CN108329387B

CN108329387B - 癌症相关的肿瘤特异转录本lin28b-tst及其用途

Info

Publication number: CN108329387B
Application number: CN201710035081.2A
Authority: CN
Inventors: 黄胜林; 何祥火; 李焱; 郭维杰; 胡治祥; 包怡超; 郑秋鹏; 吕洞宾
Original assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Current assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2017-01-17
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2037-01-17
Also published as: CN108329387A

Abstract

本发明提供了癌症相关的肿瘤特异转录本LIN28B‑TST及其用途，具体地，本发明提供的LIN28B‑TST可在多种肿瘤组织中表达，在某些肿瘤组织中高表达，但在正常分化组织和胚胎组织中均不表达，并且可在体外、体内能够明显促进肿瘤细胞的生长和增殖、促进肿瘤的发生。

Description

癌症相关的肿瘤特异转录本LIN28B-TST及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域。具体地，涉及癌症相关的肿瘤特异转录本LIN28B-TST及其用途。

背景技术

深度RNA测序已经从一个崭新的视角展现了人类转录组的特性和剪切方式的多样性和复杂性。癌症是一种具有异质性的复杂疾病，包含了遗传学和表观遗传学层面的改变，使得它形成了更复杂的转录组。因此，癌症的转录组有很大的潜能产生肿瘤特异转录本(Tumor-Specific Transcripts,TST)。肿瘤特异转录本的鉴定具有非常重要的临床作用，肿瘤特异转录本的分类，例如融合转录本(fusion transcripts)对理解肿瘤的发生过程也有很重大的意义(融合转录本是肿瘤特异转录本的一种，来源于DNA的易位)。失去正常调控的转录过程和表观遗传学改变可能导致大量的肿瘤特异转录本，包括特异的mRNA和基因间的全新转录本。然而，这些特异转录本的鉴定和功能还尚未被完全阐明。

LIN28的蛋白家族，包括LIN28A和LIN28B，是一种在胚胎发生中高表达，但成年人组织中不表达的RNA结合蛋白。LIN28蛋白可以阻止肿瘤抑制因子let-7家族RNA(一种微小RNA)的成熟，并调控哺乳动物干细胞的自我更新。然而，引起LIN28B基因激活的机制在此之前并未被阐明。

因此，本领域迫切需要研究LIN28B基因在癌症中激活的全新机制，并开发与肿瘤生长和增殖相关的蛋白，以及***的靶点药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种与肿瘤易感性和/或预后有关的新靶点LIN28B-TST及其诊断、治疗等方面的应用。

本发明的第一方面提供了一种分离的LIN28B-TST多肽，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-30个，更佳地，1-15个，更佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:1中第1-22位所示的22个氨基酸的氨基酸序列、具有肿瘤细胞特异性表达，并且具有促进肿瘤细胞的生长和增殖、促进肿瘤发生的活性的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:1氨基酸序列有≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)，且具有SEQ ID NO:1中第1-22位所示的22个氨基酸的氨基酸序列、具有肿瘤细胞特异性表达、并且具有促进肿瘤细胞的生长和增殖、促进肿瘤发生的活性的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述多肽来自于哺乳动物，较佳地，人、大鼠、小鼠，优选，人。

在另一优选例中，所述多肽将LIN28B-WT(SEQ ID NO.:3)N端的一个或多个(较佳地，3个)氨基酸替换为SEQ ID NO:1中第1-22位所示的22个氨基酸构成的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的多肽。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列。

在另一优选例中，所述DNA序列选自下组：基因组序列、cDNA序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为mRNA或cDNA。

在另一优选例中，所述多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％(较佳地至少90％，更佳地至少95％)相同性：

(i)编码如本发明第一方面所述的多肽的多核苷酸；和

(i i)与多核苷酸(i)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多肽。

在另一优选例中，所述多核苷酸的序列具有如SEQ ID NO.:2所示的序列。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明第五方面提供了一种多肽的制备方法，包括：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的多肽；和分离所述的多肽。

本发明第六方面提供了一种特异性抑制剂，所述抑制剂特异性地与本发明第一方面所述的多肽结合或抑制LIN28B-TST表达。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括反义核酸、抗体、小分子化合物、CrispR试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述反义核酸包括siRNA、shRNA、miRNA。

在另一优选例中，所述的抑制剂不抑制或基本不抑制野生型LIN28B。

在另一优选例中，所述的抑制剂优先抑制LIN28B-TST(与野生型LIN28B相比)。

在另一优选例中，所述的抑制剂特异性针对LIN28B-TST的特异表位。

在另一优选例中，所述的特异表位指LIN28B-TST具有的但野生型LIN288不具有的表位。

在另一优选例中，所述的特异表位选自下组：

(a)SEQ ID NO.:1中第1-22位的氨基酸序列构成的表位；

(b)SEQ ID NO.:1第1-22位的氨基酸序列与LIN28B-TST多肽的其他氨基酸序列所构成的表位。

在另一优选例中，所述的特异性抑制剂结合于所述LIN28B-TST多肽的特异表位，或结合于所述LIN28B-TST多肽的特异表位与其他序列组成的复合表位，所述特异表位选自下组：SEQ ID NO.:1中第1-22位的氨基酸序列：MSHRRQVLQKRMRSFNQVSSAP(SEQ ID NO.:8)。

在另一优选例中，所述特异性抑制剂可特异性抑制LIN28B-TST的启动子的活性。

在另一优选例中，所述LIN28B-TST的启动子如SEQ ID NO.:9所示。

本发明第七方面提供了一种本发明第六方面所述的特异性抑制剂的用途，所述特异性抑制剂用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于(i)肿瘤的诊断或预后判断；(ii)抑制肿瘤细胞生长和增殖；和/或(iii)抑制肿瘤发生的能力。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组肿瘤的细胞：肝癌、***、子宫内膜癌、胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胃癌、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：肝癌、***、子宫内膜癌、胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胃癌、或其组合。

本发明第八方面提供了一种药物组合物，包括：

本发明第六方面所述的特异性抑制剂；和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括下调所述LIN28B-TST多肽或核苷酸的表达量或活性的小分子化合物、和/或核酸。

在另一优选例中，所述核酸包括siRNA、shRNA、miRNA。

本发明第九方面提供了一种检测(尤其是非诊断地体外检测)样品中是否存在LIN28B-TST的方法，包括：将样品与LIN28B-TST的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在LIN28B-TST。

本发明第十方面提供了一种检测与LIN28B-TST异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

本发明第十一方面提供了一种本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的多核苷酸的用途，用于筛选抑制LIN28B-TST活性的抑制剂、或者用于肽指纹图谱鉴定、或用作核酸检测的对照品。

本发明第十二方面提供了一种确定测试物是否是LIN28B-TST的抑制剂的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试物存在下，培养表达LIN28B-TST的细胞；并且在不存在所述测试物且其它条件相同的对照组中，培养相同的细胞；

(b)检测测试组中所述细胞中所述LIN28B-TST的表达量E1或其活性A1；并与对照组中所述细胞中所述LIN28B-TST的表达量E2或活性A2进行比较；

其中，如果所述表达量E1显著低于所述表达量E2或所述活性A1显著低于所述活性A2，则表示所述待测试物是LIN28B-TST的抑制剂。

在另一优选例中，所述检测包括核酸水平的检测、和/或蛋白水平的检测。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指E1/E2或A1/A2的比值≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞来自于人。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)：对步骤(b)确定的LIN28B-TST多肽抑制剂进一步测试其对肿瘤细胞生长和增殖的抑制作用(包括体外细胞实验、或动物实验)。

在另一优选例中，所述的测试物包括：抗体、化合物、核酸。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

本发明第十三方面提供了一种LIN28B-TST多肽、或其转录本、或其编码序列、或其检测试剂的用途，用于制备一检测试剂盒，所述的试剂盒用于肿瘤的诊断或预后。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肝癌、***、子宫内膜癌、胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胃癌、或其组合。

在另一优选例中，所述的LIN28B-TST多肽、或其转录本、或其编码序列被用作参照或标准品。

在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：引物、探针、抗体、蛋白芯片、核酸芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂是特异性检测LIN28B-TST的检测试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂是区分LIN28B-TST和LIN28B-WT的检测试剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了转录组测序分析在多种癌症中发现了新的LIN28B肿瘤特异转录本LIN28B-TST。其中，

(A)在不同转录组测序文库中，LIN28B基因位置的reads序列分布。

(B)于TCGA数据库中，LIN28B-TST和LIN28B-WT在不同癌症种类中的表达水平。HCC，即肝细胞肝癌(样本数＝348)；CESC，即宫颈及宫颈内癌(样本数＝296)；LGG，即脑低级别胶质瘤(样本数＝529)；DLBC，即弥漫性大B细胞淋巴瘤(样本数＝45)；BRCA，即乳腺浸润性癌(样本数＝1093)；SKCM，即皮肤上皮黑色素瘤(样本数＝294)；UCEC，即子宫体内膜样癌(样本数＝175)；BLCA，即膀胱尿道上皮癌(样本数＝388)；HNSC，即肺鳞状细胞癌(样本数＝494)；KIRP，即肾***细胞癌(样本数＝290)；LUAD，即肺腺癌(样本数＝504)；GBM，即多形性胶质母细胞瘤(样本数＝158)；UCS，即子宫肉瘤(样本数＝42)；ESCA，即食管癌(样本数＝179)；STAD，即胃腺癌(样本数＝384)，COAD，即结肠腺癌(样本数＝288)。

图2显示了LIN28B-TST转录本的鉴定。其中，

(a)Huh7细胞中LIN28B-TST的Northern blot结果。

(b)HuH-7细胞中LIN28B-TST的5’RACE实验cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序结果。

(c)HuH-7细胞中LIN28B-TST的3’RACE实验cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序结果。

(d)与LIN28B-WT转录本相比，LIN28B-TST转录本在5’端有2个特异的外显子。LIN28-TST特异转录本用红色标注。转录起始几率最高第一个碱基对(hg19chr6:104,937,026)被认为是转录起始位点。翻译起始位点有两个(ATGs；用蓝色加粗下划线标记)：第一个ATG,hg19chr6:104,937,099-104,937,101；第二个ATG,chr6:104,950,476-104,950,478.终止密码子(TAA)用蓝色下划线标记。3’UTR用绿色标记。

(e)LIN28B-TST的氨基酸序列。翻译起始于1或者2号起始密码子。相应的有两个蛋氨酸(用蓝色下划线标记)导致有两种蛋白，分别为29.38kDa(269个氨基酸)和27.96kDa(258个氨基酸)。LIN28B-TST特异的氨基酸序列用红色标记。

图3显示了LIN28B在多种细胞系中的表达。用qPCR实验检测LIN28B-WT和LIN28B-TST转录本在多种细胞系中表达情况。

图4显示了LIN28B-TST和LIN28B-WT在组织的表达及其与肿瘤预后的关系。其中，

(A)LIN28B-TST和LIN28B-WT在胎儿肝脏，正常肝脏，非肿瘤组织和肝细胞肝癌(HCC)组织中的表达情况。

(B)伴(+)或不伴(-)有LIN28B-TST表达的HCC的病人总生存曲线。P值使用对数秩检验(Log-rank test)计算得出。

图5显示了LIN28B-TST的表达调控。其中，

(A)LIN28B-TST在不同的转录起始位点，在HuH-7细胞系中，进行染色体免疫共沉淀测序(ChIP-seq)和5’段cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends)。

(B)在HEK-293T细胞系中，LIN28B-TST启动子进行5’段的一系列敲除后的荧光素酶报告实验。

(C)LIN28B-TST启动子区域的2个CpG岛的位置示意图。启动子甲基化的状态使用亚硫酸氢钠测序。在指定的CpG位点，实心圆圈代表的是甲基化胞嘧啶，而空心圆圈代表的是未甲基化的胞嘧啶。

(D)使用或不使用10μM 5-氮杂脱氧胞苷(5-AZA)处理6天后，LIN28B在细胞系中的表达的免疫印迹结果。

(E)使用1μM JQ1或转染靶向c-Myc的siRNA后，LIN28B和cMyc在细胞系中表达的免疫印迹结果。β肌动蛋白(β-actin)作为内参。

图6显示了LIN28B-TST编码一段具有额外N端氨基酸的长蛋白异构体。其中，

(A)LIN28B转录本变体和对应的异构体示意图。起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用黑色箭头标示。

(B)表达LIN28B-WT和LIN28B-TST的细胞的免疫印迹结果。图示两个预测的LIN28B-TST起始密码子从ATG到AGG被分别和共同突变。

(C)LIN28B-WT和LIN28B-TST在多种细胞系中的表达。

图7显示了LIN28B-TST在肿瘤病人组织中的表达。其中，

(A)使用LIN28B-TST抗体在HEK-293T细胞系，HuH-7细胞系和HCC病人组织中进行免疫印迹实验。T，即HCC组织；N，即对应的非肿瘤组织。

(B)使用LIN28B-TST抗体在HCC和正常肝组织中进行免疫组化染色。

图8显示了LIN28B-TST对肿瘤细胞增殖的影响。其中，

(A)在NCI-H1299细胞系中，siRNA下调LIN28B-TST表达后进行克隆形成实验和细胞增殖实验。使用靶向LIN28B-TST的两个siRNA，即si-LIN28B-TST-1和si-LIN28B-TST-2。没有靶标的siRNA被作为阴性对照(Ctrl)。

(B)在Huh-7细胞系中，siRNA下调LIN28B-TST表达后进行克隆形成实验和细胞增殖实验。

图9显示了使用CRISPR/Cas9技术下调LIN28B-TST表达后对肿瘤细胞增殖的影响。其中，

(A)在图中用红色实心三角形标记了sgRNA靶向的的位点。在Huh-7细胞中用免疫印迹实验验证了敲除效率。无靶向位点的sgRNA作为内参(Ctrl)。

(B)在Huh-7细胞中使用CRISPR/Cas9下调LIN28B-TST对克隆形成和细胞增殖能力的影响。***,p<0.001.

图10显示了动物实验检测下调LIN28B-TST后在体内对细胞增殖的影响。使用CRISPR/Cas9下调LIN28B-TST的表达。其中，

(A)LIN28B-TST敲除的HuH-7的小鼠移植瘤的体积。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.

(B)LIN28B-TST敲除的HuH-7的小鼠移植瘤的质量。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，经过大量的筛选，意外地首次发现并分离了一种新的转录本LIN28B-TST(变异体)，它表现出高表达水平和高剪切指数分数，它有如下几个特征：1)在野生型LIN28B-WT蛋白的N端增加了22个新的氨基酸序列；2)它在多种肿瘤组织中表达，在某些肿瘤组织中高表达，但均不在正常组织中表达。3)该变异体在体外能够明显促进肿瘤细胞的生长和增殖、促进肿瘤的发生。4)该变异体在体内能够明显促进肿瘤细胞的生长和增殖、促进肿瘤的发生。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“LIN28B-TST多肽”、“LIN28B-TST蛋白”、“变异体”、“LIN28B-TST变异体”均可互换使用，均指具有LIN28B-TST变异体氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的蛋白或多肽，它在体内、体外能够明显促进肿瘤细胞的生长和增殖、促进肿瘤的发生。

如本文所用，术语“LIN28B-WT多肽”、“野生型的LIN28B蛋白”、“LIN28B-WT蛋白”可互换使用，均指天然的LIN28B蛋白，序列如SEQ ID NO.:3所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.:4所示。

LIN28B-TST

本发明人通过转录组测序(RNA-seq)发现了一个LIN28B基因的全新转录本，它表现出高表达水平和高剪切指数分数，命名为LIN28B-TST。LIN28B-TST在肝细胞肝癌和很多其他的人类癌症细胞中特异表达，在正常组织中不表达。LIN28B-TST表达高的HCC病人预后较差。与野生型LIN28B转录本不同，LIN28B-TST从一个新的转录起始位点产生而来，并含有一个不被c-Myc调控的强启动子。表达LIN28B-TST的肿瘤可能被分类为一种新的侵袭性肿瘤亚型。在体内实验和体外实验显示，下调LIN28B-TST的表达可以显著抑制肿瘤细胞增殖。这些发现证明了LIN28B基因在癌症中激活的全新机制，并提示LIN28B-TST作为肿瘤诊断和治疗的潜在应用价值。

在本发明中，代表性的LIN28B-TST多肽是指具有LIN28B-TST变异体氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的蛋白或多肽。

在本发明中，代表性的LIN28B-TST多肽是指将LIN28B-WT(SEQ ID NO.:3)N端的一个或多个(较佳地，3个)氨基酸替换为SEQ ID NO:1中第1-22位所示的22个氨基酸构成的氨基酸序列。

在本发明中，代表性的野生型LIN28B多肽(LIN28B-WT多肽)指具有SEQ ID NO.:3所示序列的蛋白或多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的LIN28B-TST蛋白或多肽”是指LIN28B-TST多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LIN28B-TST蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。LIN28B-TST多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人LIN28B-TST蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人LIN28B-TST蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人LIN28B-TST多肽”指具有人LIN28B-TST蛋白活性的SEQ IDNO:1序列的多肽。该术语还包括具有与人LIN28B-TST蛋白相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人LIN28B-TST蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人LIN28B-TST DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人LIN28B-TST多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人LIN28B-TST多肽或其片段与其他多肽所形成的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人LIN28B-TST多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人LIN28B-TST多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人LIN28B-TST蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人LIN28B-TST多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人LIN28B-TST蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，它包含的多核苷酸序列全长为5428个碱基，其开放读框位于74-880位，编码全长为269个氨基酸的LIN28B-TST蛋白(SEQID NO:1)。

本发明蛋白的制备

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人LIN28B-TST核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或TRA2B-DNAH5蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的TRA2B-DNAH5多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人LIN28B-TST多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

另一方面，本发明还包括对本发明LIN28B-TSTDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于本发明LIN28B-TST产物或片段。较佳地，指那些能与本发明LIN28B-TST基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体，尤其是该特异性抗体不识别LIN28B-WT天然蛋白。本发明还提供了一种特别优选的特异性抗体，它识别和结合SEQ ID NO.:1中第1-22位的氨基酸序列，较佳地，可识别和结合SEQ ID NO.:1中第3-22位的氨基酸序列。

本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明LIN28B-TST的分子，也包括那些并不影响本发明LIN28B-TST功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的本发明LIN28B-TST基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明LIN28B-TST基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明LIN28B-TST蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerl ing等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断本发明LIN28B-TST功能的抗体以及不影响本发明LIN28B-TST功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用本发明LIN28B-TST基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与本发明LIN28B-TST基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗本发明LIN28B-TST蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的本发明LIN28B-TST蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与本发明LIN28B-TST蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断本发明LIN28B-TST蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如本发明LIN28B-TST蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭本发明LIN28B-TST蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用本发明LIN28B-TST蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

LIN28B-TST的抑制剂及其用途

利用本发明LIN28B-TST，通过各种常规筛选方法，可筛选出抑制LIN28B-TST或活性表达的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

典型地，本发明的抑制剂的例子包括(但并不限于)：小分子化合物、抗体、反义核酸(包括siRNA、shRNA、miRNA)、Crispr试剂。其中，所述本发明的抑制剂为特异性的抑制剂，其特异性结合于或靶向所述LIN28B-TST特异的多肽或核酸序列特异表位，或结合于所述LIN28B-TST多肽的特异表位与其他序列组成的复合表位，或抑制LIN28B-TST的特异性的强启动子。

并且，在一优选实施方式中，本发明所述的抑制剂优先抑制LIN28B-TST(与野生型LIN28B相比)。

本发明蛋白抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可用于抑制肿瘤细胞的生长。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，用于癌症(尤其是肝癌)方面的治疗。在使用本发明LIN28B-TST的抑制剂时，还可同时使用其他肿瘤治疗剂，如顺铂等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明LIN28B-TST的抑制剂(如抗体或小分子化合物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。此外，本发明的抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的LIN28B-TST的抑制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约100毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人LIN28B-TST蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于LIN28B-TST蛋白的无表达或异常/无活性的LIN28B-TST蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的LIN28B-TST蛋白，以抑制内源性的LIN28B-TST蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将LIN28B-TST基因转移至细胞内。构建携带LIN28B-TST基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组人LIN28B-TST基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制LIN28B-TST mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

抑制LIN28B-TST启动子活性的抑制剂也在本发明的范围之内。LIN28B-TST和LIN28B-WT启动子不同，可通过药物筛选出抑制LIN28B-TST的小分子药物或中药组分，对LIN28B-WT不影响。

诊断方法

本发明还涉及定量和定位检测人LIN28B-TST核酸或蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人LIN28B-TST蛋白水平，可以用作解释人LIN28B-TST蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断LIN28B-TST蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在LIN28B-TST蛋白的方法是利用LIN28B-TST蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与LIN28B-TST蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在LIN28B-TST蛋白。

LIN28B-TST蛋白的多聚核苷酸可用于LIN28B-TST蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，LIN28B-TST蛋白的多聚核苷酸可用于检测LIN28B-TST蛋白的表达与否或在疾病状态下LIN28B-TST蛋白的异常表达。如LIN28B-TST DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断LIN28B-TST蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用LIN28B-TST蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测LIN28B-TST蛋白的转录产物。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现新转录本LIN28B-TST，它在肝细胞肝癌和很多其他的人类癌症细胞中特异表达，在正常组织中不表达，LIN28B-TST有一个新的转录起始位点，表达受启动子区甲基化的调控。

(2)本发明首次发现相比野生型的蛋白LIN28B-WT，LIN28B-TST蛋白在野生型的蛋白LIN28B-WT的N端多了一段新的序列，该新序列能被特异的抗体识别，并且下调LIN28B-TST的表达可在体外和体内显著抑制肿瘤细胞的增殖。

(3)本发明首次发现LIN28B-TST可以作为新的肿瘤诊断和治疗的靶分子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明说明书中所用的试剂和材料均为市售产品。

通用方法

I.材料方法

1、细胞培养和化学试剂

人类胚胎肾细胞HEK-293T、HuH-7和SK-HEP-1细胞(购自ATCC和日本细胞库)在DMEM(Gibco,New York,USA)培养基中培养；NCI-H1299细胞(购自ATCC)在RPMI-1640(Gibco)培养基中培养；HCT-116细胞(购自ATCC)在McCoy’s 5A(Gibco)培养基中培养；AGS和A549细胞购自ATCC)在F-12K(Gibco)培养基中培养。各培养基中加入10％牛胎血清(Gibco)，100IU/mL青霉素-链霉素(Gibco)。细胞置于37℃，含5％CO₂的培养箱中进行培养。JQ1从Selleck Chemicals(Houston,USA)公司购置。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5AZA)从Sigma-Aldrich(St.Louis,USA)公司购置。

2、RNA抽提，逆转录和实时定量PCR反应(Quantitative real-time polymerasechain reaction)

总RNA根据生产商的操作指南用TRIzol试剂从细胞或者组织中提取。cDNA用PrimeScript^TM RT reagent Kit(TaKaRa,Tokyo,Japan)合成。实时定量PCR反应(qPCR)使用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa).β-actin用作内参。使用的引物序列如表2所示。成熟的miRNAs使用

MicroRNA Assays(Applied Biosystems,Foster City,USA)中的特异引物和探针进行定量。U6small nuclear(snRNA)作为内参。

表2引物表

3、Northern blot

使用DIG Northern Starter Kit(Roche,Indianapolis,IN,USA)制备地高辛标记的RNA探针，相应的PCR产物作为T7转录的模板。PCR引物列在补充表格2中。使用NorthernMax Kit(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)进行。10μg总RNA在2％agarose胶中进行分离，然后转移到尼龙膜(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上。膜干燥后进行紫外交联(265nm,200mJ/cm²)1min。在62℃进行预杂交1h,然后62℃进行杂交过夜。室温下，使用含0.1％SDS的2x SSC洗膜，然后62℃洗膜30min,洗两次。接下来用含0.1％SDS的0.2x SSC洗膜，62℃洗膜30min,洗两次。膜洗好后进行显影(Typhoon,MolecularDevices)。

4、RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)

5′-RACE和3′-RACE实验根据SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,Mountain View,USA)的说明书进行操作。5′-RACE和3′-RACE使用的引物列在补充表格2。PCR产物克隆到pMD20-T or pMD18-T vector(TaKaRa)进行sanger测序。

5、抗体

所使用的抗体包括：H3K27ac(39133；ChIP-qPCR and ChIP-seq)和RNApol II(61667；ChIP-qPCR and ChIP-seq)从Active Motif(Carlsbad,USA)公司购买；H3K4me3(9751；ChIP-qPCR and ChIP-seq),c-Myc(13987；WB)和LIN28B(11965；WB)从CST(Danvers,USA)公司购买；IGFBP1(22803-1-AP；WB)和IGFBP3(14642-1-AP；WB)从Proteintech(Rosemont,USA)公司购买；ACTB(A2228；WB)是从Sigma-Aldrich公司购买；IGFBP2(AP10127b；WB)是从Abgent(San Diego,USA)公司购买；LIN28B-TST是由GenScript(Nanjing,China)公司合成的，具有特异的N端免疫序列(HRRQVLQKRMRSFNQVSSAP(SEQ IDNO.:1中第3-22位).

6、Western blot

蛋白质在10％或14％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide,SDS)凝胶中进行分离，然后转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad,Hercules,USA)上。膜用5％脱脂奶粉封闭并用一抗孵育。蛋白条带用化学发光检测试剂(ThermoFisher Scientific)在Tanon 6100化学发光成像仪进行检测。

7、寡核苷酸转染

小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)由RiboBio(Guangzhou,China)公司合成，LIN28B-TST干扰序列为：5′-GGAAAGCACAUUAGACCAU-3′(SEQ ID NO.:5)和5′-AGGUUCUUCAGAAGAGGAU-3’(SEQ ID NO.:6)；c-Myc的干扰序列为5′-GGUCAGAGUCUGGAUCACC-3′(SEQ ID NO.:7)。细胞使用

RNAiMAXreagent(Invitrogen)试剂转染寡核苷酸，最终浓度为50nM，转染后48h进行实验。

8、细胞增殖和克隆形成实验

使用CCK8(Cell Counting Kit-8,Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)检测细胞的增殖。在克隆形成实验中，1×10³个细胞种在6孔板的每个孔中，37℃培养1–2周。细胞使用4％多聚甲醛固定并用1％结晶紫(Sigma-Aldrich)染色。最后进行细胞克隆计数和分析。

9、免疫组织化学染色

组织样本使用中性***固定，石蜡包裹，并切成5μm厚的切片。组织切片脱蜡后再水化，并用蒸馏水冲洗。切片置于10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)使用微波炉加热20min进行抗原修复。在室温下用3％H₂O₂作用30min来去除内源性过氧化物酶。切片使用封闭液(Thermo Fisher Scientific)室温封闭1h，然后加LIN28B-TST一抗(1:500)，在湿盒中室温孵育1h。孵育后洗涤切片，孵育生物素标记的抗兔二抗，然后孵育HRP标记的链霉亲和素(streptavidin)。二氨基联苯胺(DAB)(DAKO,Glostrup,Denmark)液体底物作为显色剂，苏木素染液(Mayer’s hematoxylin)(DAKO)作为复染剂。全部切片使用Axioskop2microscope显微镜(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)观察拍照。

10、裸鼠接种

收集用CRISPR/Cas9技术敲除的LIN28B的HuH-7细胞以及对照细胞，用DMEM进行重悬。在每只裸鼠(雄BALB/c-nu/nu,6周龄)的背部靠下部位皮下接种2×10⁶个细胞(重悬于200μL DMEM)。每隔3-4天用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W)。用下列公式计算肿瘤的体积(V):V＝(L x W²)/2.4周后处死小鼠，取出形成的肿瘤并称重。所有裸鼠的饲养和实验操作都按照上海医学实验动物伦理委员会的规定进行。

实施例1获得LIN28B-TST的序列

通过不同正常组织和癌症组织及数个细胞系的转录组测序(RNA-seq)分析研究了潜在的特异转录本。通过大量的筛选，发现了大量的新肿瘤特异转录本，包括430个基因间的全新转录本和1385个覆盖已知基因的转录本。在这些肿瘤特异转录本中，意外的发现了一个LIN28B基因的全新转录本，它表现出高表达水平和高剪切指数分数，命名为LIN28B-TST。并且发现LIN28B-TST在肝细胞肝癌组织(HCC)、HuH-7肝细胞肝癌细胞系以及NCI-H1299肺癌细胞系中表达，而野生型LIN28转录本(LIN28B-WT)则表达于HEK-293T人类胚胎肾细胞系中(图1A)。所有变异转录本都不在正常肝组织中表达(图1A)。LIN28-TST在5’端具有2个新的外显子，另外3个外显子则与野生型的转录本所含外显子2-4一致(图1A)。

通过核糖核酸印迹法(Northern Blot)和cDNA末端快速扩增法(RapidAmplification of cDNA Ends)确认了LIN28B-TST转录本的存在(图2)。

实施例2在肿瘤细胞和组织中检测LIN28B-TST的mRNA表达水平

为了测定LIN28B-TST的表达，从TCGA转录本测序数据库中筛选了22个不同的肿瘤的超过7000个样本。LIN28B在10.2％的肿瘤中表达，在所有表达LIN28B的肿瘤样本中，LIN28B-TST又特异地表达在HCC(91.5％,54/59)和很多其他例如***(CESC,86.2％,25/29)和宫颈内膜癌、脑低级别胶质瘤(LGG,85.2％,23/27)、乳腺浸润性癌(BRCA,69.8％,30/43)、皮肤上皮黑色素瘤(SKCM,68.1％,32/47)、肺鳞状细胞癌(LUSC,50％,59/118)的癌症种类中(图1B)。为了区别和定量分析LIN28B-WT和LIN28B-TST的表达水平，设计了特殊的引物(表2)，并在多种细胞系中进行了实时聚合酶链反应(RT-PCR)(图3)。之后进一步在120对肝癌样本中确认LIN28B-TST在HCC组织中广泛表达，但不在正常肝组织或胎儿肝组织中表达；相反的是，LIN28B-WT在胎儿肝组织能检测到表达，且肝癌中只散在地表达LIN28B-WT(图4A)。生存分析表明，患有HCC且表达LIN28B-TST的病人预后更差(图4B)。通过RT-PCR发现LIN28B-TST在正常心、肺、脑、胃、肠、肺、肝、脾、胰腺、骨骼肌等组织均未检测到表达。

实施例3LIN28B-TST的调控机理及产生蛋白鉴定

LIN28B的转录本测序结果提示了一个在LIN28B-WT上游距离20kb左右的可变转录起始点(ATI)。之后进行了5’RACE扩增，并将前述的ATI定位到6号染色体的chr6:104,937,026区域。染色体免疫共沉淀测序(ChIP-seq)发现了组蛋白H3K4me3，H3K27Ac和RNA多聚酶II(RNApol II)在ATI位点附近的显著富集(图5A)，这是启动子活动的典型表现。这些数据显示LIN28B-TST从一个典型的染色质变异新产生的ATI位点中出现。为了检测ATI位点的区域可否作为一个启动子行使功能，将这段可能存在LIN28B-TST启动子的DNA片段克隆入了荧光素酶报告基因中。荧光素酶报告分析显示，LIN28B-TST的启动子活性是HEK-293T细胞系中LIN28B-WT或SV40的启动子活性的超过20倍(图5B)。

一系列基因敲除实验发现了一段靠近ATI位点的约200个bp长度的核心启动子区域(图5B)。为了研究LIN28B-TST启动子区的CpG岛甲基化是否和LIN28B-TST的表达相关，在ATI及其两侧的区域进行了亚硫酸盐测序。在LIN28B-TST的启动子区域，两个CpG岛被发现。与LIN28B-TST不表达的样本对比，表达LIN28B-TST的样本在第二个CpG岛中表现了更低的CpG甲基化水平(图5C)。

为了确认CpG位点的去甲基化足够导致LIN28B-TST的表达，在不表达LIN28B或表达LIN28B-WT的细胞中用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-AZA)研究了LIN28B-TST。在本不表达LIN28B的SK-HEP1和AGS细胞系中，5-AZA的处理强烈地激活了LIN28B-TST的表达；而且在表达LIN28B-WT的HEK-293T和A549细胞系中，5-AZA的处理可显著激活LIN28B-TST并抑制LIN28B-WT的表达(图5D)。

这些结果显示，LIN28B-TST启动子的去甲基化可能是LIN28B-TST转录的前提。发明人还研究了LIN28B-TST是否可以被c-Myc癌基因调控，结果表明，c-Myc可以直接调控LIN28B-WT的表达。通过小干扰RNA(siRNA)或BET抑制剂JQ1对c-Myc的抑制，显著地降低了LIN28B在表达LIN28B-WT的HepG2细胞系的表达，而LIN28B-TST并未随着c-Myc在表达LIN28B-TST的HuH-7细胞系中的表达沉默被改变(图5E)。这表明，LIN28B-TST的激活是独立于c-Myc的表达的。

LIN28B-TST转录本包含2个预测的框内起始密码子(ATGs)在5’端，导致了其编码蛋白具有额外的氨基端氨基酸(图6A和6B)。对表达LIN28B-TST的不同癌症细胞系进行免疫印迹分析发现一条主要的条带，表明LIN28B-TST主要从第一个起始密码子被翻译(图6C)。发明人进一步分别或一起变异了两个起始密码子。免疫印迹显示每个LIN28B-TST变异的形式都不再产生对应的蛋白质条带(图6B)。

实施例4制备LIN28B-TST抗体

制备了一种抗LIN28B-TST蛋白额外的氨基端氨基酸的兔源抗体。合成LIN28B-TST特异多肽HRRQVLQKRMRSFNQVSSAP，即SEQ ID NO.:1中第3-22位的氨基酸序列，进行KLH偶联，5mg注射到兔子进行3次免疫，取兔血清，并进行亲和层析，获得针对LIN28B-TST特异抗体。

免疫印迹的结果显示，这种抗体可以特异地识别主要的LIN28B-TST异构体，而并不能特异识别较小的LIN28B-TST异构体或LIN28B-WT(图6B)。使用上述的特异抗体进行免疫印迹和免疫组化技术，还可以在HCC组织中检测到了LIN28B-TST的表达，而不能在正常肝脏组织中检测到(图7A和7B)。

实施例5细胞生长和增殖实验

发明人进一步使用siRNA和CRISPR/Cas9基因编辑技术沉默LIN28B-TST的表达，并观察到显著的细胞生长抑制作用和细胞集落形成抑制作用(图8和图9)。通过裸鼠皮下成瘤动物试验，发现沉默LIN28B-TST可显著地抑制Huh-7肝癌细胞的成瘤能力，并且下调了肿瘤的质量与体积(图10)。

这些结果表明，LIN28B-TST是对于癌症细胞增殖和肿瘤发生非常关键的转录本，并在一定程度上具备作为癌症治疗特异靶标的潜能。

实施例6筛选LIN28B-TST的抑制剂

按本发明的所述方法，将以下两组物质施用于Huh-7细胞系，然后LIN28B-TST的表达活性以及以下两组物质对细胞生长和增殖的影响检测：(a)候选物质；(b)空白对照。

如果组(a)的细胞的LIN28B-TST的表达活性以及以下两组物质对生长和增殖的程度在统计学上显著低于组(b)的LIN28B-TST的表达活性以及以下两组物质对细胞的生长和增殖，则表明该候选物质是LIN28B-TST的抑制剂。

类似地，按本发明的所述方法，将以下两组物质施用于NCI-H1299细胞系(表达LIN28B-TST)，然后观察对LIN28B-TST表达的活性以及对细胞生长和增殖的影响：(a)候选物质；(b)空白对照。

如果组(a)的LIN28B-TST的表达活性以及细胞的生长和增殖的程度在统计学上显著低于组(b)的LIN28B-TST的表达活性以及细胞的生长和增殖，则表明该候选物质是LIN28B-TST的抑制剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

<120> 癌症相关的肿瘤特异转录本LIN28B-TST及其用途

<130> P2016-1869

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser His Arg Arg Gln Val Leu Gln Lys Arg Met Arg Ser Phe Asn

1 5 10 15

Gln Val Ser Ser Ala Pro Gly Gly Ala Ser Lys Gly Gly Gly Glu Glu

20 25 30

Pro Gly Lys Leu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Glu Ser Gln Val Leu Arg

35 40 45

Gly Thr Gly His Cys Lys Trp Phe Asn Val Arg Met Gly Phe Gly Phe

50 55 60

Ile Ser Met Ile Asn Arg Glu Gly Ser Pro Leu Asp Ile Pro Val Asp

65 70 75 80

Val Phe Val His Gln Ser Lys Leu Phe Met Glu Gly Phe Arg Ser Leu

85 90 95

Lys Glu Gly Glu Pro Val Glu Phe Thr Phe Lys Lys Ser Ser Lys Gly

100 105 110

Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Leu Gly

115 120 125

Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Thr Leu Gln Lys Arg Lys Pro Lys

130 135 140

Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu

145 150 155 160

Cys Ser Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His Tyr Cys Gln Ser Ile

165 170 175

Met His Met Val Ala Asn Cys Pro His Lys Asn Val Ala Gln Pro Pro

180 185 190

Ala Ser Ser Gln Gly Arg Gln Glu Ala Glu Ser Gln Pro Cys Thr Ser

195 200 205

Thr Leu Pro Arg Glu Val Gly Gly Gly His Gly Cys Thr Ser Pro Pro

210 215 220

Phe Pro Gln Glu Ala Arg Ala Glu Ile Ser Glu Arg Ser Gly Arg Ser

225 230 235 240

Pro Gln Glu Ala Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ile Ala Pro Glu Glu Gln

245 250 255

Ser Lys Lys Gly Pro Ser Val Gln Lys Arg Lys Lys Thr

260 265

<210> 2

<211> 5444

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

aggctggtgt tgaactcctg ggctcaagcg attcgccacg tcaacctctg aagaaggtgc 60

tgggattaca agcatgagcc accgccgcca ggttcttcag aagaggatga ggtcattcaa 120

ccaggtttca tcagccccag gcggggctag caaaggtggt ggagaagagc ccgggaagct 180

gccggagccg gcagaggagg aatcccaggt tttgcgcgga actggccact gtaagtggtt 240

caatgtgcgc atgggatttg gattcatctc catgataaac cgagagggaa gccccttgga 300

tattccagtc gatgtatttg tacaccaaag caaactattc atggaaggat ttagaagcct 360

aaaagaagga gaaccagtgg aattcacatt taaaaaatct tccaaaggcc ttgagtcaat 420

acgggtaaca ggacctggtg ggagcccctg tttaggaagt gaaagaagac ccaaagggaa 480

gacactacag aaaagaaaac caaagggaga tagatgctac aactgtggtg gccttgatca 540

tcatgctaag gaatgtagtc tacctcctca gccaaagaag tgccattact gtcagagcat 600

catgcacatg gtggcaaact gcccacataa aaatgttgca cagccacccg cgagttctca 660

gggaagacag gaagcagaat cccagccatg cacttcaact ctccctcgag aagtgggagg 720

cgggcatggc tgtacatcac caccgtttcc tcaggaggct agggcagaga tctcagaacg 780

gtcaggcagg tcacctcaag aagcttcctc cacgaagtca tctatagcac cagaagagca 840

aagcaaaaag gggccttcag ttcaaaaaag gaaaaagaca taacaggtct tcttcatatg 900

ttctttcctt tacccggttg caaagtctac ctcatgcaag tataggggaa cagtatttca 960

caagcagtag ctgacctggg attttaacta ctattgggga actgtgaatt ttttaaacag 1020

acaaatcact ctaagcaaat tacatttgag cagggtgtca tgttttatgt taattcagag 1080

aataagatac tatgtctgtc aatatgtgca tgtgtgagag ggagagagcc tgagtctgtg 1140

tgtgtacatg aggattttta tataggaatg tagacacata tataaagagg ctttgtcttt 1200

atatatttgt gtatagatca aagcacacac cctctctcat ataattggat atttccaaga 1260

attgaaaacc catgtgaagc attatagata gttttaaatt taacccactg gagttttctt 1320

gaaataccac ttcttttata ttatataaaa ctaaaaacac gactgttacc ttttgtgtga 1380

accaaaggat acttcagatc tcagagctgc caattatggg gtactaaagg tttttaagac 1440

atccagttct cccgaatttg ggattgcctc tttttcttga aatctctgga gtagtaattt 1500

ttttccccct tttttgaagg cagtacctta acttcatatg cctctgactg ccataagctt 1560

ttttgattct gggataacat aactccagaa aagacaatga atgtgtaatt tgggccgata 1620

tttcactgtt ttaaattctg tgtttaattg taaaattaga tgcctattaa gagaaatgaa 1680

ggggaggatc atcttagtgg cttgttttca gtagtatttt aatatcagct tcttgtaacc 1740

ttttccatgt tgtgagggtt gtaagggatt gtgtggcaac agcagcttcc cttggctaac 1800

tcaatcttct acccattgct tagagcaggg agccctcctt atttactact gaagacctta 1860

gagaactcca attgtttggc atatattttt ggtggtggtt tttattcctc ctggagagtt 1920

atctaatttg tttctaaaac aaacaagcag caaagaaatg aattaaatac tggggttgag 1980

aattaaaatt aagtggatgt tcacagttgc ccaatatata tgacctgcaa atgatacgaa 2040

aaagtgcagc atttagtggc agttaacaag agtgacaagc ctggggcaga ggtaccaaac 2100

ctctcccacc agagagctag aagtatttta tacagtaact ttgatcttat ggaagtgacc 2160

ttcaatgctt attctgaagt aacctatatg gtggatacag gatgaacatt cagtgccagg 2220

gagaatcttc tcaggttggt tctcgttaga gtgataaact ggctaggggc catagtattg 2280

gtcctgttag gtttcggtca tggaaaaaaa aattattttg gggtcatcct ggctctagat 2340

gttatgggca aatttctgaa acatctgcaa gaaggtacca gttaattata gtgcttaata 2400

ttgggaataa gattaagcat tataattata atgtatgggc ctgttggtgt aagctcagat 2460

aattaaataa aaatagcatg actcaaatga gacatattct gctgaacagt ttctacttcc 2520

tctcccgcct gtcctgtcat gggagacgtg tatagttgct gctgtttcag caaaccacca 2580

taagacgaaa atgcctcagg ttgggttgcc agtcctttac aactcagctt gaatttcaca 2640

acagtgattg tgagaatctg cgtggtatac actgaaatat cggtgtgctg tgatgcaaag 2700

cttacctttg acgatattga atgtgatata gctgtagaga agtacttcct tgccttatgt 2760

gaggatttca aacttattta aattatgtag acaaatcaaa gtggcattgc ttaattttta 2820

gcaggcataa taagcaagtt aacagtaaaa tgcaaaacat gataagcgtt gctcaatttt 2880

tagcaggtat aataagcagg ttaacagtaa aaatgcaaaa catgatagat aagtcacttt 2940

gaaaattcaa accaaagttc cttcacctta tggaaatagg aaattatgga cttcaaaatt 3000

ggacacttcc tgtttacaaa aagaaattca gagctaaaat catggtaaaa aaaaatagaa 3060

acacttgaga actatggtct ttatgggtgc aatttgaaat ccttttcatc atcttaccag 3120

actaaactaa gagcacatac caaacctatc ttatggttga aagttggggt ttatttttta 3180

tatgagaata ttatcactat tacataacat actcaggaca aagaactttg ctcagggaac 3240

ataccatgta atatttttgt tgtttcttta cagactagtc tacagtcctg cttactcaaa 3300

acaaaccaaa taacttatac ctttatataa gtattatgta ctgatgatag taactacctc 3360

tgagtttgac acagatcaaa atttttgaat atcagatatc agttatccta tttttatttc 3420

atgtgaaaac tcctctaaag cagattccct caactctgtg catatgtgaa tatcactgat 3480

gtgaacacat tgttcattta cataggtaaa atattactct gtttacagca aaaggctacc 3540

tcatagttga tacatagcac acctgtatgt atgctgttcc agccttacag gtggctgata 3600

attctctggt acagaacctt tttatctgta ttataaatag caattcacaa ctgcatgttt 3660

ctgacaaaca cttgtgaata atgaagcatc tcgttttagt tagcaaagtc tccaaacatt 3720

tccttaaaat aatcatgtat ttagtttaaa gaattatggg cactgttcaa cttaagcaaa 3780

acagaacacg gaagcagtct tagaagcacc actttgccca gaggtggagg ttggaagggg 3840

tagcagggag aggggttggt gtatgcaggt attcatgcta ggcaaagagt ttaaaagacg 3900

ccaatgtcct tcatttactg tctgtgctgc cctgaagcca agcgtattgc agcattatag 3960

ccccaggcac ataactaact agcactggct tgccaaggaa tgaacatgca atgccattac 4020

tagctattga gggaaaaggg tctgtgtgaa gcatcacttt gcagggatta ctaatggtgg 4080

ggcagcaggt ctgtgaatta agttatctct tgacctcacc ctcatgtcaa cacaaatgta 4140

attcctaaac aagatgcatt gccagtctct tagccctgta agctgatctt ttgctacatg 4200

gcagactata atgaaaacat ttttatactt gggtttctag tcttcactag aaggccttgg 4260

atgtattttt gcagttgaaa gatttagaaa gatttttacc tgcttataac ttggaagttt 4320

agagtgcaat gtaagaaaaa agatcaagaa atgtcatgtt attagcatca gtccacctcc 4380

aatattgccg atactttttt tattctggct cagttttatt ttgcaccagt gcggccccaa 4440

gttactgctg gttgtattta gtttgtgaat aggagcccat aagtgttaat agactttgta 4500

acattcacta taagatgaat tatacaggac atgggaaatc tcattaagtc ttaaagttaa 4560

tttaaattaa tttatctgtt ttctctaaga aatgtttatc ataaaatata tatgtgtatt 4620

tcccctttgg ttataaaatt tgggaaagta tgtacaagtg cagctgcact gactttaatt 4680

ttctagatgt cttaatgaga tttatttgtt ttagagaaga acatcttgtt aaaagcatca 4740

aactctgtct tacatagctg tcaacagcct ctttaagatg tggtggttgt atgatctgtg 4800

tcttaattgt tcagttagag tgagaagttg acctatgatt catttttaaa ttttatattt 4860

ggaacaaagc tgcaagttat ggtaaagtac tgtactgtga gaagtattat gatatttaat 4920

gcatctgtgg cttaacactt gtgagagtta ccagcttgaa aatgatggtg ttgactacct 4980

cttgaatcac atctatcaac cactggcacc taccaccaag ctggcttcaa ttagtatgtg 5040

ttgctttttg gtattaacaa ctaaccgtac tagagaccaa agtgaaccct gatttttata 5100

tgtctttaat aatggtgttt tatctagtgt ttttaaatta tcctgtgtag tatttagatt 5160

acctcattgt ccattttgac tcatgttgtt tacaagtgaa aataaaaaca cttgaactgt 5220

atgtttttaa aagacaaaaa aggggtagat gtttggaatg cgtttcactc gcatgcagtc 5280

atctggaggg actgaagcac tgtttgcctt tctgtacact ctgggtttta tattctcatt 5340

tcatgcctaa tgtcttattc tgtcaattat ggatatgttg aggtttaaaa aaattacttg 5400

attaaaaata aaacatataa cgttggcatt taaaaaaaaa aaaa 5444

<210> 3

<211> 250

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ala Glu Gly Gly Ala Ser Lys Gly Gly Gly Glu Glu Pro Gly Lys

1 5 10 15

Leu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Glu Ser Gln Val Leu Arg Gly Thr Gly

20 25 30

His Cys Lys Trp Phe Asn Val Arg Met Gly Phe Gly Phe Ile Ser Met

35 40 45

Ile Asn Arg Glu Gly Ser Pro Leu Asp Ile Pro Val Asp Val Phe Val

50 55 60

His Gln Ser Lys Leu Phe Met Glu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Gly

65 70 75 80

Glu Pro Val Glu Phe Thr Phe Lys Lys Ser Ser Lys Gly Leu Glu Ser

85 90 95

Ile Arg Val Thr Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Leu Gly Ser Glu Arg

100 105 110

Arg Pro Lys Gly Lys Thr Leu Gln Lys Arg Lys Pro Lys Gly Asp Arg

115 120 125

Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Ser Leu

130 135 140

Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His Tyr Cys Gln Ser Ile Met His Met

145 150 155 160

Val Ala Asn Cys Pro His Lys Asn Val Ala Gln Pro Pro Ala Ser Ser

165 170 175

Gln Gly Arg Gln Glu Ala Glu Ser Gln Pro Cys Thr Ser Thr Leu Pro

180 185 190

Arg Glu Val Gly Gly Gly His Gly Cys Thr Ser Pro Pro Phe Pro Gln

195 200 205

Glu Ala Arg Ala Glu Ile Ser Glu Arg Ser Gly Arg Ser Pro Gln Glu

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ile Ala Pro Glu Glu Gln Ser Lys Lys

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Gln Lys Arg Lys Lys Thr

245 250

<210> 4

<211> 5517

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

aattgacaaa gtcacgtgtg ctcagggggc cagaaactgg agagaggaga gaaaaaaatc 60

aaaagaagga aagcacatta gaccatgcga gctaaatttg tgatcgcaca aaatcaagat 120

gttagattga tgcagaagat cactccgttc caaagggaaa gttttcatct cacgagtttg 180

gagctgaggg cccgtggggc aacatggccg aaggcggggc tagcaaaggt ggtggagaag 240

agcccgggaa gctgccggag ccggcagagg aggaatccca ggttttgcgc ggaactggcc 300

actgtaagtg gttcaatgtg cgcatgggat ttggattcat ctccatgata aaccgagagg 360

gaagcccctt ggatattcca gtcgatgtat ttgtacacca aagcaaacta ttcatggaag 420

gatttagaag cctaaaagaa ggagaaccag tggaattcac atttaaaaaa tcttccaaag 480

gccttgagtc aatacgggta acaggacctg gtgggagccc ctgtttagga agtgaaagaa 540

gacccaaagg gaagacacta cagaaaagaa aaccaaaggg agatagatgc tacaactgtg 600

gtggccttga tcatcatgct aaggaatgta gtctacctcc tcagccaaag aagtgccatt 660

actgtcagag catcatgcac atggtggcaa actgcccaca taaaaatgtt gcacagccac 720

ccgcgagttc tcagggaaga caggaagcag aatcccagcc atgcacttca actctccctc 780

gagaagtggg aggcgggcat ggctgtacat caccaccgtt tcctcaggag gctagggcag 840

agatctcaga acggtcaggc aggtcacctc aagaagcttc ctccacgaag tcatctatag 900

caccagaaga gcaaagcaaa aaggggcctt cagttcaaaa aaggaaaaag acataacagg 960

tcttcttcat atgttctttc ctttacccgg ttgcaaagtc tacctcatgc aagtataggg 1020

gaacagtatt tcacaagcag tagctgacct gggattttaa ctactattgg ggaactgtga 1080

attttttaaa cagacaaatc actctaagca aattacattt gagcagggtg tcatgtttta 1140

tgttaattca gagaataaga tactatgtct gtcaatatgt gcatgtgtga gagggagaga 1200

gcctgagtct gtgtgtgtac atgaggattt ttatatagga atgtagacac atatataaag 1260

aggctttgtc tttatatatt tgtgtataga tcaaagcaca caccctctct catataattg 1320

gatatttcca agaattgaaa acccatgtga agcattatag atagttttaa atttaaccca 1380

ctggagtttt cttgaaatac cacttctttt atattatata aaactaaaaa cacgactgtt 1440

accttttgtg tgaaccaaag gatacttcag atctcagagc tgccaattat ggggtactaa 1500

aggtttttaa gacatccagt tctcccgaat ttgggattgc ctctttttct tgaaatctct 1560

ggagtagtaa tttttttccc ccttttttga aggcagtacc ttaacttcat atgcctctga 1620

ctgccataag cttttttgat tctgggataa cataactcca gaaaagacaa tgaatgtgta 1680

atttgggccg atatttcact gttttaaatt ctgtgtttaa ttgtaaaatt agatgcctat 1740

taagagaaat gaaggggagg atcatcttag tggcttgttt tcagtagtat tttaatatca 1800

gcttcttgta accttttcca tgttgtgagg gttgtaaggg attgtgtggc aacagcagct 1860

tcccttggct aactcaatct tctacccatt gcttagagca gggagccctc cttatttact 1920

actgaagacc ttagagaact ccaattgttt ggcatatatt tttggtggtg gtttttattc 1980

ctcctggaga gttatctaat ttgtttctaa aacaaacaag cagcaaagaa atgaattaaa 2040

tactggggtt gagaattaaa attaagtgga tgttcacagt tgcccaatat atatgacctg 2100

caaatgatac gaaaaagtgc agcatttagt ggcagttaac aagagtgaca agcctggggc 2160

agaggtacca aacctctccc accagagagc tagaagtatt ttatacagta actttgatct 2220

tatggaagtg accttcaatg cttattctga agtaacctat atggtggata caggatgaac 2280

attcagtgcc agggagaatc ttctcaggtt ggttctcgtt agagtgataa actggctagg 2340

ggccatagta ttggtcctgt taggtttcgg tcatggaaaa aaaaattatt ttggggtcat 2400

cctggctcta gatgttatgg gcaaatttct gaaacatctg caagaaggta ccagttaatt 2460

atagtgctta atattgggaa taagattaag cattataatt ataatgtatg ggcctgttgg 2520

tgtaagctca gataattaaa taaaaatagc atgactcaaa tgagacatat tctgctgaac 2580

agtttctact tcctctcccg cctgtcctgt catgggagac gtgtatagtt gctgctgttt 2640

cagcaaacca ccataagacg aaaatgcctc aggttgggtt gccagtcctt tacaactcag 2700

cttgaatttc acaacagtga ttgtgagaat ctgcgtggta tacactgaaa tatcggtgtg 2760

ctgtgatgca aagcttacct ttgacgatat tgaatgtgat atagctgtag agaagtactt 2820

ccttgcctta tgtgaggatt tcaaacttat ttaaattatg tagacaaatc aaagtggcat 2880

tgcttaattt ttagcaggca taataagcaa gttaacagta aaatgcaaaa catgataagc 2940

gttgctcaat ttttagcagg tataataagc aggttaacag taaaaatgca aaacatgata 3000

gataagtcac tttgaaaatt caaaccaaag ttccttcacc ttatggaaat aggaaattat 3060

ggacttcaaa attggacact tcctgtttac aaaaagaaat tcagagctaa aatcatggta 3120

aaaaaaaata gaaacacttg agaactatgg tctttatggg tgcaatttga aatccttttc 3180

atcatcttac cagactaaac taagagcaca taccaaacct atcttatggt tgaaagttgg 3240

ggtttatttt ttatatgaga atattatcac tattacataa catactcagg acaaagaact 3300

ttgctcaggg aacataccat gtaatatttt tgttgtttct ttacagacta gtctacagtc 3360

ctgcttactc aaaacaaacc aaataactta tacctttata taagtattat gtactgatga 3420

tagtaactac ctctgagttt gacacagatc aaaatttttg aatatcagat atcagttatc 3480

ctatttttat ttcatgtgaa aactcctcta aagcagattc cctcaactct gtgcatatgt 3540

gaatatcact gatgtgaaca cattgttcat ttacataggt aaaatattac tctgtttaca 3600

gcaaaaggct acctcatagt tgatacatag cacacctgta tgtatgctgt tccagcctta 3660

caggtggctg ataattctct ggtacagaac ctttttatct gtattataaa tagcaattca 3720

caactgcatg tttctgacaa acacttgtga ataatgaagc atctcgtttt agttagcaaa 3780

gtctccaaac atttccttaa aataatcatg tatttagttt aaagaattat gggcactgtt 3840

caacttaagc aaaacagaac acggaagcag tcttagaagc accactttgc ccagaggtgg 3900

aggttggaag gggtagcagg gagaggggtt ggtgtatgca ggtattcatg ctaggcaaag 3960

agtttaaaag acgccaatgt ccttcattta ctgtctgtgc tgccctgaag ccaagcgtat 4020

tgcagcatta tagccccagg cacataacta actagcactg gcttgccaag gaatgaacat 4080

gcaatgccat tactagctat tgagggaaaa gggtctgtgt gaagcatcac tttgcaggga 4140

ttactaatgg tggggcagca ggtctgtgaa ttaagttatc tcttgacctc accctcatgt 4200

caacacaaat gtaattccta aacaagatgc attgccagtc tcttagccct gtaagctgat 4260

cttttgctac atggcagact ataatgaaaa catttttata cttgggtttc tagtcttcac 4320

tagaaggcct tggatgtatt tttgcagttg aaagatttag aaagattttt acctgcttat 4380

aacttggaag tttagagtgc aatgtaagaa aaaagatcaa gaaatgtcat gttattagca 4440

tcagtccacc tccaatattg ccgatacttt ttttattctg gctcagtttt attttgcacc 4500

agtgcggccc caagttactg ctggttgtat ttagtttgtg aataggagcc cataagtgtt 4560

aatagacttt gtaacattca ctataagatg aattatacag gacatgggaa atctcattaa 4620

gtcttaaagt taatttaaat taatttatct gttttctcta agaaatgttt atcataaaat 4680

atatatgtgt atttcccctt tggttataaa atttgggaaa gtatgtacaa gtgcagctgc 4740

actgacttta attttctaga tgtcttaatg agatttattt gttttagaga agaacatctt 4800

gttaaaagca tcaaactctg tcttacatag ctgtcaacag cctctttaag atgtggtggt 4860

tgtatgatct gtgtcttaat tgttcagtta gagtgagaag ttgacctatg attcattttt 4920

aaattttata tttggaacaa agctgcaagt tatggtaaag tactgtactg tgagaagtat 4980

tatgatattt aatgcatctg tggcttaaca cttgtgagag ttaccagctt gaaaatgatg 5040

gtgttgacta cctcttgaat cacatctatc aaccactggc acctaccacc aagctggctt 5100

caattagtat gtgttgcttt ttggtattaa caactaaccg tactagagac caaagtgaac 5160

cctgattttt atatgtcttt aataatggtg ttttatctag tgtttttaaa ttatcctgtg 5220

tagtatttag attacctcat tgtccatttt gactcatgtt gtttacaagt gaaaataaaa 5280

acacttgaac tgtatgtttt taaaagacaa aaaaggggta gatgtttgga atgcgtttca 5340

ctcgcatgca gtcatctgga gggactgaag cactgtttgc ctttctgtac actctgggtt 5400

ttatattctc atttcatgcc taatgtctta ttctgtcaat tatggatatg ttgaggttta 5460

aaaaaattac ttgattaaaa ataaaacata taacgttggc atttaaaaaa aaaaaaa 5517

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaaagcaca uuagaccau 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

agguucuuca gaagaggau 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggucagaguc uggaucacc 19

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Ser His Arg Arg Gln Val Leu Gln Lys Arg Met Arg Ser Phe Asn

1 5 10 15

Gln Val Ser Ser Ala Pro

20

<210> 9

<211> 1708

<212> DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400> 9

acgtaggcta tttccattct tttgctatta taaaaatcaa tccaggtata cacatcattt 60

gctgtataag atgcacttat atctctggga taatttccca ggaaagggat tgctaagtca 120

tagagtatat tttaaatttt gagagatttc accaaatttc cctctctaaa tgttgtgccc 180

ccttggtacc cccaccagga atgtatcaaa gtatgggttt atctatagcc tcaccaaaaa 240

attattttaa aactttaaag ctgtatttta acagtgtgtt gtcaaacgtt aggatttttg 300

ccagtttaat agacaaacac aagtttgtca caatttttat gaattattat tatttttttg 360

agatggagtc ttgctctgtc gcccaggctg gaatgcagtg gcgcaatctc ggctcattgc 420

aatctccccc tcccgggttc aagcgatttt cccgcctcag cccccggagt agctgggact 480

acaggcgccc gccaccacgc ccggctaatt tttgtatttt cagtagagac gcggtgtcac 540

catgttggcc agctggtatt gaactcctga tatcaggtga tccacccacc tcggtctccc 600

aaagtgctgg gattacagga gtgacccacc gcgcccagcc aacagttttt atgaatgtta 660

aacttcctgt tcatttctca ttttcctctt ctgtacataa gggagtgctc aatagataca 720

atataatttg ggtgacagtg cttgctttat taacttttga tgttggaaat aatttgtatt 780

tgtgataggt atgtagcagt ctaaaacaaa cttttgtgac tgatttcttt tactatgata 840

aatgcaaaaa atctgtgcca tgtgcagcaa gtcagttctc tgcagaatga tattaatttt 900

tcagtgaaga agcaaaatca tttctaacaa tgattcttgt tatgggttga actgcatccc 960

tccaaaaaga tgttgaagtc ctacccccca gtctctgtaa atgtgtactt aaaaataggg 1020

tccttgtagt taatcaagtt aagatgagat cattagggtg ggtcctaatc tgactggtgt 1080

cctgaaaagg aaaaattggg gcatggggac agataagtag aaagggaaga caatgtgatg 1140

acacaagcag cagccattta caagctaagg aatgcccgag tctaccagaa gccaggagag 1200

aggcttggca cagattctca tcacagtcca gaatcgaccc ggaagccttc agatctgtaa 1260

gacgttacat ttttgttgtt tcagccaccc tagaaagcaa atacaatgct attcaccctg 1320

ttgcccacgc tggcctggaa cttctgtact caagcgatcg gcccatctcg gtctcctaat 1380

gtgccgggat tacaggcatg agccactgca cccggccagc tagttttaat ctttttcttt 1440

ctttcttcca ttttaggaca ggatcgcact gttgcccagg gtggagtgca gtggcgcaat 1500

cttggctcac tgcaacctcc gcccccctgc tggagagatc ctcccacctc agcctcccca 1560

atagctggga ccactggcgc gcagaccacg cccagcgaat tttttgtaga gagccaggtc 1620

gccattttcc acaggctggt gttgaactcc tgggctcaag cgattcgcca cgtcaacctc 1680

tgaagaaggt gctgggatta caagcatg 1708

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgatgcagaa gatcactccg t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatccaagg ggcttccctc t 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttacaagcat gagccaccg 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctcttctcc accacctttg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttgttacagg aagtcccttg cc 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgctatcac ctcccctgtg tg 22

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggagccctcc ttatttact 19

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatcactaat acgactcact ataggggaaa cctaacagga ccaat 45

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttctttggct gaggaggtag 20

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gactacctct tgaatcacat ctatcaacca ctg 33

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agaagattct agagctagcg aattcatggc cgaaggcggg gctagcaaag gtg 53

<210> 21

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agaagattct agagctagcg aattcatgag ccaccgccgc caggttcttc ag 52

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgcagatcct tcgcggccgc ggatcctact tgcatgaggt agactttgca accggg 56

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgataggtac cgagctctta tgagaaagta gccctttttc ctgag 45

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcttacttag atcgcagatc cctcagctcc aaactcgtga gatg 44

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgataggtac cgagctctta cgtaggctat ttccattctt ttgc 44

<210> 26

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcttacttag atcgcagatc gcttgtaatc ccagcacctt cttc 44

<210> 27

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgataggtac cgagctctta caaagtatgg gtttatctat agcctcacc 49

<210> 28

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgataggtac cgagctctta gagtagctgg gactacaggc gcccgccac 49

<210> 29

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cgataggtac cgagctctta tttgtatttg tgataggtat gtagcagtc 49

<210> 30

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgataggtac cgagctctta gggtgggtcc taatctgact ggtgtcctg 49

<210> 31

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cgataggtac cgagctctta agaaagcaaa tacaatgcta ttcaccctg 49

<210> 32

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgataggtac cgagctctta tggagtgcag tggcgcaatc ttggctcac 49

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cgataggtac cgagctctta ggagagatcc tcccacctca gcctcccca 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgataggtac cgagctctta cagaccacgc ccagcgaatt ttttgtaga 49

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgataggtac cgagctctta caggctggtg ttgaactcct gggctcaag 49

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

caccgaaata aactgacctg gcgg 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aaacccgcca ggtcagttta tttc 24

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

caccgaacca ggtttcatca gcccc 25

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aaacggggct gatgaaacct ggttc 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

caccgtgcta tagatgactt cgtgg 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aaacccacga agtcatctat agcac 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ttttgggata attttttagg aaagg 25

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

accaactaac caacataata acacc 25

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tattagggtg ggttttaatt tgatt 25

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

aaaaaaatct ctccaacaaa aaaac 25

Claims

1.一种特异性抑制剂，其特征在于，所述抑制剂特异性地与LIN28B-TST多肽结合，所述LIN28B-TST 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.∶1所示，所述的抑制剂特异性针对 LIN28B-TST的特异表位，所述特异表位的氨基酸序列为∶MSHRRQVLQKRMRSFNQVSSAP。

2.一种权利要求1所述的特异性抑制剂的用途，其特征在于，所述特异性抑制剂用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于（i）肿瘤的诊断或预后判断；（ii）抑制肿瘤细胞生长和增殖；和/或（iii）抑制肿瘤发生。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞选自下组肿瘤的细胞∶肝癌、***、子宫内膜癌、胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胃癌、或其组合。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组∶肝癌、***、子宫内膜癌、胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胃癌、或其组合。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的特异性抑制剂；和药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括下调所述LIN28B-TST 多肽表达量或活性的小分子化合物、和/或核酸。