CN108342324A - 一种小球藻保存方法 - Google Patents

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辛乃宏
李炳乾
刘颖芬
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Abstract

本发明提供了一种小球藻保存方法，通过在藻液中添加最终量为1‑5g/L和2‑8％的丙酸钙及甘油，使小球藻藻液在0‑8℃下，保存时间45天时无变质，且小球藻活性达90％以上。与现有技术相比，本发明通过对保存方法的改进，为小球藻藻液的储存开发提供了必要条件。

Description

一种小球藻保存方法
技术领域
本发明属于微藻养殖技术领域，具体涉及一种小球藻保存方法，尤适用于异养小球藻的保存。
背景技术
小球藻是一种重要的微藻资源，具有极其丰富的营养成分和优良的医疗保健作用。含有丰富的蛋白质、氨基酸、色素、多不饱和脂肪酸等,营养全面,是水产及畜牧养殖理想的饲料原料。其蛋白质含量50％～67％，其中含有人体所必须的20种氨基酸、多种维生素和微量元素，以及亚麻酸、亚油酸、类胡萝卜素等成分。小球藻中富含CGF(小球藻生长因子)，能迅速恢复养殖动物机体造成的损伤。小球藻中含有的生物活性物质糖蛋白、多糖体以及高达13％的核酸等物质具有显著的抑瘤抗癌、增强免疫及抗病毒感染的活性。
在水产养殖上，单细胞的小球藻可直接作为海水鱼育苗的水质调节以及轮虫、卤虫等海水鱼育苗活饵料的培育饵料，也可以用于海水鱼、海参、对虾等的饵料添加剂，具有很高的经济价值。
除了在水产养殖的应用，小球藻因其含有动物生长所需的蛋白质、碳水化合物、脂质、氨基酸、矿物质、维生素、虾青素、纤维素等四十多种营养物质，现在作为饲料或饲料添加剂被广泛应用于牲畜(如猪、鸡等)的饲养中，在动物饲料中添加小球藻能明显的提高动物的免疫力、成活率和产量，并能促进动物采食、提高生长速度和减少疾病。尤其可替代目前饲养动物所用的抗生素、抗菌素等药品，免除使用激素类物质作为饲料所造成的药物残留。
目前国内对小球藻的培养的主要分为自养和异养，而异养基本是通过发酵来生产小球藻，但相对于自养小球藻，异养培养出的藻液中含有大量碳氮源和微量元素，十分有利于细菌，霉菌等其它微生物的生长。因此异养小球藻藻液的保存问题仍是一个难题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种小球藻保存方法，以解决现有的小球藻藻液难以保存的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种小球藻保存方法，在无菌环境下，向小球藻藻液中加入丙酸钙、甘油，低温保存。
进一步的，丙酸钙的添加量为1-5g/L。
进一步的，甘油的添加量为2-8％wt。
进一步的，低温为0-8℃
进一步的，无菌环境为超净工作台或无菌室。
优选的，少量小球藻藻液操作可在超净工作台中进行，大量的小球藻藻液操作需在至少紫外(强度≥70μW/cm2)杀菌30min的无菌室中进行。
优选的，所述小球藻藻液为异养发酵获得的小球藻藻液。
向小球藻藻液中加入前，丙酸钙及甘油均需121℃灭菌20min以上。
相对于现有技术，本发明所述的小球藻保存方法具有以下优势：
(1)本发明所述的对小球藻藻液的保存方法进行了改进，并且通过添加食用级甘油和丙酸钙，为小球藻发酵液的长时间保存提供了基础条件；
(2)本发明涉及的甘油和丙酸钙均为无害物质，其中丙酸钙还可为人畜提供必需的钙；
(3)使用本发明方法后，小球藻藻液在0-8℃下，保存时间45天时无变质，且小球藻活性达90％以上。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
其中：％wt指质量百分数；
以下实例中所用小球藻为Chlorella sorokiniana NK-01，来自南开大学。小球藻也可为其他现有的小球藻。
下面结合实施例来详细说明本发明。
小球藻藻液的培养方法如下：
(1)实验室摇床培养
摇床转速120r/min、接种量5％、pH 7.0、温度为30℃、时间96h；
(2)发酵罐培养
发酵条件为：通光通气、溶氧30％、pH 7.0、接种量10％、培养温度30℃、搅拌转速60r/min、培养时间96h。
培养基的组份：葡萄糖35g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2-EDTA0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO31g/L、微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液配方为每升含有：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g。
所述培养基配置需将葡萄糖与其他组份分开，115℃灭菌15分钟，冷却后混合使用。
实施例1
称取1g丙酸钙于15mL EP中，加入10mL蒸馏水；吸取10mL甘油于50mL EP管中，加入10mL蒸馏水，混匀。将上述配好的100g/L的丙酸钙母液和50％甘油母液于灭菌锅中121℃灭菌20min，置于超净工作台中备用。
在250mL三角瓶中配置90mL小球藻培养基，接种5mL小球藻藻液，摇床发酵4天，获得小球藻藻液，设置3组实验组和对照组，其中小球藻的密度实验组平均为3.1*107cfu/mL，对照组平均为3.2*107cfu/mL。
在超净工作台中分别将1mL丙酸钙母液和4mL甘油母液加入到已发酵好的实验组小球藻藻液中，使藻液中丙酸钙和甘油的浓度分别为1g/L和2％，对照组加入5mL无菌蒸馏水，封口，置于4℃冰箱中保存。
45天后观察富硒小球藻藻液形态，其中实验组3瓶均无浑浊变质，而对照组1瓶明显浑浊变质，利用平板涂布法计数，实验组小球藻的密度为2.9*107cfu/mL，活性达到93.5％，且无其它杂菌，对照组小球藻的密度平均为2.6*107cfu/mL，活性为81.3％。
实施例2
利用5000L发酵罐中试培养小球藻，装料量为3000L，发酵时间4天。
分别取15Kg的丙酸钙和240L甘油于500L补料罐中，加入60L蒸馏水，121℃灭菌20min，待冷却后导入到5000L发酵罐中，此时小球藻密度为7.4*108cfu/mL。
将准备盛放藻液的桶提前用蒸汽消毒，灌入小球藻藻液，转入8℃冷库中。取6桶10L装小球藻藻液设置实验组和对照组，实验组中丙酸钙和甘油的含量分别为5g/L和8％，每组3个平行，其中对照组为转入丙酸钙和甘油之前取出。45天后观察小球藻藻液形态，其中实验组3桶均无浑浊变质，而对照组2桶明显浑浊变质，利用平板涂布法计数，实验组小球藻的密度为6.8*108cfu/mL，活性达到91.9％，且无其它杂菌，仅剩的对照组小球藻的密度为3.6*108cfu/mL，活性仅为48.6％。
实施例3
称取3g丙酸钙于15mL EP管中，加入10mL蒸馏水；吸取10mL甘油于50mL EP管中，加入10mL蒸馏水，将上述配好的300g/L的丙酸钙母液和50％甘油母液于灭菌锅中121℃灭菌20min，置于超净工作台中备用。
在250mL三角瓶中配置85mL小球藻发酵液，接种4mL小球藻藻液，摇床发酵。4天获得小球藻藻液，设置实验组和对照组，每组3个平行，其中小球藻的密度实验组平均为5.4*107cfu/mL，对照组平均为6.7*107cfu/mL。
在超净工作台中分别将1mL丙酸钙母液和10mL甘油母液加入到已发酵好的实验组小球藻藻液中，使藻液中丙酸钙和甘油的浓度分别为3g/L和5％，对照组加入11mL无菌蒸馏水，封口，置于0℃冰箱中保存。
45天后观察小球藻藻液形态，其中实验组和对照组均无浑浊变质，利用平板涂布法计数，实验组小球藻的密度为5.2*107cfu/mL，活性达到96.3％，对照组小球藻的密度平均为6.4*107cfu/mL，活性为95.5％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种小球藻保存方法，其特征在于：在无菌环境下，向小球藻藻液中加入丙酸钙、甘油，低温保存。
2.根据权利要求1所述的小球藻保存方法，其特征在于：丙酸钙的添加量为1-5g/L。
3.根据权利要求2所述的小球藻保存方法，其特征在于：甘油的添加量为2-8％wt。
4.根据权利要求1-3任一项所述的小球藻保存方法，其特征在于：低温为0-8℃。
5.根据权利要求4所述的小球藻保存方法，其特征在于：无菌环境为超净工作台或无菌室。
6.根据权利要求5所述的小球藻保存方法，其特征在于：少量小球藻藻液操作可在超净工作台中进行，大量的小球藻藻液操作需在至少紫外杀菌30min的无菌室中进行。
7.根据权利要求1-3或5-6任一项所述的小球藻保存方法，其特征在于：所述小球藻藻液为异养发酵获得的小球藻藻液。
8.根据权利要求1-3或5-6任一项所述的的小球藻保存方法，其特征在于：向小球藻藻液中加入前，丙酸钙及甘油均需121℃灭菌20min以上。
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