CN1052511C - 酶法生产没食子酸的工艺 - Google Patents

Abstract

酶法生产没食子酸的工艺，涉及用酶的方法制取芳环化合物衍生物的技术，目的是提供一种提高产品收率、降低原料单耗、合理利用资源的工艺。本发明的工艺将发酵制酶与水解制酸分别在不同容器中相对分开进行，同时分别控制两步反应的最适温度、pH值、溶氧量等条件及反应时间，让两步反应均达到最佳状态，使单宁全部水解。用本发明的工艺生产没食子酸，产品得率高，原料消耗少，可改善生产环境，简化流程，对原料的适应性广，可大幅度地提高经济效益。

Description

酶法生产没食子酸的工艺

本发明涉及使用酶的方法来制取芳环化合物衍生物的技术，具体而言，涉及酶法生产没食子酸的工艺。

没食子酸又名倍酸、五倍子酸(gallic acid)，化学名称为3，4，5-三羟基苯甲酸(3，4，5-trihydroxy benzoic acid)，分子式为(OH)₃C₆H₂COOH·H₂O，结构式为：

分子量188.14，白色针状结晶，是一种用途广泛的精细化工产品。工业上常用五倍子(chinese nut galls)或塔拉(tara，刺云实)为原料，通过化学水解法或微生物发酵法制取没食子酸。其中，化学水解法是以强酸或强碱为催化剂，使五倍子单宁水解生成没食子酸。然后，经过过滤、浓缩、脱色、干燥等一系列化工过程制得产品。

使用硫酸水解法，由于浓硫酸具有强氧化性，在反应过程中会破坏单宁中的一部份苯环结构，而且有副反应；因此，水解转化率仅85％，总收率为69％，原料未充分利用，产品经济效益不高。

用碱水解法(CN1057255A)产品收率比酸水解法高，但须使用大量的碱作为催化剂，而后又用硫酸中和反应产物。用五倍子作原料的碱法工艺(U.S.Patent 2723992.1955)，需使用大量有机溶剂进行萃取分离，再经过溶剂回收、脱色、干燥等过程得到产品。溶剂萃取法设备投资大，有机溶剂成本高，溶剂萃取及回收技术复杂，在国内不宜采用。

微生物发酵法(CN87103987)的原理是利用微生物在含单宁的水溶液中进行发酵，以单宁酸水解后的葡萄糖作为碳源，供微生物生长、繁殖，与此同时微生物在溶液中经诱导产生酶，单宁又经酶的催化水解作用生成没食子酸。这种方法的生产周期长，水解不完全，发酵结束后还有15％～20％单宁未水解转化。

本发明的目的是提供一种克服上述缺点的没食子酸生产工艺，用以提高产品收率，降低原料单耗，简化工艺流程，经济、合理地利用植物单宁资源。

长期的科研与生产实践早已证明：很多种霉菌在一定条件下与诱导物作用都能生成单宁酶(tannase)，其中，以黑曲霉菌使用得最多、最成熟，已经有一百多年的应用历史。单宁酶又称单宁乙酰基水解酶(tannin acyl enzyme)，属于孢外诱导酶(induced enzyme)，是一种具有水解催化性能的生物催化剂。在适宜条件下，它能专一、高效、定向裂解单宁中的酯键、糖苷键和缩酚键水解生成没食子酸。

人们经过多年的生产实践和研究(Agr.Biol.Chem.，Vol.32.No.7，P.803～809，1968)，发现生成单宁酶的最佳条件与酶水解单宁的最佳条件，包括温度、pH值、溶氧量、诱导物浓度、培养基成分等，大部份不相同。在一般发酵法生产工艺中，单宁酶的生成和水解单宁的反应，都是在同一个反应器(发酵罐)中进行。由于两个反应要求的最佳条件不同，在发酵过程中，总是顾此失彼、相互制约，两者都不能达到最佳反应状态。这就是导致单宁水解不完全的主要原因。

为解决发酵法工艺中的这一难题，发明人提出的解决方案是：将发酵制酶与水解制酸两个反应分别用两个容器相对地分开进行，使二者都达到最佳状态。这样，单宁水解转化率可达98％以上，已经接近或达到定量转化。必须说明，制酶和制酸二者既有区别，又有联系，相辅相成，各有所侧重，并不是绝对的划分。在制酶过程中，以生成大量含酶菌丝球为主，与此同时也培养出大量健壮黑曲霉孢子；在制酸过程中以水解单宁为主，同时又继续进行发酵，产生一部份酶，促使单宁完全水解，因此也同样需要供给足够的溶解氧。

在发酵制酶过程中，各项发酵参数及培养基的配比十分重要，必须严格控制。适宜温度为27～33℃，最适温度为30℃；起始pH值为5～6.5，反应过程中加碱调节在pH3～5之间，以pH3.5～4.5为最好；溶氧量控制在3.5～5.0gO₂/L·h之间。采用黑曲霉No.316(aspergillus neiger No.316)作为产酶菌种。

制酶培养基中，C/N比为5～15，单宁浓度为1％～8％；单宁以外碳源加入量为单宁量的0.3～1倍。外加碳源包括蔗糖、葡萄糖、蜂糖等均可使用；外加氮源可以用任何无机铵盐或硝酸盐，如硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等均可使用。培养基中还应有少量的硫、磷、钾、钠、锌、镁的无机盐和酵母膏或维B族化合物作为营养添加剂。

用上述发酵条件和培养基配比制成的单宁酶溶液可用于水解制酸，制酸适宜温度为30～37℃，最适温度为34～35℃；在反应过程中加入氨水调节pH在4～7之间，以pH5.5～6.5为最好；溶氧量为3.5～5.0gO₂/L·h。用五倍子为原料，单宁浓度为6％～10％(W/V)；用塔拉粉为原料，加入量为12％～20％(W/V)。

使用本发明的酶法生产没食子酸的工艺有以下优点：(1)反应时间比发酵法短，产品得率高，原料单耗低。用含单宁不等的五倍子和塔拉分别作为原料，产品得率分别为原料的47％～52％和28％～33％，总收率可达到80％～90％。与酸水解法相比，用本发明工艺每年生产1吨产品可节约0.3～0.4吨五倍子或0.6～0.9吨塔拉。(2)改善了生产环境。本发明的工艺反应条件缓和，无高温、高压操作，“三废”污染小，容易治理；酸、碱及活性炭的消耗量比化学水解法明显降低。(3)原料适应性广。既可使用五倍子或塔拉为原料；也可用单宁含量低和果胶质高的五倍子花(又称倍花)作为原料。(4)工艺流程简单。与现有生产方法比较，“水解”前省去浸提工段；“水解”后省去结晶和脱色操作各一次。

附图为本发明的工艺流程示意图。经过菌种种子预培养，然后转入经灭菌后的培养基溶液中发酵制酶，经测定酶活性合格后，即用于水解制酸。水解反应结束后，加硫酸或盐酸调节pH，经过过滤除去滤渣，然后将滤液浓缩，冷却后得到粗结晶。将粗晶分离，重新溶于水，加活性炭脱色，重结晶。然后再次分离，回收母液，最后经干燥和粉碎即可得到没食子酸产品。

以下实施例可以更清楚地说明本发明：

制酶实施例1           按以下成份配比配制培养基：

    单宁              10～100g/L

    蔗糖              14g/L

    NH₄Cl            3g/L

    KH₂PO₄                  1g/L

    MgSO₄·7H₂O           0.5g/L

    ZnSO₄·7H₂O           0.3g/L

    酵母膏                   0.5g/L

将配制好的培养基分装在几个500ml振荡烧瓶中，灭菌。为避免单宁高温水解，单宁在灭菌后加入，用5mol NaOH调节溶液起始pH值为5～6.5，接着立即接入黑曲霉菌No.316菌种，放置在THZ-82A恒温振荡器上反应。设定温度30℃，调节转速为130～140r/min，使反应液中溶解氧保持在3.5～5.0O₂g/L.h用5mol NaOH调节数次，使反应液的pH值保持在3.5～4.5之间，连续反应40小时以上，直至测定酶的活性达到最大值为止，即用于制酸。

制酶实施例2              按以下成份比例配制培养基：

    单宁                 10～100g/L

    葡萄糖               16g/L

    NH₄NO₃             2.2g/L

    KH₂PO₄             1g/L

    MgSO₄·7H₂O        0.5g/L

    ZnSO₄·7H₂O        0.3g/L

    复合维B              10mg

将配制好的培养基分别装入振荡烧瓶中，灭菌后加入单宁。余下步骤按制酶实施例1进行。

制酸实施例1  将五倍子粉装入带有半自动加氨装置和外接酸度计、溶氧仪的特制反应瓶中，加入适量热水溶解，使溶液单宁浓度为8％(W/V)。冷却至室温后加入10％～20％(V/V)新制好的酶溶液。将反应瓶放在THZ-82A恒温振荡器上反应，设定温度34℃，转速调节在140～150r/min，使反应液溶氧量保持在4.5～5.0gO₂/L·h。在反应过程中连续加入10mol氨水，保持溶液pH为5.5。连续反应35小时以上，直至单宁全部水解为止。反应产物用盐酸或硫酸调节至pH值1～2，经过粗结晶、脱色、重结晶后得到产品。原料含单宁64.8％，产品得率为原料的47.7％，纯度98％。

制酸实施例2   将塔拉粉装入反应瓶(与制酸实施例1相同)，加入适量热水溶解，使溶液中原料量为15％(W/V)，冷却后加入20％(V/V)新制好的酶溶液，放到恒温振荡器上反应。设定温度35℃，转速为140～150r/min，溶氧量4.5～5gO₂/L·h。反应过程中连续加氨水使反应液pH值为6.0。反应时间40小时以上，直至单宁水解完全为止。反应产物经过同制酸实施例1的调pH、粗结晶、脱色、重结晶过程得到产品。原料含单宁41.13％，产品得率为原料的27％，纯度为98.5％。

Claims (3)

1 用微生物在培养基中制得单宁酶，使五倍子或塔拉中的单宁水解，再经过滤、浓缩、结晶、脱色、干燥制得没食子酸的工艺，本发明的特征包括：

(1)  所用的菌种为黑曲霉菌№316；

(2)  所用的培养基的C/N比值为5～15；单宁浓度为1％～8％，单宁以外的碳源加入量为单宁量的0.3～1倍；

(3)  发酵制酶与水解制酸两步反应分别用两个容器分开进行。

2 按照权利要求1所述的工艺，其特征在于发酵制酶过程中控制的温度为27～33℃；起始pH值控制为5～6.5，然后加碱调至pH3～5；溶氧量控制在3.5～5.0gO₂/L.h之间。

3 按照权利要求1所述的工艺，其特征在于水解制酸过程中，反应温度控制在30～37℃；pH值用氨水调至4～7，溶氧量在3.5～5.0gO₂/L.h；水解时五倍子单宁浓度为6％～10％(W/V)，塔拉粉用量为12％～20％。

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