CN101221154B - 一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过高效液相色谱仪对牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法。即待测试样中加入体积比9∶1的甲醇水溶液，充分涡动提取，称重后高速冷冻离心沉降蛋白，然后过滤净化获得试样液；称取纳他霉素标准品，用甲醇溶解并称重后作为质量浓度储备液，然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液；利用高效液相色谱仪对试样处理液进行检测；然后便可计算出结果。采用本发明的方法检测牛奶中纳他霉素的含量，快速有效，相对平均偏差小于5.0％，由此可见，本发明的方法，为牛奶及其制品中纳他霉素含量的检测，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足研究和生产中的需要。

Description

一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法
技术领域
本发明涉及一种牛奶及其制品中纳他霉素的含量的测定方法，特别是涉及一种通过效液相色谱仪对牛奶中纳他霉素的含量进行检测的方法。
背景技术
纳他霉素(Natamycin)也称游链霉素(Pimaricin)，商品名为霉克(NatamycinTM)是一种重要的多烯类大环内酯抗菌素，能有效的抑制酵母菌和霉菌的生长，阻止丝状真菌中黄曲霉素的形成。1996年我国食品添加剂委员会会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准。根据我国《食品添加剂食用卫生标准》(GB2760)规定，食品中最大残留量是10.0mg/kg。纳他霉素已经被作为食品的防腐剂而得到广泛的应用，不仅在牛奶中，牛奶制品如酸奶、干酪中也常常添加已起到防腐作用，但是目前还没有制定牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，因此建立一种快速、准确、方便和经济的检测方法，有利于监控奶制品生产厂家纳他霉素的添加使用量，从而保障食品安全。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，克服前处理沉降蛋白技术上的缺陷，通过摸索提取液最佳配比，最佳的提取时间和最佳色谱条件而提供一种牛奶及其制品中纳他霉素的含量测定方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：
本发明的一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法包括如下步骤：
充分混匀待测试样2.0g加入甲醇和水(9+1)8.0ml，充分涡动提取10min，称重，使试样和所加甲醇水溶液总重量在10.0000±0.1g(试样重量和提取液总重量控制在1∶4左右)，记录称重数据后，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10.0min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液；
称取纳他霉素标准品，用甲醇溶解并称重后作为质量浓度储备液，然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液；
利用高效液相色谱仪对标准液和试样处理液进行检测；
计算结果，试样中纳他霉素的计算公式为：
X = c × m 1 m 2
式中：
X-试样中纳他霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
c-试样处理液浓度(mg/kg)；
m1-试样和提取液总质量，单位为克(g)；
m2-试样质量，单位为克(g)。
优选地，所述提取溶剂为甲醇和水，比例为9∶1。
优选地，涡动提取时间为10min。
优选地，所述待测试样在整个的制备过程中采用质量浓度进行操作和计算。
优选地，4℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10.0min沉淀蛋白。
优选地，利用高效液相色谱仪对试样处理液进行检测，检测条件为：
色谱柱：Agilent C185.0μm，250×4.6mm
流动相：甲醇+水＝70+30
流速：1.0ml/min；
进样***：自动进样器；
进样量：10μl；
温度：30℃；
并根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
本发明的优点是：采用本发明的方法检测牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，快速有效，误差率小于5％，检出限为1.0mg/kg。由此可见，本发明的方法，为检测牛奶中纳他霉素的含量，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足研究和生产中的需要。
具体实施方式
实施例1，液体奶中纳他霉素含量的精密度和回收率检测：
称取充分混匀的待测试样2.0024g，(精确称量至0.0001克)，置于50ml的离心管中，加入甲醇和水(9+1)6.0ml，充分涡动提取10min，称重，使试样和所加甲醇水溶液总重量在10.019g(试样重量和甲醇水溶液总重量控制在1∶4左右)，记录称重数据后，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10.0min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液。
称取纳他霉素标准品(纯度97.5％美国Aldrick)10.00mg，用甲醇溶解并称重至10.0000g，浓度为1000mg/kg的储备液，然后进一步用甲醇稀释50倍作为标准使用液，再稀释为0.1、0.5、1.0、20.0mg/kg的标准使用液。
检测仪器为现有的岛津-20A高效液相色谱仪：
检测条件为：
色谱柱：Agilent C185.0μm，250×4.6mm
流动相：甲醇+水＝70+30
流速：1.0ml/min；
进样***：自动进样器；
进样量：10μl；
温度：30℃；
根据其质谱峰定性，外标法定量。
计算结果，试样中纳他霉素的计算公式为：
X = c × m 1 m 2
式中：
X-试样中纳他霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
c-试样处理液浓度(mg/kg)；
m1-试样和提取液总质量，单位为克(g)；
m2-试样质量，单位为克(g)。
经过计算，结果为：
试样中纳他霉素的含量按公式(1)进行计算，结果如下：
试样   添加量mg·L-1   回收率/％   平均回收率/％ 相对标准偏差/％
  1#   2#   3#   4#   5#   6#
  1   2.006   85.4   78.6   82.5   77.9   84.2   78.6   81.2   4.0
  2   5.012   89.2   85.7   89.1   92.5   81.3   86.7   87.4   4.4
  3   10.024   93.7   95.4   94.2   90.4   95.8   93.8   93.9   2.0
实施例2，固体干酪中纳他霉素精密度和回收率的检测：
称取充分混匀的待测试样2.0001g，(精确称量至0.0001克)，置于50ml的离心管中，加入甲醇和水(9+1)6.0ml，充分涡动提取10min，称重，使试样和所加甲醇水溶液总重量在10.0340g(试样重量和甲醇水溶液重量控制在1∶4左右)，记录称重数据后，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10.0min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液。
称取纳他霉素标准品(纯度97.5％美国Aldrick)10.00mg，用甲醇溶解并称重至10.0000g，浓度为1000mg/kg的储备液，然后进一步用甲醇稀释50倍作为标准使用液，再稀释为0.1、0.5、1.0、20.0mg/kg的标准使用液。
检测仪器为现有的岛津-20A高效液相色谱仪：
检测条件为：
色谱柱：Agilent C185.0μm，250×4.6mm
流动相：甲醇+水＝70+30
流速：1.0ml/min；
进样***：自动进样器；
进样量：10μl；
温度：30℃；
根据其质谱峰定性，外标法定量。
计算结果，试样中纳他霉素的计算公式为：
X = c × m 1 m 2
式中：
X-试样中纳他霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
c-试样处理液浓度(mg/kg)；
m1-试样和提取液总质量，单位为克(g)；
m2-试样质量，单位为克(g)。
经过计算，结果为：
试样中纳他霉素的含量按公式(1)进行计算，结果如下：
试样   添加量mg.L-1   回收率/％   平均回收率/％ 相对标准偏差/％
  1#   2#   3#   4#   5#   6#
  1   2.006   79.1   84.5   82.6   80.9   83.2   82.6   81.7   4.8
  2   5.012   90.8   94.8   91.5   92.7   93.5   92.9   92.4   4.8
  3   10.024   95.5   96.1   98.5   101.9   96.6   94.7   97.9   1.8
显而易见，本领域的普通技术人员，可以用发明的一种通过高效液相色谱仪对牛奶及其制品中纳他霉素含量进行测定。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。

Claims (7)

1.一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：所述测定方法包括如下步骤：
称取充分混匀的待测试样2.0000±0.1g，加入体积比9∶1的甲醇水溶液8.0ml，充分涡动提取10min，称重，使试样和所加提取液总重量在10.0000±0.0100g，试样重量和提取液总重量控制在1∶4左右，记录称重数据后，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10.0min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液，
称取纳他霉素标准品，用甲醇溶解并称重后作为质量浓度储备液，然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液；
利用高效液相色谱仪对标准液和试样处理液进行检测；
计算结果，试样中纳他霉素的计算公式为：
X = c × m 1 m 2
式中：
X-试样中纳他霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
c-试样处理液浓度(mg/kg)；
m1-试样和提取液总质量，单位为克(g)；
m2-试样质量，单位为克(g)。
2.根据权利要求1所述的一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：所述甲醇水溶液提取，理想的提取液配比，很好的控制了杂质的干扰，并保证了回收率。
3.根据权利要求1所述的一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：涡动提取时间为10min，此条件下具有最好的混合提取效率。
4.根据权利要求1所述的一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：所述试样重量和提取液总重量控制在1∶4左右，此条件下具有最佳提取和沉降蛋白效率。
5.根据权利要求1所述的牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10.0min沉淀蛋白，具有很好的沉降效果。
6.根据权利要求1所述的一种牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：所述利用高效液相色谱仪对试样处理液进行检测的条件为：
色谱柱：Agilent C18 5.0μm，250×4.6mm
流动相：甲醇+水＝70+30
流速：1.0ml/min；
进样***：自动进样器；
进样量：10μl；
温度：30℃；
此条件下具有很好的分离效果。
7.根据权利要求1所述的牛奶及其制品中纳他霉素含量的测定方法，其特征在于：利用较为普遍、适用的高效液相色谱仪对牛奶及其制品中纳他霉素的含量进行检测。
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