CN108424941A - 一种制备细菌纤维素膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细菌纤维素生产领域，特别涉及一种制备细菌纤维素膜的方法。本发明一种制备细菌纤维素膜的方法包括以下步骤：（1）甜菜渣除果胶；（2）甜菜渣酶解；（3）酶解液脱色；（4）制作培养基；（5）培养得到细菌纤维素膜。本发明一种利用甜菜渣制备细菌纤维素的方法具有操作简单，条件温和，能够适应于大规模生产的优点。

Description

一种制备细菌纤维素膜的方法
技术领域
本发明属于细菌纤维素生产领域，特别涉及一种利用甜菜渣制备细菌纤维素膜的方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某种微生物发酵产生的天然纤维素，其典型的代表菌为木葡糖醋酸杆菌(Glucoacetobacter xylinum)。BC相比于植物或藻类产生的天然纤维素有许多优异的特性，如高结晶度(95％)、高聚合度(DP值2000～8000)、纳米级网状结构、高抗张强度、高吸水能力、高保水能力、生物相容性好和生物可降解等许多优良的性能。因此，在医用敷料方面有着巨大的应用前景。
甜菜是除甘蔗外的主要糖来源原料，在我国种植面积广泛，产量大。甜菜经过压榨提取蔗糖后剩下的甜菜渣中，粗纤维被全部保留下来，干物质组成为：纤维素26％、半纤维素28％、木质素3％、果胶28％、蛋白5％、灰分3％、其他27％。甜菜渣去除果胶后，剩余的残渣中主要成分为纤维素和半纤维素，是一种非常有利用价值的资源，如果将其中的纤维水解为可溶性糖类，以其为培养基主要成分来制备细菌纤维素，不仅提供了甜菜渣新的利用方式，而且还提供了培养细菌纤维素的新方法。
在传统工艺上，对纤维素的主要水解方法是利用强碱、强酸、高温和高压等剧烈条件，这些方法不仅成本较高，而且会对环境造成破坏。在植物组织中影响纤维素酶水解纤维素的主要组成成分为果胶和木质素，而甜菜渣中木质素的含量较低，利用盐酸法去除甜菜渣中的果胶后，有利于纤维素酶酶解余下的纤维素，使甜菜渣中的纤维素酶解成纤维二糖和葡萄糖，可作为基础培养基来生产细菌纤维素。此方法既降低了生产成本，也保护了环境。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备细菌纤维素膜的方法，该方法操作简单，反应条件温和，原料易得，能够适应于大规模生产。
一种制备细菌纤维素膜的方法，包括以下步骤：
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣粉碎，过30～100目筛，加入盐酸，加热搅拌萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗若干遍后备用；
(2)甜菜渣酶解：在步骤(1)得到的洗净的滤渣中加入纯化水，搅拌，将得到的混合液用盐酸或醋酸调节至pH＝4.0～5.5，在温度40～60℃，加入纤维素酶，酶活不小于400u/mg，缓慢搅拌3～24h，酶解结束后离心或抽滤去除沉淀，收集水解液；
(3)酶解液脱色：在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，所述活性炭和水解液的固液比为0.1％-3％[w(g)/v(mL)]，100rpm搅拌脱色10min～60min，离心或抽滤去除沉淀；
(4)制作培养基：取步骤(3)脱色后的水解液，补加氮源、无机盐、丙三醇，然后用稀碱液微调pH至5.0～5.3，105℃灭菌15～30min，冷却后作为培养基；
(5)培养得到细菌纤维素：在步骤(4)得到的培养基中接入木醋杆菌，在28～30℃环境下，浅盘静态培养5～8天，得到细菌纤维素膜。
所述步骤(1)中盐酸的PH值为1.5，所述甜菜渣和盐酸的比为1:30～1:70[w(g)/v(mL)]。
所述步骤(1)中搅拌加热温度为80～90℃，搅拌时间为4～6小时。
所述步骤(2)中滤渣与纯化水的固液比为1:5～1:30[w(g)/v(mL)]。
所述步骤(2)中纤维素酶加入量为步骤(1)风干的甜菜渣质量的0.3％～2％，酶活性不小于400u/mg。
所述步骤(4)中氮源加入量为步骤(3)脱色后的水解液量的0.5～5％[w(g)/v(mL)]，无机盐加入量为步骤(3)脱色后的水解液量的0.005～0.2％[w(g)/v(mL)]，丙三醇加入量为步骤(3)脱色后的水解液量的0.1～1.0％[w(g)/v(mL)]。
所述的无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的一种或几种；所述的氮源为蛋白胨、玉米浆、铵盐中的一种或几种。
所述木醋杆菌的接入量占步骤(4)培养基量的8％。
所述步骤(4)中稀碱溶液是浓度为1mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾的一种或两种。
所述木醋杆菌的接入量占步骤(4)培养基量的8％。
本发明具有以下优点：
1.传统纤维素水解需要强碱、强酸、高温和高压等剧烈条件，本发明只需要使用稀碱，稀酸，相对较低的温度及常压即可，反应条件温和，操作简便，便于生产；
2.利用盐酸法去除甜菜渣中的果胶后，有利于纤维素酶酶解余下的纤维素，使甜菜渣中的纤维素酶解成纤维二糖和葡萄糖，可作为基础培养基来生产细菌纤维素；
3.甜菜渣是一种可再生资源，用于发酵生产细菌纤维素不仅提高了经济利用价值，也为细菌纤维素的生产提供原料。
具体实施方式
下述实例中的木醋杆菌购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号1.1812。
实施例1培养基的制备
实施例1
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过30目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:30[w(g)/v(mL)]，80℃加热搅拌4h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:5[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为4.0，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量2％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，40℃搅拌24h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为0.1％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌10min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为0.5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.005％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为0.1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钠溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养5天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例2
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过30目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:30[w(g)/v(mL)]，80℃加热搅拌4h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:15[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为4.0，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量2％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，40℃搅拌24h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钾溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例3
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过60目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:30[w(g)/v(mL)]，85℃加热搅拌4h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:20[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用醋酸调节至pH为4.0，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量1.2％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，50℃搅拌16h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钠溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例4
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过60目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:50[w(g)/v(mL)]，85℃加热搅拌5h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:20[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为4.0，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量1.2％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，50℃搅拌16h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钾溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例5
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过60目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:50[w(g)/v(mL)]，85℃加热搅拌5h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:20[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为5.2，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量1.2％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，50℃搅拌16h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钠溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例6
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过100目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:70[w(g)/v(mL)]，90℃加热搅拌6h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:20[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为5.5，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量0.3％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，60℃搅拌3h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％0[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钠溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例7
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过100目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:70[w(g)/v(mL)]，90℃加热搅拌6h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:20[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为5.5，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量0.3％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，60℃搅拌6h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钠溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
实施例8
(1)甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣用中药粉碎机粉碎，过100目筛，加入pH为1.5的盐酸溶液混合，甜菜渣与盐酸溶液的固液比为1:70[w(g)/v(mL)]，90℃加热搅拌6h萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗两遍后备用。
(2)甜菜渣酶解：按步骤(1)得到的洗净的滤渣和纯化水1:30[w(g)/v(mL)]加入到容器内，将得到的混合液用盐酸调节至pH为5.5，加入占步骤(1)风干的甜菜渣质量0.3％的纤维素酶(酶活性为不小于400u/mg)，60℃搅拌3h，用抽滤或离心去除沉淀，收集水解液。
(3)酶解液脱色：再在水解液中加入与水解液的固液比为3％[w(g)/v(mL)]的活性炭脱色，100rpm搅拌60min，抽滤去除沉淀。
(4)制备培养基：在所得的脱色水解液中补加与脱色水解液固液比为5％[w(g)/v(mL)]的氮源、与脱色水解液固液比为0.2％[w(g)/v(mL)]的无机盐、与脱色水解液固液比为1％[w(g)/v(mL)]的丙三醇，搅拌溶解均匀后，用稀氢氧化钠溶液调至脱色水解液pH为5.0-5.3，将配制好的发酵液在105℃条件下灭菌15min，冷却后作为培养基。
(5)在上述培养基中按8％(占培养基)的接种量接入木醋杆菌，摇晃均匀，定量500ml分装倒入浅盘，用透气纸封口，在28℃环境下，静态培养8天。所得细菌纤维素膜片清洗烘干后对其进行称重，结果详见表1。
表1细菌纤维素膜产率
由表1所示，在细菌纤维素膜干重上配方1产量最高，可达30.2g/㎡，其次是配方2和配方5，分别为27.1g/㎡和25.3g/㎡，配方8产量最少，为12.4g/㎡。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，在本领域的一般技术人员可以较简单的理解，可以在形式上和细节上对其作出其他的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的范围。

Claims (8)

1.一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）甜菜渣除果胶：将风干的甜菜渣粉碎，过30~100目筛，加入盐酸，加热搅拌萃取果胶，反应结束后过滤收集滤渣，用纯化水冲洗滤渣，冲洗若干遍后备用；
（2）甜菜渣酶解：在步骤（1）得到的洗净的滤渣中加入纯化水，搅拌，将得到的混合液用盐酸或醋酸调节至pH=4.0~5.5，在温度40~60℃，加入纤维素酶，酶活不小于400u/mg，缓慢搅拌3~24h，酶解结束后离心或抽滤去除沉淀，收集水解液；
（3）酶解液脱色：在步骤（2）得到的水解液中加入活性炭，所述活性炭和水解液的固液比为0.1%-3%[w（g）/v（mL）]，100rpm搅拌脱色10min~60min，离心或抽滤去除沉淀；
（4）制作培养基：取步骤（3）脱色后的水解液，补加氮源、无机盐、丙三醇，然后用稀碱液微调pH至5.0~5.3，105℃灭菌15~30min，冷却后作为培养基；
（5）培养得到细菌纤维素：在步骤（4）得到的培养基中接入木醋杆菌，在28~30℃环境下，浅盘静态培养5~8天，得到细菌纤维素膜。
2.如权利要求1所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述步骤（1）中盐酸的PH值为1.5，所述甜菜渣和盐酸的比为1:30~1:70[w（g）/v（mL）]。
3.如权利要求1所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述步骤（1）中搅拌加热温度为80~90℃，搅拌时间为4~6小时。
4.如权利要求1所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述步骤（2）中滤渣与纯化水的固液比为1:5~1:30[w（g）/v（mL）]。
5.如权利要求1所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述步骤（2）中纤维素酶加入量为步骤（1）风干的甜菜渣质量的0.3%~2%。
6.如权利要求1所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述步骤（4）中氮源加入量为步骤（3）脱色后的水解液量的0.5~5%[w（g）/v（mL）]，无机盐加入量为步骤（3）脱色后的水解液量的0.005~0.2%[w（g）/v（mL）]，丙三醇加入量为步骤（3）脱色后的水解液量的0.1~1.0%[w（g）/v（mL）]。
7.如权利要求7所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述的无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的一种或几种；所述的氮源为蛋白胨、玉米浆、铵盐中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的一种制备细菌纤维素膜的方法，其特征在于：所述木醋杆菌的接入量占步骤（4）培养基量的8%。
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