CN108431664A - 荧光校准载片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光成像。为了增强与用于校准荧光显微镜的多个荧光通道的相容性，提供了一种校准载片(10)，所述校准载片(10)包括基底(12)和像素布局(14)。所述像素布局(14)包括被布置在所述基底的表面(18)上的多个间隔开的金属纳米结构(16)。所述金属纳米结构被布置成产生等离子10体共振，所述等离子体共振允许激发波长处的吸收光(20)产生光致发光和/或荧光(22)以生成荧光图像。所述荧光图像包括被提供用于荧光显微镜的校准的多个像素强度值。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像的领域，并且具体涉及校准载片(slide)，涉及荧光显微镜的校准***，并且涉及用于校准荧光显微镜的方法。
背景技术
荧光成像已经在例如活检、医药和材料科学中使用。例如，在数字病理学中，荧光成像实现了荧光标记的载片的多通道扫描，帮助研究从其样本获得更多的信息。然而，在长期使用之后，例如由于荧光显微镜的故障的光学布置，荧光成像***的扫描准确性可能波动或者甚至下降。荧光显微镜因此可能需要被例程地校准以保证性能。校准载片通常被用于校准荧光显微镜。例如，US 2013/0292559 A1描述了一种基于荧光染料的校准载片。然而，可能需要多种荧光染料用于基于染料的校准载片，以便与多个荧光通道相容。
发明内容
可能存在对提供与多个荧光通道相兼容的校准载片的需要。
本发明的目的是由独立权利要求的主题来解决的，其中，进一步的实施例被包含在从属权利要求中。应当注意，本发明的以下描述的各方面也适用于校准载片，适用于荧光显微镜的校准***，并且适用于校准荧光显微镜的方法。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于荧光显微镜的校准载片。所述校准载片包括基底和像素布局，所述像素布局包括被布置在所述基底的表面上的被布置成多个间隔开的金属纳米结构。所述金属纳米结构被布置成产生等离子体共振，所述等离子体共振允许激发波长处的吸收光产生光致发光和/或荧光以生成荧光图像。所述荧光图像包括被提供用于荧光显微镜的校准的多个像强度度值。
在此应当注意，本发明能够有利地用在适合于数字病理学中的所谓的全载片成像的任何类型的显微镜中。例如，本发明涵盖基于线的扫描以及基于片材的扫描的显微镜。
基于等离子体共振的校准载片示出了当利用在对应激发波长处的光进行激发时可以覆盖所有典型的荧光通道的宽吸收和发射谱。因此，所述校准载片的相同区域可以提供在大的谱范围上的光致发光和/或荧光输出。换言之，所述校准载片上的一种类型的等离子体结构可以被用于校准所有荧光通道。这可以代替对多种荧光染料的需要。此外，由于在金属纳米结构中对激发光的自然共振吸收以及不同波长的激发光的一部分的重新发射，这样的校准载片的光致发光和/或荧光可以较不易于退化。例如，相比于常规的基于染料的样本，这样的校准载片可以在一定时间内是稳定的，并且不示出变淡。此外，由于等离子体不随着时间而消退，可能不存在对例如每年对校准载片进行校准的需要。
根据范例，所述基底是光学透明的。
因此，所述荧光成像能够与明场成像相组合，其中，所述像素布局可见为彩色图像。所述校准载片的所述像素布局的可见性可以允许快速的定位、样本定位和视觉样本检查，这使所述校准更快。
根据范例，所述金属纳米结构被布置成彼此耦合。
通过进行局部的和耦合的共振的组合，能够设计具有范围为从紫外到红色的共振波长的校准载片。这提供了在明光照射下产生不同颜色的灵活性。
在范例中，所述校准载片不仅被提供用于校准荧光响应，而且也用于校准例如针对明场和荧光成像***的颜色。这样的组合可以改善校准过程的效率。
根据范例，所述校准载片还被提供有至少一个布局，所述至少一个布局选自包括以下项的组：单层的彩色微珠、分辨率和失真测试目标、以及无机磷光体层。
换言之，所述校准载片包括两个或更多个不同的样本或目标。在范例中，所述校准载片包括用于根据等离子体效应产生光致发光和/或荧光的像素布局以及单层的彩色微珠。在另外的范例中，所述校准包括像素布局、单层的彩色微珠、以及分辨率和失真测试目标。
以这种方式，能够利用等离子体共振来模拟荧光和幻影特征。能够利用微珠来评价焦点和成像。分辨率和失真目标评价分辨率和拼接(stitching)伪影。利用多个目标在相同校准载片上的组合，可以实现更有效且准确的校准。
此外，无机磷光体也可以与等离子体相组合以增强所述发射谱的特定部分的发射。
根据本发明的第四方面，提供了一种制造具有多布局的荧光校准载片的方法，所述多种布局包括像素布局、单层的彩色微珠、以及分辨率和失真测试目标，所述像素布局具有被布置在所述基底的表面上的多个间隔开的金属纳米结构，所述方法包括以下步骤：
aa)将单层的彩色微珠沉积在基底上，形成显微镜载片；
bb)将像素布局以及分辨率和失真测试目标沉积在两个不同的基底上，形成两个盖片；并且
cc)将两个盖片组装在所述显微镜载片上，以形成校准载片。
换言之，三个过程能够在单独的基底上进行，在完成这些过程之后所述单独的基底被组装在一起。
以这种方式，尽管这三种技术(纳米压印光刻和干蚀刻、化学结合以及光学光刻)的制造方法不与彼此相兼容，但是能够将所有三种技术组合在一个校准载片上。
根据本发明的第二方面，提供了一种荧光显微镜的校准***。所述校准***包括荧光显微镜以及根据在上文和下文中所描述的范例中的一个范例的校准载片。所述荧光显微镜包括光源和光探测器。所述光源和所述光探测器被布置在光学路径中。在校准中，所述光源被配置成提供要被定位在所述光学路径中的所述校准载片的所述金属纳米结构吸收的处于激发波长的光，以产生光致发光和/或荧光。所述光探测器被配置成探测所产生的光致发光和/或荧光，以采集荧光图像数据作为用于校准目的的校准测试数据。
所述荧光显微镜可以被用在数字病理学中。例如，所述荧光显微镜例如可以是多通道荧光数字病理学扫描器、明场和荧光数字病理学扫描器、或者明场、荧光和荧光原位杂化(FISH)数字病理学扫描器。
因此，所述荧光成像***可以在多个荧光通道中被校准而无需改变校准载片。这可以简化校准流程并且增加效率。此外，由于荧光强度的一致性处于显微镜水平，也可以保证校准准确性。
根据范例，所述校准***还被提供有校准设备，所述校准设备包括存储单元和处理单元。所述存储单元被配置成存储至少一个荧光通道的预定标准校准数据。所述处理单元被配置成将所采集的校准测试数据与所存储的预定标准校准数据进行比较，以生成所述至少一个荧光通道的强度校正曲线(profile)。所述强度校正曲线被提供用于针对所述至少一个荧光通道而校正利用所述荧光显微镜获得的荧光病理学样本的荧光图像数据。
所述校准设备可以是荧光显微镜的一体部分。备选地，所述校准设备可以是计算机。
根据范例，除了所述像素布局之外，至少一个布局被提供在所述校准载片的所述表面上，所述至少一个布局选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标。所述光探测器被配置成采集所述至少一个布局的图像数据作为另外的校准测试数据。所述存储单元被配置成存储所述至少一个布局的另外的预定标准校准数据。所述处理单元被配置成将所采集的另外的校准测试数据与所存储的另外的预定标准校准数据进行比较，以校准所述荧光显微镜的参数。所述参数选自包括以下项的组：所述荧光显微镜的聚焦质量以及分辨率和拼接伪影。
以这种方式，能够评价和校准所述荧光显微镜的荧光、颜色、焦点、成像和拼接、或者其组合而无需改变所述校准载片。所述校准过程可以被简化，这也可以增强校准荧光显微镜的效率。
根据范例，所述荧光显微镜是落射荧光显微镜。
所述落射荧光方法可以提供高信噪比。
根据本发明的第三方面，提供了一种用于校准包括光源和光探测器的荧光显微镜的方法，所述光源和所述光探测器被布置在光学路径中，所述方法包括以下步骤：
a)利用从所述光源朝向所述光探测器的光来照射被定位在所述光学路径中的校准载片；其中，所述校准载片包括基底和像素布局，所述像素布局包括被布置在所述基底的表面上的多个间隔开的金属纳米结构，其中，所述金属纳米结构被布置成产生等离子体共振；并且
其中，照射所述校准载片的所述光产生等离子体共振，所述等离子体共振允许激发波长处的吸收光产生光致发光和/或荧光以生成荧光图像，所述荧光图像包括被提供用于荧光显微镜的校准的多个像素强度值；
b)采集所述荧光图像的荧光图像数据作为校准测试数据；并且
c)使用所述校准测试数据用于所述荧光显微镜的校准目的。
根据范例，所述方法步骤c)还包括以下子步骤：
c1)提供预定标准校准数据；
c2)将所获得的校准测试数据与所述预定标准校准数据进行比较，以生成强度校正曲线；并且
c3)使用所述强度校正曲线来校准利用所述荧光显微镜获得的荧光病理学样本的荧光图像数据。
根据范例，除了所述像素布局之外，至少一个布局被提供在所述校准载片的所述表面上，所述至少一个布局选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标；并且
其中，所述方法还包括以下步骤：
d)采集所述至少一个布局的图像数据作为另外的校准测试数据；
e)提供所述至少一个布局的另外的预定标准校准数据；并且
f)将所采集的另外的校准测试数据与所存储的另外的预定标准校准数据进行比较，以校准所述荧光显微镜的参数；
其中，所述参数选自包括以下项的组中：
-所述荧光显微镜的聚焦质量；以及
-分辨率和拼接伪影。
根据本发明的一方面，提供了一种利用等离子体共振效应来吸收在激发波长处的光以产生用于校准荧光显微镜的光致发光和/或荧光的校准载片。所述校准载片包括薄层的金属纳米结构，其具有小于1μm的厚度。薄的厚度可以确保在所述校准载片上不存在失焦区域，并且另外，所述校准载片具有与病理学载片相当的厚度。因此，所述校准载片也适合于如数字病理学的应用。此外，所述校准载片具有跨所述校准载片的处于显微镜水平的均匀荧光强度。相比于基于荧光染料的校准载片，所述校准载片的荧光更不易于退化。由于制作工艺，还能够被大批量保证均匀荧光强度，这适合于评价扫描器到扫描器的变化性。
参考下文所述的实施例，本发明的这些方面和其他方面将是显而易见的并且得到阐明。
附图说明
本发明的示范性实施例将会在下文中参考以下附图来进行描述：
图1A和1B示出了校准载片的范例的示意图。
图2A至2D示出了校准载片的另外的范例。
图3A和3B示出了校准载片的荧光图像的两个范例。
图4A和4B示出了当暴露于具有两个不同激发波长的光时图3B中的校准载片的荧光图像的范例。
图5示出了用于荧光和颜色校准两者的校准载片的另外的范例。
图6示出了具有多个布局的校准载片的另外的范例。
图7示出了荧光显微镜的范例。
图8示出了用于校准荧光显微镜的方法的范例的基本步骤。
图9示出了方法的另外的范例。
图10示出了用于制造具有多个布局的荧光校准载片的方法的范例的基本步骤。
附图仅被示意性地图示而并非按比例。遍及附图，相同的参考标记指代相同或相似的特征。
具体实施方式
图1B示出了用于荧光显微镜42(参见图7中的范例)的校准载片10的范例的顶视图。图1A示出了沿着在图1B中示出的线1A-1A的截面视图。
校准载片10包括基底12和像素布局14，所述像素布局14具有被布置在基底12的表面18上的多个间隔开的金属纳米结构16。金属纳米结构16被布置成产生等离子体共振，所述等离子体共振允许激发波长处的吸收光20(以实线箭头指示)产生光致发光和/或荧光22(以虚线箭头指示)以生成荧光图像。所述荧光图像包括被提供用于荧光显微镜的校准的多个像素强度值。
任选地，盖片26被提供用于覆盖并保护像素布局14。为了安装可选的盖片20，能够使用进入金属纳米结构16之间的胶水、树脂或者任何其他适当的材料。
另外的选项是利用光学透明的氧化物层(未示出)覆盖金属纳米结构16。利用氧化物层，金属纳米结构16能够被保形地涂覆。所述氧化物层可以由例如二氧化硅(SiO2)、氮化硅(Si3N4)、SiO2与Si3N4的混合物(SiOxNy)、或者任何其他适当的氧化物或材料制成。可选的氧化物层可以提供对盖片附接的更好保护和方便性。
基底12(也被称为介电基底)可以由任何适当的材料制成。
在范例中，基底12是不透(或较少透)光的。例如，基底12是硅(Si)基底、绝缘体上硅(SOI)基底或者锗(Ge)基底。
在另一范例中，基底12在工作波长下是光学透明的，这允许透射光而无明显的散射或吸收。基底12可以是完全透明的。例如，基底12能够透射多于90％的光。基底12也可以是部分透明的。例如，基底12能够透射60％的光。例如，基底可以由二氧化硅、二氧化钛、氮化硅、石英、熔融二氧化硅、塑料、蓝宝石等。
基底12的透明性可以使得校准载片10在透射模式下工作，这允许与明场成像的组合。以这种方式，所述样本(或像素布局)在明场显微镜检查中是可见的，这允许快速的定位、样本定位和视觉样本检查并且因此使校准更快。
在另外的范例中，基底12也可以是具有低自体荧光的基底。然而，这样的基底的自体荧光应当是足够低的，而不影响等离子体生成的光致发光和/或荧光的对比度。
金属纳米结构16可以包括选自包括金、银、铜和铝的组中的金属。适合于产生等离子体共振的其他金属也可以被考虑。任选地或优选地，金属是铝或铝合金。铝能够支持等离子体共振为紫外线(UV)，这对于银和金来说是不可能的。此外，铝在环境中是稳定的，并且具有比银和金更少的成本。
术语“纳米结构”涉及具有在纳米尺度上的至少一个尺寸的结构。
在范例中，每个金属纳米结构具有在30nm至700nm、优选为60nm至450nm的范围中的截面尺寸28。截面尺寸28涉及沿着基底12的表面18的尺寸，金属纳米结构16被布置在基底12的表面18上。在图1B中，金属纳米结构16被图示为具有圆形形状的形式的截面。在这种情况下，截面尺寸28涉及圆形形状的直径。
在范例中，每个金属纳米结构具有在10nm至1μm、优选为25nm至150nm的范围中的厚度30。术语“厚度”涉及从基底12的表面18延伸的金属纳米结构16的高度。
如在图1A中所示出的，金属纳米结构16可以在基底12的表面18上形成突出部。在另一范例(未示出)中，金属纳米结构16可以在基底12的表面18上形成凹陷。
金属纳米结构16可以沿着基底12的表面18被周期性地布置。例如，在图1B中，金属纳米结构16以二维正方形栅格方式进行布置。金属纳米结构16也可以例如以二维六边形栅格方式不同地进行布置。
在另一范例(未示出)中，金属纳米结构16以具有不规律周期性的准周期性方式进行布置。
在范例中，相邻金属纳米结构16之间的距离32与可见光波长相当，其在100nm至1μm、优选为180nm至650nm的范围中。距离32也可以被称为节距，其为两个相邻金属纳米结构的中心之间的距离。作为选项，金属纳米结构16被布置成彼此耦合。
术语“耦合”涉及相邻金属纳米结构之间的耦合的共振。
局部的和耦合的共振的组合使得能够产生覆盖宽波长范围的不同颜色。这样的组合可以为设计用于校准荧光和颜色响应两者的校准载片提供灵活性。
金属纳米结构16在基底18的表面18上的布置限定了像素布局14。
图2A至图2D示出了校准载片10的像素布局14的另外的范例的顶视图。
在图2A中，像素布局14包括单尺寸金属纳米结构16的栅格。每个金属纳米结构16限定像素。
在图2B、图2C和图2D中，颜色是通过多个金属纳米结构单元34的周期性来设置的，因此每个金属纳米结构单元限定大的像素。
在图2B和图2C中，每个金属纳米结构单元34包括具有不同截面尺寸的金属纳米结构16。
在图2D中，金属纳米结构单元34包括具有与像素布局14的其余部分不同的截面尺寸的金属纳米结构16。
以这种方式，各种特征能够被图案化(patterned)在校准载片的表面上。
图3A和图3B示出了校准载片10的荧光图像的两个范例。在图1中，校准载片10被图案化有小尺度的特征。在图2中，校准载片10被图案化有大尺度的特征。
金属纳米结构16的像素布局14可以通过使用从包括纳米压印光刻和干蚀刻的组中选择的方法来制造。由于制作工艺，一致性能够被大批量保证，这适合于标准化目的。所述制作工艺也可以确保利用定制荧光图案(参见例如图3A和图3B)对校准载片进行图案化的灵活性。
此外，应当注意，当暴露于不同的激发波长时，像素布局14的相同区域能够在大的谱范围内提供荧光输出。
图4A和图4B示出了当暴露于具有两个不同激发波长的光时图3B中的像素布局14的荧光图像的两个范例。
换言之，相同的校准载片能够示出当利用对应的激发波长激发时可以覆盖所有典型荧光通道的宽吸收和发射谱。
术语“荧光通道”涉及选择性地透射特异于染料的激发和发射波长的光的一对激发和发射滤波器，所述染料诸如是4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基若丹明(TRITC)和花青(Cy)。
以这种方式，可以不需要多种荧光染料。一种类型的等离子体金属纳米结构可以校准所有荧光通道。
另外，由于校准载片也在透射模式下工作并且像素也能够在明光照射下产生颜色，相同的校准载片也可以提供用于颜色校准的手段。
图5示出了用于荧光和颜色校准两者的校准载片10的范例。校准载片10包括至少两个像素子布局36。至少两个像素子布局36被配置成在明光照射下例如利用具有不同尺寸和/或不同布置的金属纳米结构16生成不同的颜色(被示为不同的灰度水平)。
这可以为选定的颜色校准方法来提供颜色表(或颜色目标)的灵活设计。例如，像素布局14可以表示像素子布局30形式的具有24个灰度场和264个颜色场的IT8颜色目标。像素布局14也可以表示像素布局30形式的具有8个颜色场的MGH(麻省综合医院)颜色目标。因此，所述像素子布局也可以被称为颜色样本。
图6示出了另外的范例，其中，除了像素布局14之外，至少一个布局38、40被提供在校准载片10的表面18上。至少一个布局38、40选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标。作为选项，布局38、40两者都被提供在表面1 8上：布局38包括单层的彩色微珠；并且布局40包括分辨率和失真测试目标。
换言之，校准载片10可以包括两个或更多个不同的样本或目标。例如，校准载片10可以包括具有从等离子体效应、单层的彩色微珠、分辨率和失真测试目标、或者其组合而产生的光致发光和/或荧光的荧光目标。
以这种方式，能够利用等离子体共振来模拟荧光和幻影特征。能够利用微珠来评价焦点和成像。分辨率和失真目标评价分辨率和拼接伪影。因此，可以改善校准过程的效率。此外，这还使得用户能够将该复杂的样本嵌入到扫描器或扫描器阶段中。
多个布局可以在任何合适的方法中都沉积在基底上。在范例中，如在图6中的选项，布局38的微珠被化学地附接到基底12，而像素布局14的金属纳米结构以及布局40的分辨率和失真目标例如通过光刻工艺被沉积在两个盖片26上。
这可以允许多个布局与不同制造方法的组合。
作为另外的选项，除了像素布局14之外，可以提供无机磷光体层(未进一步示出)，诸如掺杂铈的钇铝石榴石(YAG：Ce)或纳米颗粒中的线发射体。无机磷光体层可以以与像素布局重叠或交叠的方式进行布置。无机磷光体可以具有在微-至亚-200nm的范围中的颗粒尺寸。
以这种方式，所述金属纳米结构可以允许无机磷光体、例如纳米磷光体的共振激发，增强光的转换。此外，由于其高化学稳定性，所述无机磷光体可能在一定时间内不(或更少)退化。
图7以示意图示出了荧光显微镜的校准***100的范例。根据上文所提到的范例中的一个范例，校准***100包括荧光显微镜42和校准载片10。
荧光显微镜42包括光源44、可选的光学布置46和光探测器48。光学布置46例如可以包括激发滤波器50、二向色镜52(或二向色分光镜)、发射滤波器54和(一个或多个)物镜56。光源44、光学布置46和光探测器48被布置在光学路径中。
在校准中，光源44被配置成提供处于激发波长的经过光学布置46以便被定位在光学路径中的校准载片10的金属结构16(未进一步示出)吸收的光20(以实线线箭头指示)，以产生光致发光和/或荧光22(以虚线箭头指示)。光探测器48被配置成探测用于采集荧光图像数据作为校准测试数据的光致发光和/或荧光22。
在范例中，如在图7中所示出的，荧光显微镜42是落射荧光显微镜，其中，激发波长的光20通过物镜56被聚焦在校准载片10上。由校准载片10发射的光致发光和/或荧光22通过被用于激发的相同物镜56聚焦到光探测器48。换言之，仅反射的激发光20与发射的光致发光和/或荧光一起到达物镜56。落射荧光方法因此可以给出高信噪比。
荧光显微镜42可以在数字病理学中使用。范例包括多通道荧光数字病理学扫描器、明场和荧光数字病理学扫描器、或者明场、荧光和FISH数字病理学扫描器。
作为选项，如在图7中所示出的，校准***100还被提供有校准设备58。校准设备58包括存储单元60和处理单元62。
存储单元60被配置成存储至少一个荧光通道的预定标准校准数据。处理单元62被配置成将所采集的校准测试数据与所存储的预定标准校准数据进行比较，以生成至少一个荧光通道的强度校正曲线。所述强度校正曲线被提供用于针对至少一个荧光通道而校正利用荧光显微镜获得的荧光病理学样本的荧光图像数据。
在范例中，所述强度校正曲线是强度校正值。
在另外的范例中，所述强度校正曲线是强度校正矩阵。
在范例中，校准设备58与荧光显微镜42集成在一起。在另一范例中，校准设备58是从荧光显微镜42接收校准测试数据的计算机。
作为另外的选项，除了像素布局14之外，至少一个布局38、40被提供在校准载片10的表面18上，所述至少一个布局38、40选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标(参见图6)。光探测器48还被配置成采集至少一个布局38、40的图像数据作为另外的校准测试数据。存储单元60被配置成存储至少一个布局32、34的另外的预定标准校准数据。处理单元62被配置成将所采集的另外的校准测试数据与所存储的另外的预定标准校准数据进行比较，以校准荧光显微镜42的参数。所述参数选自包括以下项的组：荧光成像***的聚焦质量以及分辨率和拼接伪影。
所述荧光显微镜的聚焦质量的校准可以基于选自包括以下项的组的微珠图像的性质的测量：强度、面积、密度和分布。测量到的性质的值然后与另外的预定标准校准数据(即已知值)进行比较，以校准荧光显微镜。
因此，相同的校准载片能够被用于校准荧光、颜色、聚焦质量、分辨率和拼接伪影。校准过程的效率因此能够被改善。
在范例中，校准载片10被永久地安装在荧光显微镜42上。
换言之，校准载片可以被集成在荧光显微镜42中。这可以在一定时间内确保非常高的质量。
图8示出了用于校准荧光显微镜的方法200，其中，所述荧光显微镜包括被布置在光学路径中的光源和光探测器。
方法200包括以下步骤：
-在第一步骤210(也被称为步骤a))中，校准载片被定位在光学路径中，并且利用从光源朝向光探测器的光进行照射。所述校准载片包括基底和像素布局，所述像素布局包括被布置在基底的表面上的多个间隔开的金属纳米结构，其中，所述金属纳米结构被布置成产生等离子体共振。照射所述校准载片的光产生允许激发波长处的吸收光产生光致发光和/或荧光以生成荧光图像的等离子体共振，所述荧光图像包括被提供用于校准荧光显微镜的多个像素强度值。
-在第二步骤220(也被称为步骤b))中，所述荧光图像的荧光图像数据被采集作为校准测试数据。
-在第三步骤230(也被称为步骤c))中，所述校准测试数据用于荧光显微镜的校准目的。
在范例中，如在图5中的选项，方法步骤c)还包括以下子步骤：
-在第一子步骤232(也被称为子步骤c1))中，提供了预定标准校准数据。
-在第二子步骤234(也被称为子步骤c2))中，所采集的校准测试数据与所述预定标准校准数据进行比较以生成强度校正曲线。
-在第三子步骤236(也被称为子步骤c3))中，所述强度校正曲线被用于校准利用荧光显微镜获得的荧光病理学样本的荧光图像数据。
图9示出了另外的选项，其中，除了像素布局之外，至少一个布局被提供在校准载片的表面上，所述至少一个布局选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标。
所述方法还包括以下步骤：
-在第四步骤240(也被称为步骤d))中，至少一个布局的图像数据被采集作为另外的校准测试数据。
-在第五步骤250(也被称为步骤e))中，提供了至少一个布局的另外的预定标准校准数据。
-在第六步骤260(也被称为步骤f))中，所采集的另外的校准测试数据与所存储的另外的预定标准校准数据进行比较，以校准荧光显微镜的参数，其中，所述参数选自包括以下项的组：所述荧光成像***的聚焦质量以及分辨率和拼接伪影。
图10示出了制造具有多个布局的校准载片的方法300，所述多个布局包括像素布局、单层的彩色微珠、以及分辨率和失真测试目标，所述像素布局具有被布置在基底的表面上的多个间隔开的金属纳米结构，所述方法包括以下步骤：
aa)将单层的彩色微珠沉积302沉积在基底上，形成显微镜载片；
bb)将像素布局以及分辨率和失真测试目标沉积304在两个不同的基底上，形成两个盖片；并且
cc)将两个盖片组装306在显微镜载片上以形成校准载片。
所述金属纳米结构可以使用纳米压印光刻和干蚀刻来制备。例如，基底保形压印光刻(SCIL)可以被用于限定连续铝层上的蚀刻掩模(例如硅基溶胶凝胶)，在此之后，该图案使用基于氯化学的各向异性反应离子刻蚀被转移到铝中。
所述分辨率和失真目标可以经由光学光刻工艺来制造。
为了制造单层的彩色微珠，通常需要具有表面上的珠的印刷/散布步骤并且随后洗掉过多珠的特殊化学工艺。
然而，在SCIL或光学光刻之后在相同载片上制作微珠单层是不可能的，因为SCIL破坏化学表面修改。在微珠之后制作SCIL也是不可能的，因为UV步骤破坏微珠结合到表面，并且表面修改使铝沉积不可能。在SCIL之后的光学光刻也是不可能的，因为SCIL蚀刻破坏利用光学光刻制作的特征。
尽管每个目标(像素布局、彩色微珠以及分辨率和失真测试目标)经由非常困难的工艺来产生并且这些工艺不与彼此相兼容，但是这些目标仍然能够通过将其制造在不同基底上而被组合在单个校准载片中。
必须指出，已经参考不同的主题对本发明的实施例进行了描述。具体地，参考方法型权利要求对一些实施例进行了描述，而参考装置型的权利要求对其他实施例进行了描述。然而，除非另有说明，本领域技术人员将从以上和以下的描述中推断出，除了属于一种类型的主题的特征的任意组合之外，涉及不同主题的特征之间的任意组合也被认为在本申请中公开。然而，所有的特征都能够被组合来提供多于特征的简单加合的协同效应。
尽管已经在附图和前面的描述中详细图示和描述了本发明，但是这样的图示和描述应当被认为是图示性或示范性的，而非限制性的。本发明不限于所公开的实施例。本领域技术人员通过研究附图、公开内容以及权利要求，在实践请求保护的发明时能够理解和实现对所公开的实施例的其他变型。
在权利要求书中，“包括”一词不排除其他元件或步骤，并且词语“一”或“一个”不排除多个。单个处理器或其他单元可以实现在权利要求中所记载的若干项的功能。尽管在互不相同的从属权利要求中记载的特定措施，但是这并不指示不能有效地使用这些措施的组合。权利要求中的任何附图标记都不应当被解释为对范围的限制。
Claims (16)
1.一种用于荧光显微镜的校准载片(10)，包括：
-基底(12)；以及
-像素布局(14)，其包括被布置在所述基底的表面(18)上的多个间隔开的金属纳米结构(16)；
其中，所述金属纳米结构被布置成产生等离子体共振，所述等离子体共振允许激发波长处的吸收光(20)产生光致发光和/或荧光(22)以生成荧光图像；并且
其中，所述荧光图像包括被提供用于荧光显微镜的校准的多个像素强度值。
2.根据权利要求1所述的校准载片，其中，所述基底是光学透明的。
3.根据权利要求1或2所述的校准载片，其中，所述金属纳米结构被布置成彼此耦合。
4.根据前述权利要求中的一项所述的校准载片，其中，所述像素布局包括至少两个像素子布局(36)，其中，所述至少两个像素子布局被配置成在明光照射下生成不同的颜色。
5.根据前述权利要求中的一项所述的校准载片，其中，所述金属纳米结构包括选自包括以下项的组的金属：金、银、铜和铝；
其中，优选地，所述金属是铝或铝合金。
6.根据前述权利要求中的一项所述的校准载片，其中，每个金属纳米结构具有在30nm至700nm、优选60nm至450nm的范围内的截面尺寸(28)；
其中，每个金属纳米结构具有在10nm至1μm、优选25nm至150nm的范围内的厚度(30)；和/或
其中，相邻金属纳米结构之间的距离(32)与在100nm至1μm、优选180nm至650nm的范围内的可见光波长相当。
7.根据前述权利要求中的一项所述的校准载片，其中，除了所述像素布局之外，至少一个布局被提供在所述校准载片的所述表面上，所述至少一个布局选自包括以下项的组：
-单层的彩色微珠；
-分辨率和失真测试目标；以及
-无机磷光体层。
8.一种校准***(100)，包括：
-荧光显微镜(42)；以及
-根据前述权利要求中的一项所述的校准载片；
其中，所述荧光显微镜包括：
-光源(44)；
-光探测器(48)；
其中，所述光源和所述光探测器被布置在光学路径中；
其中，在校准中，所述光源被配置成提供要被定位在所述光学路径中的所述校准载片的所述金属纳米结构吸收的在激发波长处的光，以产生光致发光和/或荧光；并且
其中，所述光探测器被配置成探测所产生的光致发光和/或荧光，以采集荧光图像数据作为用于校准目的的校准测试数据。
9.根据权利要求8所述的***，其中，所述校准***还被提供有校准设备(58)，所述校准设备包括：
-存储单元(60)；以及
-处理单元(62)；
其中，所述存储单元被配置成存储至少一个荧光通道的预定标准校准数据；
其中，所述处理单元被配置成将所采集的校准测试数据与所存储的预定标准校准数据进行比较，以生成所述至少一个荧光通道的强度校正曲线；并且
其中，所述强度校正曲线被提供用于针对所述至少一个荧光通道而校正利用所述荧光显微镜获得的荧光病理学样本的荧光图像数据。
10.根据权利要求8或9所述的***，其中，除了所述像素布局之外，至少一个布局被提供在所述校准载片的所述表面上，所述至少一个布局选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标；
其中，所述光探测器被配置成采集所述至少一个布局的图像数据作为另外的校准测试数据；
其中，所述存储单元被配置成存储所述至少一个布局的另外的预定标准校准数据；
其中，所述处理单元被配置成将所采集的另外的校准测试数据与所存储的另外的预定标准校准数据进行比较，以校准所述荧光显微镜的参数；并且
其中，所述参数选自包括以下项的组：
-所述荧光显微镜的聚焦质量；以及
-分辨率和拼接伪影。
11.根据权利要求8至10中的任一项所述的***，其中，所述荧光显微镜是落射荧光显微镜。
12.根据权利要求8至11中的任一项所述的***，其中，所述校准载片被永久地安装在所述荧光显微镜上。
13.一种用于校准包括光源和光探测器的荧光显微镜的方法(200)，所述光源和所述光探测器被布置在光学路径中，所述方法包括以下步骤：
a)利用从所述光源朝向所述光探测器的光来照射(210)被定位在所述光学路径中的校准载片；
其中，所述校准载片包括基底和像素布局，所述像素布局包括被布置在所述基底的表面上的多个间隔开的金属纳米结构，其中，所述金属纳米结构被布置成产生等离子体共振；并且
其中，照射所述校准载片的所述光产生等离子体共振，所述等离子体共振允许激发波长处的吸收光产生光致发光和/或荧光以生成荧光图像，所述荧光图像包括被提供用于所述荧光显微镜的校准的多个像素强度值；
b)采集(220)所述荧光图像的荧光图像数据作为校准测试数据；并且
c)使用(230)所述校准测试数据用于所述荧光显微镜的校准目的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法的步骤c)还包括以下子步骤：
c1)提供(232)预定标准校准数据；
c2)将所采集的校准测试数据与所述预定标准校准数据进行比较(234)，以生成强度校正曲线；并且
c3)使用(236)所述强度校正曲线来校准利用所述荧光显微镜获得的荧光病理学样本的荧光图像数据。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，除了所述像素布局之外，至少一个布局被提供在所述校准载片的所述表面上，所述至少一个布局选自包括以下项的组：单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标；并且
其中，所述方法还包括以下步骤：
d)采集(240)所述至少一个布局的图像数据作为另外的校准测试数据；
e)提供(250)所述至少一个布局的另外的预定标准校准数据；并且
f)将所采集的另外的校准测试数据与所存储的另外的预定标准校准数据进行比较(260)，以校准所述荧光显微镜的参数；
其中，所述参数选自包括以下项的组：
-所述荧光显微镜的聚焦质量；以及
-分辨率和拼接伪影。
16.一种制造具有多个布局的荧光校准载片的方法(300)，所述多个布局包括像素布局、单层的彩色微珠以及分辨率和失真测试目标，所述像素布局具有被布置在所述基底的表面上的多个间隔开的金属纳米结构，所述方法包括以下步骤：
aa)将单层的彩色微珠沉积(302)在基底上，形成显微镜载片；
bb)将像素布局以及分辨率和失真测试目标沉积(304)在两个不同的基底上，形成两个盖片；并且
cc)将两个盖片(306)组装在所述显微镜载片上，以形成校准载片。
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