙腈)＝75:25，产物出峰时间37min，流速：0.5ml/min。
供试品溶液的配制：取(S)-CHOH 160mg，精密称定，加4mL乙腈适量超声使溶解，制成每1ml含(S)-CHOH约40.0mg的溶液，作为供试品溶液。
精密量取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，按面积归一化法计算，产物(3R,5S构型)保留时间：约37分钟，异构体(3S,5S构型)保留时间：约44分钟。产物液相色谱图如图4所示。5个实验组不同实验条件下产物转化率如表1所示。
表1反应底物浓度和产物转化率
| 底物浓度 | 转化率 | |
| 实验组1 | 20mM | 79％(21h) |
| 实验组2 | 40mM | 80％(42h) |
| 实验组3 | 60mM | 40％(51h) |
| 实验组4 | 100mM | 22％(67h) |
| 实验组5 | 100mM | 83％(17h) |
Claims (10)
1.一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)发酵培养L.kefir全细胞菌株；
(2)在发酵液中添加底物(S)-CHOH、葡萄糖和MgCl2，进行催化转化；
(3)产物分离提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菌株选用L.kefirATCC35411。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，富集培养的培养基成分为酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，发酵培养基成分为酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L，发酵pH6.0，温度30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将发酵液浓缩至OD660＝100，后在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，取出转化液，加入1:1乙酸乙酯，混匀，8000rpm离心10min分离菌体细胞，取上清用乙酸乙酯：水＝1:1萃取三次，取出产物(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯后，去除水层，产物留在乙酸乙酯层，加入30g/L无水硫酸钠干燥1-2h，干燥后将溶剂进行旋蒸，45℃，压力从大气压降至150mPa，直至将溶剂旋干，旋蒸后将产物放入真空干燥箱进一步干燥，获取所需产物。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将-20℃冷冻的L.kefir细胞在室温下解冻，磷酸钾缓冲液200mM，pH6.5洗涤；以4500rpm离心10分钟，除去上清液；将细胞沉淀物悬浮于培养基中富集培养，装液量：200ml/500mL，接种量：2％(v/v)，摇床150rpm，温度30℃，培养24h；富集培养基成分为酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L；
在5L的发酵罐中进行发酵，装液量：1.8L/5L，接种量10％，接入发酵培养基，成分为酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L，pH 6.0；温度30℃，发酵pH 6.0，通空气，通气速度0.6VVM，转速100-200rpm；当葡萄糖浓度＜5g/L时，开始补料，补料速率：5mL/L/h补料12h后，加大速率至9mL/L/h，同时进行葡萄糖浓度的实时监控，补料培养基，成分为酵母粉160g/L，葡萄糖400g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，一水合硫酸锰0.125g/L，培养72h；
(2)添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，20mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通氮气，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压；
(3)取出转化液，加入1:1乙酸乙酯，混匀，8000rpm离心10min分离菌体细胞，取上清，用乙酸乙酯：水＝1:1萃取三次，取出产物(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯后，去除水层，产物留在乙酸乙酯层，加入30g/L无水硫酸钠干燥1-2h，干燥后将溶剂进行旋蒸，45℃，压力从大气压降至150mPa，直至将溶剂旋干，旋蒸后将产物放入真空干燥箱进一步干燥，获取产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将发酵液浓缩至OD660＝100，发酵液在4100rpm离心15min，去上清后用200mM，pH6.5的磷酸钾缓冲液将菌泥重悬，10mM氯化镁，400Mm葡萄糖，100mM(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通氮气，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810239859.6A CN108441523A (zh) | 2018-03-22 | 2018-03-22 | （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810239859.6A CN108441523A (zh) | 2018-03-22 | 2018-03-22 | （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108441523A true CN108441523A (zh) | 2018-08-24 |
Family
ID=63196626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810239859.6A Withdrawn CN108441523A (zh) | 2018-03-22 | 2018-03-22 | （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108441523A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111748527A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-10-09 | 上海多宁生物科技有限公司 | 化学成分限定高效补料培养基及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1152054A1 (en) * | 1999-12-03 | 2001-11-07 | Kaneka Corporation | Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same |
| CN104844457A (zh) * | 2015-03-23 | 2015-08-19 | 爱斯特（成都）生物制药有限公司 | 一种(3r,5s)-6-氯二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
| CN105087684A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-11-25 | 连云港宏业化工有限公司 | 一种（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
-
2018
- 2018-03-22 CN CN201810239859.6A patent/CN108441523A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1152054A1 (en) * | 1999-12-03 | 2001-11-07 | Kaneka Corporation | Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same |
| CN104844457A (zh) * | 2015-03-23 | 2015-08-19 | 爱斯特（成都）生物制药有限公司 | 一种(3r,5s)-6-氯二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
| CN105087684A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-11-25 | 连云港宏业化工有限公司 | 一种（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AMIDJOJO M 等: "Asymmetric synthesis of tert-butyl (3, 5) 6-chloro-dihydroxyhexanoate with Lactobacillus kefir", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
| SUN XINGYUAN等: "Bioconversion process for synthesis of tert-butyl (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate using liquid-core immobilized Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2233", 《KOREAN JOURNAL OF CHEMICAL ENGINEERING》 * |
| 何秀娟: "两步酶法不对称合成（3R，5S）-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111748527A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-10-09 | 上海多宁生物科技有限公司 | 化学成分限定高效补料培养基及其制备方法和应用 |
| CN111748527B (zh) * | 2020-05-15 | 2021-01-29 | 上海多宁生物科技有限公司 | 化学成分限定高效补料培养基及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | One step recovery of succinic acid from fermentation broths by crystallization | |
| JP3502419B2 (ja) | 乳酸および乳酸エステルの製造方法 | |
| CN105018538B (zh) | 一种基于结晶法发酵分离耦合生产乳酸镁的方法 | |
| CN107217048A (zh) | 一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用 | |
| CN107868757B (zh) | 一种植物内生真菌及其应用 | |
| CN109182410A (zh) | 一种（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法 | |
| CN102206686B (zh) | 生物催化不对称还原制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯的方法 | |
| CN108441523A (zh) | （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 | |
| US8067195B2 (en) | Process for producing 7-methoxy-3-desacetylcefalotin | |
| CN104630125B (zh) | 工程菌及其在制备(3r, 5s)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯中的应用 | |
| US9963414B2 (en) | Process for the preparation and isolation of carboxylic esters | |
| CN103966275A (zh) | 生物法制备高纯度l-叔亮氨酸 | |
| CN104762360A (zh) | 新特性腈水合酶诱导的高含量烟酰胺合成 | |
| CN105732373B (zh) | 一种制备(r)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯的方法 | |
| CN110857276B (zh) | 一类手性β-羟基酰胺类化合物及其制备方法与应用 | |
| CN105567584B (zh) | 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用 | |
| CN104342416B (zh) | 含有一个或几个点突变的洛伐他汀酰基转移酶 | |
| CN108048317B (zh) | 一种非天然氨基酸的连续合成***及连续合成方法 | |
| CN104370953B (zh) | 一种(r)‑叔丁基二甲基硅氧基‑戊二酸单酯的制备方法 | |
| CN102559553B (zh) | 一株无色杆菌及其不对称催化还原碳碳双键的方法 | |
| CN105713932B (zh) | 一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法 | |
| CN106811491B (zh) | 光学活性的β-羟基酯类化合物的制备方法及其中间体 | |
| JP3705046B2 (ja) | 微生物による光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール及びその誘導体の製法 | |
| CN116024187B (zh) | 一种维兰特罗中间体的酶催化制备方法 | |
| CN102409068A (zh) | 一种(3aS,6aR)-生物素手性内酯的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180824 |