CN108392500B - 一种制备灵芝三萜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备灵芝三萜的方法，该方法包括如下步骤：将灵芝子实体加入50‑100％的乙醇，液料质量比30‑80:1，提取温度55‑100℃，提取时间1‑3小时，提取液浓缩得到灵芝醇提物；将灵芝子实体加工成10‑80目粒度大小，加入灵芝醇提物混匀，然后放入超临界的萃取罐内，进行超临界CO2萃取；萃取物65℃以下浓缩和干燥，得灵芝提取物。本发明的制备灵芝三萜的方法，提取得到的灵芝三萜，当作用浓度为100ug/mL时，对人***肿瘤细胞LNCaP的抑制率为66.76％，22RV1的抑制率为62.69％。

Description

一种制备灵芝三萜的方法
技术领域
本发明涉及食药用真菌的深加工领域，具体的说涉及一种制备灵芝三萜的方法。
技术背景
灵芝(Ganoderma lucidum)属单子菌纲，多孔菌科，具有补中益气、扶正固本、延年益寿等功效，是一种珍贵的中药材，素有“仙草”之誉。研究表明灵芝具有抗衰老、调节免疫、保肝排毒、抑制肿瘤、抗菌、抗病毒等功效。灵芝含有多种生物活性成分，包括三萜、多糖、甾醇、生物碱等。灵芝三萜和灵芝多糖是灵芝中的主要的活性物质。
提取灵芝三萜的方法主要有：有机溶剂提取法，超声波提取法和超临界二氧化碳萃取法。传统的萃取方法主要是使用有机溶剂从灵芝子实体中萃取三萜，该方法消耗的有机溶剂多、耗时长；大部分的超临界技术被广泛运用到灵芝孢子油的提取中，而灵芝子实体的超临界萃取普遍存在提取效率低、成本高和活性低等问题。因此，需要开发一种提取率高但成本低的灵芝三萜提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备灵芝三萜的方法，该方法包括如下步骤：
①将灵芝子实体加入50-100％的乙醇，液料质量比30-80:1，提取温度55-100℃，提取时间1-3小时，提取液浓缩得到灵芝醇提物；
②将灵芝子实体加工成10-80目粒度大小，加入步骤①的灵芝醇提物混匀，然后放入超临界的提取罐内，进行超临界CO2萃取；
③超临界萃取工艺条件为：温度40-70℃，压力20-50Mpa，50-100％(V/V)的乙醇做为夹带剂，用量4-10mL/g，时间1-3h；
④萃取物65℃以下浓缩和干燥，得灵芝提取物。
其中步骤①中：
所述的浓缩得到的灵芝醇提物中含质量分数为2％-20％的乙醇，其中乙醇的含量是通过提取液浓缩时乙醇回收量计算而得；
其中步骤②中：
所述的芝子实体与灵芝醇提物的质量比例为10:1-1:10；
所述的CO2纯度为99-100％；
超临界萃取工艺条件为：温度40-60℃，压力20-35Mpa，80-100％(V/V)乙醇作为夹带剂，用量4-8mL/g，时间1-3h。
本法将热回流提取和超临界提取结合，大大降低了提取溶剂的消耗、减少了提取时间，提高了提取效率，同时还保护了灵芝子实体提取物的活性。
本发明结合了两种提取技术：先使用大规模提取灵芝三萜的热回流技术进行初步提取，然后采用绿色高效的超临界萃取技术进一步萃取。结果表明：两种方法的有效结合，提高了灵芝三萜提取效率，缩短了热回流提取的时间，不仅降低了能耗，而且降低了提取物中热敏性的成分损失，提高了灵芝提取物的活性，提取得到的灵芝三萜对***增生具有很高的生物活性。
本发明涉及一种提取灵芝三萜的方法，提取得到的灵芝三萜对***相关疾病具有很好的效果。当灵芝三萜样品作用浓度为100ug/mL时，***肿瘤细胞LNCaP的抑制率为66.76％，22RV1的抑制率为62.69％，抑制效果接近400μM的阳性药物非那雄胺。
本发明的灵芝三萜制备方法，将传统的灵芝醇提物与灵芝子实体混匀，采用绿色高效的超临界技术深度加工生产灵芝活性成分，可以使提取效率大大提高，大大降低提取成本，活性也有很好的提升，可以为营养保健和医药领域中的新产品及原料提供技术支持。
附图说明
图1实施例1的灵芝萃取物抑制LNCaP细胞和22RV1细胞活性比较
其中，横坐标中的F为非那雄胺
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
将产地为浙江龙泉的沪农灵芝(G.lucidum)1号(上海市农业科学院)子实体粉碎后过20目筛，称取1000g置于提取罐内，加入80％的乙醇，液料质量比40:1，提取温度85℃，提取3h后提取液过滤浓缩得到灵芝醇提物88.83g，标记为Ⅰ，其含有10％的乙醇。
将灵芝子实体加工成60目粒度大小，将制备的浸膏状灵芝醇提物Ⅰ和灵芝子实体以质量比为1:1比例加入混匀，然后称取40g混合物放入超临界的提取罐内，进行超临界CO2萃取，提取工艺条件为：温度40℃，压力30Mpa，90％乙醇夹带，夹带剂用量6mL/g，时间1h。
萃取结束后，从分离釜出料口收集萃取液，65℃浓缩和干燥，得灵芝萃取物4.09g，萃取率为10.2％。按照2015药典，以齐墩果酸为对照品，测得灵芝三萜含量为35.91％。
灵芝三萜含量的计算方法(2015药典测定灵芝三萜含量方法)：
1.对照品溶液的制备取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。
2.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分别置15mL具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10mL，即得)0.2mL、高氯酸0.8mL，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰水浴中冷却5分钟，取出，精密加入乙酸乙酯4mL，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在546nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。
3.供试品溶液的制备取制备得到的灵芝萃取物粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50mL，超声处理(功率140W，频率42kHz)45分钟，滤过，滤液置100mL量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并人同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。
4.测定法精密量取供试品溶液0.2mL，置15mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得。
本品按干燥品计算，含三萜及甾醇以齐墩果酸(C30H48O3)计，不得少于0.50％。
实施例2
将产地为浙江龙泉的沪农灵芝(G.lucidum)1号(上海市农业科学院)子实体粉碎后过10目筛，称取1000g置于提取罐内，加入90％的乙醇，液料质量比为40:1，提取温度90℃，提取2h后过滤浓缩得到灵芝醇提物81.49g，标记为Ⅱ，其含有5％的乙醇。
将灵芝子实体加工成80目粒度大小，将制备的浸膏状灵芝醇提物Ⅱ和灵芝子实体按照质量比为1:1比例加入混匀，然后称取40g混合物放入超临界的提取罐内，进行超临界CO2萃取，提取工艺条件为：温度50℃，压力35Mpa，90％乙醇夹带，夹带剂用量6mL/g，时间1.5h。
萃取结束后，从分离釜出料口收集萃取液，65℃浓缩和干燥，得灵芝萃取物5.37g，萃取率为13.4％。按照2015药典，以齐墩果酸为对照品，测得灵芝三萜含量为38.43％。
实施例3
LNCaP细胞的抑制率检测
将细胞浓度为54个/mL的肿瘤细胞LNCaP(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)悬浮液180μL加入96孔板中，待48h后加入20μL待检样品(实施例1的灵芝萃取物、热回流提取、索氏提取、超声提取和冷浸提取四种方法制备得到的灵芝提取物)，以DMSO为阴性对照，非那雄胺为阳性对照，每个样品设3个重复，在37℃、5％浓度的CO2条件下培养48h后，吸去旧培养基加入180μL无色1640培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)，20μL0.075mg/mL的Alamar Blue试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)，待变色后用酶联免疫检测仪于570和600nm下测吸光值，用公式计算样品对细胞增殖的影响。
Figure BDA0001618565530000041
当实施例1的灵芝萃取物样品作用浓度为100ug/mL时，LNCaP细胞的抑制率为66.76％。
实施例4
22RV1细胞的抑制率检测
将细胞浓度为5×104个/mL肿瘤细胞22RV1(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)悬浮液180μL加入96孔板中，待24h后加入20μL实施例1的提取物样品，以DMSO为阴性对照，非那雄胺为阳性对照，每个样品设3个重复，在37℃、5％浓度的CO2条件下培养72h后，吸去旧培养基加入180μL无色1640培养基(美国Thermo Fsher Scientific公司)，20μL 0.075mg/mL的Alamar Blue试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)，待变色后用酶联免疫检测仪于570和600nm下测吸光值，用公式计算样品对细胞增殖的影响。
当实施例1的灵芝萃取物样品作用浓度为100μg/mL时，***肿瘤细胞22RV1的抑制率为62.69％。

Claims (3)

1.一种制备灵芝三萜的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
①将灵芝子实体加入50-100％的乙醇，液料质量比30-80:1，提取温度55-100℃，提取时间1-3小时，提取液浓缩得到灵芝醇提物；
②将灵芝子实体加工成10-80目粒度大小，加入步骤①的灵芝醇提物混匀，然后放入超临界的萃取罐内，进行超临界CO2萃取；灵芝子实体与灵芝醇提物的质量比例为1:1；
③超临界萃取工艺条件为：温度40-70℃，压力20-50Mpa，50-100％(V/V)乙醇做为夹带剂，用量4-10mL/g，时间1-3h；
④萃取物65℃以下浓缩和干燥，得灵芝提取物。
2.根据权利要求1所述的制备灵芝三萜的方法，其特征在于其中步骤①中：
所述的浓缩得到的灵芝醇提物中含质量分数为2％-20％的乙醇。
3.根据权利要求1所述的制备灵芝三萜的方法，其特征在于其中步骤②中：
所述的灵芝子实体与灵芝醇提物的质量比例为1:1；
所述的CO2纯度为99-100％；
超临界萃取工艺条件为：温度40-60℃，压力20-35Mpa，80-100％(V/V)乙醇作为夹带剂，用量4-8mL/g，时间1-3h。
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