CN108421034A - 激肽释放酶7在皮肤创伤愈合中的应用 - Google Patents

激肽释放酶7在皮肤创伤愈合中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。本发明人利用人表皮细胞分泌制备激肽释放酶7，分离纯化后，加入体外培养的人类原代表皮细胞培养液中，可加快表皮细胞生长，与普通培养基相比，表皮贴壁更快，生长更迅速，生长状态良好。表皮细胞划痕结果表明，加入激肽释放酶7后，细胞迁移速度快，在60h左右即可恢复90％左右细胞汇合度。本发明为临床治疗皮肤创伤提供了更多选择。将激肽释放酶7制成外用药剂，可以加快愈合速度、提高愈合效果，将在皮肤创伤愈合领域发挥重要作用。

Description

激肽释放酶7在皮肤创伤愈合中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及激肽释放酶在创伤愈合中的应用，还涉及用于创伤愈合的含有该细胞因子的组合物。
背景技术
皮肤是人体面积最大的器官，具有阻挡异物和防止病原体入侵的屏障保护功能，还具有排汗、感觉冷热和压力等的重要生理功能，同时皮肤又是机体免疫***的重要组成部分，任何原因造成的皮肤连续性被损伤以及缺失性损伤都会产生创口的急慢性感染及其相应的并发症。
由于皮肤烧烫伤、炎症、溃疡以及术后等原因造成的皮肤损伤既影响美观也影响人们的生活质量，甚至严重时，如深度的大面积烧烫伤，皮肤失去屏障保护作用，致使大量细菌通过皮肤侵入人体，引发全身感染而导致死亡。因此创伤愈合在现实生活及临床工作中都有着重要的现实意义。
创伤愈合的一般生物学过程主要包括炎症反应、细胞增殖修复和组织的成熟与重建这三个紧密联系的阶段。研究表明，细胞因子在创伤愈合过程中能够发挥一定的作用：组织对创口的即刻反应是形成血凝块以阻止出血，同时释放炎症细胞因子以调节血流量，并吸引淋巴细胞核巨噬细胞对抗感染，刺激血管形成和胶原沉积，导致了高度血管化，富含细胞的肉芽组织形成。细胞因子作为药物可加速创伤组织修复，并逆转不良修复状态。
激肽释放酶主要分为两大类：即血浆激肽释放酶(PK)和组织激肽释放酶(TK)。TKs在体内分布较广泛，目前广泛认为人组织激肽释放酶基因家族已发现至少15个，即KLKl～KLKl5。越来越多的报道证实，人组织激肽释放酶具有多种生理功能，例如通过直接激活蛋白酶激活受体1，促进皮肤创面愈合和角化细胞迁移。
人激肽释放酶7(hKLK7)，在皮肤、中枢神经***高表达，主要通过激肽发挥作用，激肽受体主要有B1R和B2R两种受体。B1R受体在正常组织中少有表达，但在炎症及组织损伤时表达上调，B1R在毛细血管增殖方面起作用，而B2R则在激肽介导的细胞迁移和凋亡方面起重要作用，可显著增加神经胶质细胞的转移及侵犯。目前，尚未有将激肽释放酶7直接用于皮肤创伤愈合中的相关研究的报道。如果将激肽释放酶7，特别是人激肽释放酶7用于创伤愈合的治疗，将具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明人在研究中发现激肽释放酶7(KLK7)可由表皮细胞分泌，并在促进创口的愈合过程中发挥作用。
因此，本发明第一个目的是提供激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。具体表现在，促进表皮细胞生长和迁移；促进真皮成纤维细胞增殖和迁移。
本发明将激肽释放酶7分离纯化后，加入体外培养的人类原代表皮细胞培养液中，可加快表皮细胞生长，与普通培养基相比，表皮贴壁更快，生长更迅速，生长状态良好，一般3-4天细胞汇合度即可达到90％左右。表皮细胞划痕结果表明，加入激肽释放酶7后，细胞迁移速度快，在60h左右即可恢复90％左右细胞汇合度。
将人激肽释放酶7加入体外培养的人真皮成纤维细胞培养液中，与普通培养液相比真皮细胞状态更好，生长迅速，可以促进真皮成纤维细胞增殖。真皮成纤维细胞划痕处理后，加入激肽释放酶7比不加该因子的细胞迁移速度快、划痕处细胞状态好、划痕恢复所需时间短。
大鼠皮肤烫伤模型中，创口处滴加激肽释放酶7，与不加激肽释放酶7的创口相比，炎症反应概率降低，伤口结痂迅速，愈合良好，愈后皮肤平整，疤痕浅。
综上研究结果可知，激肽释放酶7在创伤愈合中可发挥重要作用。
本发明第二个目的是提供一种利用表皮细胞制备激肽释放酶7的方法。具体是：用人皮肤表皮细胞培养基培养人原代表皮细胞，隔天换液，表皮细胞4-5天进行传代，回收细胞培养上清液，上清液中含有人激肽释放酶7。
所述表皮细胞培养基配方为：角质无血清培养基:DMEM培养基:Ham’s F-12培养基＝2:1:1、终浓度1.5mM的200mM L-谷氨酰胺、终浓度25μg/ml的牛垂体提取物、终浓度0.2ng/ml的表皮生长因子、0.4mM/500ml的氯化钙。
说明本发明方法可以成功利用培养过人表皮细胞的培养基制备人激肽释放酶7。
本发明第三个目的是提供一种用于创口愈合的、含激肽释放酶7的药剂。
鉴于激肽释放酶7在创口愈合中的作用，激肽释放酶7可做成外用药剂用于临床抗炎抗感染、促进伤口愈合等。所述药剂包含细胞因子激肽释放酶7及其他辅助成分；所述药剂为喷剂、滴剂、药膏、凝胶、敷料及其他外用剂型。涂敷于伤口部分，加速创伤愈合，适用于临床治疗。
此外，所述药剂也可以是将激肽释放酶7加在现有外用抗炎药物中，发挥辅助作用，诱导细胞增殖分化，促进创伤愈合。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明人首次发现人表皮细胞可以分泌激肽释放酶7，并利用人表皮细胞可以成功制备激肽释放酶7。为激肽释放酶7的广泛应用，提供了基础。
2、本发明首次明确了激肽释放酶7在创伤愈合中的作用。激肽释放酶7可以促进表皮细胞生长，加快细胞迁移速度；并可以促进真皮成纤维细胞增殖、加快细胞迁移速度；划痕处表皮细胞及真皮细胞状态好、划痕恢复所需时间短。将激肽释放酶7用于大鼠皮肤烫伤的创口处，可以加速结痂、减少炎症反应、促进愈合，愈后皮肤平整，疤痕浅。
3、本发明为临床治疗皮肤创伤提供了更多选择。将激肽释放酶7制成外用药剂，可以加快愈合速度、提高愈合效果，将在皮肤创伤愈合领域发挥重要作用。
附图说明
图1为实验例1划痕处不同时间点真皮细胞生长迁移的情况。其空白对照组中每孔加入3ml DMEM培养基；阴性对照组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；阴性对照组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；实验组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基；实验组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基。
图2为实验1划痕后划痕处不同时间点表皮细胞生长迁移的情况。其中空白对照组中每孔加入3ml人皮肤表皮细胞培养基；阴性对照组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；阴性对照组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；实验组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基；实验组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基。
图3为winstar品系大鼠烫伤后烫伤处不同时间点伤口修复愈合情况。图中空白对照组烫伤后不做处理；阴性对照组25μg/ml烫伤后滴加蛋白浓度为25μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；实验组25μg/ml烫伤后滴加蛋白浓度为25μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基。注：做实验当天记为Day 0，实验第二天记为Day 1，以此类推。Day6补加20μl。Day8补加20μl。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。
实施例1、利用人表皮细胞制备人激肽释放酶7
步骤如下：
(1)用人皮肤表皮细胞培养基(DMEM培养基:Ham’s F-12培养基＝2:1:1、终浓度1.5mM的200mM L-谷氨酰胺、终浓度25μg/ml的牛垂体提取物、终浓度0.2ng/ml的表皮生长因子、0.4mM/500ml的氯化钙)培养人原代表皮细胞，隔天换液，表皮细胞一般4-5天进行传代，回收细胞培养上清液；
(2)将细胞培养上清液3000rpm离心5min，去除死细胞、细胞碎片及其他杂质；
(3)浓缩：取离心后的细胞培养上清液，用M型超滤浓缩离心管离心，4500rpm/s离心15min，只保留培养液中相对分子质量大于3000的蛋白质，小分子量蛋白质被离心去除。
(4)细胞培养上清液体积浓缩20倍后(100ml浓缩至5ml)，Bradford法测总蛋白浓度，浓度为0.5mg/ml。
(5)取浓缩过的细胞培养上清液，用生物质谱分析其中包含的蛋白质种类及相对含量。
(6)取人皮肤表皮细胞培养基培养液，用步骤(3)所述方法浓缩相同倍数，通过生物质谱分析其中包含的蛋白质种类及相对含量。
(7)分析上述步骤(5)细胞培养上清液及步骤(6)人皮肤表皮细胞培养基上清液中的蛋白质种类及含量，发现两者人激肽释放酶7(hKLK7)含量差异极显著。人皮肤表皮细胞培养基中该细胞因子含量为0，细胞培养上清液中含量显著增加。详见表1：
表1
实施例2、一种用于创口愈合的医用喷剂，包括如下组分：
其中激肽释放酶7，优选为人激肽释放酶7。
按照常规喷剂的制备方法制成即可。
实施例3、一种用于创口愈合的医用凝胶，包括如下组分：
其中激肽释放酶7，优选为人激肽释放酶7。
按照常规凝胶的制备方法制成即可。
实施例4、一种用于创口愈合的医用软膏，包括如下组分：
其中激肽释放酶7，优选为人激肽释放酶7。
按照常规软膏的制备方法制备即可。
实验例1：人激肽释放酶7促进体外划痕处人表皮细胞与人真皮成纤维细胞生长迁移实验
(1)液氨罐中取出表皮或真皮细胞，37℃水浴轻摇使其溶解。
(2)将溶解后的细胞吹打混匀加入约8ml含10％FBS的DMEM中，混匀，1000rpm离心5min。
(3)弃上清，细胞沉淀用含双抗的DMEM培养基重悬洗涤一次，1000rpm离心5min。
(4)弃上清，加入10ml人皮肤表皮细胞培养基或真皮培养基重悬细胞沉淀，放入T75cm2的flask中。此时，记下细胞代次。
(5)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36-38℃，4.5-5.5％CO2，90-100％湿度。4天换液一次。
(6)待细胞密度达90％以上时，开始进行细胞收集。
(7)弃掉培养瓶中的表皮或真皮培养液。
(8)细胞用5ml PBS洗涤一次去除残留的血清。
(9)加入含EDTA的0.05％胰酶，3ml/75cm2培养瓶，放入细胞培养箱中孵育5-10min(真皮细胞消化时间比表皮细胞短)。
(10)加5-7ml含10％FBS的DMEM中和胰酶，将细胞吹下转移到50ml离心管中，1000rpm离心5min。
(11)弃上清，用含双抗的F12重悬细胞，细胞计数板计数。
(12)取适量细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，用人皮肤表皮细胞培养基或含5％FBS的DMEM重悬细胞，铺入提前划线的六孔板中。此时，细胞记为下一代次。
(13)将六孔板放置于培养箱中培养，培养条件为36-38℃，4.5-5.5％CO2，90-100％湿度。
(14)待六孔板中的细胞生长致密时，弃掉六孔板中的培养液。
(15)六孔板中每孔细胞用2-3ml PBS洗涤一次去除残留的血清。
(16)弃洗涤液，每孔加入1-2ml PBS，沿划线制造细胞划痕。
(17)显微镜下观察划痕效果，用PBS吹打几次划痕洗掉残余细胞碎片。
(18)弃洗涤液，用人皮肤表皮细胞培养基或DMEM培养基稀释浓缩的人皮肤表皮细胞培养基与浓缩因子激肽释放酶7，稀释至不同浓度。
(19)以人皮肤表皮细胞培养基或DMEM培养基为空白对照，以稀释的浓缩人皮肤表皮细胞培养基为阴性对照，稀释的激肽释放酶7为实验组，每孔加入3ml对应浓度的样品。
(20)加样完成后划痕处在显微镜下进行0h拍照，接下来依次进行不同时间点的拍照，观察细胞因子激肽释放酶7对细胞划痕处细胞迁移的影响。结果如图1和图2所示。
从图1和图2中可以看出，实验组使用一定浓度浓缩后的细胞因子人激肽释放酶7进行细胞培养，对细胞划痕处细胞的生长迁移有促进作用，且促进效果与细胞因子的浓度相关。
将人激肽释放酶7加入体外培养的人类原代表皮细胞培养液中，可加快表皮细胞生长，与普通培养基相比，表皮贴壁快，生长迅速，生长状态良好，一般3-4天细胞汇合度即可达到90％左右。表皮细胞划痕结果表明，加入人激肽释放酶7后，细胞迁移速度快，在60h左右即可恢复90％左右细胞汇合度。
将人激肽释放酶7加入体外培养的人真皮成纤维细胞培养液中，与普通培养液相比真皮细胞状态更好，生长迅速，可以促进真皮成纤维细胞增殖。真皮成纤维细胞划痕处理后，加入人激肽释放酶7比不加该因子的细胞迁移速度快、划痕处细胞状态好、划痕恢复所需时间短。
实验例2：细胞因子激肽释放酶7促进winstar品系大鼠烫伤处伤口修复愈合实验
(1)稀释的浓缩人皮肤表皮细胞培养基记为样品1，为阴性对照，样品1的蛋白浓度为25μg/ml；稀释的细胞因子激肽释放酶7记为样品2，为实验组，样品2的蛋白浓度为25μg/ml。
(2)提前一天将winstar品系大鼠背部剃毛并用脱毛液硫化钠做脱毛处理。
(3)水浴锅的温度设为85℃，利用水浴锅加热铜管，裸露处对称两个部位用加热的铜管做烫伤10s。
(4)实验共分为三组：
空白对照组：裸露处对称两个部位烫伤，不滴加任何培养基或细胞因子。
阴性对照组：裸露处对称两个部位烫伤，滴加10-20μl样品1，滴加完毕后，使大鼠处于麻醉状态静置20-30min，以防滴加的培养基由于大鼠的活动而洒落。
实验组：裸露处对称两个部位烫伤，滴加10-20μl样品2，滴加完毕后，使大鼠处于麻醉状态静置20-30min，以防滴加的培养基由于大鼠的活动而洒落。
(5)创口愈合的不同时间点拍照，连续观察直至伤口愈合。结果如图3所示。
(6)图3结果显示人皮肤表皮细胞培养上清中激肽释放酶7可促进伤口愈合，明显优于空白对照组和阴性对照组。说明细胞因子激肽释放酶7对伤口修复愈合效果明显，主要表现在促进结痂和结痂脱落上。创口处滴加激肽释放酶7，与不加激肽释放酶7的创口相比，炎症反应概率降低，伤口结痂迅速，愈合良好，愈后皮肤平整，疤痕浅。
综合现有的研究，KLK7在创伤愈合中的作用，一方面可能是激活促炎性细胞因子前白细胞介素-1β，在损伤早期出现，通过自身量的改变，发动机体的炎症反应，使毛细血管壁通透性增加，诱导炎性细胞向损伤区域浸润，调节炎症细胞分泌细胞因子，从而使损伤进入修复阶段，在创伤愈合中发挥重要作用；另一方面，KLK7在皮肤中作为分泌性蛋白酶可降解维持皮肤完整结构的蛋白corneodesmosome(包括desmoglein，desmocollin和desmoplakin)，引起细胞桥粒的降解，从而降低细胞的凝聚力并在表皮更新的末期促进细胞脱落，促进角质层细胞脱落，以加快创口愈合过程。

Claims (10)

1.激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述应用包括：促进表皮细胞生长和迁移；促进真皮成纤维细胞增殖和迁移。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述激肽释放酶7为人激肽释放酶7。
4.一种利用人表皮细胞制备人肽释放酶7的方法，其特征是，用人皮肤表皮细胞培养基培养人原代表皮细胞，隔天换液，表皮细胞4-5天进行传代，回收细胞培养上清液，上清液中含有人激肽释放酶7；
5.如权利要求4所述的利用人表皮细胞制备人肽释放酶7的方法，其特征是，所述表皮细胞培养基配方为：角质无血清培养基:DMEM培养基:Ham’s F-12培养基＝2:1:1、终浓度1.5mM的200mM L-谷氨酰胺、终浓度25μg/ml的牛垂体提取物、终浓度0.2ng/ml的表皮生长因子、0.4mM/500ml的氯化钙。
6.一种用于创口愈合的药剂，其特征是，所述药剂含激肽释放酶7。
7.如权利要求6所述的用于创口愈合的药剂，其特征是，所述激肽释放酶7为人激肽释放酶7。
8.如权利要求6或7所述的用于创口愈合的药剂，其特征是，所述药剂为喷剂，包括如下重量百分比的组分：
9.如权利要求6或7所述的用于创口愈合的药剂，其特征是，所述药剂为凝胶，包括如下重量百分比的组分：
10.如权利要求6或7所述的用于创口愈合的药剂，其特征是，所述药剂为软膏，包括如下重量百分比的组分：
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