CN108376608B - 一种磁性纳米粒子及其制备磁性固相载体的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于固相多肽合成技术领域，具体涉及一种用于固相多肽合成的磁性纳米粒子，并进一步公开其合成方法，及其在制备固相多肽合成中磁性固相载体的应用。本发明所述磁性纳米粒子以超顺磁四氧化三铁颗粒(Fe3O4)为磁性核，通过油酸改性并在其表面包覆聚苯乙烯(PS)，以形成核壳型PS@Fe3O4结构的磁性纳米粒子，并且在苯乙烯包覆Fe3O4的同时引入4‑(4‑乙烯基苄氧基苄醇)，从而得到了一种表面聚合物改性的纳米磁性球。得到的磁性纳米粒子具有合适的尺寸，并具有可以进一步功能化的表面化学适应性，以及在介质中有很好的分散性和相容性，可作为多肽固相合成中的磁性固相载体之用。

Description

一种磁性纳米粒子及其制备磁性固相载体的用途
技术领域
本发明属于固相多肽合成技术领域，具体涉及一种用于固相多肽合成的磁性纳米粒子，并进一步公开其合成方法，及其用于制备固相多肽合成中磁性固相载体的用途。
背景技术
多肽作为一种有机聚合物，因其具有多种功能性和良好的生物相容性而受到越来越多的关注，使得多肽的化学合成方法也成为了有机合成领域的一大重要区域。目前，多肽合成的原理主要是以氨基酸为基本单元，并在催化剂的作用下，通过氨基酸之间羧基与氨基的反应形成酰胺键将进行连接，并以此实现多肽链的增长。但是，在传统的多肽有机合成方法中，相连接的氨基酸之间的羧基与氨基的连接通常仅仅依靠氨基酸之间的自由结合，以此得到的多肽通常都是氨基酸无规则连接的多肽结构。可见，现有多肽合成方法难以得到特定序列或特定长度氨基酸序列的多肽，得到的多肽产物也难以应用。
1963年，Merrifield创立了以Boc为氨基酸保护基的固相多肽合成法(SolidPhase Peptide Synthesis,SPPS)，自此以保护氨基酸为原料的固相合成法以其特有的优势引起了人们的关注。并在此后的几十年间，多肽固相合成技术经过不断完善，从小规模、短肽链合成逐步发展到大规模、长肽链的合成。该方法首先需要选择合适的固相载体，通过在载体表面偶联Linker来实现多肽的生长和切割，进而将一端基团保护的氨基酸逐个接枝，形成多肽链。在固相法合成中，当反应在固相载体上进行时，避免了液相法合成所必需的繁琐耗时的中间体分离纯化步骤，其操作步骤简单可控，反应时间迅速，在多肽的合成中占有越来越重要的地位。
固相多肽合成技术是现代蛋白质化学研究的一项关键技术，也是获取生物活性多肽的一种重要方法，除Merrifield开发的Boc化学外，还包括Fmoc化学。相对于Boc化学，Fmoc化学除了满足快速自动化制备的要求外，更加方便快捷，在生化、免疫、分子微生物学及药学等需求多肽较多的领域应用广泛。现有技术中，用于多肽合成的固相载体一般都是微米级聚合物，其在合成过程中需要多次过滤离心等复杂步骤，且合成出的多肽无法直接用到生物体内，需切割后方可进行下一步应用，严重影响了固相多肽合成技术的发展。
超顺磁性(Superparamagnetism)是指颗粒小于临界尺寸时具有单畴结构的铁磁物质，在温度低于居里温度且高于转变温度(Block Temperature)时表现为顺磁性特点，但在外磁场作用下其顺磁性磁化率远高于一般顺磁材料的磁化率，称为超顺磁性。超顺磁性纳米粒子在靶向药物载体、细胞分离、核磁共振、免疫检测和生物分子纯化等生物医学领域具有广阔的应用前景，并且在多肽固相合成技术中，常作为固相载体予以使用。然而，现有磁性纳米粒子由于尺寸效应及磁偶极子引力等作用，使得磁性粒子易于团聚，且化学稳定性不高，并易受到氧化，导致其表面羟基不足，以至于难以直接应用，严重影响了合成的多肽的性能。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子具有合适的尺寸，并具有可以进一步功能化的表面化学适应性，以及在介质中有很好的分散性和相容性，能够用于制备固相多肽合成中的磁性固相载体。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种磁性纳米粒子的合成方法，包括如下步骤：
(1)将超顺磁Fe3O4粒子进行油酸改性，获得油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子；
(2)取所述油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子分散于有机溶剂中形成磁流体，并向上述磁流体中加入苯乙烯、4-(4-乙烯基苄氧基苄醇)和二乙烯苯，形成磁流体油相；
(3)将上述得到的磁流体油相滴加到十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中分散均匀，制得悬浮液；
(4)向上述得到的悬浮液中加入过硫酸钾引发剂，在氮气气氛下，于60-80℃进行反应；反应结束后，将溶液进行磁性分离，弃去溶液并收集沉淀物，即得所需的磁性纳米粒子。
所述步骤(1)中，所述超顺磁Fe3O4粒子进行油酸改性的步骤具体包括：取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶于去离子水中，在氮气气氛下，于70-80℃条件下加入氨水进行反应；反应结束后，向上述混合物中加入油酸，于70-80℃下进行改性反应；将反应所得磁性纳米颗粒洗涤至中性，真空干燥后得到所需的油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子。
所述步骤(2)中，所述有机溶剂为正己烷。
所述步骤(2)中，所述苯乙烯、4-(4-乙烯基苄氧基苄醇)和二乙烯苯的用量摩尔比为3-5：0.4-0.6：0.4-0.6，并优选4：0.5：0.5。
所述步骤(3)中，所述十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液的质量浓度为0.5-2g/L。
本发明还公开了由所述方法合成的磁性纳米粒子。
本发明还公开了所述的磁性纳米粒子用于制备固相多肽合成中磁性固相载体的用途。
本发明还公开了一种固相多肽合成方法，包括如下步骤：
S1、按照所述方法合成所述磁性纳米粒子，并作为磁性固相载体；
S2、通过HOBt/DIC/DMAP活泼酯偶联体系在所述磁性固相载体的表面连接第一个Fmoc-氨基酸；
S3、利用HOBt/HBTU/DIEA偶联体系将Fmoc保护的氨基酸单体逐个接到所得固相载体上，进行特定序列多肽的合成；
S4、向上述连接好特定多肽的体系中加入K试剂，将合成的多肽侧链脱保护且从磁性球固相上切下；
S5、将上述切下的多肽旋蒸并用冰***进行沉降，收集沉降物，即得所需的多肽。
所述步骤S2中，所述磁性固相载体、Fmoc-氨基酸、HOBt、DIC、DMAP的用量比为1：3：6：4：0.1；
所述步骤S3中，所述磁性固相载体、Fmoc-氨基酸、HBTU、HOBt、DIEA的用量比为1：3：3：3：6。
本发明还公开了由所述的方法合成的多肽或多肽库。
本发明所述磁性纳米粒子以超顺磁四氧化三铁颗粒(Fe3O4)为磁性核，通过油酸改性并在其表面包覆聚苯乙烯(PS)，以形成核壳型PS@Fe3O4结构的磁性纳米粒子，并且在苯乙烯包覆Fe3O4的同时引入4-(4-乙烯基苄氧基苄醇)，从而得到了一种表面聚合物改性的纳米磁性球。表征结果证明，本发明制备的超顺磁性Fe3O4粒子具有适宜的尺寸及良好的单分散性。采用微乳液法对Fe3O4表面包覆PS壳的同时对磁性球进行了表面功能改性，得到的磁性纳米粒子具有合适的尺寸，并具有可以进一步功能化的表面基团，且及在介质中有很好的分散性和相容性。
本发明所述磁性纳米粒子可以均匀地分散在多肽合成试剂中，并在外加磁场的作用下可迅速实现分离，为多肽合成提供很大的便利，并且能够简便、精确地合成特定序列的多肽，可用于多肽固相合成的固相载体。同时，经本发明方法合成的磁性纳米颗粒可直接用到生物体内，合成的多肽经切割试剂切割后可以满足用于在体内多肽的靶向应用，也可用于建立合成大规模的多肽库，以迅速筛选出功能多肽，并进行多肽的靶向筛选和生物功能认证。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中制得油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子的透射电镜图(TEM)；
图2为实施例1中制得表面聚合物改性的磁性纳米粒子的透射电镜图(TEM)；
图3为本发明实施例4中合成的六肽的ESI-MS图。
具体实施方式
下述实施例中透射电镜照片由JEOL JEM-1200型透射电镜测得；傅立叶变换红外光谱分析图片由Nicolet 6700型红外光谱仪测得。
实施例1
本实施例所述磁性纳米粒子的合成方法，包括下述步骤：
(1)将12g FeCl3·6H2O和4.9g FeCl2·4H2O溶于50mL去离子水中，然后于80℃、在N2气氛中，在剧烈搅拌下将50ml氨水迅速加入到上述溶液中，混匀；
搅拌30分钟后向上述混合物中加入2g油酸，将悬浮液在80℃下保持反应1小时，反应结束后将磁性纳米颗粒用去离子水洗涤至中性，真空干燥后得到油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子；
采用透射电子显微镜对得到的油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子进行微观形貌分析，结果如图1所示，从图中可以看出，油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子单分散性好，粒径均一，粒径约为10nm；
(2)将得到的油酸改性超顺磁Fe3O4粒子分散到正己烷中形成磁流体(控制所述磁流体与溶剂的固液比为0.125g/mL)，在通常超声条件下向上述磁流体中加入苯乙烯、4-(4-乙烯基苄氧基苄醇)和二乙烯苯(DVB)(摩尔比为4：0.5：0.5)形成磁流体油相，以所述磁流体的量计，每毫升磁流体加400μL苯乙烯；
(3)将上述磁流体油相滴加到1g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中，在冰水浴条件下于细胞粉碎机中超声10分钟，得到悬浮液；
(4)将上述粉碎好的悬浮液加入过硫酸钾(KPS)引发剂(以每毫升磁流体加入0.6gKPS)，于70℃、氮气气氛剧烈机械搅拌下反应3小时；反应结束后，将所得溶液放置于磁铁上，放置一定时间后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到表面包覆聚苯乙烯(PS)形成核壳型PS@Fe3O4结构的磁性纳米粒子，即可作为固相多肽合成中的磁性固相载体之用。
采用透射电子显微镜对本实施例中得到的表面聚合物改性的磁性纳米粒子进行了微观形貌分析，结果如图2所示，从图中可以看出，所得的磁性纳米粒子经表面聚合物改性后，单分散性好，壳层明显，粒径均一，粒径约为100nm。
实施例2
本实施例所述磁性纳米粒子的合成方法，包括下述步骤：
(1)将12g FeCl3·6H2O和4.9g FeCl2·4H2O溶于50mL去离子水中，然后于70℃、在N2气氛中，在剧烈搅拌下将50mL氨水迅速加入到上述溶液中，混匀；
搅拌20分钟后向上述混合物中加入2g油酸，将悬浮液在70℃下保持反应2小时，反应结束后将磁性纳米颗粒用去离子水洗涤至中性，真空干燥后得到油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子；
(2)将得到的油酸改性超顺磁Fe3O4粒子分散到正己烷中形成磁流体(控制所述磁流体与溶剂的固液比为0.125g/mL)，在常规超声条件下向上述磁流体中加入苯乙烯、4-(4-乙烯基苄氧基苄醇)和二乙烯苯(DVB)(摩尔比为3：0.4：0.4)，形成磁流体油相，以所述磁流体的量计，每毫升磁流体加400μL苯乙烯；
(3)将上述磁流体油相滴加到2g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中，在冰水浴条件下于细胞粉碎机中超声20分钟，得到悬浮液；
(4)将上述粉碎好的悬浮液加入过硫酸钾(KPS)引发剂(以每毫升磁流体加入0.6gKPS)，于80℃、氮气气氛剧烈机械搅拌下反应2小时；反应结束后，将所得溶液放置于磁铁上，放置一定时间后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到表面包覆聚苯乙烯(PS)形成核壳型PS@Fe3O4结构的磁性纳米粒子，即可作为固相多肽合成中的磁性固相载体之用。
实施例3
本实施例所述磁性纳米粒子的合成方法，包括下述步骤：
(1)将12g FeCl3·6H2O和4.9g FeCl2·4H2O溶于50mL去离子水中，然后于80℃、在N2气氛中，在剧烈搅拌下将50mL氨水迅速加入到上述溶液中，混匀；
搅拌30分钟后向上述混合物中加入2g油酸，将悬浮液在80℃下保持反应2小时，反应结束后将磁性纳米颗粒用去离子水洗涤至中性，真空干燥后得到油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子；
(2)将得到的油酸改性超顺磁Fe3O4粒子分散到正己烷中形成磁流体(控制所述磁流体与溶剂的固液比为0.125g/mL)，在常规超声条件下向上述磁流体中加入苯乙烯、4-(4-乙烯基苄氧基苄醇)和二乙烯苯(DVB)(三者摩尔比为5：0.6：0.6)，形成磁流体油相，以每毫升磁流体加400μL苯乙烯；
(3)将上述磁流体油相滴加到0.5g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中，在冰水浴条件下于细胞粉碎机中超声20分钟，得到悬浮液；
(4)将上述粉碎好的悬浮液加入过硫酸钾(KPS)引发剂(以每毫升磁流体加入0.6gKPS)，于60℃、氮气气氛剧烈机械搅拌下反应2小时；反应结束后，将所得溶液放置于磁铁上，放置一定时间后弃去溶液，收集沉淀用水洗三遍，得到表面包覆聚苯乙烯(PS)形成核壳型PS@Fe3O4结构的磁性纳米粒子，即可作为固相多肽合成中的磁性固相载体之用。
实施例4
本实施例中以上述实施例1中合成的纳米磁性粒子作为磁性固相载体，进行6肽(VMIMIV)的固相合成，具体包括下述步骤：
S1、按照实施例1中方法制得所述磁性纳米粒子，并作为磁性固相载体；同时进行反应器的处理：将反应容器用铬酸洗液浸泡过夜，蒸馏水洗净干燥后用10％二氯二甲基硅烷-甲苯溶液浸泡20min，确认仪器内表面全部与试剂接触且无气泡附着；然后用无水甲醇浸泡20min后干燥备用；
S2、将所得磁性纳米粒子用NN,-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡洗涤后，向得到的磁性固相载体中加入Fmoc保护的氨基酸活泼酯偶联液，所述的活泼酯溶液是将Fmoc保护的氨基酸单体溶于HOBt/DIC/DMAP/DMF的溶液中活化15分钟得到，其用量的摩尔比为：磁性固相载体：Fmoc-Val：HOBt：DIC：DMAP＝1：3：6：4：0.1，将反应置于摇床25℃反应3小时；
反应结束后，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF将磁性固相载体洗涤4遍得到连接一个Fmoc-Val的固相载体；
向上述固相中加入20wt％二乙胺/DMF溶液，反应20分钟脱去氨基酸上的Fmoc保护，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF将固相洗涤4遍，得到连接一个氨基酸的固相载体；
S3、向上述连接了第一个氨基酸(Val)的固相中加入Fmoc保护的氨基酸单体(Met)的活泼酯溶液，所述的活泼酯溶液是含有Fmoc保护的氨基酸/HBTU/HOBt/DIEA的DMF溶液，其用量的摩尔比为：固相载体：Fmoc-Met：HBTU：HOBt：DIEA＝1：3：3：3：6，将反应置于摇床25℃反应3小时；
反应结束后，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF洗涤4遍；
向上述固相中加入20wt％二乙胺/DMF溶液，反应20分钟脱去氨基酸上的Fmoc保护，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF将固相洗涤4遍；
S4、向上述得到的固相载体中继续按上述方法加入下一个保护的氨基酸单体的活泼酯溶液，直至合成目标肽；
向合成的连接好特定多肽的体系中加入K试剂(10-20mL)，将合成的多肽侧链脱保护且从磁性球固相上切下；所述K试剂由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚和水按82.5：5：2.5：5：5的质量比例配制而成；
S5、将上述切下的多肽旋蒸并用冰***进行沉降，收集沉降物，即得所需的六肽(VMIMIV)。
将上述得到的六肽(VMIMIV)用ESI验证合成多肽的化学结构，检测结果如图3所示，可见，本发明方法能够合成特定序列的多肽结构，产物结构正确。
实施例5
本实施例中以上述实施例2中合成的纳米磁性粒子作为磁性固相载体，进行6肽(VMIMIV)的固相合成，具体包括下述步骤：
S1、按照实施例2中方法制得所述磁性纳米粒子，并作为磁性固相载体；同时进行反应器的处理：将反应容器用铬酸洗液浸泡过夜，蒸馏水洗净干燥后用10％二氯二甲基硅烷-甲苯溶液浸泡25min，确认仪器内表面全部与试剂接触且无气泡附着；然后用无水甲醇浸泡25min后干燥备用；
S2、将所得磁性纳米粒子用NN,-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡洗涤后，向得到的磁性固相载体中加入Fmoc保护的氨基酸活泼酯偶联液，所述的活泼酯溶液是将Fmoc保护的氨基酸单体溶于HOBt/DIC/DMAP/DMF的溶液中活化20分钟得到，其用量的摩尔比为：磁性固相载体：Fmoc-Val：HOBt：DIC：DMAP＝1：3：6：4：0.1，将反应置于摇床25℃反应4小时；
反应结束后，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF将固相载体洗涤6遍得到连接一个Fmoc-Val氨基酸的固相载体；
向上述固相中加入20wt％二乙胺/DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸上的Fmoc保护，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF将固相洗涤6遍，得到连接一个氨基酸的固相载体；
S3、向上述连接了第一个氨基酸(Val)的固相中加入Fmoc保护的氨基酸单体(Met)的活泼酯溶液，所述的活泼酯溶液是含有Fmoc保护的氨基酸/HBTU/HOBt/DIEA的DMF溶液，其用量的摩尔比为：固相载体：Fmoc-Met：HBTU：HOBt：DIEA＝1：3：3：3：6，将反应置于摇床25℃反应4小时；
反应结束后，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF洗涤4遍；
向上述固相中加入20wt％二乙胺/DMF溶液，反应30分钟脱去氨基酸上的Fmoc保护，将反应置于磁铁上收集磁颗粒并弃去溶液，用DMF将固相洗涤6遍；
S4、向上述得到的固相载体中继续按上述方法加入下一个保护的氨基酸单体的活泼酯溶液，直至合成目标肽；
向合成的连接好特定多肽的体系中加入K试剂(三氟乙酸：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯酚：水＝82.5：5：2.5：5：5)，将合成的多肽侧链脱保护且从磁性球固相上切下；
S5、将上述步骤中从纳米颗粒固相上切下的多肽以***沉降，收集产品即得所需的六肽(VMIMIV)。经检测，所得多肽产物结构正确。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种磁性纳米粒子的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将超顺磁Fe3O4粒子进行油酸改性，获得油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子；
所述超顺磁Fe3O4粒子进行油酸改性的步骤具体包括：取FeCl3•6H2O和FeCl2•4H2O溶于去离子水中，在氮气气氛下，于70-80℃条件下加入氨水进行反应；反应结束后，向上述混合物中加入油酸，于70-80℃下进行改性反应；将反应所得磁性纳米颗粒洗涤至中性，真空干燥后得到所需的油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子；
（2）取所述油酸改性的超顺磁Fe3O4粒子分散于有机溶剂中形成磁流体，并向磁流体中加入苯乙烯、4-（4-乙烯基苄氧基苄醇）和二乙烯苯，形成磁流体油相；
所述苯乙烯、4-（4-乙烯基苄氧基苄醇）和二乙烯苯的用量摩尔比为3-5：0.4-0.6：0.4-0.6；
（3）将得到的磁流体油相滴加到十二烷基硫酸钠水溶液中分散均匀，制得悬浮液；所述十二烷基硫酸钠水溶液的质量浓度为0.5-2 g/L；
（4）向得到的悬浮液中加入过硫酸钾引发剂，在氮气气氛下，于60-80℃进行反应；反应结束后，将溶液进行磁性分离，弃去溶液并收集沉淀物，即得所需的磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的合成方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述有机溶剂为正己烷。
3.由权利要求1或2所述方法合成的磁性纳米粒子。
4.权利要求3所述的磁性纳米粒子用于制备固相多肽合成中磁性固相载体的用途。
5.一种固相多肽合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、按照权利要求1或2所述方法合成所述磁性纳米粒子，并作为磁性固相载体；
S2、通过HOBt/DIC/DMAP活泼酯偶联体系在所述磁性固相载体的表面连接第一个Fmoc-氨基酸；
S3、利用HOBt/HBTU/DIEA偶联体系将Fmoc保护的氨基酸单体逐个接到所得固相载体上，进行特定序列多肽的合成；
S4、向连接好特定多肽的体系中加入K试剂，将合成的多肽侧链脱保护且从磁性球固相上切下；
S5、将切下的多肽旋蒸并用冰***进行沉降，收集沉降物，即得所需的多肽。
6.根据权利要求5所述的固相多肽合成方法，其特征在于：
所述步骤S2中，所述磁性固相载体、Fmoc-氨基酸、HOBt、DIC、DMAP的用量摩尔比为1：3：6：4：0.1；
所述步骤S3中，所述磁性固相载体、Fmoc-氨基酸、HBTU、HOBt、DIEA的用量摩尔比为1：3：3：3：6。
7.由权利要求5或6所述的方法合成的多肽或多肽库。
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