CN108431217A - 用于产生脂肪酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生亲本脂肪酶的脂肪酶变体制剂的方法，该方法包括改变编码亲本脂肪酶的多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。本发明还涉及编码该脂肪酶变体的多核苷酸、脂肪酶变体及其用途。

Description

用于产生脂肪酶的方法

序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及脂肪酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。

背景技术

脂肪酶是重要的生物催化剂，其已经示出对于不同应用是有用的。脂肪酶已经被用于去除脂质污渍并且已经被添加至不同组合物中。当前清洁和/或织物护理组合物包含许多活性成分，这些活性成分干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力，并且特别地在这样的组合物中脂肪酶的稳定性任然是一项挑战。需要可以在用于清洁的组合物的严苛环境中起作用的脂肪酶。

发明内容

多年来，脂肪酶一直被成功地用于各种应用中。然而，可以在清洁组合物中使用的有效的脂肪酶的选择仍然是相当有限的。人们一直努力试图通过修饰脂肪酶来获得有改变的特征比如活性、稳定性等的变体从而提供与清洁组合物中的成分有更好的相容性的脂肪酶。到目前为止，要提供不仅能在清洁组合物的严苛的环境中生存，同时又能表现出洗涤性能的脂肪酶仍然是一项挑战。

本发明涉及用于产生具有增加的稳定性的脂肪酶制剂的方法，该脂肪酶制剂在与活化剂接触时可以被活化或重新活化，由此重新获得该脂肪酶制剂的水解活性，该活性是提供洗涤效果的基础。

本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生和使用这些变体的方法。

根据本发明，提供了用于产生亲本脂肪酶的脂肪酶变体制剂的方法，该方法包括改变编码亲本脂肪酶的多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。

根据本发明，提供了一种用于获得亲本脂肪酶的脂肪酶变体的方法，该方法包括向亲本脂肪酶引入在该亲本脂肪酶一个或多个位置处的改变，其中在一个或多个位置处的该改变提供了至少一个二硫键，并且其中当根据实例3确定水解活性时，如与该亲本脂肪酶的水解活性相比，该脂肪酶变体的水解活性降低。

优选地，该脂肪酶变体具有前肽和成熟部分，其中改变一个或多个核苷酸的步骤形成含有半胱氨酸残基的前肽和/或成熟部分。

便利地，改变一个或多个核苷酸的步骤形成含有两个半胱氨酸残基的前肽和/或成熟部分。

有利地，该亲本脂肪酶是接合菌脂肪酶和/或与SEQ ID NO:2具有至少50％序列一致性。

优选地，该亲本脂肪酶是具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQID NO:16的氨基酸序列的接合菌脂肪酶。

便利地，改变一个或多个核苷酸的步骤包括在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

有利地，改变一个或多个核苷酸的步骤包括在对应于位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24的一个或多个位置处的取代，并且包括在对应于SEQ IDNO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246和249的一个或多个位置处的取代。

优选地，改变一个或多个核苷酸的步骤包括在对应于选自SEQ ID NO:2的L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和M-31C/V249C的位置的一个或多个残基处的取代。

优选用于获得亲本脂肪酶的脂肪酶变体的方法，该方法包括向亲本脂肪酶引入在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246和249的一个或多个位置处的取代，其中该取代提供了至少一个二硫键，并且其中当根据实例3测量时，如与该亲本脂肪酶的水解活性相比，所述脂肪酶变体的水解活性降低。

优选地，改变选自一个或多个以下的取代，这些取代选自L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、S-24C/G104C、P-46C/N186C、S-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和S-31C/V249C，其中该位置对应于SEQ ID NO:2的位置。

根据本发明，提供了由本发明的方法获得的脂肪酶变体。

根据本发明，提供了编码亲本脂肪酶的脂肪酶变体的多核苷酸，该多核苷酸包含在一个或多个核苷酸上的改变，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。

根据本发明，提供了由本发明的方法可获得的多核苷酸。

根据本发明，提供了包含本发明的多核苷酸的核酸构建体。

根据本发明，提供了包含任何本发明的多核苷酸的表达载体。

根据本发明，提供了包含本发明的多核苷酸的宿主细胞。

根据本发明，提供了用于从本发明的多核苷酸产生脂肪酶的方法，该方法包括：(a)适合于表达脂肪酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该脂肪酶变体。

根据本发明，提供了根据本发明的前述方法制备的脂肪酶变体。

根据本发明，提供了亲本脂肪酶的脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含在一个或多个核苷酸上的改变，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。

优选地，脂肪酶变体包含在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

便利地，该脂肪酶变体包含在对应于-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、和-24的一个或多个位置处的取代，并且包含在对应于SEQ ID NO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

有利地，该脂肪酶变体包含在对应于选自SEQ ID NO:2的L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和M-31C/V249C的位置的一个或多个残基处的取代。

优选地，所述脂肪酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16具有至少50％序列一致性。

优选地，该脂肪酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16具有至少50％序列一致性，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。

根据本发明，提供了包含任何本发明的脂肪酶变体的组合物。

优选地，本发明的组合物被配制为规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个隔室的袋；单个或多个隔室单位剂型；或其任何组合。

便利地，本发明的组合物进一步包含活化剂。

有利地，该活化剂是蛋白酶和/或还原剂。

根据本发明，提供了清洁的方法，该方法包括用本发明的组合物接触表面或物品。

根据本发明，提供了用于增加任何本发明的脂肪酶变体的水解活性的方法，该方法包括使所述脂肪酶变体与活化剂接触的步骤。

具体实施方式

定义

脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC3.1.1类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一方面，本发明的这些变体具有至少20％，例如，至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16的多肽的脂肪酶活性。

脂肪酶底物：术语“脂肪酶底物”可以是经受如以上所定义的脂肪酶的活性的任何底物。

织物：如在此使用的术语“织物”是指用于如所描述的本发明目的的任何适合的织物、纺织品和/或亚麻布。

洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶降解和/或去除存在于待清洁的织物上的脂质或含脂质污渍的能力。洗涤性能可以通过计算在以下方法部分中定义的Δ反射指数(delta remission index)值来定量。洗涤性能可以在如所描述的所有类型的适合织物上测量，所述织物包括在衣物洗涤、和工业清洁及机构清洁中使用的任何织物。

活化剂：术语“活化剂”意指例如通过破坏二硫键和/或降解前肽可以活化或再活化本发明的脂肪酶的任何试剂或底物。活化剂包括(1)降解前肽的酶，例如像具有内肽酶活性、外肽酶活性、氨基肽酶活性、羧肽酶活性、蛋白酶活性等的酶；和(2)破坏半胱氨酸桥(cys-桥、C-C桥)的还原剂，例如像三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(β-ME)、三(3-羟丙基)膦(THPP)和亚硫酸盐(如亚硫酸钠)。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异通过突变天然产生，并且可能导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

二硫键：术语“二硫键(“disulfide bond”，“disulfide link”)、“二硫桥”、“半胱氨酸键(“cysteine bond”，“cysteine link”)、“半胱氨酸桥”、“S-S键(“S-S bond”，“S-Slink”)、“S-S桥”旨在具有相同的含义，意指在两个半胱氨酸氨基酸残基的硫醇之间的键。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该DNA分子包含一种的多核苷酸，该的多核苷酸编码变体并且有效地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段含有SEQ ID NO:3的氨基酸1至269的数目或SEQ ID NO:7的氨基酸1至269的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％，但是小于100％。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与亲本相比改进的变体相关的特征。这样的改进的特性包括但不限于：稳定性，例如像热稳定性、洗涤剂中的热稳定性、洗涤剂中的稳定性、储存稳定性；活性，例如像增加或降低(即改变的)水解活性，洗涤剂中改变的水解活性；被活化的能力；被重新活化的能力；底物比活性；污渍去除，例如像脂质污渍去除；以及洗涤性能。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其天然相关的一种或多种或所有天然存在的组分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至269，其与SEQ ID NO:3的氨基酸1至269相同。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至269，其与SEQ ID NO:7的氨基酸1至269一致。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。因此，在一方面，该成熟多肽可以开始于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的氨基酸1、2、3、4或5。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸295至930。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸67至873。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接的：术语“可操作地连接的”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。

亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指进行改变以产生本发明的酶变体的脂肪酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如EMBOSS程序包的Needle程序中所执行的(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：

(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列含有SEQ ID NO:1的核苷酸295至930或SEQ ID NO:5的核苷酸67至873的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％，但是小于100％。

变体：术语“变体”或“脂肪酶变体”意指具有脂肪酶活性的多肽，与源自其的亲本脂肪酶相比，该多肽包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的改变(即，取代、***、和/或缺失)。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且***意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的这些变体具有至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或100％的亲本脂肪酶的脂肪酶活性。在一些方面，该亲本脂肪酶是SEQ IDNO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；或SEQ ID NO:16。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的脂肪酶。

变体命名规则

出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中披露的多肽来确定另一种脂肪酶中的相应的氨基酸残基。还可以将SEQ ID NO 2中披露的多肽用作参照序列，用于对其他多肽中相应位置进行编号。负号“-“可以用在氨基酸的位置数之前，表示在SEQ IDNO 2的前肽-94至-1中做出的变化。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与例如SEQ ID NO 2、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:7进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选版本5.0.0或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO 2、SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:7中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种脂肪酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar，2004，Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他酶与SEQ ID NO 2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:7的多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,ProteinEngineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单字母和三字母的氨基酸缩写。

取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”表示在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

在本发明的上下文中。有待改变(例如被取代)的这些氨基酸用SEQ ID NO 2中存在的氨基酸来指示(例如A-47C)。对于技术人员清楚的是本发明不限于SEQ ID NO 2的变体，即SEQ ID NO 2作为亲本脂肪酶。当其他脂肪酶被修饰时，“起始”氨基酸可能不同。这还可以用X表示，例如X-47C。

缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

***.对于氨基酸***，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。将多个氨基酸的***表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***氨基酸#1、***氨基酸#2等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所***的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所***的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变.在可以在某一位置引入不同的改变的情况下，所述不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指定以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

变体

本发明涉及亲本脂肪酶的脂肪酶变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少75％，但小于100％序列一致性，并且包含在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

位置数之前的负号“-”(例如-57)表示在对应于前肽区域中的位置的位置中做出的改变，例如在SEQ ID NO 2的前肽区域中(即，SEQ ID NO 2的-94至-1)。这些改变不限于在SEQ ID NO 2中做出的改变，如以上在“变体命名规则”中的描述将该序列用于编号。

本发明涉及亲本脂肪酶的脂肪酶变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少75％，但小于100％序列一致性，并且包含在对应于位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、和-24的被称为前肽的区域中的一个或多个位置处的取代，并且包含在对应于SEQ ID NO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的被称为成熟蛋白质的区域中的一个或多个位置处的取代。

本发明还涉及变体，其中该变体包含选自以下的SEQ ID NO:2的残基处的取代：L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和M-31C/V249C。

在一些方面，本发明涉及选自下组的变体，该组由以下组成：(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％序列一致性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交；(c)由以下多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸与SEQ ID NO:3的多肽编码序列具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但是小于100％序列一致性；和(d)SEQ ID NO:3的多肽片段，其中该片段具有脂肪酶活性。

在一些方面，本发明涉及变体，其与亲本脂肪酶的氨基酸序列具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但是小于100％序列一致性。

在一些方面，本发明涉及变体，其与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但是小于100％序列一致性。

在一些方面，本发明涉及变体，其与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但是小于100％序列一致性。

在一些方面，本发明涉及变体，其中本发明的变体中的取代的数量是1-40个，例如1-30、1-20、1-10和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个取代。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含被C取代的氨基酸，或由其组成。在另一方面，该变体包含被C取代的SEQ ID NO:2的氨基酸，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含被C取代的1个氨基酸，或由其组成。在另一方面，该变体包含被C取代的SEQ ID NO:2的1个氨基酸，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含被C取代的2个氨基酸，或由其组成。在另一方面，该变体包含被C取代的SEQ ID NO:2的2个氨基酸，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置A-24的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置A-24的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代A-24C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置S-24的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置S-24的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代S-24C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置M-31的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置M-31的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代M-31C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置S-31的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置S-31的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代S-31C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置A-33的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置A-33的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代A-33C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置E-36的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置E-36的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代E-36C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置P-37的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置P-37的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代P-37C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置D-38的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置D-38的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代D-38C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置T-40的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置T-40的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代T-40C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置A-43的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置A-43的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代A-43C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置S-43的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置S-43的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代S-43C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置P-46的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置P-46的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代P-46C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置A-47的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置A-47的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代A-47C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置L-54的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置L-54的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代L-54C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置L-57的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置L-57的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代L-57C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置P101的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置P101的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代P101C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置V102的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置V102的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代V102C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置G104的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置G104的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代G104C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置N120的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置N120的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代N120C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置P182的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置P182的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代P182C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置N186的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置N186的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代N186C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置A212的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置A212的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代A212C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置L216的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置L216的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代L216C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置L239的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置L239的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代L239C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置E240的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置E240的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代E240C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置N246的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置N246的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代N246C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，该变体包含在对应于位置V249的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置V249的位置处的该氨基酸被C取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的取代V249C，或由其组成。

在一些方面，本发明涉及变体，其中该变体相对于亲本具有测量为大于1.0的改进因子(IF)的一个或多个(例如，若干个)改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下组成：热稳定性；在洗涤剂中的热稳定性；在洗涤剂中的水解活性；在洗涤剂中的稳定性。优选地，该改进的特性是在洗涤剂中的水解活性。在活化之前，本发明的脂肪酶变体如与其亲本脂肪酶相比具有较低的水解活性。当二硫键被破坏和/或前肽被降解时，本发明的脂肪酶变体的水解活性增加。使用实例5或实例3中列出的测定，通过在0,2MHEPES缓冲液(pH 8,5)中用1.35％(w/v)Savinase孵育储存的洗涤剂/蛋白质样品持续15分钟，测量4-甲基伞形酮(4-MU)的释放，可以确定水解活性。

在一些方面，本发明涉及变体，其中该改进因子(IF)在选自下组的至少一种测定中大于1.0，该组由以下组成：如在PCT/EP 2015/061509中描述的A热稳定性测定；B在洗涤剂中的热稳定性测定；C性能筛选测定；和D在洗涤剂中的稳定性测定。在一些方面，本发明涉及变体，其中该改进因子(IF)在至少两种、至少三种、或至少四种测定中大于1.0。

在一些方面，本发明涉及变体，其中该改进因子(IF)是至少1.1；1.2；1.3；1.4；1.5；1.6；1.7；1.8；1.9；2.0；2.1；2.3；2.4；或2.5。

在一些方面，本发明涉及变体，其中该变体具有脂肪酶活性，并且包含在对应于SEQ ID NO:2或多肽的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％一致性，并且如与亲本相比具有在洗涤剂中改进的稳定性(即，IF>1.0)。可以通过如实例5中所述的洗涤剂稳定性测定或水解活性测定来对改进的特性进行测量。

在一些方面，本发明涉及变体，其中该变体具有脂肪酶活性，并且包含在对应于位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、和-24(前肽)的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，和在对应于SEQID NO:2或多肽的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249(成熟蛋白质)的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％一致性，并且如与亲本相比具有在洗涤剂中改进的稳定性(即，IF>1.0)。可以通过如实例5中所述的洗涤剂稳定性测定或水解活性测定来对改进的特性进行测量。

这些变体可以进一步在一个或多个(例如，若干个)其他位置处包含一个或多个另外的取代。

这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins[蛋白质]，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸变化具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸变化可改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

例如，这些变体可进一步包含对应于以下的一个或多个位置处的取代：SEQ IDNO:3的A8T、Y28LC、I41T、C43S、D48E、K50E、Y60AC、D61NKRAVLSTC、R80C、S84C、I86C、N87C、A90C、D91NKRAVLST、F94LTK、S98P、S103R、D113NKRAVLST、S114C、G116V、N120KD、K131F、G156D、N186Y、E201QKRAVLST、I204VATSG、V205IL、L208VATSG、F213VATSG、H217N、D226NKRAVLST、T236A、T241S、D243NKRAVLSTH、V254IATSG、L255VATSG、D256NKRAVLST、L258VATSG、Y260WCGV、L267VATSG。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

亲本脂肪酶

该亲本脂肪酶可以是腐质酶家族或接合菌家族的脂肪酶。该腐质酶家族包含来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)菌株DSM 4109的脂肪酶以及与所述脂肪酶具有高于50％同源性的脂肪酶。来自疏棉状腐质霉(同义词疏棉状

嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶，TlL)的脂肪酶具有示于SEQ IDNO:6中的氨基酸序列。该家族还包括：来自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberlii)(P25234)的脂肪酶、来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(EP 130064、WO 98/26057)的脂肪酶、来自异孢镰刀菌(F.heterosporum)(R87979)的脂肪酶、来自米曲霉(A.oryzae)(085895)的脂肪酶、来自黑曲霉(A.niger)(Y09330)的脂肪酶、来自塔宾曲霉(A.tubingensis)(Y09331)的脂肪酶、来自塔宾曲霉(A.tubingensis)(WO 98/45453)的脂肪酶、具有等电点为6.9和表观分子量为30kDa的来自茄类镰刀菌(F.solanii)的脂肪酶(WO96/18729)。该接合菌家族包含与米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶(SEQ ID NO:3)具有至少50％同源性的脂肪酶。该家族还包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16的脂肪酶，以及在WO 96/13578和WO 97/27276中所述来自反射犁头霉(Absidia reflexa)、孢囊犁头霉(A.sporophora)、伞房犁头霉(A.corymbifera)、布氏犁头霉(A.blakesleeana)、格力斯犁头霉(A.griseola)的脂肪酶。

该亲本脂肪酶可以是(a)与SEQ ID NO:3具有至少75％序列一致性的多肽；(b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交；(c)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75％序列一致性，(d)与SEQ ID NO:7具有至少75％序列一致性的多肽；(b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交；或(e)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少75％序列一致性。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:3具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，该多肽具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相差多达40个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:7具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:10相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:11相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:12相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:13相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:14相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:15相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，该亲本具有脂肪酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:16相差多达40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。

在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至269，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:3，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:3的氨基酸1至269，或由其组成。

在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:6的成熟多肽，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:6的氨基酸1至269，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:7，或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:7的氨基酸1至269，或由其组成。

在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:3的多肽的片段。在一方面，片段含有SEQ IDNO:3的氨基酸1至269的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但是小于100％。

在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:7的多肽的片段。在一方面，片段含有SEQ IDNO:7的氨基酸1至269的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但是小于100％。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:3的等位基因变体。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:7的等位基因变体。

在另一方面，该亲本是由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交(Sambrook等人，1989，MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，冷泉港，纽约)。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段、SEQ ID NO:5的多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO:6的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。可以使用DNA和RNA探针两者。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以筛选由这样的其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列或与SEQ IDNO:5或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列；(v)SEQ ID NO:5；(vi)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列；(vii)其全长互补体；或(viii)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸292至1098。在另一方面，该核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:5的核苷酸67至873。在另一方面，该核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:6的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:5。

在另一个实施例中，该亲本由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于一个或多个相同启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，在该内含肽技术中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割而释放所述两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure、Function、and Genetics[蛋白质：结构、功能与遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。

该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从……中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经***来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是丝状真菌脂肪酶，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属脂肪酶。

在另一方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉尤其是疏棉状嗜热丝孢菌、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、成层梭孢壳菌、白毛梭孢壳、澳洲梭孢壳、粪梭孢壳、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、秘鲁梭孢壳、毛梭孢壳、瘤孢梭孢壳、耐热梭孢壳、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉脂肪酶。

在另一方面，该亲本是接合菌脂肪酶，例如，犁头霉属物种的脂肪酶，例如SEQ IDNO:8的脂肪酶；小孢根霉华变种(Rhizopus microsporus var.chinensis)，例如SEQ IDNO:9的脂肪酶；闪光须霉(Phycomyces nitens)，例如SEQ ID NO:10的脂肪酶；卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，例如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的脂肪酶；雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)，例如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的脂肪酶；五通桥毛霉(Mucorwutungkiao)，例如SEQ ID NO:15的脂肪酶；或米根霉(Rhizopus oryzae)，例如SEQID NO:16的脂肪酶。

在另一方面，该亲本是米黑根毛霉脂肪酶(RmL)，例如SEQ ID NO:2的脂肪酶或其与SEQ ID NO:3一致的成熟多肽。

在另一方面，该亲本是疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TlL)，例如，SEQ ID NO:6的脂肪酶或其与SEQ ID NO:7一致的成熟多肽。

应理解的是对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等效物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,NorthernRegional Research Center,NRRL)。

可以使用上文提及的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得脂肪酶变体和/或其片段的方法，这些方法包括向亲本脂肪酶引入在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代，其中该变体和/或片段具有脂肪酶活性；并且回收该变体和/或片段。

本发明还涉及用于获得脂肪酶变体和/或其片段的方法，这些方法包括向亲本脂肪酶引入在对应于位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、和-24的一个或多个位置处的取代，并且包括在对应于SEQ ID NO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

在一些方面，本发明涉及用于获得脂肪酶变体和/或其片段的方法，这些方法包括向亲本脂肪酶引入在对应于-24C、-31C、-33C、-36C、-37C、-38C、-40C、-43C、-46C、-47C、-54C、和-57C的一个或多个位置处的取代，并且包括在对应于SEQ ID NO:2的位置101C、102C、104C、120C、182C、186C、212C、216C、239C、240C、246C、和249C的一个或多个位置处的取代，其中该变体和/或片段具有脂肪酶活性；并且回收该变体和/或片段。

在一些方面，本发明涉及用于获得脂肪酶变体和/或其片段的方法，这些方法包括向亲本脂肪酶引入选自以下的SEQ ID NO:2的残基处的取代：L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和M-31C/V249C，其中该变体和/或片段具有脂肪酶活性；并且回收该变体和/或片段。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许该质粒的粘性末端以及***片段彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis，1979，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报])76:4949-4955；和Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人，2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人，1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在许多可以用于制备变体的可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004，Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或***并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸***载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在本领域是熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例为从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”中；和在Sambrook等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替代未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由Romanos等人，1992(见上文)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导序列，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被有效地连接至该变体编码序列的3’-末端，并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节***的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵子***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核***中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在这样的位点处***或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中来表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，这样使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒一起含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

载体优选地含有一个或多个选择性标志物，所述标志物容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标志物是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。

细菌选择性标志物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标志物。用于酵母宿主细胞的适合的标志物包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。这些整合元件可为与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可为非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可进一步包含使该载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸***宿主细胞中以增加变体的产生。可以通过将序列的至少一个另外的拷贝整合入宿主细胞基因组中或通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因来获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等人，2004,Folia Microbiol.[叶线形微生物学](布拉格)49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等人，2006,J.Microbiol.Methods[应用与环境微生物学]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)，原生质体转化(参见，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝***孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义的，在：Ainsworth andBisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥，英国)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)中所描述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474、以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156、以及WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，所述方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在适合营养培养基中发生，所述培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可以从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性，可以是以下实例中所述的测定。

该变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从该营养介质中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。

组合物

在一方面，本发明涉及包含亲本脂肪酶的脂肪酶变体的组合物，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少75％，但小于100％序列一致性，并且包含在对应于SEQ IDNO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

在一方面，本发明涉及包含亲本脂肪酶的脂肪酶变体的组合物，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少75％，但小于100％序列一致性，并且包含在对应于位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、和-24(前肽)的一个或多个位置处的取代，并且包含在对应于SEQ ID NO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249(成熟蛋白质)的一个或多个位置处的取代。

在另一方面，本发明涉及包含亲本脂肪酶的脂肪酶变体的组合物，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少75％，但小于100％序列一致性，并且包含在对应于-24C、-31C、-33C、-36C、-37C、-38C、-40C、-43C、-46C、-47C、-54C、和-57C的一个或多个位置处的取代，并且包含在对应于SEQ ID NO:2的101C、102C、104C、120C、182C、186C、212C、216C、239C、240C、246C、和249C一个或多个位置处的取代。

洗涤剂

在一些方面,本发明涉及包括根据该方法制备的脂肪酶的组合物。

在一些方面，本发明涉及组合物，该组合物被配制为规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个室的袋；单个或多个室单位剂型；或其任何组合。

在一些方面，本发明涉及进一步包含活化剂的组合物。在一些方面，该活化剂是还原剂和/或蛋白质降解剂。在一些方面，该还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(β-ME)、三(3-羟丙基)膦(THPP)、亚硫酸盐(如亚硫酸钠)等。在一些方面，该蛋白质降解剂是具有内肽酶活性、外肽酶活性、氨基肽酶活性、羧肽酶活性、蛋白酶活性等的酶。

在一些方面，本发明涉及组合物，其中通过使所述脂肪酶变体与活化剂接触来增加脂肪酶变体的活性。

下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于这些组合物中，并且在此的方法可以合宜地并入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料等一起的情况下修饰该组合物的美感。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了前述引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包含另外的功能性。

除非另外指出，以百分比计的量是按该组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送***、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露，此类其他组分的适合实例以及使用水平发现于US 5576282、US 6306812、和US 6326348中，通过引用将这些文献结合在此。

因此，在某些实施例中，本发明不含有以下辅助材料中的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送***、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以是如下文详述地存在的：

表面活性剂-根据本发明的组合物可以包含表面活性剂或表面活性剂***，其中该表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0,2wt％到40wt％、从0,5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％或从20wt％至25wt％的水平存在。

适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。

适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为C_10-13烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(LAS)可以通过将可商购获得的直链烷基苯(LAB)磺化来获得；适合的LAB包括低2-苯基LAB，例如或其他适合的LAB包括高2-苯基LAB，例如适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成途径(诸如HF)也可以是适合的。在一方面，使用LAS的镁盐。

适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面，为C_8-18烷基硫酸盐，或主要为C₁₂烷基硫酸盐。

另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在另一方面为C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。

烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。

去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是C_1-4烷基基团，典型地为甲基和/或乙基基团。

阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

适合的非离子去污表面活性剂选自下组，该组由以下组成：C₈-C₁₈烷基乙氧基化物，如C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物，其中该烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；C₁₂-C₁₈醇和C₆-C₁₂烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如普朗尼克C₁₄-C₂₂中链分支的醇；C₁₄-C₂₂中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。

适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。

在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化醇，例如C_8-18烷基乙氧基化醇，该烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是C_8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子表面活性剂包括

非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。

适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物、及其混合物。

适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R₁)(R₂)(R₃)N⁺X^-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C_6-18烷基或烯基部分，R₁和R₂独立地选自甲基或乙基部分，R₃是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单C_10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C₁₀烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。

阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵盐及其组合。

适合的两性表面活性剂/兼性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子表面活性剂-阴离子表面活性剂以及辅助的阴离子辅助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，如NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子表面活性剂和处于其酸形式的辅助阴离子表面活性剂或辅助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺、或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。

半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物。

包含一种或多种阴离子表面活性剂以及另外一种或多种非离子表面活性剂、并任选地与另外的表面活性剂例如阳离子表面活性剂的混合物的表面活性剂***可以是优选的。优选的阴离子与非离子表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。

皂-在此的组合物可以含有皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，这些组合物含有从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。

在此有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂、及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。

在一个实施例中，该皂选自自由脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。

用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci₂-Ci₄脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci₈脂肪酸、及其混合物。

当存在时，织物软化阳离子辅助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。

在此的皂和非皂阴离子表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子表面活性剂和皂。

助水溶剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助水溶剂。助水溶剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，助水溶剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。助水溶物并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多助水溶剂改变了含有极性和非极性特征的物质的***(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。助水溶剂常规在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。

洗涤剂可以含有从0至10wt％，如从0至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂***或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包含从0至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。该组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。

助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合试剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2',2”-次氮基三乙醇(TEA)和羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、鳌合试剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。

螯合剂和晶体生长抑制剂-在此的组合物可以含有螯合剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦酰基丁烷1,2,4-三羧酸( AM)及其衍生物。典型地，该组合物可以包含从0.005wt％至15wt％，或从3.0wt％至10wt％的螯合试剂或晶体生长抑制剂。

漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包含多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包含从0至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：

(1)预成形的过酸：适合的预成形的过酸包括但不限于选自下组的化合物，该组由以下组成：预成形的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。预成形的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁴选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁴基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且Y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁴是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有从30℃至60℃范围内的熔点。

预形成的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁵选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁵基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁵是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自下组的那些，该组由以下组成：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入此类组合物中作为可以被涂覆的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(3)术语漂白活化剂在此意指经由过水解作用与过氧化氢反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。在此将使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当该漂白活化剂是疏水的时，具有从6个至14个碳原子或从8个至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS))、和/或披露于WO98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有以下优点：它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白***可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白***还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可以使用任何适合的漂白活化剂，但是在本发明的一方面，本主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，这样使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。

(4)二酰基过氧化物-优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R¹-C(O)-OO-(O)C-R²，其中R¹表示C₆-C₁₈烷基，优选地是含有具有至少5个碳原子的直链并且任选地含有一个或多个取代基(例如-N⁺(CH₃)₃、-COOH或-CN)和/或在烷基的相邻碳原子之间***的一个或多个中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C₆-C₁₂烷基基团，并且R²表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，这样使得R¹和R²一起含有总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R¹和R²是直链的未取代的C₆-C₁₂烷基链。最优选地，R¹和R²是相同的。二酰基过氧化物(其中R¹和R²均是C₆-C₁₂烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R₁或R₂)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不含有分枝的或下垂的环，或优选在α位或β位都不含有分枝的或下垂的环，或最优选在α位或β位或γ位都不含有分枝的或下垂的环。在一个另外优选的实施例中，DAP可以是不对称的，这样使得R1酰基基团优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基基团的水解缓慢。

四酰基过氧化物漂白种类优选选自具有以下通式的四酰基过氧化物：R³-C(O)-OO-C(O)-(CH₂)n-C(O)-OO-C(O)-R³，其中R³表示C₁-C₉烷基，或C₃-C₇基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。

优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选实施例中，这些漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。

优选地，漂白组分包含漂白催化剂(5和6)。

(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺鎓阳离子和聚离子；亚胺两性离子；改性的胺；改性的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。

适合的亚胺鎓阳离子及聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron[四面体](1992),49(2),423-38所述的进行制备(参见例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360569所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360568所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。

适合的亚胺鎓兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282中所述进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614中所述进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264中所述进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。

适宜的改性胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可依照描述于Tetrahedron Letters[四面体通讯](1987)，28(48)，6061-6064中的方法制备。适合的改性氧化胺氧传递催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧基-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。

适合的N-磺酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于根据Journal of OrganicChemistry[有机化学杂志](1990)，55(4)，1254-61中描述的程序制备的3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物。

适宜的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于，[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可依照描述于Journal ofthe Chemical Society[化学学会杂志]，Chemical Communications[化学通讯](1994)，(22)，2569-70中描述的方法制备。

适合的N-酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据Polish Journal ofChemistry[波兰化学杂志](2003)，77(5)，577-590中描述的程序制得的[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺。

适合的噻二唑二氧化物氧传递催化剂包括但不限于可以根据US5753599(第9栏，实例2)中描述的程序制得的3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物。

适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可依照Tetrahedron Letters[四面体通讯](1994)，35(34)，6329-30中所述的方法制备。

适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。

优选地，所述漂白催化剂包含亚胺离子和/或羰基官能团，并且通常能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包含过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包含环状亚胺离子官能团，优选其中该环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包含芳基亚胺离子官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，该洗涤剂组合物包括具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logP_o/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logP_o/w的方法。

典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的X_SO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定X_SO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在此实例中，X_SO是过氧亚胺正离子漂白种类的X_SO。

优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：n和m独立地是从0至4，优选n和m均是0；每个R¹独立地选自取代的或未取代的选自下组的基团，该组由以下组成：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R¹取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R²独立地选自取代的或未取代的独立地选自下组的基团，该组由以下组成：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R²可以与任何其他的R²结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R²可以合并以形成羰基；并且任何两个R²可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R³是C₁至C₂₀取代的或未取代的烷基；R⁴是氢或Q_t-A部分，其中：Q是分支或未分支的烯烃，t＝0或1，并且A是选自下组的阴离子基团，该组由以下组成：OSO₃ ^-、SO₃ ^-、CO₂ ^-、OCO₂ ^-、OPO₃ ^2-、OPO₃H^-和OPO₂ ^-；R⁵是氢或-CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O]_k-R⁸部分，其中：每个Y独立地选自下组，该组由以下组成：O、S、N-H、或N-R⁸；并且每个R⁸独立地选自下组，该组由以下组成：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自下组，该组由以下组成：CO、SO₂、SO、PO和PO₂；R⁹和R¹⁰独立地选自下组，该组由以下组成：H和C₁-C₄烷基；R¹¹和R¹²独立地选自下组，该组由以下组成：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R⁶是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且X，如果存在的话，是适合的电荷平衡反离子，优选地当R⁴是氢时，X是存在的，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲氧硫酸盐(methosulphate)、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、硼四氟化物以及磷酸盐。

在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：

其中R¹³是含有从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基或含有从一个至24个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³是含有从八个至18个碳原子的支链烷基或含有从八个至十八个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基和异-十五烷基；优选地，R¹³选自下组，该组由以下组成：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。

优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包括过酸源。过酸源可以选自(a)预成形的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，这样使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或2:1至10:1。

(6)含有金属的漂白催化剂-可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的含有金属的漂白催化剂是以下催化***，该催化***包含一种具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，一种具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及一种对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿N-供体配体的配体。

如果希望的话，可以借助锰化合物催化在此的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。

在此有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，像例如US 5597936和US 5595967中传授的程序。

在此的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整在此的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。

即成的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，像例如US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。

(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的这些组合物中使用的优选漂白组分包含过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包含漂白催化剂，优选以上所述的有机漂白催化剂。

特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。

示例性漂白***还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。

织物调色剂-该组合物可以包含织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土轭合物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下组成：属于以下比色指数(C.I.)分类的染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。

在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下组成：比色指数(染工和着色师学会(Society of Dyers and Colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下组成：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下组成：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。

适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下组成：含有轭合色原体的聚合物(染料-聚合物轭合物)以及与色原体共聚合进聚合物主链中的聚合物，及其混合物。

在另一方面，适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下组成：在(美利肯(Milliken))名称之下的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自下组的聚合物形成的染料-聚合物轭合物，该组由以下组成：包含选自由羟基部分、一级胺部分、二级胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。仍在另一方面，适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下组成：紫色CT，与活性蓝、活性紫或活性红染料轭合的羧甲基纤维素(CMC)，如与C.I.反应性蓝19(由麦格酶(Megazyme)，威克洛，爱尔兰，以产品名AZO-CM-CELLULOSE，产品代码S-ACMC下售卖)轭合的CMC、烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂，烷氧基化的噻吩聚合物着色剂、及其混合物。

优选的调色染料包括发现于WO 08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：

其中R₁和R₂可以独立地选自：

a)[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH]

其中R’选自下组，该组由以下组成：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下组成：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

b)R₁＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R₂＝[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH]

其中R’选自下组，该组由以下组成：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下组成：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

c)R₁＝[CH₂CH₂(OR₃)CH₂OR₄]并且R₂＝[CH₂CH₂(O R₃)CH₂OR₄]

其中R₃选自下组，该组由以下组成：H、(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；并且其中z＝0至10；

其中R₄选自下组，该组由以下组成：(C₁-C₁₆)烷基、芳基基团、及其混合物；以及

d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。

本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：

其中R’选自下组，该组由以下组成：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下组成：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。

本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：

典型地包含具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是在结构I中的具有在上文中“部分a”中的以下下垂基团的那些。

表A：

R1

R2

R’

R”

x

y

R’

R”

x

y

A

H

H

3

1

H

H

0

1

B

H

H

2

1

H

H

1

1

c＝b

H

H

1

1

H

H

2

1

d＝a

H

H

0

1

H

H

3

1

使用的另外的增白剂包括描述于US 2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。

适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土、及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组由阳离子/碱性染料和粘土组成，该阳离子/碱性染料选自下组，该组由以下组成：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕色1至23、CI碱性黑1至11，并且该粘土选自下组，该组由以下组成：蒙脱石粘土、水辉石粘土、皂石粘土及其混合物。在又另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组由以下组成：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595轭合物，蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015轭合物，蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555轭合物，蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040轭合物，蒙脱石碱性红R1 C.I.45160轭合物，蒙脱石C.I.碱性黑2轭合物，锂蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595轭合物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015轭合物，锂蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555轭合物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040轭合物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160轭合物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2轭合物，皂石碱性蓝B7 C.I.42595轭合物，皂石碱性蓝B9 C.I.52015轭合物，皂石碱性紫V3 C.I.42555轭合物，皂石碱性绿G1C.I.42040轭合物，皂石碱性红R1 C.I.45160轭合物，皂石C.I.碱性黑2轭合物以及它们的混合物。

适合的颜料包括选自下组的颜料，该组由以下组成：黄士酮、阴丹酮、含有从1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中该酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中该苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解性的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以含有高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子含有高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。

在另一方面，适合的颜料包括选自下组的颜料，该组由以下组成：群青(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)及其混合物。

上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001wt％至0.5wt％、或0.0001wt％至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。

胶囊化物-该组合物可以包含胶囊化物。在一方面，胶囊化物包含一个核心，具有内表面和外表面的包壳，所述包壳封装所述核心。

在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包括一种选自下组的材料，该组由以下组成：香料增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂；在一方面，石蜡；酶；抗菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包含一种选自下组的材料，该组由以下组成：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一方面，所述氨基塑料可以包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一方面，所述聚脲可以包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一方面，所述多糖可以包含藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。

在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含香料。

在所述胶囊化物的一方面，所述包壳可以包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。

在一方面，披露了适合的胶囊化物可以包含核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的85％或90％可以具有从0.2MPa至10MPa、从0.4MPa至5MPa、从0.6MPa至3.5MPa、或从0.7MPa至3MPa的抗断强度；并且具有从0％至30％、从0％至20％、或从0％至5％的有益试剂泄露。

在一方面，所述胶囊化物的85％或90％可以具有从1至80微米、从5至60微米、从10至50微米、或从15至40微米的粒度。

在一方面，所述胶囊化物的85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的颗粒壁厚。

在一方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括一种选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括一种选自下组的材料，该组由以下组成：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油(caster oil)、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油(castoroil)、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。

在一方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，该树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲、及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚、及其混合物。

在一方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆料中的胶囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的胶囊可以通过US 2008/0305982；和/或US 2009/0247449的以下传授来制成。

在一个优选方面，该组合物还可以包含沉积助剂，优选由下组组成，该组包含阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及含有甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或多种选自下组的单体，该组包含丙烯酸和丙烯酰胺。

香料-在一方面，该组合物包含包含选自下组的一种或多种香料原材料的香料，该组由以下组成：1,1’-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二羧酸，二乙酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇，单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酰乙酸，2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)氧]-1-丙醇；十五内酯；α-甲基-苯甲醇酯；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基甲基丁酸，乙酯；苯甲醛；2-甲基甲基丁酸，1-甲基乙酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸，甲基酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊乙酸，甲基酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸，苯基甲基酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α,α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸，苯基甲基酯；环己基丙酸，2-丙烯基酯；己酸，2-丙烯基酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛烷-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸，甲基酯；8-环十六烯-1-酮；甲基紫罗兰酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸，(3Z)-3-己烯酯；2-十三碳烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；乙酰乙酸,(2-甲基丁氧基)-,2-丙烯基酯；苯甲酸,2-羟基-,3-甲基丁基酯；2-丁烯-1-酮，1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-，(Z)-；环戊酸，2-己基-3-氧代-，甲基酯；苯丙醛，4-乙基-.α.,.α.-二甲基-；3-环己烯-1-甲醛，3-(4-羟基-4-甲基戊基)-；乙酮，1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-亚甲基桥薁-5-基)-，[3R-(3.α.,3a.β.,7.β.,8a.α.)]-；十一醛，2-甲基-2H-吡喃-2-酮，6-丁四氢化-；苯丙醛，4-(1,1-二甲基乙基)-.α.-甲基-；2(3H)-呋喃酮，5-庚二氢-；苯甲酸，2-[(7-羟基-3,7-二甲基亚辛基)氨基]-，甲基；苯甲酸，2-羟基-，苯基甲基酯；萘，2-甲氧基-；2-环戊烯-1-酮，2-己基-；2(3H)-呋喃酮，5-己二氢-；环氧乙烷甲酸，3-甲基-3-苯基-，乙基酯；2-氧杂二环[2.2.2]辛烷，1,3,3-三甲基-；苯戊醇，.γ.-甲基-；3-辛醇，3,7-二甲基-；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇，二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-亚甲基桥-1H-茚-6-醇丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-亚甲基桥-5H-茚-5-亚基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；2-羟基-苯甲酸，甲基酯；2-羟基-苯甲酸，己基酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸，戊基酯；2,3-庚二酮；2-己烯-1-醇；6-辛烯-2-醇，2,6-二甲基-；大马酮(α，β，γ或δ或其混合物)，4,7-亚甲基桥-1H-茚-6-醇，3a,4,5,6,7,7a-六氢-，乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；乙酮，1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-；3-环己烯-1-甲醛，3,5-二甲基-；3-环己烯-1-甲醛，2,4-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-，乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)，和环戊酮，2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-和1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。

在一方面，该组合物可以包含胶囊化的香料颗粒，该颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性的聚乙烯醇。在一方面，胶囊化物包含(a)至少部分水溶的固体基质，包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由该固体基质包封的香料油。

在另一方面，该香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。

聚合物-该组合物可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

该组合物可以包含一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。

该组合物可以包含两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，这些聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，这样使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包含一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包含烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。

在此，烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT 90/01815中。化学上地，这些材料包含聚丙烯酸酯，每7-8个丙烯酸脂单位具有一个乙氧基侧链。侧链具有化学式-(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₃，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包含在此的组合物的从0.05wt％至10wt％。

本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他辅助表面活性剂和其他佐剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地该两亲接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一种下垂部分，选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫(BASF)供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。

羧酸酯聚合物-本发明的组合物还包括一种或多种羧酸酯聚合物，如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，该羧酸酯聚合物是具有从4,000Da至9,000Da或从6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。

污物释放聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：

(I)-[(OCHR¹-CHR²)_a-O-OC-Ar-CO-]_d

(II)-[(OCHR³-CHR⁴)_b-O-OC-sAr-CO-]_e

(III)-[(OCHR⁵-CHR⁶)_c-OR⁷]_f

其中：

a、b和c是从1至200；

d、e和f是从1至50；

Ar是1,4-取代的亚苯基；

sAr是1,3-取代的亚苯基，该亚苯基在5位上被SO₃Me取代；

Me是Li，K，Mg/2，Ca/2，Al/3，铵，单-、二-、三-、或四烷基铵，其中烷基基团是C₁-C₁₈烷基或C₂-C₁₀羟基烷基，或其混合物；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地选自H或C₁-C₁₈正-或异-烷基；以及

R⁷是直链或支链的C₁-C₁₈烷基，或直链或支链的C₂-C₃₀烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C₈-C₃₀芳基，或C₆-C₃₀芳基烷基。

适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如Marloquest SL，由萨索尔(Sasol)供应。

纤维素聚合物-本发明的组合物还包括一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自下组，该组包含羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素、及其混合物。在一方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。

酶-该组合物可以包含提供清洁性能和/或织物护理益的一种或多种另外的酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、黄原胶酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、***糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶和淀粉酶、或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶-适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自以下属的纤维素酶：芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属，例如US 4435,307、US 5648,263、US 5691178、US 5776757以及WO 89/09259中披露的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉以及尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、和WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0531315、US 5457046、US 5686593、US 5763254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中所述的那些。

其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 02/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO 01/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

蛋白酶-适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是源自芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及源自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO 95/23221中)、及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP1921148中)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如源自解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、^*36D、V68A、N76D、N87S,R、^*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、 Ultra、 Ultra、 Ultra、 Ultra、和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： Preferenz^Tm、Purafect PurafectEffectenz^Tm、 以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶-适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括如在EP 258068和EP305216中所述的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为疏棉状腐质霉)的脂肪酶、来自腐质霉属(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)菌株(这些假单胞菌属菌株中的一些现在重命名为伯克氏菌属)(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP 218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)的脂肪酶、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、来自稻瘟病菌(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(WO11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(WO11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(WO 12/137147)的脂肪酶。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipex Evity^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。

淀粉酶-可以与本发明的酶/变体/酶共混物一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如GB 1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包含示于WO 06/066594的SEQ ID NO:6中的源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 06/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或具有90％序列一致性的其变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQ IDNO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的其变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:2具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或***的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。

其他的实例是淀粉酶变体，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternational Inc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶-根据本发明所述的适合的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC 1.11.1.7包含的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。

适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、和WO98/15257中描述的那些。

过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。

在实施例中，本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。

已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。

还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。

在优选实施方案中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属物种，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)、或不等弯孢(Curvularia inaequalis)，例如如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS 102.42、或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70；或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii，如描述于WO01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie、或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium物种。

根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。

优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。

来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。

来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。

优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。

其他优选的酶包括在商标名下售卖的果胶裂解酶，以及在商标名下售卖的甘露聚糖酶(诺维信公司)，以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))。

这一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。

非尘颗粒可以例如US 4106991和US 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来涂覆。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸使液体酶制剂稳定。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。

染料转移抑制试剂-本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制试剂。适合的聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制试剂可以按从0.0001wt％至10wt％、从0.01wt％至5wt％或从0.1wt％至3wt％的水平存在。

增亮剂-本发明的组合物还可含有可以给正在清洁的物品着色的另外的组分，例如荧光增亮剂。

该组合物可以包含C.I.荧光增亮剂260，处于具有以下结构的α-晶体形式：

在一方面，增亮剂是冷水可溶性增亮剂，如处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260。在一方面，增亮剂主要处于α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的C.I.荧光增亮剂260是处于α-晶体形式。

增亮剂典型地是处于微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。

该组合物可以包含处于β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260，并且(i)处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260与(ii)处于β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。BE 680847涉及用于制得处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的方法。

可以用于本发明中的商业光学增亮剂可以划分为多个亚组，这些亚组包括但不必限制于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑类、5元和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“The Production andApplication of Fluorescent Brightening Agents[荧光增亮剂的产生和应用]”，M.Zahradnik，由John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]，纽约出版(1982)。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的具体非限制性实例是在US 4790856和US 3646015中鉴定的那些。

另外适合的增亮剂具有以下结构：

适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。

在一方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成颗粒。硅酸盐-本发明的组合物还可以含有硅酸盐，如硅酸钠或硅酸钾。该组合物可以包含从0wt％至小于10wt％硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。

分散剂-本发明的组合物还可以含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。

酶稳定剂-用于在组合物中使用的酶可以通过各种技术来稳定。在此使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规稳定试剂的实例是例如多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述来配制该组合物。在包含蛋白酶的水性组合物的情况下，可以添加可逆蛋白酶抑制剂来进一步改进稳定性，所述可逆蛋白酶抑制剂例如是硼化合物，包括硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸及其衍生物；或化合物，例如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇。

溶剂-适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。

结构化剂/增稠剂-结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。该组合物可以包含从0.01wt％至5wt％、或从0.1wt％至2.0wt％的结构化剂。该结构化剂典型地选自下组，该组由以下组成：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水改性的碱性可膨胀的乳液(例如Polygel W30(3V西格玛(Sigma)))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶、及其混合物。适合的结构化剂包括氢化的蓖麻油及其非乙氧基化的衍生物。适合的结构化剂披露于US 6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化***，该***具有一系列纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于WO 10/034736中。

调节剂-本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。在此有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自下组，该组由以下组成：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物、及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于International Cosmetic Ingredient Dictionary[国际化妆品成分词典]，第五版，1993，以及CTFA Cosmetic Ingredient Handbook[CTFA化妆品成分手册]，第二版，1992中。

鉴于提供改进的调节益处(如在施加至湿发的过程中的湿滑感、柔软度以及对干发的保湿感)，高熔点脂肪化合物以从0.1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1.5wt％至16wt％、从1.5wt％至8wt％的水平包括在该组合物中。

本发明的组合物可以含有阳离子聚合物。在组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05wt％至3wt％、从0.075wt％至2.0wt％、或从0.1wt％至1.0wt％。在预期使用该组合物的pH下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，该pH的范围将大体上是从pH 3至pH 9、或在pH 4与pH 8之间。在此，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与1000万之间、在50,000与500万之间、或在100,000与300万之间。

用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物含有阳离子含氮部分，如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。

此类聚合物的非限制性实例描述于CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary[CTFA化妆品成分词典]，第三版，由Estrin、Crosley、和Haynes编著(The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.[化妆品、化妆用具以及香水联合公司]，华盛顿特区(1982))。

用于在该组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔豆胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔豆胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，在此的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，该凝聚相是由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于US 3962418、US 3958581、和US 2007/0207109中。

本发明的组合物可以包括作为调节剂的非离子聚合物。在此具有大于1000的分子量的聚亚烷基乙二醇(polyalkylene glycol)是有用的。具有以下通式的那些是有用的：

其中R⁹⁵选自下组，该组由以下组成：H、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包括在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包含形成乳化液体颗粒的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在该组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下项的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式于在此的水性表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。

在组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂颗粒的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。

硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01wt％至10wt％。适合的硅酮调节剂以及对于硅酮的任选的悬浮剂的非限制性实例描述于美国再公告专利号34,584；US 5104646；US5106609；US 4152416；US 2826551；US 3964500；US 4364837；US 6607717；US 6482969；US5807956；US 5981681；US 6207782；US 7465439；US 7041767；US 7217777；US 2007/0286837 A1；US 2005/0048549 A1；US 2007/0041929 A1；GB 849433；DE 10036533中，将所有文献通过引用结合在此；Chemistry and Technology of Silicones[硅酮的化学与技术]，纽约：学术出版社(1968)；通用电气硅酮橡胶产品数据列表SE 30、SE 33、SE 54和SE76；硅酮化合物(Silicon Compounds)，彼特拉克***公司(Petrarch Systems,Inc.)(1984)；以及Encyclopedia of Polymer Science and Engineering[聚合物科学与工程化百科全书]，第15卷，第2版，第204-308页，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)(1989)中。

本发明的组合物还可以包含从0.05wt％至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如硅酮(在此所述的)组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于在此的组合物中的是在US 5674478和US 5750122或在US 4529586；US 4507280；US 4663158；US 4197865；US 4217914；US 4381919；以及US 4422853中所描述的调节剂。

卫生学与恶臭味-本发明的组合物还可以包含蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(如)、聚乙烯亚胺(例如来自巴斯夫公司(BASF)的)及其锌复合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放Ag⁺或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。

益生素-这些组合物可以包含益生素，如描述于WO 09/043709中的那些。

增泡剂-如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如C₁₀-C₁₆烷醇酰胺或C₁₀-C₁₄烷基硫酸酯)可以典型地以1wt％至10wt％的水平掺入组合物中。C₁₀-C₁₄单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡辅助表面活性剂(如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如MgCl₂、MgSO₄、CaCl₂、CaSO₄等)可以典型地以0.1wt％至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。

泡沫抑制剂-用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在US 4489455和US 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如Kirk OthmerEncyclopedia of Chemical Technology[柯克·奥思默化工百科全书]，第三版，第7卷，第430-447页(John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司]，1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族C₁₈-C₄₀酮(例如，硬脂酮)，N-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于US 2954347；US4265779；US 4265779；US 3455839；US 3933672；US 4652392；US 4978471；US 4983316；US5288431；US 4639489；US 4749740；US 4798679；US 4075118；EP 89307851.9；EP 150872；以及DOS 2,124,526。

对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选是以“泡沫抑制量”存在的。“泡沫抑制量”意指组合物的配制者可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。

在此的组合物将通常包含从0至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高至5wt％的量存在。优选地，使用从0.5wt％至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高至2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1wt％至2wt％的范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01wt％至5.0wt％的范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2wt％至3wt％使用醇泡沫抑制剂。

在此的组合物可以在宽的pH范围内具有清洁活性。在某些实施例中，这些组合物具有从pH 4至pH 11.5的清洁活性。在其他实施例中，这些组合物从pH 6至pH 11、从pH 7至pH 11、从pH 8至pH 11、从pH 9至pH 11、或从pH 10至pH 11,5具有活性。

在此的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，该温度将是低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些实施例中，对于这些组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃、或从40℃至50℃。

组合物的形式

在此描述的洗涤剂组合物被有利地用在例如私人家庭的衣物洗涤应用中连同在工业清洁和机构清洁中。本发明的组合物具体是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一方面，本发明涉及一种组合物，其中该组合物的形式选自下组，该组由以下组成：规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个隔室的袋；单个或多个隔室单位剂型；或其任何组合。

该组合物的形式可以将多个隔室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个隔室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

袋可以被配置为单个或多个隔室。它可以具有适合保持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。所述内部体积可以分成袋的隔室。优选的膜是高分子材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同(US 2009/0011970A1)。

脂肪酶颗粒

包含在本发明的水溶性膜中的脂肪酶变体可以存在为脂肪酶颗粒。这些脂肪酶颗粒可以甚至含有一种或多种另外的酶，如以下所述。

脂肪酶颗粒是处于固体微粒形式的脂肪酶变体的任何形式。脂肪酶颗粒可以是脂肪酶晶体、脂肪酶沉淀、喷雾或冻干的脂肪酶或任何形式的粒状脂肪酶，为粉末或液体中的悬浮液。典型地，脂肪酶颗粒的粒度，测量为当量球径(基于体积的平均粒度)是低于2mm，优选低于1mm，低于0.5mm，低于0.25mm，或低于0.1mm；并且高于0.05μm，优选高于0.1μm，高于0.5μm，高于1μm，高于5μm或高于10μm。

在一个优选实施例中，脂肪酶颗粒的粒度是从0.5μm至100μm。

脂肪酶颗粒含有至少1％w/w脂肪酶蛋白、优选至少5％w/w脂肪酶蛋白、至少10％w/w脂肪酶蛋白、至少20％w/w脂肪酶蛋白、至少30％w/w脂肪酶蛋白、至少40％w/w脂肪酶蛋白、至少50％w/w脂肪酶蛋白、至少60％w/w脂肪酶蛋白、至少70％w/w脂肪酶蛋白、至少80％w/w脂肪酶蛋白、或至少90％w/w脂肪酶蛋白。

在优选的实施例中，脂肪酶颗粒是脂肪酶晶体，或脂肪酶蛋白是处于结晶形式。

可以按如本领域中已知的多种方式进行酶结晶(例如，如描述于WO 91/09943或WO94/22903中)。

脂肪酶可以被配制在如本领域已知的脂肪酶颗粒中，用于固体酶配制品，例如用于减少粉尘、改进稳定性和或改变酶的释放速率的配制品。脂肪酶颗粒还可以被配制在基质中或涂覆有试剂，这些基质或试剂抑制酶颗粒在用于制备水溶性膜的PVOH/膜溶液中溶解。

脂肪酶颗粒的表面上的脂肪酶分子还可以是交联的，像CLEC(交联酶晶体)或CLEA(交联酶聚集体)。

水溶性膜

水溶性膜、用于其中的任选成分以及制备它们的方法在本领域是熟知的。在一类实施例中，该水溶性膜包括PVOH。PVOH是一种通常通过醇解(通常被称为水解或皂化)聚乙酸乙烯酯而制备的合成树脂。完全水解的PVOH(其中几乎所有乙酸基基团已被转化为醇基团)是一种仅在热水(高于约140°F(60℃))中溶解的强氢键键合的高度结晶聚合物。如果在聚乙酸乙烯酯水解之后允许剩余足够数目的乙酸基，那么该PVOH聚合物被称作部分水解的，它的氢键键合更弱并且结晶度更低并且在冷水(低于约50°F(10℃))中是可溶的。一种中间冷/热水溶性膜可以包括例如中间部分水解的PVOH(例如，具有约94％至约98％的水解度)，并且仅在温水(例如，在约40℃及以上的温度下快速溶解)中易溶。完全和部分水解的PVOH类型都通常被称为PVOH均聚物，尽管部分水解的类型在技术上是一种乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物。

包含于本披露的水溶性膜中的PVOH的水解度可以是约75％至约99％。当水解度降低时，由树脂制成的膜将具有降低的机械强度但是在约20℃以下的温度下更快的溶解。当水解度增加时，由树脂制成的膜将倾向于机械强度更高并且热成型性将倾向于降低。可以对PVOH的水解度进行选择这样使得该树脂的水溶性是温度依赖性的，并且因此由树脂、相容性试剂以及另外的成分制成的膜的溶解度也受到影响。在一类实施例中，该膜是冷水可溶的。一种冷水溶性膜(在低于10℃的温度下可溶于水中)可以包括水解度在约75％至约90％范围内、或在约80％至约90％范围内、或在约85％至约90％范围内的PVOH。在另一类实施例中，该膜是热水溶性的。一种热水溶性膜(在至少约60℃的温度下可溶于水中)可以包括水解度为至少约98％的PVOH。

除了PVOH之外或在PVOH的替代方案中，其他所使用的成膜树脂可包括但不限于改性的聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、水溶性丙烯酸脂共聚物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、普鲁兰，水溶性天然聚合物包括但不限于瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶、以及淀粉，水溶性聚合物衍生物包括但不限于乙氧基化的淀粉和羟丙基化的淀粉、、聚(丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠)、聚马来酸单甲酯、其共聚物以及上述任何项的组合。在一类实施例中，该成膜树脂是一种由乙烯醇、乙酸乙烯酯以及丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠组成的三元共聚物。出人意料地，基于乙烯醇、乙酸乙烯酯以及丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠的三元共聚物的水溶性膜已经展示出高百分比的酶回收。

水溶性树脂可以按任何适合的量(例如在约35wt％至约90wt％范围内的量)包括在该水溶性膜中。该水溶性树脂的量与所有酶、酶稳定剂和辅助添加剂的组合量相比的优选重量比可以是任何适合的比率，例如在约0.5至约5、或约1至约3、或约1至约2范围内的比率。

用于在此描述的膜中使用的水溶性树脂(包括但不限于PVOH树脂)可以由对于所希望的膜特性而言任何适合的粘度来表征，任选地在约5.0cP至约30.0cP、或约10.0cP至约25cP范围内的粘度。PVOH树脂的粘度通过使用具有UL适配器的布氏(Brookfield)LV型粘度计来测量新制备的溶液而确定，如在英国标准EN ISO 15023-2:2006附录E布氏测试法中所描述的。在20℃下阐述4％聚乙烯醇水溶液的粘度是国际惯例。在此以cP指定的所有PVOH粘度应被理解为是指在20℃下4％聚乙烯醇水溶液的粘度，除非另外说明。

本领域中熟知的是，PVOH树脂的粘度与同一PVOH树脂的重量平均分子量相关，并且该粘度通常被用作的代理。因此，该水溶性树脂的重量平均分子量任选地可以在约35,000至约190,000、或约80,000至约160,000的范围内。该树脂的分子量只需要足以使得它被适宜技术模制形成塑料薄膜即可。

根据本披露的水溶性膜可以例如以适合于其预期目的的量包括其他任选添加剂成分，包括但不限于，增塑剂、表面活性剂、消泡剂、成膜剂、防粘连剂、内脱模剂、抗黄变剂以及其他功能性成分。

水被认为是对于PVOH和其他聚合物而言一种非常有效的增塑剂，然而，水的挥发性使得它的效用受限，因为聚合物膜需要对多种环境条件(包括低的和高的相对湿度)具有至少一些耐受性(稳健性)。甘油的挥发性比水小得多，并且已经被很好地确立为对于PVOH和其他聚合物而言一种有效的增塑剂。如果在膜配制品中所使用的水平太高，甘油或其他这种液态增塑剂它们自身可以引起表面“出汗(sweating)”和油腻。这在膜中可以导致以下问题，例如给消费者的手以不可接受的触感，并且如果没有以一定的方式(例如，表面撒粉)减轻出汗，甚至会将膜阻断在辊上或成堆薄片中。这可以表征为过塑化。然而，如果添加至膜的增塑剂太少，该膜对很多最终用途可能缺乏足够的延展性和柔性，例如被转化成最终使用类型，例如袋。

用于在本披露的水溶性膜中使用的增塑剂包括但不限于山梨醇、甘油、双甘油、丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、聚乙二醇(高达MW400)、2-甲基-1,3-丙二醇、乳酸、甘油一乙酸酯、三醋精、柠檬酸三乙酯、1,3-丁二醇、三羟甲基丙烷(TMP)、聚醚三醇及其组合。如上所述，多元醇通常可用作增塑剂。增塑剂使用越少，膜可能变得越脆，而增塑剂使用越多，膜可能失去拉伸强度。增塑剂可以按例如在约25phr至约50phr，或从约30phr至约45phr，或从约32phr至约42phr范围内的量被包括在该水溶性膜中。

用于在水溶性膜中使用的表面活性剂在本领域是熟知的。任选地，包括表面活性剂以在浇铸时辅助树脂溶液的分散。用于本披露的水溶性膜的适合的表面活性剂包括但不限于二烷基磺基琥珀酸酯、甘油和丙二醇的乳酸化脂肪酸酯、脂肪酸乳酰酯、烷基硫酸钠、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、烷基聚氧乙烯醚、卵磷脂、甘油和丙二醇的乙酰化脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、脂肪酸乙酰化酯、肉豆蔻基二甲基氧化胺、三甲基牛脂烷基氯化铵、季铵化合物、其盐以及上述任何项的组合。因此，表面活性剂可以按例如小于约2phr，例如小于约1phr、或小于约0.5phr的量被包括在该水溶性膜中。

考虑使用的一种类型的次级成分是消泡剂。消泡剂可以有助于聚结泡沫气泡。用于在根据本披露的水溶性膜中的适合的消泡剂包括但不限于疏水性二氧化硅，例如细粒度的二氧化硅或煅制二氧化硅，包括Foam 消泡剂(可获得自爱墨瑞得高性能材料公司(Emerald Performance Materials))，包括Foam 327、Foam UVD、Foam163、Foam 269、Foam 338、Foam 290、Foam 332、Foam 349、Foam 550以及Foam 39，它们是专有的非矿物油消泡剂。在实施例中，可以按0.5phr或更少的量使用消泡剂，例如0.05phr、0.04phr、0.03phr、0.02phr或0.01phr。优选地，为了避免应激致白，将避免显著量的二氧化硅。

用于制备水溶性物品(包括膜)的方法包括浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出，如本领域中已知的。一类考虑的实施例由在此描述的水溶性膜通过浇铸形成表征，例如通过将在此描述的成分与水混合以产生水性混合物(例如具有任选分散的固体的溶液)，向表面施加该混合物，并且干燥去除水以产生膜。类似地，可通过干燥该混合物，同时将其局限为所希望的形状以形成其他组合物。

在一类考虑的实施例中，通过浇铸水溶性混合物形成该水溶性膜，其中该水溶性混合物根据以下步骤制备：

(a)提供水溶性树脂、水以及排除增塑剂的任何任选的添加剂的一种混合物；

(b)煮沸混合物30分钟；

(c)将混合物在烘箱中在至少40℃的温度下脱气；任选地在40℃至70℃的范围内，例如约65℃；

(d)在65℃或更低的温度下向混合物中添加一种或多种酶、增塑剂以及另外的水；以及

(e)在无涡旋的情况下搅拌混合物，直到混合物的颜色和稠度看起来大体上一致；任选地持续在30分钟至90分钟的范围内的一段时间，任选地至少1小时；以及

(f)在搅拌的时间段之后迅速浇铸混合物(例如，在4小时、或2小时、或1小时内)。

如果过早地将酶添加至混合物(例如，与辅助添加剂或树脂一起)，酶活性可能降低。不旨在受任何具体理论的束缚，据信将具有酶的混合物煮沸导致酶变性并且在溶液中储存延长的时间段同样导致酶活性降低。

在一类实施例中，在中度至温和条件下通过迅速干燥膜使得根据本披露的水溶性膜保持高的酶活性。如在此使用的，迅速干燥是指小于24小时，任选地小于12小时、任选地小于8小时、任选地小于2小时、任选地小于1小时、任选地小于45分钟、任选地小于30分钟、任选地小于20分钟、任选地小于10分钟，例如在约6分钟至约10分钟或8分钟的范围内的干燥时间。如在此使用的，中度至温和条件是指低于170°F(77℃)，任选地在约150°F至约170°F(约66℃至约77℃)的范围内，例如，165°F(74℃)的干燥温度。随着干燥温度增加，酶倾向于越快变性，而随着干燥温度降低，干燥时间增加，由此使酶在延长的时间段内暴露在溶液中。

该膜有用于产生一种包以含有一种组合物，例如，衣物洗涤或餐具洗涤组合物，由此形成一种袋。在此描述的膜还可用于制备一种具有两个或更多个隔室的包，其由相同的膜或者结合其他聚合材料的膜制成。另外的膜可以是例如通过浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出相同或者不同的聚合材料而获得的，如本领域中已知的。在一个类型的实施例中，适于用作另外的膜的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、聚丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(例如黄原胶和角叉菜胶)。例如，聚合物可以选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯及其组合，或选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)及其组合。

本披露的袋和/或包包含至少一个密封的隔室。因此，这些袋可以包含单个隔室或多个隔室。这些袋可以具有含酶和不含酶的区域。在包括多个隔室的实施例中，每个隔室可以含有相同的和/或不同的组合物。进而，这些组合物可以采取任何适合的形式，包括但不限于，液体、固体及其组合(例如，悬浮在液体中的固体)。在一些实施例中，这些袋包含第一、第二和第三隔室，其中每一个隔室分别含有一种不同的第一、第二和第三组合物。在一些实施例中，如描述于EP 2258820中，这些组合物可以是视觉上不同的。

多隔室袋和/或包的这些隔室可以具有一个或多个相同的或不同的尺寸和/或体积。本发明多隔室袋的这些隔室可以是分开的或以任何适合方式结合的。在一些实施例中，该第二和/或第三和/或随后的隔室叠加在该第一隔室上。在一个实施例中，该第三隔室可以叠加在该第二隔室上，该第二隔室进而以一种夹层构型叠加在该第一隔室上。可替代地，该第二和第三隔室可以叠加在该第一隔室上。然而，还可以同样地设想的是，该第一、第二和任选地第三和随后的隔室可以按并排的关系相互附接。这些隔室可以被包装成一串，每个隔室通过穿孔线是各自地可分开的。因此，每个隔室可以被终端用户从该串的剩余部分单独地撕去。

在一些实施例中，多隔室袋和/或包包括三个隔室，其由一个大的第一隔室和两个较小的隔室组成。较小的第二和第三隔室叠加在大的第一隔室上。对这些隔室的尺寸和几何结构进行选择，这样使得此安排是可实现的。这些隔室的几何结构可以是相同或不同的。在一些实施例中，与该第一隔室相比，该第二和任选地第三隔室各自具有一个不同的几何结构和形状。在这些实施例中，该第二和任选地第三隔室以一种设计被安排在该第一隔室上。该设计可以是装饰性的、教导性的、或说明性的，例如以说明一个概念或指导，和/或用于指示该产品的来源。在一些实施例中，该第一隔室是最大的隔室，其具有两个大的围绕周边密封的面，而该第二隔室较小，其覆盖小于约75％、或小于约50％的该第一隔室的一个面的表面积。在存在有一个第三隔室的实施例中，上述结构可以是相同的，但是该第二和第三隔室覆盖小于约60％、或小于约50％、或小于约45％的该第一隔室的一个面的表面积。

本披露的袋和/或包可以包含一种或多种不同的膜。例如，在单个隔室的实施例中，该包可以由一个折叠到其自身上并且在边缘处密封的壁制成，或者可替代地，由两个在边缘处密封在一起壁制成。在多个隔室的实施例中，该包可以由一种或多种膜制成，这样使得任何给定的包隔室可以包含由单种膜或具有不同组成的多种膜制成的壁。在一个实施例中，一种多隔室袋包含至少三个壁：一个外上壁；一个外下壁；以及一个分隔壁。该外上壁和该外下壁通常是相对的并且形成该袋的外部。该分隔壁在该袋的内部并且沿着密封线被固定至这些通常相对的外壁。该分隔壁将该多隔室袋的内部分隔成至少一个第一隔室和一个第二隔室。在一类实施例中，该分隔壁可以是唯一含有酶的膜由此最小化消费者对这些酶的暴露。

袋和包可用任何适合的设备和方法制成。例如，单个隔室袋可用本领域公知的立式填充、卧式填充或转鼓填充技术制成。此类工艺可以是连续的或间断的。可以将该膜润湿和/或加热以提高其延展性。该方法还可以涉及使用真空以将该膜牵引到一个适合的模具中。一旦该膜处在该表面的水平部分上，将该膜牵引到该模具中的真空可以实施约0.2至约5秒、或约0.3至约3、或约0.5至约1.5秒。该真空可以这样使得它提供例如在10毫巴至1000毫巴的范围内、或在100毫巴至600毫巴的范围内的一个下压。

这些模具(包可以在其中制成)可具有任何形状、长度、宽度和深度，取决于这些袋所需要的维度。如果希望的话，这些模具还可以彼此在大小和形状上不同。例如，最终的袋的体积可以为约5ml至约300ml、或约10至150ml、或约20至约100ml，并且这些模具大小可相应被调整。

在一个实施例中，该包包括一个第一和一个第二密封隔室。通常，该第二隔室与该第一密封隔室处于一种叠加关系，以使得该第二密封隔室和该第一密封隔室共用该袋内部的一个分隔壁。

在一个实施例中，包括一个第一和一个第二隔室的包进一步包括一个第三密封隔室。通常，该第三密封隔室与该第一密封隔室处于一种叠加关系，以使得该第三密封隔室和该第一密封隔室共用该袋内部的一个分隔壁。

在不同实施例中，该第一组合物和该第二组合物选自以下组合之一：液体、液体；液体、粉末；粉末、粉末；以及粉末、液体。

在不同实施例中，该第一、第二和第三组合物选自以下组合之一：固体、液体、液体以及液体、液体、液体。

在一个实施例中，该单个隔室或多个密封隔室含有一种组合物。该多个隔室可以各自含有相同或不同的组合物。该组合物选自一种液体、固体或其组合。

在该方法中，热可以被施加至该膜，通常称为热成型。可以用任何适合的手段施加热量。例如，在将该膜供给到表面上之前或一旦在表面上，可以通过使它处于加热元件之下或通过热空气而直接对其加热。可替代地，例如，可以通过加热表面或将一种热物品施加到该膜上而间接对其加热。可以使用红外光加热该膜。该膜可以被加热至至少50℃，例如，约50℃至约150℃、约50℃至约120℃、约60℃至约130℃、约70℃至约120℃或约60℃至约90℃的温度。

可替代地，可以通过任何适合的手段润湿该膜，例如，在将它供给到表面上之前或一旦在表面上，直接通过将一种润湿剂(包括水、该膜组合物的溶液、用于该膜组合物的增塑剂、或前述项的任何组合)喷雾到该膜上，或间接通过润湿表面或通过将一种湿润物品施加到该膜上。

一旦膜已经被加热和/或润湿，可以将它牵引到一个适当的模具中，优选地使用真空。例如，该膜可以按至少约1.5的拉伸比，以及例如，任选地高达2的拉伸比热成型。可以通过使用任何适合的手段完成该模制膜的填充。在一些实施例中，最优选的方法将取决于产品形式和所需要的填充速度。在一些实施例中，通过在线填充技术填充该模制膜。然后通过任何适合的方法，使用第二膜将经填充的开口包封闭，以形成袋。这可以当处于水平位置并且在连续匀速运动中完成。可以通过以下方式完成封闭：连续地将第二膜(优选水溶性膜)供给到这些开口包上方和上面，并且然后优选将第一和第二膜一起密封，典型地在模具之间的区域并且因此在包之间。

可以利用任何适合的密封包和/或其独立隔室的方法。这类手段的非限制性实例包括热密封、溶剂焊接、溶剂密封或液封及其组合。可以在至少200°F(93℃)的温度下将该水溶性包和/或其独立隔室热密封，例如在约220°F(约105℃)至约290°F(约145℃)、或约230°F(约110℃)至约280°F(约140℃)的范围内。典型地，只用热或溶剂处理将形成密封的区域。典型地，可以通过任何方法将热或溶剂施加到封闭材料上，并且典型地，只施加到将形成密封的区域上。如果使用溶剂密封或液封或焊接，可以优选的是同样施加热。优选的液封或溶剂密封/焊接方法包括选择性地将溶剂施加到模具之间的区域或封闭材料上、通过例如将其喷雾或印刷到这些区域上，并且然后施加压力到这些区域上，以形成密封。例如，可以使用如上所述的密封辊和带(任选地也提供热)。

然后，可以通过切割装置将所形成的袋切割。可以使用任何已知方法完成切割。可以优选的是，还可以按连续方式进行切割，并且优选地以恒定的速度并且优选地当处于水平位置时。该切割装置可以是例如一种锋利物品、或一种热物品、或激光，由此，在后者的情况下，该热物品或激光“烧”穿该膜/密封区域。

多隔室袋的不同隔室可以按并排样式一起制成，其中所得到的连体袋可以通过切割而被分开或可以不被分开。可替代地，这些隔室可以被分开地制成。

在一些实施例中，可以根据一种包括以下步骤的方法制成袋：

a)形成第一隔室(如上所述)；

b)在步骤(a)中形成的封闭隔室的一些或全部内形成凹口，以产生一个叠加在该第一隔室之上的第二模制隔室；

c)借助第三膜填充并封闭该第二隔室；

d)密封该第一、第二和第三膜；以及

e)切割这些膜以产生多隔室袋。

可以通过向步骤(a)中制备的隔室施加真空来实现步骤(b)中形成的凹口。

在一些实施例中，第二和/或第三隔室可以在分开的步骤中制成，并且然后与该第一隔室结合，如描述于EP 2088187或WO 2009/152031中。

在其他实施例中，可以根据一种包括以下步骤的方法制成袋：

a)任选地使用热和/或真空，在第一成型机上使用第一膜形成第一隔室；

b)用第一组合物填充该第一隔室；

c)在第二成型机上，任选地使用热和真空使第二膜变形，以制成第二和任选地第三模制隔室；

d)填充该第二和任选地第三隔室；

e)使用第三膜密封该第二和任选地第三隔室；

f)将该密封的第二和任选地第三隔室放到该第一隔室上；

g)密封该第一、第二和任选地第三隔室；以及

h)切割这些膜以产生多隔室袋。

可以基于该第一和第二成型机进行以上方法的适合性对其进行选择。在一些实施例中，该第一成型机优选为一种卧式成型机，而该第二成型机优选为一种转鼓成型机，优选地位于该第一成型机之上。

应当理解的是，通过使用适当的进料站，有可能制造掺入多种不同或独特组合物和/或不同或独特液体、凝胶或糊状组合物的多隔室袋。

制造组合物的方法

本发明的组合物可以被配制为任何适合的形式，并且可通过被配制者所选择的任何方法来制备，这些方法的非限制性实例描述于申请人的实例中以及US 4990280；US20030087791A1；US 20030087790A1；US 20050003983A1；US 20040048764 A1；US 4762636；US 6291412；US 20050227891 A1；EP 1070115 A2；US 5879584；US 5691297；US 5574005；US 5569645；US 5565422；US 5516448；US 5489392；US 5486303中，将所有文献通过引用结合在此。本发明的组合物或根据本发明制备的组合物包含清洁和/或处理组合物，该组合物包括但不限于用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬质表面和任何其他表面的组合物，该织物和家居护理领域包括：空气护理(包括空气清新剂和气味递送***)、汽车护理、餐具洗涤、织物调理(包括软化和/或清新)、衣物洗涤、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器洗碗剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载基质的组合物(例如添加干燥剂的片层)。优选的是用于清洁和/或处理纺织品和/或硬质表面(最优选为纺织品)的组合物和方法。组合物优选地是在洗涤过程的预处理步骤中或主要洗涤步骤中(最优选用于纺织品洗涤步骤)使用的组合物。

如在此所用的，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指出，该子集包括颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调节组合物(包括软化和/或清新)，可以处于液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载基质的组合物(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类组合物可以是处于标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类组合物可以在某些方面呈非水性的程度。

使用方法

本发明包括在织物和/或家居护理领域中用于清洁任何表面(包括处理纺织品或硬表面或其他表面)的方法。在本发明的一方面，该方法包括在洗涤过程的预处理步骤或主要洗涤步骤(最优选用于在纺织品洗涤步骤中使用或可替代地用于在餐具洗涤(包括手动以及自动/机械餐具洗涤两者)中使用)中接触有待处理的表面的步骤。在本发明的一个实施例中，将脂肪酶变体和其他组分顺序地添加至用于清洁和/或处理表面的方法中。可替代地，同时地添加脂肪酶变体和其他组分。

如在此所用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。洗涤可以用泡沫组合物进行(如在WO 08/101958中所述)，和/或通过施加交变压力(压力/真空)作为擦洗和机械搅拌的附加方法或替代方式来进行。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段的任一种来完成。本发明的清洁组合物理想地适用于在洗衣以及餐具洗涤应用中使用。因此，本发明包括用于清洁物体(包括但不限于织物、餐具、刀具以及厨具)的方法。该方法包括使有待清洁的物体与所述清洁组合物接触的步骤，该清洁组合物包含申请人的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物中的至少一个实施例。织物可以包含能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的大多数任何织物。该溶液可以具有从8至10.5的pH。可以在溶液中以从500ppm至15.000ppm的浓度使用组合物。水温范围典型地是从5℃至90℃。水与织物之比典型地是从1:1至30:1。

在一方面，本发明涉及使用与SEQ ID NO:3具有至少75％一致性的多肽产生一种组合物的方法。在一方面，本发明涉及该组合物用于清洁物体的用途。

在一方面，本发明涉及产生组合物的方法，该方法包括添加该变体。在一方面，本发明涉及产生该组合物的方法，该方法包括添加与SEQ ID NO:3具有至少75％一致性的多肽、以及表面活性剂。在一方面，本发明涉及用于清洁表面的方法，该方法包括使待清洁的表面上存在的脂质污渍与该清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及用于水解存在于表面上的污渍和/或污渍中的脂质的方法，该方法包括使污渍和/或污渍与清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及水解脂肪酶底物的方法，该方法包括使所述底物与该变体接触。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等效方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言本发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这些修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

本发明涉及已经被修饰为含有二硫键或二硫桥的脂肪酶变体，如与亲本脂肪酶相比，该二硫键或二硫桥导致脂肪酶的较低水解活性。可以通过破坏二硫键和/或降解附着于二硫键的肽来活化或重新活化该脂肪酶变体，因此使活化的脂肪酶变体更有效地发挥功能。可以引入二硫键，这样使得脂肪酶变体的前肽部分与脂肪酶变体的成熟部分连接。如与亲本脂肪酶相比，键和前肽部分的存在导致脂肪酶变体的较低水解活性，参见例如实例3。这可以允许脂肪酶变体在加工、配制、运输和储存等过程中保持其活性，尤其是当脂肪酶变体处于洗涤剂组合物的潜在苛刻环境中时。可以通过破坏二硫键或降解或去除前肽部分来活化脂肪酶变体，因此使该脂肪酶变体更有效地作用于底物。这有效地保留了当被需要时准备好的脂肪酶变体的活性，减少或防止在储存等期间亲本脂肪酶可能发生的活性损失。本发明的这一方面适用于脂肪酶，该脂肪酶包含前肽或对应于前肽的区域，不限于例如像接合菌脂肪酶，并且特别地不限于米黑根毛霉脂肪酶。有用的接合菌脂肪酶的实例是源自或具有SEQ ID No:2、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ IDNo:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、或SEQ ID No:16的序列的那些。

本发明还涉及脂肪酶的成熟部分内的二硫键的使用以实现相同的效果。一些脂肪酶的结构域被称为盖(或辦)，在酶的无活性状态下覆盖活性位点。活化后，该盖改变构象并移动以暴露活性位点，这使得底物进入并开始催化。可以修饰脂肪酶变体以含有影响盖移动从而暴露活性位点的能力的二硫键。特别地，可以引入二硫键来抑制盖打开的能力。如与亲本脂肪酶相比，键的存在导致脂肪酶变体的较低水解活性。这可以允许脂肪酶变体在加工、配制、运输和储存等过程中保持其活性，尤其是当脂肪酶变体处于洗涤剂组合物的潜在苛刻环境中时。在键断裂后，例如通过引入还原剂和/或表面活性剂，盖可以更容易地打开，并且脂肪酶变体的水解活性增加。这有效地保留了当被需要时准备好的脂肪酶变体的活性，减少或防止在储存等期间亲本脂肪酶可能发生的活性损失。本发明的这一方面适用于脂肪酶，该脂肪酶包含盖或对应于盖的区域，不限于例如像腐质霉脂肪酶，并且特别地不限于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。有用的腐质霉脂肪酶的实例是源自或具有SEQ ID No:6的序列的那些。

用于本发明的一种酶是米黑根毛霉脂肪酶。野生型脂肪酶可用于配制洗涤剂组合物，除其他物品外用于洗涤纺织品。洗涤剂组合物中的环境可能非常苛刻，并且可以导致组分的失活，特别是包括脂肪酶的酶。因此，虽然可以将脂肪酶添加到洗涤剂组合物中，但取决于环境条件和时间长短，当使用洗涤剂组合物时酶的总体活性可能低于所希望的水平。本发明通过提供处于无活性保护形式的脂肪酶来解决该问题，从而在需要时保持酶的活性。在一方面，这可以通过提供具有在前肽和酶的成熟肽组分之间可破坏的键的脂肪酶变体来实现。换言之，本发明涉及通过前肽和酶原的成熟脂肪酶部分之间的桥稳定的复合来稳定并且抑制脂肪酶。这可以通过向前肽-酶复合物的结构中引入S-S桥(二硫键)来实现。这可以通过产生突变以引入半胱氨酸来代替天然存在的氨基酸残基来实现。S-S桥可以稳定被抑制的复合物，超过用与脂肪酶的N-末端的前肽的共价键获得的稳定。

受控的活化可以通过破坏S-S键和/或通过降解前肽部分，例如通过添加活化剂来获得。如上所述，活化剂可以包含酶(如蛋白酶)和/或还原剂。优选地，该活化剂包含表面活性剂和还原剂(优选亚硫酸盐)。脂肪酶的活化或重新活化可以在需要脂肪酶是活性的时刻实现。因此，例如，可以提供包含本发明的脂肪酶变体的洗涤剂组合物，该脂肪酶变体处于连接的、保护的和无活性的形式。该洗涤剂组合物可以与活化剂混合，例如以蛋白酶和/或还原剂的形式，然后其将破坏S-S键和/或降解前肽部分，释放准备使用的活性成熟形式的脂肪酶。正如我们以下将要讨论的，被保护的酶的这种活化可以按多种方式进行。

现在我们将通过一些实例来讨论本发明。

已经制备并测试了根据本发明的变体，表明本发明可以在使用前保护酶，并然后在需要时产生活性酶。RPPI0018和RPPI0019是具有在前肽和脂肪酶的材料蛋白质部分之间的两种不同的经引入的S-S桥的RmL-变体。对于这两种变体，已经进行了测试以表明在按照原样添加时在受控的测试中它们具有极少洗涤性能或没有洗涤性能。已经进行了活性测定，在没有或有用蛋白酶预处理15分钟的情况下，其显示出通过与蛋白酶(Savinase)孵育从0活性到这些变体的全部活化的转化。用与还原剂TCEP和2％亚硫酸盐的类似的孵育获得这些变体的部分活化。在实例3的测试中观察到在无蛋白酶洗涤剂组合物中储存期间的显著的稳定性。当与野生型RmL相比时，进行了差示扫描量热法，其显示这些变体的18℃至20℃的稳定性。测量了78℃至80℃及以上的最大Tm，当与1mM LAS孵育时，Tm仅降低至大约75℃至77℃。

参考如SEQ ID NO:2中所示的RmL的编号***，用于本发明的脂肪酶变体的以下列表包括以下项：L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、M-31C/V249C。优选的变体包括P-46C/N186C(RPPI0019)、T-40C/P182C(RPPI0018)、L-54C/P101C、A-24C/G104C、和D-38C/A212C。

在使用中，这些受保护的脂肪酶变体可以按许多不同的方式包装。例如，它们可以在将受保护的酶与活化剂分开的包装中提供。当需要酶时，使用者可以操作该包装以引起活化剂和受保护酶的混合。这可以例如按多室包装的形式，其中一个室含有脂肪酶变体，并且另一个室含有一种或多种活化剂。这两个室最初是分开的，但是可以使它们彼此连通，以允许活化剂与受保护的酶混合。这可以按多室包装的形式实现，其中外部施加的力使得两个室之间的屏障断裂或以其他方式被去除，从而允许该活化剂接触受保护的酶并因此使S-S桥断裂。这然后提供了准备使用的活化酶。

实现酶活化的另一种方式是提供分开的组合物，其中一种组合物包含受保护的酶，并且另一种组合物包含一种或多种活化剂。然后可将这两种组合物混合以便于活化准备使用的酶。在优选的实施例中，这些组合物处于液体形式。

优选的活化剂包括蛋白质降解酶，例如蛋白酶(如Savinase(诺维信公司)。优选的活化剂还包括还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)和亚硫酸钠。

本发明在下面各段中进行了进一步的定义：

段落1.一种用于产生亲本脂肪酶的脂肪酶变体制剂的方法，该方法包括改变编码亲本脂肪酶的多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。

段落2.根据前述段落所述的方法，其中该脂肪酶变体具有前肽和成熟部分，其中改变一个或多个核苷酸的步骤形成含有半胱氨酸残基的前肽和/或成熟部分。

段落3.根据前述段落所述的方法，其中改变一个或多个核苷酸的步骤形成含有两个半胱氨酸残基的前肽和/或成熟部分。

段落4.根据段落1所述的方法，其中该亲本脂肪酶是接合菌脂肪酶，和/或与SEQID NO:2具有至少50％序列一致性。

段落5.根据任何前述段落所述的方法，其中该亲本脂肪酶是具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的接合菌脂肪酶。

段落6.根据任何前述段落所述的方法，其中改变一个或多个核苷酸的步骤包括在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

段落7.根据任何前述段落所述的方法，其中改变一个或多个核苷酸的步骤包括在对应于位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24的一个或多个位置处的取代，并且包括在对应于SEQ ID NO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

段落8.根据任何前述段落所述的方法，其中改变一个或多个核苷酸的步骤包括在对应于选自SEQ ID NO:2的L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和M-31C/V249C的位置的一个或多个残基处的取代。

段落9.一种编码亲本脂肪酶的脂肪酶变体的多核苷酸，该多核苷酸包含在一个或多个核苷酸上的改变，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。

段落10.一种多核苷酸，该多核苷酸可以通过段落1至8中任一项所述的方法获得。

段落11.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如段落9-10中任一项所述的多核苷酸。

段落12.一种表达载体，该表达载体包含如段落9-10中任一项所述的多核苷酸。

段落13.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如段落9-10中任一项所述的多核苷酸。

段落14.一种用于产生来自如段落9-10中任一项所述的多核苷酸的脂肪酶的方法，该方法包括：(a)在适合用于表达脂肪酶变体的条件下培养如段落13所述的宿主细胞；并且(b)回收该脂肪酶变体。

段落15.一种根据段落14所述的方法制备的脂肪酶变体。

段落16.一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含在一个或多个核苷酸上的改变，其中该改变提供了至少一个二硫键和所述脂肪酶变体的水解活性，该所述脂肪酶变体的水解活性如与该亲本脂肪酶的水解活性相比是降低的。

段落17.根据段落15-16中任一项所述的脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

段落18.根据段落15-16中任一项所述的脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含在对应于-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、和-24的一个或多个位置处的取代，并且包含在对应于SEQ ID NO:2的位置101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

段落19.根据段落15-16中任一项所述的脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含在对应于选自SEQ ID NO:2的L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、A-24C/G104C、P-46C/N186C、A-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和M-31C/V249C的位置的一个或多个残基处的取代。

段落20.根据段落15-19中任一项所述的脂肪酶变体，其中所述脂肪酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16具有至少50％序列一致性。

段落21.一种组合物，该组合物包含如段落15-20中任一项所述的脂肪酶变体。

段落22.如段落21所述的组合物，该组合物被配制为规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个隔室的袋；单个或多个隔室单位剂型；或其任何组合。

段落23.如段落21-22中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含活化剂。

段落24.如段落23所述的组合物，其中该活化剂是蛋白酶和/或还原剂。

段落25.一种清洁方法，该方法包括使表明或物品与根据段落21-24中任一项所述的组合物接触。

段落26.一种用于增加如段落15-20中任一项所述的脂肪酶变体的水解活性的方法，该方法包括使所述脂肪酶变体与活化剂接触的步骤。

实例

以下实例包括米黑根毛霉脂肪酶(RmL)和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TlL)的变体。两种这样的优选的RmL变体被称为RPPI0018(P182C T-40C)和RPPI0019(N186C P-46C)。

SEQ ID No:1列出了RmL的核苷酸序列，包括编码以下切割的前原肽(带下划线的)的序列：

SEQ ID No:2列出了RmL的氨基酸序列，包括以下切割的前原肽序列(preprosequence)(带下划线的)：

SEQ ID No:3列出了RmL成熟蛋白质的氨基酸序列：

SEQ ID No:4列出了RmL的前肽的氨基酸序列：

VPIKRQSNST VDSLPPLIPS RTSAPSSSPS TTDPEAPAMS RNGPLPSDVE TKYGMALNATSYPDSVVQAM

SEQ ID No:5列出了TlL的核苷酸序列，包括编码以下切割的前原肽(带下划线的)的序列：

SEQ ID No:6列出了TlL的氨基酸序列，包括以下切割的前原肽序列(带下划线的)：

SEQ ID No:7列出了TlL成熟蛋白质的氨基酸序列：

RPPI0018和RPPI0019的构建的描述

米黑根毛霉脂肪酶(RmL)的变体，RPPI0018(T-40C P182C)和RPPI0019(P-46CN186C)被设计为具有在前肽区域以及在成熟肽中的突变以研究该前肽和该成熟肽之间的相互作用。

进行基于PCR的定点诱变以产生具有针对每个突变的两个重叠引物的这些变体，在单个PCR反应中正向引物具有所希望的突变。然后在37℃下，在PCR机中用DpnI限制性内切酶处理PCR产物6小时。DpnI消化甲基化的或亲本模板DNA，而未被甲基化的新形成的突变DNA链保持完整。然后将PCR产物用于转化感受态的大肠杆菌细胞。质粒DNA从单个分离的转化体中分离，并发送用于序列分析，这确认所希望的突变的存在。

序列确认的质粒DNA在米曲霉ToC1512中通过转化的原生质体方式得到转化。通过在96孔培养板中的2mL表达培养基(M400)中接种孢子，并在34℃下静置生长4天，以小规模针对蛋白表达筛选转化体，其后在SDS-PAGE上分析蛋白表达。然后将表达菌落在COVE-N琼脂斜面上划线，在1L带挡板的摇瓶中的M400培养基中由此进行摇瓶发酵，在34℃，180rpm下持续4天。在SDS-PAGE上分析蛋白表达。一旦确认表达，给出发酵培养液用于蛋白质纯化。

RPPI18和RPPI19的纯化

在丁基Toyopearl柱上纯化之前，澄清的培养上清液是从米曲霉培养液中，通过在布氏漏斗(产品编号PW90，J Brand)中，使用Seitz过滤器(产品编号K250，颇尔印度公司(Pall India corporatio))和WHATMAN玻璃过滤器GF/F级(产品编号1825-25，沃特曼-通用电气医疗集团(Whatman-GEHealthcare))的组合进行真空过滤，随后在真空过滤单元(产品编号50060，TARSONS)上，使用200 0.2u过滤器(产品编号60301，颇尔公司(PALLcorporation))进行无菌过滤制得。

将丁基Toyopearl柱用洗涤缓冲液(25mM HEPES，pH 7.0+1.5M(NH₄)₂SO₄缓冲液)预平衡。向澄清的培养物上清液中添加需要量的固体(NH₄)₂SO₄从而使其达到1.5M浓度。通过过滤(0.45u)去除因此形成的沉淀物。然后将样品以152cm/hr的线性流速施加到丁基Toyopearl柱(10x 200mm，柱床体积10mL)上。通过用洗涤缓冲液洗涤该柱，去除未结合或弱结合的蛋白质，直至280nm处的OD达到低于0.1吸光度单位。用25mMHEPES，pH 7.0+0.4M(NH₄)₂SO₄进行脂肪酶的洗脱。

将从丁基Toyopearl柱汇集的洗脱级分施加到用25mM HEPES，pH 7.0以25cm/hr的线性流速进行预平衡的Superdex-75柱(25x 450mm，柱床体积180mL)上。用相同的缓冲液完成蛋白质的洗脱。将经纯化的蛋白质级分收集并汇集。

实例1：热稳定性

使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)，通过差示扫描量热法(DSC)确定RmL野生型连同RmL变体RPPI0018和RPPI0019的热稳定性。在200K/hr的恒定的程序化加热速率下，加热在缓冲液(50mM HEPES；pH 8.0；0.2mM CaCl₂)中的酶溶液后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。运行相似的实验，其中将1mM LAS(阴离子表面活性剂)或0.05mg/mL Relase(热稳定蛋白酶，诺维信公司)添加至缓冲液中。从10℃的储存条件下，将样品溶液和参考溶液(大约0.2mL)装载到量热仪中(参考溶液：没有酶的缓冲液)，并且在从20℃至100℃的DSC扫描之前，在20℃下热预平衡大约20分钟。

测量的变性温度(Tm)对于RmL野生型是59℃，并且对于脂肪酶变体：RPPI0018和RPPI0019的Tm分别是80℃和76℃。当在相应的条件(80℃和76℃与59℃)下测试时，与RmL野生型相比，这些RmL变体具有改进的稳定性。此外，通过添加洗涤剂组合物成分(例如1mMLAS或0.05mg/mLRelase)在测试时观察到这些变体的Tm高于在没有添加任何洗涤剂组合物成分获得的RmL野生型的Tm(59℃)。

实例2:自动机械应力测定(AMSA)

为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽和盖子，该盖子对所有槽开口强力挤压衣物洗涤样品(待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。按如下说明，在标准B型洗涤剂，pH 8中进行洗衣实验：

用NaOH或柠檬酸进行最后调节至指定pH。通过将CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺＝4:1)添加到测试***中，将水硬度调节至15°dH。

洗涤之后，将纺织品在自来水中沖洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且之后立即将纺织品在100℃下干燥10min。

将洗涤性能测量为所洗涤的脏纺织品的颜色变化。该污物是与姜黄混合的奶油。姜黄含有着色剂姜黄素，其通过具有pH依赖性颜色变化而用作pH指示剂。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从奶油酰基甘油酯释放并且这导致pH降低并且由此导致姜黄素pH指示剂的颜色变化。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照亮时，从所洗涤的脏纺织品反射-发射的光的颜色变化程度。

用专业平板扫描仪(EPSON EXPRESSION 10000XL，阿特亚公司(AteaA/S)，Lautrupvang 6，2750巴勒鲁普，丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤的脏纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。

归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为相对于反射-发射的蓝色(B)和(R)光的总和，绿色光(G)的反射-发射的增加。相对于参考脂肪酶(SEQ ID NO 3)，脂肪酶的洗涤性能(RP(洗涤))被计算为：RP(洗涤)＝(G/(B+R)(测试的脂肪酶)-G/(B+R)(无酶))/(G/(B+R)(参考脂肪酶)-G/(B+R)(无酶))。

表1：洗涤性能

酶	RP(洗涤)
		RmL wt-成熟蛋白质	1,00
RPPI0018	-0,08
		RPPI0019	0,00

实例3：RPPI-变体的活化

在0.03mg/mL的酶浓度下通过测量由经纯化的蛋白质样品释放4-甲基伞形酮(4-MU)来确定性能(即，水解活性)，该经纯化的蛋白质样品在0.2M HEPES，pH 8.5中稀释，并且分别按以下进行孵育：

(1)有和没有蛋白酶：在50％(w/w)洗涤剂B中的0,68％(v/v)在RT下，持续15分钟。

(2)有和没有还原剂：在0.2M HEPES缓冲液(pH 8.5)中的5uM三(2-羧乙基)膦(TCEP)，在RT下，持续15分钟。

(3)有和没有还原剂：在0.2M HEPES缓冲液(pH 8.5)中的2,0％(w/v)亚硫酸钠NaSO₂(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)207845)，在RT下，持续15分钟。

(4)有和没有还原剂：在0.2M HEPES缓冲液(pH 8.5)中在50％(w/w)洗涤剂B中的5uM三(2-羧乙基)膦(TCEP)，在RT下，持续15分钟。

(5)有和没有还原剂：在0.2M HEPES缓冲液，pH 8.5中在50％(w/w)洗涤剂B中的2,0％(w/v)亚硫酸钠NaSO₂(西格玛-奥德里奇公司207845)，在RT下，持续15分钟。

在初始底物制备步骤中，将纤维素(Avicel)用甘油三酯和4-甲基伞形酮油酸(4-MU油酸)的混合物来包衣。在该测定中，包衣的纤维素纤维在缓冲液、洗涤剂溶液和脂肪酶溶液中悬浮。通过测量在Ex:365nm和Em:445nm下作为时间函数的释放的4-甲基伞形酮(4-MU)的荧光来监测在纤维素悬浮液中的脂肪酶活性。

化学品：4-甲基伞形酮油酸(油酸4-甲基伞形酮酯，西格玛奥德里奇公司75164)；正己烷(西格玛奥德里奇公司15671)；橄榄油(西格玛奥德里奇公司O-1514)；纤维素棉短绒，Avicel H-101(西格玛奥德里奇公司11365)；HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸、西格玛奥德里奇公司H33759)；氯化钙脱水物；Triton^TM X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基-聚乙二醇、叔辛基苯基聚乙二醇、聚乙二醇叔-辛基苯基醚西格玛奥德里奇公司T9284)；4mol/L NaOH(Fluka 35274)；标准B型洗涤剂；三(2-羧乙基)膦(TCEP)；NaSO₂(西格玛-奥德里奇207845)。

用于孵育的HEPES缓冲液基于以下储备溶液：1M HEPES、5mM CaCl₂、50ppm TritonX-100。用4M NaOH调节至pH 8.5。

通过将668uL的4-MU-油酸原液(4mg/mL 4-甲基伞形酮油酸在己烷中)和3.03mL橄榄油原液移液至在用于旋转蒸发器的圆底烧瓶中的100mL己烷中来制备包衣的纤维素纤维，并且适当混合，之后添加10g纤维素纤维。将烧瓶安装到旋转蒸发器上，并且通过在减压和恒混合(通过旋转)下蒸发去除己烷，以确保底物在纤维素上均匀地包衣。完全去除己烷以后，将包衣的纤维素纤维转至棕色烧瓶中并将材料在避光-20°下储存直至使用。

通过将180μL的底物悬浮液转移至黑色微孔微量滴定板(例如Nunclonsurface、具有黑底的96孔黑色板NUNC 137101)的各孔中进行测定。在移液时重要的是要保持底物悬浮液恒定、充分的混合以确保相同量的包衣的纤维素纤维被转移至微量滴定板的各孔中。

以添加20uL的孵育溶液来开始测定。应在添加洗涤剂工作溶液(1.835g标准B型洗涤剂；100ml 1M HEPES缓冲液，通过向测试***中添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺＝4:1)将水硬度调节至15°dH，并最终用Milli Q水调节至500mL)之后立即添加酶孵育溶液。

在酶添加之后从1至6分钟，通过每隔30秒测量在Ex：365nm和Em：445nm处的荧光(动态模式)来获得酶活性。在第一次测量之前通过摇动5秒钟来混合板，但是在接下来的测量之间不再这样做。在室温下，即在大约20℃下进行测定。

使用在酶添加之后的1-6分钟时间窗，将活性计算为荧光对时间的图的斜率(单位：RFU/秒，其中RFU是相对荧光信号单位)。

表2：蛋白酶对脂肪酶活性的影响

表3：TCEP对脂肪酶活性的影响

表4：NaSO₂对脂肪酶活性的影响

表5：TCEP/标准B型洗涤剂对脂肪酶活性的影响

表6：NaSO₂/标准B型洗涤剂对脂肪酶活性的影响

实例4：RPPI-变体的洗涤剂稳定性

通过随着时间的加速储存稳定性实验测试洗涤剂稳定性。在30℃下，将封闭的玻璃小瓶中的10g标准B型洗涤剂分别与％标准B型洗涤剂和0,76ug/mL蛋白质样品孵育3个月，并且以规律的时间间隔进行残余活性测量。对于每种蛋白质，将平行样品储存在-18℃下，并且在平行测量作为参考样品之前进行除霜。

通过测量由储存的洗涤剂/蛋白质样品释放4-甲基伞形酮(4-MU)来确定性能(即，水解活性)，该储存的洗涤剂/蛋白质样品在0,2M HEPES缓冲液(pH 8,5)中与1.35％(w/v)Savinase孵育15分钟。在初始底物制备步骤中，将纤维素(Avicel)用甘油三酯和4-甲基伞形酮油酸(4-MU油酸)的混合物来包衣。在该测定中，包衣的纤维素纤维在缓冲液、洗涤剂溶液和脂肪酶溶液中悬浮。通过测量在Ex:365nm和Em:445nm下作为时间函数的释放的4-甲基伞形酮(4-MU)的荧光来监测在纤维素悬浮液中的脂肪酶活性。

化学品：4-甲基伞形酮油酸(油酸4-甲基伞形酮酯，西格玛奥德里奇公司75164)；正己烷(西格玛奥德里奇公司15671)；橄榄油(西格玛奥德里奇公司O-1514)；纤维素棉短绒，Avicel H-101(西格玛奥德里奇公司11365)；HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸、西格玛奥德里奇公司H33759)；氯化钙脱水物；Triton^TM X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基-聚乙二醇、叔辛基苯基聚乙二醇、聚乙二醇叔-辛基苯基醚西格玛奥德里奇公司T9284)；4mol/L NaOH(Fluka 35274)；标准B型洗涤剂。

用于孵育的HEPES缓冲液基于以下储备溶液：1M HEPES、5mM CaCl₂、50ppm TritonX-100。用4M NaOH调节至pH 8.5。

通过将668uL的4-MU-油酸原液(4mg/mL 4-甲基伞形酮油酸在己烷中)和3.03mL橄榄油原液移液至在用于旋转蒸发器的圆底烧瓶中的100mL己烷中来制备包衣的纤维素纤维，并且适当混合，之后添加10g纤维素纤维。将烧瓶安装到旋转蒸发器上，并且通过在减压和恒混合(通过旋转)下蒸发去除己烷，以确保底物在纤维素上均匀地包衣。完全去除己烷以后，将包衣的纤维素纤维转至棕色烧瓶中并将材料在避光-20℃下储存直至使用。

通过将180uL的底物悬浮液转移至黑色微孔微量滴定板(例如Nunclon surface、具有黑底的96孔黑色板NUNC 137101)的各孔中进行测定。在移液时重要的是要保持底物悬浮液恒定、充分的混合以确保相同量的包衣的纤维素纤维被转移至微量滴定板的各孔中。

以添加20uL的孵育溶液来开始测定。应在添加洗涤剂工作溶液(1.835g标准B型洗涤剂)之后立即添加酶孵育溶液；通过向测试体系添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺＝4:1)将100mL 1M HEPES缓冲液的水硬度调节至15°dH并且最终使用Milli Q水调节至500mL)。对于空白，添加20uL脂肪酶孵育缓冲液。

在酶添加之后从1至6分钟，通过每隔30秒测量在Ex：365nm和Em：445nm处的荧光(动态模式)来获得酶活性。在第一次测量之前通过摇动5秒钟来混合板，但是在接下来的测量之间不再这样做。在室温下，即在大约20℃下进行测定。

使用在酶添加之后的1-6分钟时间窗，将活性计算为荧光对时间的图的斜率(单位：RFU/秒，其中RFU是相对荧光信号单位)。通过参考平行测量的样品计算残余活性，该平行测量的样品以相同时间间隔、在-18℃下储存并且在测量之前进行除霜。

基于在时间“t”的残余活性(RA)，通过以下公式计算半衰期：t_1/2＝t*ln(2)/ln(RA_o/Ra_t)

表7：脂肪酶的半衰期

脂肪酶	时间(天)
		Lipex	38
RmL wt	3
		RPPI-0018	55
RPPI-0019	79

实例5：TLL-变体

脂肪酶(EC 3.1.1.3)代表一类能够作用于水不溶性底物的羧酸酯水解酶。为了创建控制两种酶活性和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TIL)中结合的内在开关，在位点255和86处将两个半胱氨酸残基工程化到蛋白质骨架中。研究与脂肪酶活化相关的结构特征表明该变体被锁定在预活化状态。在有和没有还原剂的橄榄油和猪油的底物乳液和天然脂质层上证实了酶活性和结合的控制。与野生型相比，锁定的脂肪酶显示非常低的酶活性(约10％)。在释放脂肪酶锁定时，酶活性完全恢复到包埋在橄榄油和猪油脂质层中的底物乳液和pNP-酯。此外，观察到锁定的脂肪酶与天然脂质底物仅10％的结合，但在添加还原剂后，结合恢复。由QCM-D测量支持这一结果，表明未锁定的脂肪酶的结合率增加了七倍。

三酰甘油水解酶(脂肪酶)通常含有若干个二硫键，以在氧化环境中实现高的热稳定性和动力学稳定性，使它们成为具有吸引力的工业生物催化剂。来自疏棉状嗜热丝孢菌(TlL)的酶在水-脂质界面处水解甘油三酯，并且野生型含有三种二硫键(C22-C268、C14-C107、C36-C41)。在均匀水性溶液中，TIL和相关脂肪酶对水溶性单体底物的活性较低。然而，当底物达到其临界胶束浓度时，脂肪酶被呈现在表面上，使得水解活性增加了许多倍。这种现象被称为“界面活化”，并且除了底物的聚集，它还涉及酶本身的结构变化。更具体地，结构改变代表被称为盖(或瓣)的α-螺旋结构域的重排，覆盖酶无活性状态下的活性位点。活化后，该盖在刚体铰链型运动中改变构象，暴露活性位点三联体(His258、Asp201、和Ser146)，该活性位点三联体使得底物通过并开始催化。盖是高度两性的，含有疏水性和亲水性残基的不同分布。在封闭状态下，亲水性残基暴露于蛋白质表面，与极性溶剂有良好的相互作用。当脂肪酶遇到脂质界面时，盖打开并且盖中的疏水性残基变得暴露并用作“脂质锚”，将酶正确定位以用于在底物结合时进行催化。总体上，盖开启事件导致组合的约的疏水面区域暴露，一个在水-脂质界面处变得在能量上可行的过渡。

通过将两个半胱氨酸残基掺入蛋白质骨架，来将变体(锁定的TIL)被设计为含有内在活性开关，使得能够形成二硫键将盖锁定在闭合构象中。在变体的晶体结构中证实了内部开关的成功形成，其揭示了闭合且稍微有张力的盖构造。为评估该有张力的构象对蛋白质稳定性的影响，使用热熔化测定法来显示与野生型相比，锁定的TIL的热稳定性降低。虽然盖是封闭的，但调查盖区域周围的结构特征表明锁定的TIL处于预活化状态。正如由其增加的温度因子所表明的，该变体的强制封闭结构似乎导致蛋白质骨架中的结构不稳定性。

在非离子表面活性剂乳化的或在经提炼的猪脂肪和橄榄油的脂质层中包埋的短、中和长链酯底物上评估二硫键对酶活性的影响。此外，分别使用微量滴定板设置和QCM-D分析研究了在与天然底物和疏水表面的界面结合中盖的作用。

材料.除非另有说明，所有的试剂和生物化学用品购买自西格玛奥德里奇公司和附属公司。

脂肪酶变体的工程化和命名.通过制成位点突变I86C和I255C，将内在活性开关设计到TIL中，使二硫键形成，将脂肪酶盖锁定在其闭合状态。该变体被称为锁定的TIL。另外，制成单个半胱氨酸变体对照，C86(TIL_C86)和C255(TlL_C255)。

变体构建、转化和筛选.通过单位点诱变创建变体。对整个基因进行DNA测序，并转化到米曲霉菌株中并根据前述的方法进行发酵。原生质体储存在-80℃下，并在需要时解冻。通过运行SDS-page分析SimplyBlue Safestain(生命技术公司(Life Technologies)，目录号LC6065)来验证表达。使用标准pNP-戊酸酯活性测定对成功转化的米曲霉菌株进行变体筛选。

蛋白质纯化.使用具有合适过滤器(目录号：1820-090，沃特曼公司)的过滤装置(耐洁(Nalgene))将发酵液无菌过滤。将NaCl添加至经过滤的上清液中至终浓度为1M。根据前述的方案，使用 Prime(安玛西亚公司(Amersham Biosciences))进行蛋白质纯化变体被高度纯化，其中通过使用Simply Blue Safestain(生命技术公司(LifeTechnologies)，目录号LC6065)的SDS-page验证没有可观察到的污染。使用离心过滤装置(Ultracel-lOK，密理博公司(Millipore))将所有样品进行缓冲液交换并浓缩在50mM MOPSpH 7.5中。对照C86变体的纯化失败，这归因于低表达产率和在纯化过程中与柱的高度结合。

热稳定性.将SYPRO Orange^TM(SO)(目录号S5692，5000x储备浓缩物)在50mM MOPS，pH 7.5中稀释250x。将蛋白质样品稀释至0.1mg/ml。向白色96孔MTP(Eurogentec RT-PL96-AFW)中添加15μL SO和蛋白质溶液至30μL的终体积，达到0.1mg/ml的最终蛋白质浓度(3μM)。用光学PCR密封件(Eurogentec RT-OPSL 100)密封该平板。在25℃下，从25℃至96℃的温度梯度，以76℃ pr/hr的扫描速率，以初始15分钟反应时间来运行，确定每种变体熔解曲线(StepOnePlus实时PCR***，应用生物***公司(Applied Biosystems))。

pNP-酯乳液测定.在底物缓冲液(50mM Tris；10mM CaCl₂；0.4％Triton X-100(CMC是0.015％(v/v)(20)))中分别确定针对短链和中链pNP-酯底物，pNP-丁酸酯和pNP-癸酸酯的活性。添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为还原剂，浓度范围为0至10mM。将10uL酶溶液与1L底物缓冲液混合。经5分钟测量由于释放的pNP-部分而引起的405nm处吸光度的增加，并且从最陡的斜率确定比活性。最终的脂肪酶浓度是2ug/mL。

脂肪酶活性测定.根据前述的方案确定脂肪酶活性。分别制备两组底物包被的96孔微量滴定测定板：1)橄榄油+pNP-癸酸酯，和2)经提炼的猪脂肪(猪油)+pNP-棕榈酸酯(以1:1摩尔比)。在非结合板(康宁公司(Corning))中，将190uL缓冲液(100mM Tris pH 7、8或9；2mM CaCl₂；有或没有5mM TCEP)添加至10uL蛋白质样品(50ug/mL)中，从而使脂肪酶与孔表面的非特异性吸附最小化。随后将板在室温下孵育10分钟。使用多道移液管(瑞宁公司(Rainin))，将150uL转移至测定板中，并且经10分钟测量由于释放的pNP-部分而引起的405nm处吸光度的增加，并且从最陡的斜率确定活性。

与天然的甘油三酯底物的结合.与天然底物(例如，橄榄油和猪油)的脂质层结合的差异在类似于以上描述的脂肪酶测定的设置中进行了研究，但没有pNP-底物。在25mMMOPS pH 7.5中将样品稀释至50μg/mL。在非结合微量滴定板(Coming)中，将有和没有1mMTCEP的190μL缓冲液(100mM Tris pH 8+2mM CaCl₂)添加至10μL样品中。在室温下孵育10分钟后，将150μL体积的样品添加至用100nmol橄榄油或猪油包被的微量滴定板中。通过在上清液中随着时间(在2-40分钟之间)测量残余活性来确定脂肪酶与橄榄油或猪油脂质表面的结合。在100μL 50mM Tris pH 75+0.4％TritonX-100+10mM CaCl₂反应缓冲液中测定20μL上清液，在405nm处从pNP-丁酸酯水解的初始速率计算活性。

完整的分子量分析.使用MAXIS II电喷射质谱仪(Bruker Daltonik GmbH，不莱梅，德国)，通过LC-ESI-MS分析针对变体锁定的TIL进行确定。在milliQ水中将所有样品稀释至约0.5mg/mL。针对未经处理的样品和用1mM TCEP处理的样品确定完整的分子量。在被施加到Aeris Widepore C4柱(菲罗门公司(Phenomenex))上，洗涤并运行乙腈线性梯度进行洗脱之前，将样品孵育30分钟，并且通过Ultimate 3000LC***(戴安公司(Dionex))以300mL/min的流引入电喷射源。用DataAnalysis版本4.2(Bruker DaltonikGmbH，不莱梅，德国)进行数据分析。

稳态荧光光谱学.在室温下(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，LS50B)，在石英比色杯(Hellma QS 105.250)中，在荧光光谱仪上记录内在色氨酸荧光发射光谱。用在295nm处的激发在310nm-650nm之间检测发射。激发和发射狭缝宽度分别是4nm和12nm。扫描速率是50nm/min，并且进行了平均两次连续的测量。在两种不同的缓冲液，例如A)25mM MOPS pH7.5，和B)25mM MOPS pH 7.5+0.4％(v/v)Triton X-100+1mM TCEP中测量发射光谱。注意，使用的Triton X-100(Cas号93422)是还原形式，适合用于用与氧化的Triton X-100大致相同的CMC的荧光测量(CMC与Triton X-100分别是0.25mM与0.22mM(21))。通过每4分钟进行发射扫描来测量荧光发射强度随时间的变化，持续30分钟。60分钟后进行最终扫描。

脂肪酶结合的QCM-D分析.在具有耗散仪(QCM-D(Q-Sense，瑞典))的E4石英晶体微量天平上进行脂肪酶结合实验，该耗散仪具有温度控制和确保受控流速的蠕动泵。在标准疏水面上进行结合，在Au传感器晶体上作为烷硫醇((HS(CH₂)₁₅CH₃)表面组装的单层(SAM)产生。用于这些实验的缓冲液是用MilliQ水制备的50mM HEPES(pH 7.5)、100mM NaCl、1mMCaCl₂，随后过滤(0.22μm)并脱气。在该研究中，我们监测在5μM记录频率下的脂肪酶结合和5次谐波的耗散变化(泛音n＝3、5、7、9、和11)。对于所有样品，针对所有泛音的ΔF值相似且具有小的耗散值，因此可以根据Sauerbrey方程计算吸附蛋白质量，将ΔF转换成质量，以ng/cm²计。温度保持在22℃下，并且用Q-tool软件分析原始数据，并使用Igor Pro(Wavemetrics Inc.)用单指数衰减函数拟合动力学。

结晶和数据收集.使用来自新英格兰生物实验室(New England BioLabs)的去糖基化试剂盒(目录号P0702L)在结晶前对蛋白质进行EndoH处理。蛋白质与EndoH的比率为10:1，并且在G5反应缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH 5.5)的存在下在37℃下孵育过夜。使用坐滴蒸汽扩散用液滴装置，使用Mosquito Cr_ystal液体处理机器人(TTP LabTech，英国)用在96孔格式的板(MRC 2-孔结晶微孔板，Swissci，瑞士)中的150nl蛋白质溶液加上150nl储库溶液进行初始结晶筛选，该96孔格式的板对54_μL储库溶液进行平衡。将结晶托盘置于RigakuMinstrel HT-UV成像***中用于进行储存和检验。在两个温度(4℃和20℃)下进行实验，伴随许多商业筛选。在20℃下，在JCSG Al(50％PEG400，0.2M硫酸锂，0.1M乙酸钠，pH 4.5)中获得最佳的衍射质量晶体。在钻石光源射束线104处收集至的数据。

结构溶液和精炼.除非另有说明，均使用来自CCP4套件中的程序进行所有计算。用XDS处理数据。空间群是P43212；通过MOLREP用野生型疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(PDB条目；1DT3)的结构作为研究模型来解决该结构。使用REFMAC对结构进行了精炼，通过COOT中的手动建模/校正进行迭代，并使用MOLPROBITY进行验证。

如前述所述，确定分别针对在橄榄油和猪油的脂质层包埋的pNP-癸酸酯和pNP-棕榈酸酯的活性。在不存在还原剂的情况下，锁定的TIL的活性非常低(2umol/min/mg和0.5μmol/min/mg)。在将TCEP添加至缓冲液后，锁定的TIL的酶活性增加几乎10倍，表明与野生型酶和单个半胱氨酸变体(TIL_C255)相比，酶活性完全恢复。重要的是，这些结果清楚地表明如由前述的研究所支持的盖在控制酶活性和界面活化方面的关键作用。

使用内在色氨酸荧光观察到的锁定的TIL的时间依赖性开锁.如前述所显示的，TIL的盖中的Trp89负责高于60％的蛋白质总荧光发射。因此，我们测量了TIL和锁定的TIL的稳态荧光发射光谱以研究Trp89周围的微环境。在单独的缓冲液(无表面活性剂或还原剂)中，与野生型的的339nm相比，针对锁定的TIL的Trp荧光发射光谱在336nm处发生轻微的蓝移并且发射最大。另外，荧光强度猝灭(约30％)。硫醇基团和二硫键充当在蛋白质中色氨酸和酪氨酸荧光的强猝灭剂。猝灭的强烈程度被认为是来自成功形成的二硫键。为了研究锁定的TIL的盖开启(活化)，在活性测定中使用的缓冲液中随时间测量荧光发射光谱(图3)。由于在该缓冲液中的洗涤剂浓度比CMC(约0.015％v/v)高若干倍，野生型的发射光谱可能代表了根据前述研究的开放盖构象的Trp环境。

观察到荧光强度的大幅增加，与前述的研究一致，表明在胶束溶液中TIL中的Trp的量子产率增加。在该缓冲液中内在Trp猝灭的程度(约30％)是未改变的，表明二硫键不受洗涤剂胶束存在的影响。为了测量针对锁定的TIL随着时间的盖开启，添加还原剂并且在60分钟的过程中选取发射光谱。在室温下孵育60分钟后，荧光发射光谱经历红移和随着时间的荧光强度的增加，达到与野生型相同的荧光强度。

在不存在还原剂的情况下，在pH 8时，通过测量上清液中的残留活性作为时间的函数来研究TIL和锁定的TIL与橄榄油和猪油的脂质表面的结合。对于TIL，在缓冲液溶液中有和没有TCEP的橄榄油和猪油上40分钟后，结合分子的级分达到约50％。对于未经处理的锁定的TIL，孵育40分钟后，在橄榄油和猪油上的结合级分非常低(约10％)。然而，当TCEP被添加至缓冲液中时，在具有的两种脂质底物上，锁定的TIL展现出类似于野生型的结合特征，其中40分钟后具有-50％结合级分。

表8：在不同浓度的TCEP的存在下，由TlL和TlL变体锁定的TlL针对pNP-癸酸酯的比活性。

表9：在不同浓度的TCEP的存在下，由TlL和TlL变体锁定的TlL针对pNP-丁酸酯的比活性。

表10：在作为还原剂的5mM二硫苏糖醇(DTT)存在或不存在的情况下，由TlL和TlL变体锁定的TlL针对pNP-癸酸酯和pNP-丁酸酯的比活性。

表11：针对分别在橄榄油或猪脂肪(猪油)的脂质层包埋的底物pNP-癸酸酯或pNP-棕榈酸酯确定脂肪酶活性。

序列表

<110> 诺维信公司

<120> 用于产生脂肪酶的方法

<130> 13248-WO-PCT

<160> 16

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 米黑根毛霉

<220>

<221> CDS

<222> (13)..(1101)

<220>

<221> 信号肽

<222> (13)..(84)

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (85)..(294)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (295)..(930)

<400> 1

ggatccttca cc atg gtt ctc aag cag cgt gca aac tac cta gga ttt ctg 51

Met Val Leu Lys Gln Arg Ala Asn Tyr Leu Gly Phe Leu

-90 -85

att gta ttc ttc acg gcc ttc ctg gtg gaa gcg gta ccc atc aag aga 99

Ile Val Phe Phe Thr Ala Phe Leu Val Glu Ala Val Pro Ile Lys Arg

-80 -75 -70

caa tcg aat tcc acg gtc gac agt ctg ccg cct ctc atc ccc tcg aga 147

Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg

-65 -60 -55 -50

acc tcg gca cct tca tca tca cca agc aca acc gac cct gaa gct cca 195

Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro

-45 -40 -35

gcc atg agt cgc aat gga ccg ctg ccc tcg gat gta gag act aaa tat 243

Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr

-30 -25 -20

ggc atg gct ttg aat gct act tcc tat ccg gat tct gtg gtc caa gca 291

Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala

-15 -10 -5

atg agc att gat ggt ggt atc cgc gct gcg acc tcg caa gaa atc aat 339

Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn

-1 1 5 10 15

gaa ttg act tat tac act aca cta tct gcc aac tcg tac tgc cgc act 387

Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr

20 25 30

gtc att cct gga gct acc tgg gac tgt atc cac tgt gat gca acg gag 435

Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu

35 40 45

gat ctc aag att atc aag act tgg agc acg ctc atc tat gat aca aat 483

Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn

50 55 60

gca atg gtt gca cgt ggt gac agc gaa aaa act atc tat atc gtt ttc 531

Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe

65 70 75

cga ggt tcg agc tct atc cgc aac tgg att gct gat ctc acc ttt gtg 579

Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val

80 85 90 95

cca gtt tca tat cct ccg gtc agt ggt aca aaa gta cac aag gga ttc 627

Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe

100 105 110

ctg gac agt tac ggg gaa gtt caa aac gag ctt gtt gct act gtt ctt 675

Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu

115 120 125

gat caa ttc aag caa tat cca agc tac aag gtt gct gtt aca ggt cac 723

Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His

130 135 140

tca ctc ggt ggt gct act gcg ttg ctt tgc gcc ctg gat ctc tat caa 771

Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln

145 150 155

cga gaa gaa gga ctc tca tcc agc aac ttg ttc ctt tac act caa ggt 819

Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly

160 165 170 175

caa cca cgg gta ggc gac cct gcc ttt gcc aac tac gtt gtt agc acc 867

Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr

180 185 190

ggc att cct tac agg cgc acg gtc aat gaa cga gat atc gtt cct cat 915

Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His

195 200 205

ctt cca cct gct gct ttt ggt ttt ctc cac gct ggc gag gag tat tgg 963

Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp

210 215 220

att act gac aat agc cca gag act gtt cag gtc tgc aca agc gat ctg 1011

Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu

225 230 235

gaa acc tct gat tgc tct aac agc att gtt ccc ttc aca agt gtt ctt 1059

Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu

240 245 250 255

gac cat ctc tcg tac ttt ggt atc aac aca ggc ctc tgt act taactcgag 1110

Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

260 265

<210> 2

<211> 363

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉

<400> 2

Met Val Leu Lys Gln Arg Ala Asn Tyr Leu Gly Phe Leu Ile Val Phe

-90 -85 -80

Phe Thr Ala Phe Leu Val Glu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn

-75 -70 -65

Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala

-60 -55 -50

Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser

-45 -40 -35

Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala

-30 -25 -20 -15

Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile

-10 -5 -1 1

Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr

5 10 15

Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro

20 25 30

Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys

35 40 45 50

Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val

55 60 65

Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser

70 75 80

Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser

85 90 95

Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser

100 105 110

Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe

115 120 125 130

Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly

135 140 145

Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Glu

150 155 160

Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg

165 170 175

Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro

180 185 190

Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro

195 200 205 210

Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp

215 220 225

Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser

230 235 240

Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu

245 250 255

Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

260 265

<210> 3

<211> 269

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉

<400> 3

Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val

20 25 30

Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp

35 40 45

Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala

50 55 60

Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro

85 90 95

Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu

100 105 110

Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp

115 120 125

Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser

130 135 140

Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg

145 150 155 160

Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln

165 170 175

Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly

180 185 190

Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu

195 200 205

Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile

210 215 220

Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu

225 230 235 240

Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp

245 250 255

His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

260 265

<210> 4

<211> 70

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉

<400> 4

Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr

20 25 30

Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp

35 40 45

Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp

50 55 60

Ser Val Val Gln Ala Met

65 70

<210> 5

<211> 876

<212> DNA

<213> 疏棉状嗜热丝孢菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(873)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(51)

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (52)..(66)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (67)..(873)

<400> 5

atg agg agc tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tct gcg tgg acg gcc ttg 48

Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

-20 -15 -10

gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc 96

Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe

-5 -1 1 5 10

aat ctc ttt gca cag tat tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat 144

Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn

15 20 25

gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc 192

Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

30 35 40

gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct 240

Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

45 50 55

gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa 288

Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

60 65 70

ttg atc gtc ctc tct ttc cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc 336

Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile

75 80 85 90

ggg aat ctt aac ttc gac ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc 384

Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

95 100 105

tgc agg gga cat gac ggc ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat 432

Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

110 115 120

acg tta agg cag aag gtg gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat 480

Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

125 130 135

cgc gtg gtg ttt acc gga cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt 528

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140 145 150

gcc gga gca gac ctg cgt gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca 576

Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser

155 160 165 170

tat ggc gcc ccc cga gtc gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc 624

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

175 180 185

gta cag acc ggc gga aca ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att 672

Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

190 195 200

gtc cct aga ctc ccg ccg cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca 720

Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

205 210 215

gag tac tgg atc aaa tct gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat 768

Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp

220 225 230

atc gtg aag ata gaa ggc atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct 816

Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro

235 240 245 250

aac att ccg gat atc cct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg 864

Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

255 260 265

aca tgt ctt tag 876

Thr Cys Leu

<210> 6

<211> 291

<212> PRT

<213> 疏棉状嗜热丝孢菌

<400> 6

Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

-20 -15 -10

Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe

-5 -1 1 5 10

Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn

15 20 25

Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

30 35 40

Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

45 50 55

Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

60 65 70

Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile

75 80 85 90

Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

95 100 105

Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

110 115 120

Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

125 130 135

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140 145 150

Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser

155 160 165 170

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

175 180 185

Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

190 195 200

Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

205 210 215

Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp

220 225 230

Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro

235 240 245 250

Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

255 260 265

Thr Cys Leu

<210> 7

<211> 269

<212> PRT

<213> 疏棉状嗜热丝孢菌

<400> 7

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

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Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

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Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

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Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

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Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

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Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

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His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

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Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

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Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

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Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

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260 265

<210> 8

<211> 338

<212> PRT

<213> 犁头霉属物种

<400> 8

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65 70 75 80

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100 105 110

Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys

115 120 125

Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn Val Leu Val Ala Val Gly

130 135 140

Glu Lys Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val Phe Arg Gly Thr Ser Ser Ile

145 150 155 160

Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe Val Pro Val Asn Tyr Pro Pro

165 170 175

Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu

180 185 190

Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys Ala Gln Leu Asp Arg His

195 200 205

Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr

210 215 220

Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His His Gly His Ala Asn Ile

225 230 235 240

Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala

245 250 255

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Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu

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Cys Leu

<210> 9

<211> 389

<212> PRT

<213> 小孢根霉华变种

<400> 9

Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu Leu

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115 120 125

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145 150 155 160

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210 215 220

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225 230 235 240

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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385

<210> 10

<211> 363

<212> PRT

<213> 闪光须霉

<400> 10

Met Lys Phe Thr Pro Leu Ser Val Val Ala Ile Ala Met Leu Phe Val

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Ser Ser Pro Val Ser Met Ala Ala Pro Ala Thr Glu Asn Thr Leu Asn

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<210> 11

<211> 395

<212> PRT

<213> 卷枝毛霉

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<210> 12

<211> 384

<212> PRT

<213> 卷枝毛霉

<400> 12

Met Val Ser Phe Val Ser Ile Ser Gln Gly Ile Ser Leu Phe Ile Val

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65 70 75 80

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115 120 125

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met

260 265 270

Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Lys Ser Asn Leu Ala Ile

275 280 285

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290 295 300

Val Asp Ser Thr Gly Ile Thr Phe Ser Arg Ser Val Asn Asn Arg Asp

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Ile Val Pro His Val Pro Pro Gln Ala Trp Gly Phe Leu His Pro Gly

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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<210> 13

<211> 378

<212> PRT

<213> 雅致放射毛霉

<400> 13

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275 280 285

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Pro Phe Ser Arg Ser Val Asn Asp Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro

305 310 315 320

Pro Gln Ala Phe Gly Tyr Leu His Ala Gly Val Glu Ala Trp Ala Arg

325 330 335

Thr Ser Thr His Val Gln Ile Cys Asn Ser Gln Ile Glu Thr Gly Ser

340 345 350

Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Phe Thr Asp His Leu Thr

355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Asn Glu Gly Leu Cys Leu

370 375

<210> 14

<211> 383

<212> PRT

<213> 雅致放射毛霉

<400> 14

Met Val Ser Phe Thr Leu Ile Ser His Gly Val Lys Leu Val Leu Val

1 5 10 15

Thr Ser Cys Leu Met Met Gly Ser Ser Glu Ser Ala Pro Val Ala Gly

20 25 30

Asn Lys Thr Val Ala Asn Ser Ser Asn Val Thr Ser Asp Ser Phe Val

35 40 45

Leu Pro Ser Ile Ile Ala Glu Arg Val Ile Ala Pro Lys Val Pro Val

50 55 60

Gly Asn His Asn Met Glu Lys Asp Ala Ile Thr Lys Asn Leu Lys Trp

65 70 75 80

Tyr Glu Glu His Val Gly Lys Ala Asn Ile Thr Lys Arg Gly Gly Glu

85 90 95

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100 105 110

Pro Ala Ile Thr Thr Ser Asp Ala Ile Tyr Val Ala Ser Thr Ala Gln

115 120 125

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Tyr Ala Pro Asp Gly Lys Leu Ile Lys Thr Phe Thr Ser Leu Ile Ser

165 170 175

Asp Thr Asn Gly Phe Val Met Arg Ser Asp Ser Gln Lys Thr Ile Tyr

180 185 190

Leu Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Thr Asp Met

195 200 205

Val Phe Asp Leu Ala Ala Tyr Gly Pro Val Ser Gly Ala Lys Val His

210 215 220

Arg Gly Phe Leu Ala Ser Tyr Gln Gln Val Val Gly Ser Tyr Phe Pro

225 230 235 240

Val Val Gln Asn Gln Leu Thr Ser Tyr Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val

245 250 255

Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Ala Leu Asp

260 265 270

Leu Tyr Gln Arg Asp Lys Arg Phe Gly Pro Asn Asn Met Ser Ile Phe

275 280 285

Thr Val Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val

290 295 300

Asp Ser Thr Asn Ile Pro Phe Ser Arg Ser Val Asn Asp Arg Asp Ile

305 310 315 320

Val Pro His Leu Pro Pro Gln Ala Phe Gly Tyr Leu His Pro Gly Val

325 330 335

Glu Ala Trp Ala Arg Ser Ser Thr Asn Val Gln Ile Cys Asn Ser Gln

340 345 350

Ile Glu Thr Ser Ser Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile

355 360 365

Glu Asp His Leu Thr Tyr Tyr Gly Ile Asn Glu Gly Lys Cys Leu

370 375 380

<210> 15

<211> 377

<212> PRT

<213> 五通桥毛霉

<400> 15

Met Val Ser Phe Val Ser Ile Ser Gln Gly Ile Ser Leu Phe Ile Ile

1 5 10 15

Val Ser Ser Met Leu Thr Gly Ser Thr Asn Ala Ala Pro Thr Ser Thr

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Asn Lys Thr Thr Glu Ala Thr Thr Phe Thr Leu Pro Pro Leu Ile Ser

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Ser Arg Ile Ile Ala Pro Lys Val Pro Ser Gly Ser His Asp Val Glu

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100 105 110

Ser Thr Val Val Ile Ala Thr Thr Ala Gln Ile Thr Glu Leu Lys Met

115 120 125

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130 135 140

Asn Ala Trp Thr Cys Thr Asn Cys Leu Lys Phe Val Pro Asp Gly Lys

145 150 155 160

Leu Ile Thr Thr Phe Ser Ser Leu Ile Thr Asp Thr Asn Gly Phe Val

165 170 175

Leu Arg Ser Asp Ala Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe Arg Gly Thr

180 185 190

Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Thr Asp Leu Ile Phe Asp Phe Thr Asp

195 200 205

Tyr Thr Pro Val Ser Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe Tyr Ala Ser

210 215 220

Tyr Lys Glu Val Val Asn Ser Tyr Phe Pro Tyr Ile Gln Ser Gln Leu

225 230 235 240

Thr Ala Tyr Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly

245 250 255

Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Ser

260 265 270

Arg Leu Ser Lys Ser Asn Leu Ala Ile Tyr Thr Val Gly Cys Pro Arg

275 280 285

Thr Gly Asn Pro Ala Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr Gly Ile Thr

290 295 300

Phe Ser Arg Ser Val Asn Asn Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro Pro

305 310 315 320

Gln Ala Phe Gly Tyr Leu His Pro Gly Val Glu Ala Trp Ala Arg Ser

325 330 335

Ser Ser Lys Val Gln Ile Cys Thr Pro Asp Ile Glu Thr Ser Leu Cys

340 345 350

Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Phe Thr Asp His Leu Thr Tyr

355 360 365

Tyr Asp Ile Asn Glu Gly Leu Cys Leu

370 375

<210> 16

<211> 392

<212> PRT

<213> 米根霉

<400> 16

Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Ala Val Pro Val Ser Gly Lys

20 25 30

Ser Gly Ser Ser Asn Thr Ala Val Ser Ala Ser Asp Asn Ala Ala Leu

35 40 45

Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro Pro Ser Asn Lys Gly Ser

50 55 60

Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Asn Met Gln Lys Asn Thr Glu

65 70 75 80

Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr Ser Ile Gly Lys Arg Asp

85 90 95

Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu Pro Ser Asp Ala Pro

100 105 110

Pro Ile Ser Leu Ser Ser Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys

115 120 125

Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala

130 135 140

Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val Val Pro Gly Asn Lys

145 150 155 160

Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile

165 170 175

Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg

180 185 190

Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser

195 200 205

Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys

210 215 220

Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu

225 230 235 240

Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala

245 250 255

His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala

260 265 270

Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu

275 280 285

Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly Gly Pro Arg Val Gly

290 295 300

Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln

305 310 315 320

Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro Pro Gln Ser

325 330 335

Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser

355 360 365

Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe

370 375 380

Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu

385 390

Claims (19)

1.一种用于获得亲本脂肪酶的脂肪酶变体的方法，该方法包括向亲本脂肪酶引入在该亲本脂肪酶一个或多个位置处的改变，其中在一个或多个位置处的该改变提供了至少一个二硫键，并且其中当根据实例3确定水解活性时，如与该亲本脂肪酶的水解活性相比，该脂肪酶变体的水解活性降低。

2.根据前述权利要求所述的方法，其中该脂肪酶变体具有前肽和成熟部分。

3.根据前述权利要求所述的方法，其中在一个或多个位置处的该改变形成包含至少两个半胱氨酸残基的前肽和/或成熟多肽。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该亲本脂肪酶是接合菌脂肪酶，和/或与SEQ ID NO:2具有至少50％序列一致性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该亲本脂肪酶是具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的接合菌脂肪酶。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该一个或多个位置选自对应于SEQ IDNO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的位置。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的改变是取代。

8.一种用于获得亲本脂肪酶的脂肪酶变体的方法，该方法包括向该亲本脂肪酶引入在对应于SEQ ID NO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代，其中该取代提供了至少一个二硫键，并且其中当根据实例3测量时，如与该亲本脂肪酶的水解活性相比，所述脂肪酶变体的水解活性降低。

9.根据权利要求8所述的方法，其中该亲本脂肪酶是接合菌脂肪酶，和/或与SEQ IDNO:2具有至少50％序列一致性。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中该亲本脂肪酶是具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的接合菌脂肪酶。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该改变选自一个或多个以下的取代，这些取代选自L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、S-24C/G104C、P-46C/N186C、S-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和S-31C/V249C，其中该位置对应于SEQID NO:2的位置。

12.一种通过如权利要求1-11中任一项所述的方法获得的脂肪酶变体。

13.一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，该脂肪酶变体与亲本脂肪酶相比包含在一个或多个位置处的改变，其中该改变提供了至少一个二硫键，并且其中如与该亲本脂肪酶的水解活性相比，所述脂肪酶变体的水解活性降低，其中根据实例3确定水解活性。

14.根据权利要求12-13中任一项所述的脂肪酶变体，其中该变体包含在对应于SEQ IDNO:2的位置-57、-54、-47、-46、-43、-40、-38、-37、-36、-33、-31、-24、101、102、104、120、182、186、212、216、239、240、246、和249的一个或多个位置处的取代。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的脂肪酶变体，其中该变体包含一个或多个以下的SEQ ID NO:2的取代：L-57C/N120C、L-54C/P101C、A-47C/V102C、S-24C/G104C、P-46C/N186C、S-43C/N186C、T-40C/P182C、T-40C/L216C、T-40C/L239C、D-38C/A212C、P-37C/E240C、P-37C/N246C、E-36C/N246C、E-36C/V249C、A-33C/V249C、和S-31C/V249C。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的脂肪酶变体，其中所述脂肪酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16具有至少50％序列一致性，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。

17.一种包含如权利要求12-16中任一项所述的脂肪酶变体的组合物。

18.根据权利要求17所述的组合物，该组合物进一步包含活化剂，其中该活化剂是蛋白酶和/或还原剂。

19.一种用于增加如权利要求12-16中任一项所述的脂肪酶变体的水解活性的方法，该方法包括使所述脂肪酶变体与活化剂接触的步骤。