CN108403802A - 苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用，属于医学药物研发技术领域。本发明利用苹果皮粉制备的药物能够有效地降低肺癌迁移与增殖，阻抑肺癌细胞生长。

Description

苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医学药物研发技术领域，具体涉及苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用。

背景技术

肺癌是最常见的肺原发生性恶性肿瘤。近50年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。每年中国约有60万人死于肺癌，成为世界第一肺癌大国。其中有90％的患者死于治疗后肺癌细胞的侵袭与迁移。如何预防肺癌肿瘤细胞的迁移与增殖，降低肺癌患者术后复发几率，延续其生命成为我们当前关注的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用。本发明利用苹果皮粉制备的药物能够有效地降低肺癌迁移与增殖，阻抑肺癌细胞生长。

本发明提供了苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用。

优选的是，所述药物中苹果皮粉的有效剂量为0.1～0.3g/mL。

优选的是，所述苹果的种类为红富士。

优选的是，所述苹果皮粉的制备方法包括以下步骤：将用盐水清洗后的苹果皮冷冻干燥30～40小时，将所述冷冻干燥得到的物料研磨粉碎过80～100目筛。

优选的是，所述苹果皮的厚度为0.01～0.04cm。

优选的是，所述盐水的质量浓度为2‰～4‰。

优选的是，所述冷冻干燥的温度为-80℃。

本发明还提供了一种抑制肺癌细胞增殖与转移的药物，所述药物包括苹果皮粉和药学上可接受的辅料，所述药物中苹果皮粉的有效剂量为0.1～0.3g/mL。

本发明提供了一种苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用。本发明利用苹果皮粉制备的药物，苹果皮中含有丰富的天然黄酮类化合物，能够诱发癌细胞和肿瘤细胞的凋亡，发挥抗癌抗肿瘤作用，而对正常组织细胞的凋亡起延缓作用。因此，通过服用含有苹果皮粉制备的药物能够有效地降低肺癌迁移与增殖，阻抑肺癌细胞生长；核心添加物苹果皮粉取材方便，制作工艺简单，价格低廉，无任何副作用。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的不同药液添加量处理后肺癌A549细胞的迁移结果图；

图2为本发明实施例4提供的不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的克隆结果图；

图3为本发明实施例4提供的不同药物添加量培养肺癌细胞A549结果图；

图4为本发明实施例5提供的100μL药物处理后肺癌A549细胞的迁移能力结果图；

图5为本发明实施例5提供的100μL药物处理后肺癌A549细胞的增殖能力结果图；

图6为本发明实施例5提供的100μL药液处理24h后肺癌A549细胞观察结果图；

图7为本发明实施例5提供的100μL药液处理24h后肺癌A549细胞周期比例分布结果图；

图8为本发明实施例5提供的流式细胞术分析100μL药液处理24h后肺癌A549细胞周期变化结果图；

图9为本发明实施例5提供的100μL药液处理24h后肺癌A549细胞凋亡比例分布结果图；

图10为本发明实施例5提供的流式细胞术分析100μL药液处理24h后肺癌A549细胞凋亡变化结果图。

具体实施方式

本发明提供了苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用。

在本发明所述药物中苹果皮粉的有效剂量为0.1～0.3g/mL，优选为0.2g/mL。在本发明中，所述有效剂量指的是苹果皮粉对细胞的作用浓度。本发明所述药物的患者服用剂量优选为2g/次，服用频率优选为3次/天。本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定。在本发明中，所述药物的剂型优选为粉末药剂。当所述药物为粉末药剂时，本发明优选采用胶囊对药物进行包裹。本发明胶囊包裹后的药物能够控制药物的释放，有助于药物的有效吸收。在本发明中，所述胶囊优选采用明胶进行制备。本发明对所述胶囊的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的胶囊制备方法即可。本发明药物在用于细胞实验时，优选采用二甲基亚砜作为溶剂，所述二甲基亚砜能够溶解苹果皮粉，成本低，渗透性强，能够使苹果皮中的有效成分渗透入细胞实验中的细胞中。

在本发明中，所述苹果的种类为红富士。本发明对所述苹果的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售苹果即可。

在本发明中，所述苹果皮粉的制备方法包括以下步骤：将用盐水清洗后的苹果皮冷冻干燥30～40小时，将所述冷冻干燥得到的物料研磨粉碎过80～100目筛，更优选为90目。

在本发明中，所述苹果皮的厚度优选为0.01～0.04cm，更优选为0.02cm。在本发明中，所述盐水的质量浓度优选为2‰～4‰，更优选为3‰。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-80℃。在本发明中，所述冷冻干燥的时间优选为30～40h，更优选为36h。本发明得到苹果皮粉后，优选将苹果皮粉在-4℃下保存备用。

本发明对所述苹果的获取方法没有特殊的限定，采用常规苹果皮获取方法即可，如用刀、刨子或其它削苹果的工具进行削皮即可。

本发明还提供了一种抑制肺癌细胞增殖与转移的药物，所述药物包括苹果皮粉和药学上可接受的辅料，所述药物中苹果皮粉的有效剂量为0.1～0.3g/mL。

本发明对所述辅料的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物辅料即可，如二甲基亚砜、乙醇等。

本发明对所述药物的制备方法没有特殊的限定，将苹果皮粉与药学上可接受的辅料进行常规混合或溶解即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

苹果皮粉制作。将苹果皮用2‰的盐水清洗，-80℃低温冷冻干燥36小时后，研磨粉碎过80目筛，-4℃保存备用。

药物制作。称取0.1g粉末溶解于1mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为0.1g/mL的药液。

实施例2

苹果皮粉制作。将苹果皮用3‰的盐水清洗，-80℃低温冷冻干燥30小时后，研磨粉碎过100目筛，-4℃保存备用。

药物制作。称取0.3g粉末溶解于1mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为0.3g/mL的药液。

实施例3

苹果皮粉制作。将苹果皮用4‰的盐水清洗，-80℃低温冷冻干燥38小时后，研磨粉碎过90目筛，-4℃保存备用。

药物制作。称取0.2g粉末溶解于1mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为0.2g/mL的药液。

实施例4

降低肺癌细胞迁移的实施方法。按照Transwell实验的基本操作方法，每500μL的反应体系中，分别加入实施例3制备得到的浓度为0.2g/mL的药液25μL、50μL和100μL。8h后，将染色后的细胞小室放置于载玻片上，荧光倒置显微镜Olympus X71下100倍拍照计数，观察细胞迁移能力。

图1为不同药液添加量处理后肺癌A549细胞的迁移结果图，其中，图1-1为对照组(只有二甲基亚砜)，图1-2为25μL药物处理组，图1-3为50μL药物处理组，图1-4为100μL药物处理组。由图1和表1可以看出，Transwell实验8h后，随着药液添加量的增加肺癌A549细胞的迁移率明显下降，50μL和100μL药物处理组的肺癌A549细胞的迁移速率明显低于对照组(不含苹果皮粉，只有二甲基亚砜)。

表1不同药液添加量处理后肺癌A549细胞的迁移个数

	对照组	25μL处理组	50μL处理组	100μL处理组
					平均值	95.75	83.63	49.75	30.75
标准差	8.89	7.87	3.92	5.01

抑制肺癌细胞克隆的实施方法。按照细胞克隆形成实验的基本操作方法，每500μL的反应体系中，分别加入实施例3制备得到的浓度为0.2g/mL的药液25μL、50μL和100μL。不同药物浓度处理持续一周后，终止培养，固定克隆，染色，利用数码相机拍照，计数克隆数量。

不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的克隆结果如图2和表2所示，其中，图2-1为对照组(只有二甲基亚砜)，图2-2为25μL药物处理组，图2-3为50μL药物处理组，图2-4为100μL药物处理组。随着药液的增加，肺癌细胞A549克隆形成的个数明显下降，50μL～100μL药物处理组的肺癌A549细胞的增殖速率明显低于对照组，细胞增殖得到了很好的抑制。

表2不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的克隆个数与形成率

	对照组	25μL处理组	50μL处理组	100μL处理组
					克隆形成数量/个	253.33	235.33	127.67	40.67
克隆形成率/％	84.44	78.44	42.56	13.56
					标准差	3.02	1.50	1.58	0.69

杀死肺癌细胞的实施方法。每500μL的细胞反应体系中，分别加入实施例3制备得到的浓度为0.2g/mL的药液25μL、50μL和100μL，细胞培养24h和48h时分别在荧光倒置显微镜Olympus X71下拍照与计数。

不同药物添加量培养肺癌细胞A549结果如图3所示。肺癌细胞A549的培养液中添加药液25μL～100μL后，肺癌细胞在24h时无明显影响(图3-1，其中，图3-1-a为对照组，图3-1-b为25μL药物处理组，图3-1-c为50μL药物处理组，图3-1-d为75μL药物处理组，图3-1-e为100μL药物处理组)；然而48h时，75μL和100μL药物添加组的细胞密度为60％左右，细胞形态变圆，有死亡趋势(图3-2，图3-2-a为对照组，图3-2-b为25μL药物处理组，图3-2-c为50μL药物处理组，图3-2-d为75μL药物处理组，图3-2-e为100μL药物处理组)。

通过在肺癌细胞培养液中添加苹果皮粉可以有效降低肺细胞迁移能力，抑制肺癌细胞增殖，一定程度上杀死肺癌细胞。同时，本发明所涉及的药物制作工艺简单，价格低廉，对人体无药物残留，无副作用。适合肺癌患者术后预防癌细胞转移与治愈过程中长期服用。

实施例5

苹果皮粉制作。将苹果皮用2％的盐水清洗，-80℃低温冷冻干燥36小时后，研磨粉碎过80目筛，-4℃保存备用。

药物制作。精确称取0.15g粉末溶解于1mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为0.15g/mL的药液。

降低肺癌迁移的实施方法。将处于对数生长期的A549细胞消化，重悬，计数，在六孔板每孔加入2×10⁵个A549细胞，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；24h后每500μL的反应体系中，加入药液100μL，对照组只添加相应体积的二甲基亚砜溶液；药物作用24h后弃去旧培养液，消化细胞，用适量培养液重悬细胞并计数；按实验设计取所需数量小室于一空24孔板中，加100μL无血清培养基到小室内，培养箱放置1～2h；在24孔板每孔加入600μL含30％FBS培养液；按一定比例稀释细胞，在Transwell小室膜水化后，从小室内小心移去培养基，再加无血清细胞悬液(含2×10⁵cell/mL)100μL到每个小室中；用镊子将装有细胞的小室小心转移到含30％FBS培养液的小孔中，放置培养箱培养8h；实验结束，取出小室，倒扣于吸水纸上以去除培养液，将棉签轻抵小室内底膜，轻轻转动擦去小室内层非迁移细胞；加400μL染色液到24孔板的空孔中；用镊子夹取小室浸泡在染色液中，染色20min，将膜表面已迁移的细胞染色；将染色的小室浸泡在一个大的水杯中，漂洗数次。室温下晾干小室；将小室放置载玻片上，荧光倒置显微镜Olympus X71下100×拍照后计数，100μL药物处理后肺癌A549细胞的迁移能力结果图如图4所示。100μL药液物处理组的肺癌A549细胞的迁移平均个数为30.75，明显低于对照组的95.75(图4和表3)其中，图4-1为对照组，图4-2为100μL药物处理组，100μL药液物处理组对肺癌细胞的迁移具有明显的阻抑作用。

表3 100μL药液处理后肺癌A549细胞的迁移个数

	对照组	100μL药液组
			平均值	95.75	30.75
标准差	8.89	5.01

抑制肺癌A549细胞增殖的操作方法。将处于对数生长期的A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；六孔板每孔加入300个A549细胞，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；24h后加入100μL药液，对照组只添加相应体积的二甲基亚砜溶液；药物作用3d后弃去旧培养液，重新加入相同浓度的药液，对照组换新鲜培养液，添加相应体积的二甲基亚砜溶液；培养一周后观察到培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去旧培养液，PBS小心浸洗2次；每孔加入1mL4％多聚甲醛，固定15min，灭菌的超纯水清洗2次，每次2min；每孔加入1mL Crystal Violet Staining Solution(1％结晶紫染色液)，室温下避光孵育10min，无菌的超纯水清洗2次，每次2min，空气干燥；将培养板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)*100％。100μL药物处理后肺癌A549细胞的增殖能力结果如图5所示，其中，图5-1为对照组，图5-2为100μL药物处理组。100μL药物处理组肺癌A549细胞的增殖能力明显下降，克隆个数与克隆形成率分别为40.76个和13.56％，显著低于对照组的253.33个和84.44％(图5和表4)。

表4 100μL药液处理后肺癌细胞A549的克隆个数与形成率

	对照组	100μL处理组
			克隆形成数量/个	253.33	40.67
克隆形成率/％	84.44	13.56
			标准差	3.02	0.69

阻抑肺癌A549细胞生长的实施方法。在无菌操作下，将处于对数生长期的肺癌细胞A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；用血球计数板计数细胞；12孔板每孔加入1×10⁴A549细胞，每组3复孔，每孔100μL细胞悬液，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；铺好板后，置37℃5％CO₂培养箱培养24h后，每500μL的细胞反应体系中，药物处理组添加药液100μL，对照组添加相同体积的二甲基亚砜。处理24h后，采用荧光倒置显微镜Olympus X71下拍照与计数，100μL药液处理24h后肺癌A549细胞观察结果如图6所示，其中，图6-1为对照组，图6-2为100μL药物处理组，100μL药液处理24h后肺癌A549细胞周期变化结果如图7和图8所示，其中图7为100μL药液处理24h后肺癌A549细胞周期比例分布结果图，图8为流式细胞术分析100μL药液处理24h后肺癌A549细胞周期变化结果图，其中，图8-1为对照组，图8-2为100μL药物处理组；100μL药液处理24h后肺癌A549细胞凋亡变化结果如图9、图10和表6所示，其中，图9为100μL药液处理24h后肺癌A549细胞凋亡比例分布结果图，图10为流式细胞术分析100μL药液处理24h后肺癌A549细胞凋亡变化结果图(碘化丙锭双染法)，其中，图10-1为对照组，图10-2为100μL药物处理组。同时，利用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡。药液100μL处理组细胞圆润，开始出现死亡趋势。细胞周期分布显示，药物处理组G1期的细胞比例明显高于对照组，G2与S期细胞分布低于对照组，A549细胞发生G1期阻抑，凋亡早期的细胞比例也明显上升。

表5 100μL药液处理后肺癌A549的细胞周期分布

	G1 phase/％	G2 phase/％	S phase/％
				Control	50.31	6.72	42.97
100μL药物组	60.22	1.62	38.15

表6 100μL药液处理后肺癌A549的细胞凋亡分布

通过本发明的药物制剂，100μL药物处理组可以有效地阻抑肺癌A549细胞的迁移能力，降低肺癌细胞A549的细胞增殖速率。同时，肺癌A549细胞停滞在G1期的比例增加，G2期与S期的比例下降，早期凋亡细胞数量显著增加，表明该药物处理能明显阻抑细胞生长，增加早期细胞凋亡发生。

实施例6

肺癌患者治疗的临床观察

患者1：唐先生，75岁，江苏江阴人。患咳凑、咳血，在当地肿瘤医院检查，影像见左肺上叶舌段可见团块状高密度影，4.22*6.65*5.32cm，边缘毛糙。舌叶上段支气管狭隘，中断。考虑肺癌可能性大。痰液检查，见癌细胞。患者与家属考虑其年纪偏大，不愿意做化疗。在医生的建议下，开始服用本实验药物，服用4个月后，未见肿瘤增大与转移现象。目前情况稳定，继续服用本实验药物。

患者2：:张女士，60岁，江苏无锡人。2017年1月检查发现右肺癌肺脑、骨、***等多处转移，未做手术及放化疗。2017年3月检查时精神差咳嗽，吐白黏痰，右胸背疼痛，胸闷，二便可。在医生的建议下，开始服用本实验药物。经过3个月的治疗，咳嗽、吐白黏痰、胸背疼痛减轻，体重增加，无不适。6个月后，患者一般情况好，咳嗽胸闷症状减轻。现继续服用本药物巩固治疗中。

患者3：李先生，35岁，江苏泰州人，肺癌晚期，左肺癌***转移。2016年7月在医院确诊为左肺癌***转移，未做特殊治疗，于2017年1月了解到我们产品，希望服用。来诊时精神睡眠差，消瘦，乏力，胸闷。在医生的建议下，按照本实验药物进行治疗，5个月后，患者一般情况良好，饮食改善，胸闷明显减轻。CT检测未见其他转移现象。

患者4：林先生，54岁，江苏淮安人。2017年1月确诊为右肺小细胞肺癌骨转移***转移。未做手术，共化疗2个疗程，余未作特殊治疗。于2017年7月在医生的建议下服用本实验药物，服用前精神睡眠差，胸闷，咳嗽，吐白黏痰，痰中带血，消瘦，乏力。服用4个月后，患者病情稳定，咳嗽，吐白黏痰明显减轻。6个月后，患者精神气色好，已不胸闷，有少量的白粘痰，饮食改善，病情稳定。CT检查未见其他转移现象，并且淋巴转移阴影面积缩小。目前，继续服用本药物，情况持续好转。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.苹果皮粉在制备抑制肺癌细胞增殖与转移的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中苹果皮粉的有效剂量为0.1～0.3g/mL。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苹果的种类为红富士。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苹果皮粉的制备方法包括以下步骤：将用盐水清洗后的苹果皮冷冻干燥30～40小时，将所述冷冻干燥得到的物料研磨粉碎过80～100目筛。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苹果皮的厚度为0.01～0.04cm。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述盐水的质量浓度为2‰～4‰。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为-80℃。

8.一种抑制肺癌细胞增殖与转移的药物，其特征在于，所述药物包括苹果皮粉和药学上可接受的辅料，所述药物中苹果皮粉的有效剂量为0.1～0.3g/mL。