CN108330124A - 一种提高l-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法 - Google Patents

一种提高l-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高L‑羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法，包括以下步骤：1)、YPS培养基：蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；M培养基：氯化钠5g，混匀定容至0.5L，调pH值7.0～7.1；琼脂培养基中加入不同浓度的乙酸钠；2)、种子培养：取25ul甘油保藏菌种，接入装在15ml试管的5mlYPS培养基中，37℃、200rpm/min水浴摇床培养过夜，转接0.5ml于250ml锥形瓶，33℃，200rpm/min往复式摇床培养4小时；3)、分批培养：采用磁力搅拌的微型玻璃反应器；4)、连续培养：微型玻璃反应器装液250ml，接种量2.5ml，通气1.5vvm，37℃，蠕动泵控制进出微型玻璃反应器的培养基流速，每隔4小时取样测定残糖及pH；5)、诱变；6)、经过筛选得到3株突变株，在含10g/l葡萄糖和10g/l乙酸钠的MA培养基中培养24小时。

Description

一种提高L-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法
技术领域
本发明属于生物化工生产领域，涉及微生物发酵的菌种基因突变及菌种选育方法，具体涉及一种提高L-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法。
背景技术
目前，微生物发酵法生产L-羟脯胺酸还处于初级阶段，尤其是菌种的产酸偏低。现有工艺菌种进行发酵法工业化生产L-羟脯胺酸的产酸偏低(产酸3～3.5％左右)，周期偏长(55～60小时)，从而导致耗能高，收率偏低的缺点。
发明内容
本发明目的是提供一种提高L-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法，大大提高了L-羟脯胺酸的发酵产酸率、提高糖转化率，降低生产成本。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种提高L-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法，包括以下步骤：
1)、YPS培养基：蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；M培养基：氯化钠5g，混匀定容至0.5L，调pH值7.0～7.1；琼脂培养基中加入不同浓度的乙酸钠；
2)、种子培养：取25ul甘油保藏菌种，接入装在15ml试管的5mlYPS培养基中，37℃、200rpm/min水浴摇床培养过夜，转接0.5ml于250ml锥形瓶(装50mlYPS培养基)，33℃，200rpm/min往复式摇床培养4小时；
3)、分批培养：采用磁力搅拌的微型玻璃反应器(500ml)，装液300ml，接种量2.5ml，通气1.5vvm，37℃；
4)、连续培养：微型玻璃反应器装液250ml，接种量2.5ml，通气1.5vvm，37℃，蠕动泵控制进出微型玻璃反应器的培养基流速，每隔4小时取样测定残糖及pH，连续三次基本不变动时，认为达到稳定；
5)、诱变：培养过夜的大肠杆菌菌液5ml，3000rpm/min高速离心10min，加无菌生理盐水，离心洗涤2次，均匀重悬，以不同剂量进行紫外辐射处理；辐射处理后，稀释涂平板进行活菌计数，经过辐射处理的菌液，是变异株和出发株组成的混合体各种微生物竞争利用基质，从而具有生长优势的微生物得以保留，不具优势则被洗掉而淘汰，实现富集的目的；
6)、经过筛选得到3株突变株，在含10g/l葡萄糖和10g/l乙酸钠的MA培养基中培养24小时，细胞量提高了25％，表现出明显的生长优势，通过在不含乙酸钠的YPS斜面上传代和含10g/l乙酸钠的MA培养基中摇瓶培养，能保持其耐乙酸的特性，具有良好的稳定性。
优选的，步骤1)中
YPS培养基：称取蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；
M培养基：称取氯化钠5g，混匀定容至0.5L，调pH值7.0；
琼脂培养基中加入不同浓度的乙酸钠。
本发明的技术效果在于：该方案利用基因突变及菌种选育方法得到的菌种替代了原工艺菌种，而发明技术方案对原有菌种进行了人工因素处理细胞，通过诱变后选用了产量突变型的正变株，使用基因突变及菌种选育方法的菌种进行发酵法工业化生产L-羟脯胺酸的产酸高，周期短，大大节约了能耗，降低了发酵成本。
具体实施方式
突变株的选育，是基于选择性环境下，因不同微生物之间存在生长和代谢的差异，使不具生长优势的细胞被洗掉，具有生长优势的细胞被富集。在乙酸和葡萄糖共存时，大肠杆菌首先利用葡萄糖，但当乙酸含量过高时(20mmol/L左右)，会抑制葡萄糖代谢。本发明利用高浓度乙酸产生的选择压力，富集在此环境中具有生长优势的突变株，耐乙酸菌株，可以在乙酸抑制环境中较快地代谢和生长，细胞对于葡萄糖的得率大大提高。
具体的：
①：称取蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g制备YPS培养基；制备M培养基，氯化钠5g，混匀定容至0.5L，调pH值7.0～7.1；琼脂培养基中加入不同浓度的乙酸钠。取25ul甘油保藏菌种，接入装在15ml试管的5mlYPS培养基中，37℃、200rpm/min水浴摇床培养过夜，转接0.5ml于250ml锥形瓶(装50mlYPS培养基)，在33℃、200rpm/min往复式摇床培养4小时；采用磁力搅拌的微型玻璃反应器(500ml)，装液300ml，接种量2.5ml，通气1.5vvm，37℃。微型玻璃反应器装液250ml，接种量2.5ml，通气1.5vvm，37℃。蠕动泵控制进出微型玻璃反应器的培养基流速，每隔4小时取样测定残糖及pH，连续三次基本不变动时，认为达到稳定。
②：诱变：培养过夜的大肠杆菌菌液5ml，3000rpm/min高速离心10min，加无菌生理盐水，离心洗涤2次，均匀重悬，以不同剂量进行紫外辐射处理。辐射处理后，稀释涂平板进行活菌计数，经过辐射处理的菌液，是变异株和出发株组成的混合体各种微生物竞争利用基质，从而具有生长优势的微生物得以保留，不具优势则被洗掉而淘汰，可实现富集的目的。
③：经过筛选得到3株突变株，在含10g/l葡萄糖和10g/l乙酸钠的MA培养基中培养24小时，细胞量提高了25％，表现出明显的生长优势，通过在不含乙酸钠的YPS斜面上传代和含10g/l乙酸钠的MA培养基中摇瓶培养，能保持其耐乙酸的特性，具有良好的稳定性。
通过选择突变株和出发株在MA平板上的生长情况，突变株表现出乙酸耐受性明显的提高，在含高浓度乙酸的平板上菌落出现时间较出发株提前，同时，在乙酸浓度为1～5g/l时其菌落直径远大于无乙酸平板上的菌落。
上述方案1、YPS培养基：蛋白胨10g/l；酵母抽提物5g/l；
2、M培养基：氯化钠5g/l；
3、MA培养基：麦芽膏20克；琼脂20克；水1000毫升；PH自然。
而在实际制备中，YPS培养基：蛋白胨9～11g/l；酵母抽提物4～6g/l；M培养基：氯化钠4.5～5.5g/l均可。
本发明方案利用基因突变及菌种选育方法得到的菌种替代了原工艺菌种，而发明技术方案对原有菌种进行了人工因素处理细胞，通过诱变后选用了产量突变型的正变株，使用基因突变及菌种选育方法的菌种进行发酵法工业化生产L-羟脯胺酸的产酸高(产酸5％)，周期短(50小时以内，具体的为49小时左右)，大大节约了能耗，降低了发酵成本。
本发明提供的一种提高发酵法工业化生产L-羟脯胺酸菌种产酸，采用该基因突变及菌种选育方法得到的菌种应用于生产L-羟脯胺酸，大大提高了L-羟脯胺酸的发酵产酸率、提高糖转化率，降低生产成本。通过基因突变及菌种选育的菌种大大提高了对于L-羟脯胺酸的发酵产酸，降低了生产成本。

Claims (2)

1.一种提高L-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、YPS培养基：称取蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；
M培养基：称取氯化钠5g，混匀定容至0.5L，调pH值7.0～7.1；
琼脂培养基中加入不同浓度的乙酸钠；
2)、种子培养：取25ul甘油保藏菌种，接入装在15ml试管的5mlYPS培养基中，37℃、200rpm/min水浴摇床培养过夜，转接0.5ml于250ml锥形瓶，该250ml锥形瓶装50mlYPS培养基，在33℃，200rpm/min往复式摇床培养4小时；
3)、分批培养：采用500ml磁力搅拌的微型玻璃反应器，装液300ml，在37℃下接种量2.5ml，通气1.5vvm；
4)、连续培养：微型玻璃反应器装液250ml，在37℃下接种量2.5ml，通气1.5vvm，蠕动泵控制进出微型玻璃反应器的培养基流速，每隔4小时取样测定残糖及pH，连续三次基本不变动时，达到稳定；
5)、诱变：培养过夜的大肠杆菌菌液5ml，3000rpm/min高速离心10min，加无菌生理盐水，离心洗涤2次，均匀重悬，以不同剂量进行紫外辐射处理；
6)、经过筛选得到3株突变株，在含10g/l葡萄糖和10g/l乙酸钠的MA培养基中培养24小时。
2.根据权利要求1所述的一种提高L-羟脯胺酸产酸菌种的基因突变及菌种选育方法，其特征在于：步骤1)中
YPS培养基：称取蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；
M培养基：称取氯化钠5g，混匀定容至0.5L，调pH值7.0；
琼脂培养基中加入不同浓度的乙酸钠。
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