CN108387545B

CN108387545B - 四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN108387545B
Application number: CN201810102270.1A
Authority: CN
Inventors: 张敏; 鲁娜; ***; 曾彩霞; 苗腾; 张锐
Original assignee: Shanghai University of Engineering Science
Current assignee: Shanghai University of Engineering Science
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108387545A

Abstract

本发明涉及材料和检测领域，提供了一种四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶，结构包括中空的四氧化三铁纳米管以及其表面附着的碳。制备方法包括：将铁盐与模板纳米棒混合，使FeOOH沉积在模板纳米管表面，再将含碳有机物前体沉积于FeOOH表面并去除模板纳米棒，碳化得到四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶。这种模拟酶具有优异的电磁性能、催化活性、生物相容性和水分散性，同时还具有类过氧化物酶以及类氧化酶双重活性，可作为类过氧化物酶催化剂，并用于检测过氧化氢以及可产生过氧化氢的物质，尤其是葡萄糖和胆固醇。与现有检测手段相比，本发明的方法简单快捷、经济环保、检测限宽、灵敏度高、选择性好、可视化。

Description

四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于材料和检测技术领域，具体涉及一种多功能四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)的制备方法，涉及基于Fe₃O₄@C-NTs优异的类过氧化物酶活性作为催化剂直接检测过氧化氢或者通过检测中间产物过氧化氢从而间接检测血糖的方法。

背景技术

目前，对血糖的检测技术已经日趋成熟，主要有高效液相色谱法、分光光度法、临床血糖生化仪等，这些检测技术普遍存在分析速度较慢、成本较高、现场即时检测较难等局限。市面上的便携式血糖仪，如：罗氏血糖仪、三诺血糖仪、强生血糖仪等，用到的试纸条价格相对高昂，对于每天都需要检测血糖的人而言，依然是一笔较大的花费，因此，建立快速高效、简单准确、经济实惠的血糖检测方法一直是近年来的热点。

最初，中国科学院生物物理研究所阎锡蕴研究小组发现四氧化三铁纳米颗粒具有类过氧化物酶催化活性，并利用这一特性，设计了两种免疫检测方法，实现了对乙肝病毒表面抗原和肌钙蛋白的检测(L.Z.Gao,J.Zhuang,L.Nie,J.B.Zhang,Y.Zhang,N.Gu,T.Wang,J.Feng,D.L.Yang,S.Perrett,X.Y.Yan,Nature Nanotechnology.2007,2,577-583)。随后，汪尔康等人利用四氧化三铁纳米颗粒类过氧化物酶特性，实现了对过氧化氢和葡萄糖的检测(H.Wei,E.K.Wang,Anal.Chem.2008,80 2250-2254)。另外，各种无机纳米***也展示出了意想不到的类过氧化物酶活性或者氧化酶活性，例如：CeO₂纳米粒子、V₂O₅纳米线、Co₃O₄NPS、Au NPS、氧化石墨烯(GO)等纳米粒子在不同pH和不同温度下表现出了比辣根过氧化物酶更加稳定的催化特性，是一种新型的模拟酶。然而，基于纳米材料的人工酶在生物催化的应用中仍然存在许多缺陷，比如合成量小、合成过程复杂、不确切的物理和化学性质等，因此，需要对纳米酶的结构进行优化调整，使其性能更加稳定。

本发明制备的具有类过氧化物酶以及类氧化物酶双重催化活性的Fe₃O₄@C-NTs，合成的过程操作简单，经济环保，对现有方法进行优化，最后在氮气氛围下高温还原FeOOH，与在H₂氛围下相比，安全系数高，与其它具有单一的类过氧化物酶活性的纳米模拟酶相比，具有优异的催化活性、电磁性能、生物相容性，在水中的分散性好。对于类过氧化物酶活性的研究，过氧化氢可作为一种底物，因此Fe₃O₄@C-NTs可以用来直接检测过氧化氢。另外，很多生物化学反应的中间产物都涉及到过氧化氢的生成，在本专利中，我们利用血糖作为检测目标，葡萄糖在葡萄糖氧化酶，以及氧气的共同作用下产生过氧化氢，过氧化氢进而通过Fe₃O₄@C-NTs的分解产生羟基自由基，生成的羟基自由基迅速将TMB氧化生成蓝色产物，然后利用TMB的蓝色氧化产物在特定波长下的吸光度可以求出样品中血糖的含量。该比色检测血糖的方法无需标记，操作简单，快速高效，可视化，具有高的灵敏度和选择性，即使当干扰物质的浓度为葡萄糖浓度的20倍时，该方法仍然可以高效的检测出葡萄糖，对血糖的检测具有较宽的线性范围。

发明内容

本发明的一个目的是提供具有类过氧化物酶和类氧化物酶双重活性的四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶及制备方法。

本发明的另一个目的在于提供基于上述四氧化三铁基复合碳纳米管的模拟酶所具有的类过氧化物酶活性，将其用于检测过氧化氢；或者检测生物活性物质例如葡萄糖，尤其是血糖的含量。

本发明的技术方案为：一种四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)，结构包括中空管状的四氧化三铁纳米管以及表面附着的碳纳米管；四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶的外径160～450nm，长度1～10μm，四氧化三铁层厚度45～75nm，碳纳米管厚度3～6nm。优选的，长度1～5μm；优选的，平均外径200～300nm，平均内径90～120nm。

上述四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶的制备方法包括如下步骤：

(1)金属氧化物纳米棒@FeOOH(负载FeOOH的金属氧化物纳米棒)的制备：金属氧化物纳米棒分散于醇水混合液中，加入铁盐溶液混合，在60～90℃下反应2～8h，取沉淀干燥；优选的，反应条件为：70～90℃下反应2～6h；

(2)FeOOH@有机物(负载有机物的FeOOH纳米管)的制备：

方法a.负载FeOOH的金属纳米棒分散于水或者醇水混合液中，与碱混合搅拌反应1～3h，加入含碳有机物前体搅拌反应10～24h，去除金属氧化物纳米棒，并且使含碳有机物前体沉积在FeOOH管的表面，得到负载有机物的FeOOH纳米管；或者，

方法b.负载FeOOH的金属纳米棒分散于水或者醇水混合液中，在碱性条件下加入含碳有机物前体搅拌反应10～24h，使含碳有机物前体沉积在FeOOH表面，洗涤干燥再用酸反应去除金属氧化物纳米棒，得到负载有机物的FeOOH纳米管(FeOOH@有机物)；

(3)负载有机物的FeOOH纳米管在氮气气氛或惰性气体气氛下碳化。

步骤(1)所述的金属氧化物纳米棒为MoO₃纳米棒或MnO₂纳米棒，其直径为50～300nm，长度1～10μm；优选的，其直径为50～300nm，长度1～5μm；

铁元素与金属氧化物纳米棒的摩尔比为1～4：1，优选为1.5～3：1，更优选为2：1。

步骤(1)所述的铁盐优选为铁铵盐，更优选为硫酸铁铵；所述的金属纳米棒为MoO₃纳米棒；铁元素与MoO₃摩尔比为1～4：1，优选为1.5～3：1，更优选为2：1。

步骤(1)的反应体系中，MoO₃纳米棒的含量为0.05～0.2mol/L。

步骤(1)的反应体系中，醇与水的体积比为1：10～20，优选为1：15～18。

步骤(1)所述的金属氧化物纳米棒为MoO₃纳米棒、MnO₂纳米棒、Al₂O₃纳米棒、ZnO纳米棒、CuO纳米棒、TiO₂纳米棒或SnO₂纳米棒，其直径为50～300nm，长度1～10μm；步骤(2)中用碱去除MoO₃纳米棒、Al₂O₃纳米棒和TiO₂纳米棒，用酸去除MnO₂纳米棒、ZnO纳米棒和SnO₂纳米棒。

步骤(2)中，负载FeOOH的金属纳米棒(金属氧化物纳米棒@FeOOH)在反应体系中的含量为0.5～5mg/mL，优选为0.7～2mg/mL。优选的，所述负载FeOOH的金属氧化物纳米棒为负载FeOOH的MoO ₃纳米棒。

步骤(2)中，所述的碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾，浓度为0.1～1mol/L，优选为0.4～0.8mol/L；优选的碱为氨水，浓度为0.4～0.8mol/L；优选的，用氨水去除MoO₃纳米棒；反应体系中氨的浓度为0.4～0.6mol/L。所述的酸为盐酸、硝酸、氢氟酸或硫酸，用酸去除金属氧化物纳米棒时，反应时间为1～6小时。

步骤(2)中，加入碳化前体有机物后，以碳元素计，在混合体系中的含量为0.1～1mg/mL，优选为0.25～0.5mg/mL。碳元素与金属氧化物纳米棒@FeOOH质量比为0.2～0.5：1。

步骤(2)中，加入含碳有机物前体后的混合体系中，醇与水的体积比为1：0.5～2，优选为0.75～1.25。

步骤(2)所述的碳化前体有机物为多巴胺、苯胺或酚醛树脂。

步骤(3)所述碳化条件为：碳化温度400～700℃，在氮气气氛或惰性气体气氛下碳化3～8h。优选的，碳化条件为：450～600℃、氮气气氛或惰性气体气氛下碳化4～6h。

所述的MoO₃纳米棒制备方法包括以下步骤：将含有钼酸盐的酸性溶液在150～220℃下水热反应10～30h，离心取沉淀干燥；所述的钼酸盐为钼酸铵、钼酸钠或钼酸钾，优选为钼酸铵；所述的酸性溶液为硝酸、硫酸或盐酸，浓度2.5～4mol/L，优选为硝酸；钼酸盐与酸性溶液的用量比为0.02～0.05mol：1L。优选的，水热反应条件为：160～200℃下水热反应15～24h。

本发明的四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)具有类过氧化物酶(尤其是过氧化氢酶)活性以及类氧化物酶活性，具有双重催化活性。因此，Fe₃O₄@C-NTs可用于制备类过氧化物酶的催化剂、过氧化物酶模拟物、类氧化物酶的催化剂或者类氧化物酶模拟物。

基于Fe₃O₄@C-NTs的类过氧化物酶活性，可以催化过氧化氢分解，使显色指示剂(底物)氧化，利用类过氧化物酶活性催化过氧化氢分解，颜色发生变化，从而用于检测样品中的过氧化氢。所述的显色指示剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、发光氨或Amplex Red。

例如，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为显色指示剂，当体系中含有过氧化氢时，Fe₃O₄@C-NTs催化过氧化氢分解产生羟基自由基，可以迅速将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化，产生蓝色物质，通过测定生成的蓝色氧化产物(TMBox，oxTMB)在特定波长(652nm)下的紫外吸光度，定性或定量检测过氧化氢，可确定过氧化氢的含量。反应式如下：

在体系中不含过氧化氢的情况下，利用Fe₃O₄@C-NTs的类氧化物酶活性，也可以催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化生成蓝色的氧化产物(TMBox，oxTMB)。

本发明的四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶可以用于定性或定量检测过氧化氢或可被氧化生成过氧化氢的物质。

很多生物化学反应的中间产物都涉及到过氧化氢的生成，生物活性物质经氧化酶催化生成过氧化氢，通过检测产生的过氧化氢可以定性、定量检测生物活性物质。例如，以葡萄糖氧化酶(GO、GOx)为催化剂，在氧气存在的条件下，将葡萄糖氧化生成过氧化氢；之后根据上述过氧化氢的比色检测方法来定性或定量测定过氧化氢，进一步确定葡萄糖的含量。反应式如下：

检测过氧化氢时，步骤包括：a.将样品与四氧化三铁基复合碳纳米管、显色指示剂与缓冲液混合均匀，在pH＝2～10、25℃～65℃下反应5～30min；b.分离四氧化三铁基复合碳纳米管，检测反应液的吸收光谱。优选的，pH＝2～5，更优选为3～4；可以采用醋酸-醋酸钠缓冲液。优选的反应温度为40～65℃；优选的反应时间为8～15min。本发明的一个优选方式中，反应温度为60℃，反应时间为10min，缓冲液pH值4。

显色指示剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，在检测体系中的含量为1～800μM，优选为10～100μM；在本发明的一个优选方式中，含量为50μM。

四氧化三铁基复合碳纳米管(Fe₃O₄@C-NTs)在检测体系中的浓度范围为5～100μg/mL，优选为10～50μg/mL；在本发明的一个优选方式中，浓度为20μg/mL。

在本发明的一个优选方式中，使用0.2M、pH＝4的醋酸-醋酸钠缓冲液，显色指示剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，检测体系中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺含量为50μM、四氧化三铁基复合碳纳米管含量为20μg/mL。

检测生物活性物质的方法，步骤包括：

I.将待测样品与相应的氧化酶混合孵育，使生物活性物质氧化生成过氧化氢；

II.加入四氧化三铁基复合碳纳米管、显色指示剂及缓冲液，在pH＝2～10、25～65℃条件下反应5～20min；

III.分离四氧化三铁基复合碳纳米管，检测反应液的吸收光谱，进行定性或定量检测。

所述生物活性物质包括糖类、脂类、甾醇类化合物、维生素、氨基酸等能够被氧化生成过氧化氢的物质，尤其是葡萄糖、胆固醇、甘氨酸、乳糖、组氨酸等。

检测葡萄糖时，步骤包括：

i.将待测样品与葡萄糖氧化酶混合孵育，使葡萄糖氧化生成过氧化氢；

ii.加入四氧化三铁基复合碳纳米管和显色指示剂及缓冲液混匀，55～65℃反应8～15min；

本发明基于Fe₃O₄@C-NTs的类过氧化物酶活性比色检测过氧化氢的方法，在检测体系中，检测过氧化氢含量的线性范围为1×10^-6～2×10^-3mol/L，检测限1.00×10^-6mol/L。

利用Fe₃O₄@C-NTs作为催化剂结合葡萄糖氧化酶比色检测葡萄糖的方法，该方法无需标记，灵敏度高，特异性强，对于葡萄糖的比色检测线性响应浓度范围为5×10^-6～2×10^-3mol/L，检测限为1.00×10^-6mol/L。

在本说明书中，术语“类过氧化物酶”指显示出过氧化物酶催化活性的物质。具体地，本发明的类过氧化物酶催化氧化还原反应，并以过氧化物作为电子受体，从而氧化底物；术语“类氧化酶”指显示出氧化酶催化活性的物质。在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3',5,5'-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换。

本发明的有益效果在于：

(1)提供的四氧化三铁基复合碳纳米管(Fe₃O₄@C-NTs)具多功能的模拟酶活性，制备过程简单，操作性好，回收率高；在水中的分散性好，利用外加磁场就很容易从溶液中分离；与其它具有单一的类过氧化物酶活性的纳米模拟酶相比，具有优异的催化活性、电磁性能、生物相容性；

(2)制备过程操作简单，经济环保，在氮气氛围下高温还原FeOOH，与在H₂氛围下相比，安全系数高；

(3)利用四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶可以直接检测过氧化氢，在1～2000μM浓度范围内对过氧化氢具有很好的线性响应，检测限低；而且可以定性定量检测以过氧化氢为产物的生物活性物质；

(4)利用四氧化三铁基复合碳纳米管模拟酶，结合葡萄糖氧化酶，可以比色检测葡萄糖尤其是血糖；该方法无需标记、快速高效、可视化，具有高灵敏度和良好的选择性，即使当干扰物质的浓度为葡萄糖浓度的20倍时，该方法仍然可以高效的检测出葡萄糖；

(5)四氧化三铁基复合碳纳米管同时具有高的类过氧化物酶和类氧化物酶催化活性，因此可以作为一种新颖的模拟酶，可以替代过氧化氢氧化酶在生物检测、临床诊断和免疫分析等中广泛使用；这种模拟酶灵敏度高，并且能够取代固有的天然酶，在较高温度下也可进行检测，检测限宽、灵敏度高、选择性好、可视化，不但大大的降低了试剂的成本，经济环保，简单快捷，而且改善了工作环境。

附图说明

图1为本发明实施例1的Fe₃O₄@C-NTs的SEM图；

图2为实施例2Fe₃O₄@C-NTs的类氧化物酶活性效果图；

图3为实施例3在不同温度下Fe₃O₄@C-NTs的催化效果图；

图4为实施例3在不同pH下Fe₃O₄@C-NTs的催化效果图；

图5为实施例3不同用量的Fe₃O₄@C-NTs的催化效果图；

图6为实施例3不同TMB浓度下Fe₃O₄@C-NTs的催化效果图；

图7为实施例4Fe₃O₄@C-NTs比色检测过氧化氢的催化效果图；

图8为实施例5的Fe₃O₄@C-NTs比色检测葡萄糖的标准曲线图；

图9为实施例6的Fe₃O₄@C-NTs的选择性比色检测图。

图10为Fe₃O₄@C-NTs的合成示意图

图11为Fe₃O₄@C-NTs比色检测血糖的原理图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施实例对本发明进行详细说明。

实施例1四氧化三铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)的合成

合成的原理示意图如图10所示，步骤如下：

(1)MoO₃纳米棒的制备

①称取1g四水合钼酸铵((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.8mmol)溶解在20mL蒸馏水和5mL浓硝酸(65％，14.4mol/L)的混合溶液中；

②完全溶解后，将该反应溶液转移至50ml特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在预热的电烤箱中于180℃加热20h；

③离心、干燥，得到长度1～10μm、直径50～150nm(平均长度5μm、平均直径100nm)的MoO₃纳米棒；

(2)MoO₃@FeOOH(负载FeOOH的MoO₃纳米棒)的制备

①称取0.096g合成的MoO₃纳米棒(0.667mmol)加入到4mL无水乙醇(EtOH)和36mLH₂O的混合溶液中；

②称取0.643g NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O(1.33mmol)溶于27mL H₂O中，然后滴入到上述混合溶液中，于70℃下搅拌3.5h；

③离心取固体并洗涤干燥，得到红棕色的MoO₃@FeOOH。

(3)FeOOH@PDA(负载有机物PDA的FeOOH纳米管)的制备

①取50mg制备的MoO₃@FeOOH，加入25mL EtOH、25mL H₂O，超声使其分散均匀；

②加入2mL 28％氨水(NH₃·H₂O，约14.8mol/L)，室温下搅拌2h；

③加入多巴胺(DA)溶液：多巴胺30mg(0.2mmol)溶于2mL乙醇和1mL H₂O，室温下搅拌14h；离心取固体并洗涤干燥，得到FeOOH@PDA。

(4)Fe₃O₄@C-NTs的制备

在氮气气氛下，将FeOOH@PDA在管式炉中于500℃碳化5h，得到Fe₃O₄@C-NTs。

所得产物的SEM电镜图如图1所示，长度1～5μm；管径160～450nm，平均约230nm；内径50～200nm，平均约100nm；其中四氧化三铁纳米管的厚度约50～75nm，碳纳米管的厚度约5nm。

实施例2四氧化三铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)的类氧化物酶活性

取290μL0.2M pH＝4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μL Fe₃O₄@C-NTs(1mg/mL)、4μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，10mM)，将上述溶液混合均匀；另外设空白对照试验，即用缓冲液代替Fe₃O₄@C-NTs进行同样的反应，检测两组反应产物在400～800nm波长下的吸光度，结果如图2。图2显示，加入了Fe₃O₄@C-NTs的反应物在652nm处有吸收峰，说明TMB被氧化，Fe₃O₄@C-NTs有类氧化物酶活性。

实施例3四氧化三铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)催化过氧化氢氧化其底物反应的条件优化实验

一、反应温度对Fe₃O₄@C-NTs溶液比色检测过氧化氢的影响

(1)取290μL0.2M pH 4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μL Fe₃O₄@C-NTs(1mg/mL)、3μL过氧化氢水溶液(0.1M)、3μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，20mM)，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤(1)中所得的混合液在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。

实验结果如图3所示。从图3中可以看出652nm处的吸光度随着温度的升高先升高后降低，为了使Fe₃O₄@C-NTs在最佳的条件下工作，故选了最大吸光度所对应的温度60℃为反应的最佳温度。

二、反应pH对多功能铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)溶液比色检测过氧化氢的影响

(1)取290μL0.2M pH＝2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入3μLFe₃O₄@C-NTs(1mg/mL)、3μL过氧化氢水溶液(0.1M)、3μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，20mM)，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

实验结果如图4所示，从图中可以看出652nm处的吸光度随着pH的升高先升高后降低，为了使Fe₃O₄@C-NTs在最佳的条件下工作，故选择了最大吸光度所对应的pH＝4.00为反应的最佳pH。

三、多功能铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)用量对比色检测过氧化氢的影响(1)取290μL 0.2M pH＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μL不同浓度的Fe₃O₄@C-NTs(最终浓度0、5、10、15、20、50、100μg/mL)、3μL过氧化氢水溶液(0.1M)、1.5μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，20mM)，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

实验结果如图5所示，从图中明显可以看出Fe₃O₄@C-NTs的加入量与652nm波长处的吸光度成线性关系，根据经验，选取四氧化三铁/碳纳米管复合材料模拟酶溶液的浓度为20μg/mL为最佳浓度。

四、TMB溶液浓度对多功能铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)比色检测过氧化氢的影响

(1)取290μL 0.2M pH＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μLFe₃O₄@C-NTs(1mg/mL)、3μL过氧化氢水溶液(0.01M)、1μL不同浓度的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，将上述溶液混合均匀；反应体系中，TMB的浓度分别为0、1、25、50、100、200、300μmol/L，过氧化氢100μmol/L，Fe₃O₄@C-NTs 20μg/mL。

(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

实验结果如图6所示，从图上可以看出，TMB的加入量与652nm波长处的吸光度成线性关系，根据经验，选取TMB的浓度为50μM为最佳浓度。

实施例4四氧化三铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)溶液比色测定过氧化氢

根据实施例3中所探索的最佳实验条件，利用Fe₃O₄@C-NTs比色测定过氧化氢，步骤如下：

(1)取290μL 0.2M pH＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于离心管中，依次向离心管中加入6μL Fe₃O₄@C-NTs(1mg/mL)、2.5μL不同浓度的过氧化氢水溶液(终浓度0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000μM)、1.5μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，10mM)溶液，将上述溶液混合均匀；

(2)将步骤1中所得的混合液在60℃水浴锅中反应10min；

(3)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

利用本发明所使用的Fe₃O₄@C-NTs对过氧化氢的检测结果如图7所示。从图中可以看出，利用Fe₃O₄@C-NTs对过氧化氢检测的线性范围为1×10^-6～2×10^-3mol/L。

实施例5四氧化三铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)比色检测葡萄糖

根据实施例2中所探索的最佳实验条件，利用Fe₃O₄@C-NTs比色测定葡萄糖。反应机理如图11所示，葡萄糖氧化酶(GOx)将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并且生成过氧化氢；加入的Fe₃O₄@C-NTs催化过氧化氢分解，并将TMB氧化为蓝色的氧化物oxTMB；再通过比色法检测过氧化氢及葡萄糖含量。步骤如下：

(1)取80μL pH＝7.0的1×PBS(磷酸缓冲溶液)于离心管中，依次加入10μL待测的不同浓度的葡萄糖(该混合体系中的浓度分别为0、50、100、200、300、400、1000、1400、1800、2000μmol/L)和10μL 10mg/mL葡萄糖氧化酶(GOx)，然后将上述溶液混合均匀，将混合液放置于37℃水浴锅中反应30min；

(2)在上述步骤(1)所得的溶液中加入385μL 0.2M pH＝4.00的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，然后依次加入2μL Fe₃O₄@C-NTs(5mg/mL，终浓度20μg/mL)、12.5μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(TMB，5mmol/L)，用缓冲液补足体积至500μL，将上述溶液混合均匀；

(3)将步骤2中所得到的混合液于60℃水浴锅中反应10min；

(4)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

(5)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。

利用本发明所使用的Fe₃O₄@C-NTs对葡萄糖的检测结果如图8所示。从图中可以看出，利用Fe₃O₄@C-NTs对葡萄糖的检测限为1.00×10^-6mol/L，检测的线性范围为5×10^-6～2×10^-3mol/L。

实施例6四氧化三铁铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)检测的选择性

(1)取80μL pH＝7.0 1×PBS(磷酸缓冲溶液)于离心管中，分别加入10μL待测的不同浓度(1mM、20mM)和10μL 10mg/mL葡萄糖氧化酶，然后将上述溶液混合均匀，将混合液放置于37℃水浴锅中反应30min；选择比色检测葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、空白

(2)在上述步骤(1)所得的溶液中加入385μL 0.2M pH＝4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，然后依次加入2μL Fe₃O₄@C-NTs(5mg/mL，终浓度20μg/mL)、12.5μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，0.5mM)将上述溶液混合均匀；

(3)将步骤2中所得到的混合液于60℃水浴锅中反应10min；

(4)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

(5)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱，。

利用本发明所使用的Fe₃O₄@C-NTs结合葡萄糖氧化酶对葡萄糖的选择检测结果如图9柱形图所示。从左到右，依次是1mM葡萄糖、20mM果糖、20mM乳糖、20mM麦芽糖、空白，从柱状图中可以看出，葡萄糖的柱状高度比其它对照物的要高出许多，证明本发明所使用的方法对葡萄糖的检测的选择性高、特异性好，即使其中果糖、乳糖等干扰性物质浓度为葡萄糖浓度20倍时，依然能够高效地检测出葡萄糖。

实施例7四氧化三铁基复合纳米管模拟酶(Fe₃O₄@C-NTs)比色检测血糖

根据实施例2中所探索的最佳实验条件，利用Fe₃O₄@C-NTs比色测定葡萄糖，步骤如下：

(1)向血清样品中加入不同浓度的葡萄糖标准溶液；

(2)将70μLpH＝7.0 1×PBS(磷酸缓冲溶液)于离心管中，依次加入20μL前处理过的加标血清样品(稀释125倍)、10μL 10mg/mL葡萄糖氧化酶，于37℃水浴锅中反应30min；

(3)将385μL 0.2M pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，2μL Fe₃O₄@C-NTs(5mg/mL，终浓度20μg/mL)、12.5μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，0.5mM)加入到上述反应液中，将上述溶液混合均匀；

(4)将上述混合溶液于60℃水浴中反应10min；

(5)通过外加磁场将Fe₃O₄@C-NTs与反应液分离；

(6)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。最后，根据葡萄糖比色检测的标准曲线计算血糖的含量，结果如表1。

表1比色检测血糖的结果

上述对实施实例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施实例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施实例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.四氧化三铁基复合碳纳米管在制备类氧化物酶的模拟酶或催化剂、或者具有类过氧化物酶和类氧化物酶双重活性的模拟酶或催化剂方面的应用，其特征在于，所述的四氧化三铁基复合碳纳米管结构包括中空的四氧化三铁纳米管以及其表面附着的碳纳米管；四氧化三铁基复合碳纳米管的外径160～450nm，四氧化三铁纳米管厚度45～75nm，碳纳米管厚度3～6nm，长度1～10μm。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述四氧化三铁基复合碳纳米管的制备方法步骤包括：

（1）制备负载FeOOH的金属氧化物纳米棒：金属氧化物纳米棒的醇水混悬液与铁盐溶液混合，在60～90℃下反应2～8h，取沉淀干燥，得到负载FeOOH的金属氧化物纳米棒；

（2）制备负载有机物的FeOOH纳米管：

方法a. 负载FeOOH的金属纳米棒分散于含碱的水溶液或者醇水混合液中，加入含碳有机物前体搅拌反应，去除金属氧化物纳米棒，并且使含碳有机物前体沉积在FeOOH管的表面，得到负载有机物的FeOOH纳米管；或者，

方法b. 负载FeOOH的金属纳米棒分散于含碱的水溶液或者醇水混合液中，在碱性条件下加入含碳有机物前体搅拌反应，使含碳有机物前体沉积在FeOOH表面，洗涤干燥再用酸去除金属氧化物纳米棒，得到负载有机物的FeOOH纳米管；

（3）在氮气气氛或惰性气体气氛下碳化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的金属氧化物纳米棒为MoO₃纳米棒、MnO₂纳米棒、Al₂O₃纳米棒、ZnO纳米棒、CuO纳米棒、TiO₂纳米棒或SnO₂纳米棒，其直径为50～300nm，长度1～10μm；步骤（2）中，含碳有机物前体中碳元素与金属氧化物纳米棒@FeOOH质量比为0.2～0.5：1。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的铁盐为铁铵盐，金属氧化物纳米棒为MoO₃纳米棒；铁元素与钼元素摩尔比为1～4：1；步骤（2）中，含碳有机物前体中碳元素与负载FeOOH的金属氧化物纳米棒质量比为0.2～0.5：1。