CN108426953A - 检测奶制品中纳他霉素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了检测奶制品中纳他霉素含量的方法，该方法包括以下步骤：1)称取奶酪，加入甲醇，超声处理30min，转入离心管中，在常温下以4000rpm/min离心6min，取上清液；2)将纳他霉素系列标准工作液注入液相色谱中，得到峰高或峰面积。以峰高或峰面积为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线；3)取步骤1)所述上清液1mL，用0.45μm有机滤膜过滤，注入液相色谱仪中得到峰高或峰面积，根据标准曲线得到上清液的浓度；其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：C18柱，5um，4.6mm×250mm；流动相：甲醇+水+冰乙酸＝60+40+5；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：305nm。

Description

检测奶制品中纳他霉素含量的方法

技术领域

本发明涉及食品领域，具体地，本发明涉及检测奶制品中纳他霉素含量的方法。

背景技术

纳他霉素是一种无臭、无味，低剂量且安全性高的食品防腐剂，其是由纳他链霉菌受控发酵制得一种白色至乳白色的无臭无味的结晶粉末，通常以烯醇式结构存在。它的作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基团结合，阻遏麦角甾醇生物合成，从而使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡。

纳他霉素可防止乳酪在成熟时发霉，以限制霉菌毒素的形成。因它很难透入乳酪，只停留在乳酪表面，所以在控制乳酪表面霉菌生长很有优势，而且不影响乳酪的成熟过程。

国内目前关于奶制品中纳他霉素含量的检测方法有GB/T21915-2008《食品中纳他霉素的测定液相法》，其测定原理是奶制品经甲醇提取，采用加水冷冻去除奶制品中的脂肪成分净化，采用反相液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。但是实验过程中加水冷冻净化沉淀效果比较差，存在沉淀不完全的现象，对检测结果造成很大的影响。

因而，检测奶制品中纳他霉素含量的方法仍有待开发和改进。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

在实验过程中，发明人发现，利用国标法测定奶制品中纳他霉素的含量，样品前处理中加水冷冻净化沉淀效果比较差，存在沉淀不完全的现象，导致待测液浑浊，使得检测结果不稳定。基于上述问题的发现，发明人开发了一种检测奶制品中纳他霉素的含量的方法，即发明人通过大量的实验，在国标的基础上，将食品中纳他霉素含量的检测方法进行改进，改进后的方法的样品前处理步骤简单，快速，离心后蛋白沉淀效果好，检测结果稳定，仪器条件稳定，检测结果准确，检测快速，满足实验需求。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测奶制品中纳他霉素含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：1)称取奶酪，加入甲醇，超声处理30min，转入离心管中，在常温下以4000rpm/min离心6min，取上清液；2)将纳他霉素系列标准工作液注入液相色谱中，得到峰高或峰面积。以峰高或峰面积为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线；3)取步骤1)所述上清液1mL，用0.45μm有机滤膜过滤，注入液相色谱仪中得到峰高或峰面积，根据标准曲线得到上清液的浓度；其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：甲醇+水+冰乙酸＝60+40+5；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：305nm。根据本发明的实施例的方法样品前处理步骤简单，快速，离心后蛋白沉淀效果好，检测结果稳定，仪器条件稳定，检测结果准确，检测快速，满足实验需求。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种检测奶制品中纳他霉素含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将奶制品溶于甲醇并进行超声、离心处理，以便得到上清液；将所述上清液进行高效液相色谱检测，以便得到纳他霉素的含量。根据本发明的实施例的方法前处理步骤简单，快速，离心后蛋白沉淀效果好，检测结果稳定，仪器条件稳定，检测结果准确，检测快速，满足实验需求。

根据本发明的实施例，上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述奶制品为奶酪或液体奶。发明人发现，奶酪或液体奶中的纳他霉素含量检测用上述方法，检测结果准确、稳定。

根据发明的实施例，所述超声处理是在室温的条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述超声处理是的时间为30min。发明人发现，对样品进行30min的超声处理能使得纳他霉素更好地溶解到甲醇中。

根据本发明的实施例，所述离心处理是在不小于4000rpm/min的转速下进行的。发明人发现，在不小于4000rpm/min的转速下离心处理，能使得蛋白质沉淀效果好，得到的上述的上清液更澄清，检测结果稳定、准确。

根据本发明的实施例，所述离心处理的时间不少于6min。发明人发现，进行不少于6min的离心处理，能使得蛋白质沉淀效果好，得到的上述的上清液更澄清，检测结果稳定、准确。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：甲醇+水+冰乙酸＝60+40+5；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：305nm。发明人发现，上述高效液相色谱的条件下对前处理样本进行检测，能够清楚准确地出现纳他霉素的峰。

根据本发明的实施例，进一步包括：将纳他霉素系列标准工作液进行高效液相色谱检测，以便得到纳他霉素浓度-峰高或峰面积标准曲线，所述高效液相色谱检测的条件如上述限定。

根据本发明的实施例，所述纳他霉素系列标准工作液的浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。发明人发现，利用纳他霉素系列标准工作液的浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL，所得到的纳他霉素浓度-峰高或峰面积标准曲线更准确，所得检测结果更加真实可信。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的纳他霉素样品空白及加标样品谱图；以及

图2为根据本发明实施例的纳他霉素标准曲线及谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

(1)试剂：

水：符合GB/T 6682规定的一级水要求；

甲醇：分析纯(样品前处理使用)、色谱纯(流动相使用)；

冰乙酸：色谱纯；

纳他霉素标准品：纯度≥89％。

(2)标准溶液的配制：

纳他霉素标准储备液(100μg/mL)：准确称取适量的纳他霉素标准品，用100mL甲醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。在4℃冰箱避光保存3个月；

纳他霉素标准系列工作溶液：分别准确吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL纳他霉素标准储备液液于100mL棕色容量瓶中，用100mL甲醇定容至刻度混匀，配成浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL的标准工作液。

(3)仪器设备：

高效液相色谱仪：带紫外检测器；

微孔滤膜：粒径为0.45μm，有机相；

锥形瓶：150mL；

离心机：≥4000rpm/min；

超声波清洗机；

分析天平：感量0.1mg；梅特勒－托利多仪器有限公司。

(4)样品前处理：

准确称取奶酪10g(精确至0.1mg)于150mL三角瓶中，加入25mL甲醇，超声30min，转入50mL离心管中，在常温下以4000rpm/min离心6min，取上清液待测。

(5)高效液相色谱仪参考条件：

色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；

流动相：甲醇+水+冰乙酸＝60+40+5；

流速：1mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：305nm。

(6)测定：

标准曲线的测定：

将纳他霉素系列标准工作液注入液相色谱中，得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品的测定：

将离心后的纳他霉素样液取1mL，用0.45μm有机滤膜过滤，注入液相色谱仪中得到峰高(或峰面积)，根据标准曲线得到待测液的浓度C。

(7)结果计算：

按公式(a)计算：

式中：

X—试样中纳他霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

C—被测液中纳他霉素含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V—试样的定容体积，单位为毫升(mL)；

M—称取试样的质量，单位为克(g)；

计算结果保留三位有效数字。

(8)方法检出限验证

将纳他霉素标液无限稀释，然后用高效液相色谱仪进行测定，直至信噪比(S/N)为10，得出纳他霉素定量检出限为0.2mg/kg，考虑到样品基体的复杂性和不同仪器灵敏度的差异，最终确定纳他霉素的定量检出限为0.5mg/kg。

(9)方法回收率验证

取液体奶样品分别以1倍、2倍、5倍三水平进行加标回收实验。以下是空白样品及加标样品纳他霉素测定结果及回收率、精密度，如表1所示：

表1：纳他霉素回收率测定结果

由表1可知，纳他霉素回收率在91.0％-101.2％之间，回收率符合检测需求。

(10)方法精密度验证：

取液体奶样品分别以1倍、2倍、5倍三水平进行加标回收实验。以下是空白样品及加标样品纳他霉素测定结果精密度，如表2和图1所示：

表2：纳他霉素精密度测定结果

由表2和图1可知，纳他霉素测定精密度为均小于5％，符合国标要求(精密度<10％)。

(11)方法稳定性验证

利用不同日期加标回收的方式进行了纳他霉素方法稳定性的验证试验。2016.7-2016.10共进行3次试验，如表3所示。

表3：纳他霉素稳定性验证

验证日期	纳他霉素回收率	纳他霉素精密度
			2016.07.09	99.4％-101.3％	2.20％
2016.08.28	92.0％-106.4％	6.27％
			2016.09.11	91.0％-101.2％	1.70％-3.83％

由表3可知，纳他霉素三次回收率在91.0％-106.4％之间，精密度在1.70％-6.27％之间；由此可知该方法的方法稳定性较好。

(12)标准曲线的绘制

分别准确吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL纳他霉素标准储备液液于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度混匀，配成浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL的标准工作液。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，如表4和图2所示。

表4：纳他霉素标准曲线及线性

由表4和图2可知，纳他霉素标准曲线线性良好，能达到0.999以上，满足检测需求。

对比例1

(1)检出限

依据GB/T21915-2008规定，固体和半固体样品定量检出限为0.5mg/kg，液体样品为0.5mg/L。

(2)方法回收率验证

取液体奶样品分别以1倍、2倍、5倍三水平进行加标回收实验。以下是空白样品及加标样品纳他霉素测定结果及回收率，区别在于样品前处理将离心净化改为国标规定的加水冷冻净化，如表5所示：

表5：

由表5可知，国标方法纳他霉素回收率在102-120％之间，回收率较高，不符合检测需求。

(10)方法精密度验证：

取液体奶样品分别以1倍、2倍、5倍三水平进行加标回收实验。以下是空白样品及加标样品纳他霉素测定结果精密度，如表6和图2所示：

表6：纳他霉素精密度测定结果

由表6可知，纳他霉素测定精密度为均大于5％，不符合国标要求(精密度<10％)。

(11)稳定性验证

利用不同日期加标回收的方式进行了纳他霉素方法稳定性的验证试验。2016.7-2016.10共进行3次试验，如表7所示。

表7：纳他霉素稳定性验证

验证日期	纳他霉素回收率	纳他霉素精密度
			2016.07.09	109.4％-115.3％	12.10％
2016.08.28	102.0％-112.5％	10.27％
			2016.09.11	101.0％-111.2％	13.83％

由表7可知，纳他霉素三次回收率在101％-115％之间，精密度在10.27％-13.83％之间；由此可知该方法的稳定性较差。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种检测奶制品中纳他霉素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)称取奶酪，加入甲醇，超声处理30min，转入离心管中，在常温下以4000rpm/min离心6min，取上清液；

2)将纳他霉素系列标准工作液注入液相色谱中，得到峰高或峰面积，以峰高或峰面积为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线；

3)取步骤1)所述上清液1mL，用0.45μm有机滤膜过滤，注入液相色谱仪中得到峰高或峰面积，根据标准曲线得到上清液的浓度；

其中，所述高效液相色谱的条件为：

色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；

流动相：甲醇+水+冰乙酸＝60+40+5；

流速：1mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：305nm。

2.一种检测奶制品中纳他霉素含量的方法，其特征在于，包括：

将奶制品溶于甲醇并进行超声、离心处理，以便得到上清液；

将所述上清液进行高效液相色谱检测，以便得到纳他霉素的含量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述奶制品为奶酪或液体奶。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述超声处理是在室温的条件下进行的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为30min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心处理是在不小于4000rpm/min的转速下进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离心处理的时间不少于6min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件为：

色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；

流动相：甲醇+水+冰乙酸＝60+40+5；

流速：1mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：305nm。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：将纳他霉素系列标准工作液进行高效液相色谱检测，以便得到纳他霉素浓度-峰高或峰面积标准曲线，

所述高效液相色谱检测的条件如权利要求8所限定的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述纳他霉素系列标准工作液的浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。