CN108329105A - 生物炭负载促生菌的生物肥料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物炭负载促生菌的生物肥料及其制备方法，该方法包括以下步骤：S1、菌悬液的制备：所述菌悬液为IAA产生菌的菌悬液；S2、制备生物炭负载促生菌的生物肥料：在步骤S1所得的IAA产生菌的菌悬液中添加生物炭，混合均匀后于25‑35℃恒温震荡4‑8h制成生物炭负载促生菌的生物肥料；所述生物炭与IAA产生菌的菌悬液的质量体积比为1g：2‑3ml。本发明利用生物炭作为IAA产生菌的载体材料，将菌株负载到生物炭材料上，成本低廉，却可以显著提高菌株在土壤中的存活率，延长存活时间，更持久的发挥“促生”和“生防”作用。

Description

生物炭负载促生菌的生物肥料及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物菌剂领域，具体涉及一种基于松木生物炭和两株植物生长促生菌的生物有机肥及其制备方法。
背景技术
近年来，化肥施用量逐年增长，过量施用化肥不仅会使瓜果不甜，菜不香，更严重的是会产生严重的环境污染的问题(沈振月等，2004)。用微生物肥料代替化学肥料，一方面可以减少化肥的用量，促进作物的生长，也可以减少环境污染的问题(沈阿林等，2004)。因此，为了提高农产品品质，保护环境，发展“无公害农业，绿色农业”，研制出能够降低化学肥料，并符合农业可持续发展要求的微生物肥料十分必要。植物生长素(IAA)是一种重要的植物生长激素，利用IAA产生菌研制的微生物肥料能够促进植物生长(Subash et al.,2016)，但是IAA产生菌在土壤中的存活率是保证微生物菌肥肥效的关键，载体材料可以为微生物提供生存空间，同时也能调节土壤理化性质，从而更适应微生物的生长(Hale et al.,2014)。
泥炭和蛭石是一种理想的载体材料，过去曾用泥炭材料作为根际促生菌或者生防菌株的载体，在接菌到载体4-8周后，菌株在载体材料上依旧保持活性(Materon andWeaver,1985；Kishore et al.,2005)。但是，由于泥炭和蛭石这两种资源有限并且不易采集，成本较高，并没有被广泛的应用(Bashan et al.,2002；Herrmann and Lesueur,2013)。其它的载体材料还包括：动物粪便、秸秆、硅藻、脱脂牛奶和生物炭(Stephens and Rask,2000)。动物粪便虽然含有丰富的养分能够为微生物所利用，但同时也携带致病菌和抗生素，对于植物生长会产生不利影响。利用秸秆作为菌株载体，秸秆中的虫卵、带菌体等一些病虫害，在秸秆直接粉碎过程中无法杀死，施用后，病虫害直接发生或者越冬来年发生(刘长跃，2004)。硅藻独特的二氧化硅为主要物质构成的细胞壁能够很好的吸附菌株，但目前国内缺少对硅藻的研究，将其应用于载体材料的研究还是一大难点(马健荣，2010)。脱脂牛奶含有丰富的微生物所需要的养分，但是考虑其成本较高，很难将其应用于农业生产。
与其它载体材料相比，生物炭来源广、制备过程简单，具有较高的孔隙度、比表面积以及能够为微生物提供有效养分等，利用生物炭作为载体材料对于提高微生物菌肥在土壤中的作用效果有着十分重要的意义。同时，高温裂解制备生物炭的过程中也相当于对生物炭进行了灭菌处理，不会引入外源其它的微生物。所以结合生物炭的自身特征，以及对土壤和微生物的有益作用，生物炭可以作为一种理想的IAA产生菌的载体材料。
因此，需要对现有技术进行改进。
参考文献：
Bacillus aryabhattai B8W22参考文献：
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Agrobacterium vitis NBRC 15140参考文献：
Ophel K and Kerr A.1990.Agrobacterium vitis sp.nov.for strains ofAgrobacterium biovar 3from grapevines.International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 40:236-241.
利用控制OD600值来调节每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量参考文献：
Liu YP,Chen L,Zhang N,Li ZF,Zhang GZ,Xu Y,Shen QR,ZhangRF.2016.Molecular Plant-microbe Interactions.29(4):324-330.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生物炭负载促生菌的生物肥料及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明一种生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：所述菌悬液为IAA产生菌的菌悬液；
S2、制备生物炭负载促生菌的生物肥料：在步骤S1所得的IAA产生菌的菌悬液中添加生物炭，混合均匀后于25-35℃恒温震荡4-8h制成生物炭负载促生菌的生物肥料；所述生物炭与IAA产生菌的菌悬液的质量体积比为1g：2-3ml。
作为本发明的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法的改进，所述步骤S2中制备生物炭负载促生菌的生物肥料的方法具体为：
在步骤S1所得的IAA产生菌的菌悬液中按照1g：2.5ml的质量体积比加入生物炭，混合均匀后于30℃恒温震摇6h，将IAA产生菌负载到生物炭上，获得生物炭负载促生菌的生物肥料。
作为本发明的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法的进一步改进，所述步骤S1中菌悬液的制备的方法具体包括以下步骤：
1.1、将IAA产生菌的种子液按0.5-2％的接种量(体积比)接种至LB液体培养基中，于25-35℃，150-200rpm恒温振荡培养箱中培养12-18h，制备获得初始菌悬液；
1.2、将步骤1.1所得初始菌悬液的OD600值调节至0.7-0.9(即，每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量约为5.0*108CFU)；
1.3、将步骤1.2所得初始菌悬液进行清洗后获得菌悬液。
作为本发明的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法的进一步改进，所述步骤1.1中初始菌悬液的具体制备方法为：将IAA产生菌的种子液按1％的接种量(体积比)接种至LB液体培养基中，于30℃，180rpm恒温振荡培养箱中培养16h。
作为本发明的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法的进一步改进，所述步骤1.3中对初始菌悬液进行清洗后获得菌悬液的方法为：
将步骤1.2所得的初始菌悬液于3-5℃，3800-4200rpm离心20-40min后倒掉液体，再用等体积的灭菌后0.85％(质量％)NaCl溶液悬浮菌体，重复进行于3-5℃，3800-4200rpm离心20-40min的清洗两次，之后将洗净的菌体用等体积灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮制备菌悬液。
作为本发明的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法的进一步改进，所述步骤1.3中对初始菌悬液进行清洗后获得菌悬液的具体方法为：将步骤1.2所得的初始菌悬液于4℃，4000rpm离心30min后倒掉液体，再用等体积的灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮菌体，重复进行于4℃，4000rpm离心30min的清洗两次，之后将洗净的菌体用等体积灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮制备菌悬液。
作为本发明的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法的进一步改进，所述IAA产生菌为Agrobacterium vitis NBRC 15140或Bacillus aryabhattai B8W22；所述生物炭为松木生物炭。
本发明还同时提供了利用上述方法制备获得的生物炭负载促生菌的生物肥料。
现有技术中，直接将微生物菌肥施入土壤中，难以保证微生物在土壤中的存活率，从而影响微生物肥料的作用效果。本发明利用生物炭作为IAA产生菌的载体材料，将菌株负载到生物炭材料上，成本低廉，却可以显著提高菌株在土壤中的存活率，延长存活时间，更持久的发挥“促生”和“生防”作用。
与现有技术相比，本发明的技术优势在于：
1、本发明制备的生物肥料生产成本低，操作简单。本发明利用松木高温裂解的生物炭为载体制成产品，价格低廉，来源广泛，负载过程简单易行。
2、本发明菌株负载效果好。以松木生物炭为菌株载体，其营造的微环境可以为微生物提供生存的空间，并为微生物提供有效养分。
本发明制备获得的Agrobacterium vitis菌株负载生物炭材料和Bacillusaryabhattai菌株负载生物炭材料处理土壤的第3天，该土壤中IAA(吲哚乙酸)与仅添加对应菌株处理的土壤中IAA的浓度相比分别增加了8倍和2倍。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为菌株A.vitis-生物炭负载体添加到土壤中后IAA的浓度随时间的变化趋势图；
图2为菌株B.aryabhattai-生物炭负载体添加到土壤中后IAA的浓度随时间的变化趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，利用生物炭作为IAA产生菌的载体材料，将菌株负载到生物炭材料上，可以提高菌株在土壤中的存活率，延长菌株的存活时间。
选用Agrobacterium vitis NBRC 15140；生物炭为松木生物炭，购买自海诺炭业有限公司，为500℃高温裂解的松木生物炭。
该生物肥料的具体制备方法包括以下步骤：
1、菌悬液的制备：制备Agrobacterium vitis的菌悬液。
1.1、将甘油保存的Agrobacterium vitis菌株按1％(体积比)的接种量接种至LB培养基中进行活化，于30℃下180rpm培养16h时间后获得浓度约为1*108CFU/ml的菌株种子液；之后将Agrobacterium vitis的种子液按1％(体积比)的接种量接种至有25ml LB液体培养基的三角瓶中，于30℃，180rpm恒温振荡培养箱中培养16h，得到Agrobacterium vitis的菌悬液，即，初始菌悬液。
LB液体培养基的制备方法如下(此为常规技术)：在每升水中加入蛋白胨10g、酵母膏5g和NaCl 10g，并采用NaOH调节其pH＝7.4～7.6，然后对最终获得的LB液体培养基进行常规的高温高压灭菌即可。
1.2、将步骤1.1中所得的初始菌悬液调节OD＝0.8左右，即，每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量约为5.0*108CFU。
本发明中利用控制OD600值来调节每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量。例如：当调节OD＝0.8左右，该菌悬液含有的菌体数量为5.0*108CFU。
将步骤1.2所得的初始菌悬液于4℃，4000rpm离心30min后倒掉液体，再用等体积的灭菌(常规高温灭菌，1.1个大气压，121℃下灭菌20min)后的0.85％NaCl溶液悬浮菌体，重复进行于4℃，4000rpm离心30min的清洗两次(即于4℃，4000rpm离心30min后倒掉液体，再添加等体积新的灭菌后0.85％NaCl溶液于4℃，4000rpm重复进行离心30min)，之后将洗净的菌体用等体积灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮制备菌悬液，即，获得菌悬液。本发明中，使用灭菌后0.85％NaCl溶液的目的是清洗菌体，去除LB液体培养基的影响。采用0.85％浓度NaCl的原因是防止菌体细胞破裂。
2、载体原料的准备：
将松木生物炭进行高温高压灭菌，本实施例中采用高压蒸汽灭菌，即，于103.4kPa、121℃下灭菌20min，并将灭菌后松木生物炭于100℃下烘干至恒重后密封待用。
3、制备生物炭负载促生菌的生物肥料：
取步骤1.3所得的菌悬液25ml，然后加入10g步骤2所得的松木生物炭载体材料，均匀混合后，于30℃恒温震摇6h，将菌株负载到生物炭上，获得菌株A.vitis-生物炭负载体(即，生物炭负载促生菌的生物肥料)。
在本案例中，也可选用本实验室筛选的IAA产生菌Agrobacterium vitis，经过16S鉴定为葡萄土壤农杆菌属，其与模式菌株Agrobacterium vitis NBRC 15140相似度在99％以上(Ophel and Kerr,1990)，采用该菌株也能达到同样的效果。
实施例2、将实施例1中所采用的菌株由“Agrobacterium vitis”更改为“Bacillusaryabhattai”，其余均等同于实施例1，获得菌株B.aryabhattai-生物炭负载体。
在本案例中，也可选用本实验室筛选的IAA产生菌Bacillus aryabhattai，经过16S鉴定为芽孢杆菌属，与模式菌株Bacillus aryabhattai B8W22相似度在99％以上(Shivaji et al.,2009)，采用该菌株也能达到同样的效果。
对比例1、取消实施例1步骤3)中的“于30℃恒温震摇6h”，其余等同于实施例1。
对比例2、将实施例1步骤3)中的菌悬液用量由25ml改成50ml；其余等同于实施例1。
实验1、菌株A.vitis-生物炭负载体添加到土壤中后对IAA的浓度影响：
1)、分别称取50g风干土到3个培养瓶中，调节含水量到田间持水量的60％，放恒温培养箱25℃预培养7天，使土壤微生物活性稳定。预培养结束后，添加0.05106g色氨酸(即，5mM IAA合成前体物质)到每个培养瓶中，混匀。
2)、预培养结束后，取3.5ml实施例1中所得的菌株A.vitis-生物炭负载体(即，生物炭负载促生菌的生物肥料)至步骤1)预培养结束后含有5mM色氨酸的土壤中，震荡混匀后28℃恒温培养，并于0、3、7和14天取样后在HPLC测定土壤中IAA的浓度，取测定得到3个IAA的浓度的平均值。
以同样的方法做空白(CK)试验，即不添加菌剂和生物炭；以及只添加菌株(菌株A.vitis)的处理(菌剂的量为2.5ml)和只添加生物炭的处理(生物炭的量为1g)，获得对应实验中不同时段IAA的浓度的平均值，如图1所示。
由图1可知，菌株A.vitis-生物炭负载体处理在0-14天土壤中IAA都能检测到，并且在第3天时菌株A.vitis-生物炭负载体处理土壤中IAA的浓度为38mg/kg，比其它处理都高接近7倍浓度，说明生物炭作为菌株载体能迅速促进土壤中IAA产生菌合成IAA。同时，生物炭负载IAA产生菌后其产生IAA的效果能够维持到14天。
将对比例1、对比例2所得载体(即，生物炭负载促生菌的生物肥料)按照实验1所述方法进行检测，所得结果为：
对比例1、在第3天时，土壤中IAA的浓度为10mg/kg。
对比例2、在第3天时，土壤中IAA的浓度为12mg/kg，产生IAA的效果能够维持到第7天。
实验2、菌株B.aryabhattai-生物炭负载体添加到土壤中后对IAA的浓度影响；
采用实施例2所得的菌株B.aryabhattai-生物炭负载体代替实验1中菌株A.vitis-生物炭负载体，并按照实验1所述的方法进行实验。
同样设置空白(CK)试验、只添加菌株(菌株B.aryabhattai)的处理和只添加生物炭的处理，分别按照实验1的步骤进行实验，获得对应实验中不同时段IAA的浓度的平均值，如图2所示。
由图2可知菌株B.aryabhattai-生物炭负载体处理土壤中IAA浓度在0-7天逐步增加到23mg/kg左右，也比其它处理高10mg/kg以上，负载效果明显。
综上，本发明通过将生物炭作为植物生长促生菌的载体，延长促生菌的发挥功能的时间同时提高菌株在土壤中合成吲哚乙酸(即，IAA)的量。本发明通过制备一种成本低、操作便捷的生物炭-菌株负载体作为生物肥料，促进农林废弃物的资源化再利用和菌株的活性。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：所述菌悬液为IAA产生菌的菌悬液；
S2、制备生物炭负载促生菌的生物肥料：在步骤S1所得的IAA产生菌的菌悬液中添加生物炭，混合均匀后于25-35℃恒温震荡4-8h制成生物炭负载促生菌的生物肥料；所述生物炭与IAA产生菌的菌悬液的质量体积比为1g：2-3ml。
2.根据权利要求1所述的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于所述步骤S2为：
在步骤S1所得的IAA产生菌的菌悬液中按照1g：2.5ml的质量体积比加入生物炭，混合均匀后于30℃恒温震摇6h，将IAA产生菌负载到生物炭上，获得生物炭负载促生菌的生物肥料。
3.根据权利要求1或2所述的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于：
所述步骤S1中菌悬液的制备的方法具体包括以下步骤：
1.1、将IAA产生菌的种子液按0.5-2％的接种量接种至LB液体培养基中，于25-35℃，150-200rpm恒温振荡培养箱中培养12-18h，制备获得初始菌悬液；
1.2、将步骤1.1所得初始菌悬液的OD600值调节至0.7-0.9；
1.3、将步骤1.2所得初始菌悬液进行清洗后获得菌悬液。
4.根据权利要求3所述的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于：
所述步骤1.1中初始菌悬液的具体制备方法为：将IAA产生菌的种子液按1％的接种量接种至LB液体培养基中，于30℃，180rpm恒温振荡培养箱中培养16h。
5.根据权利要求4所述的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于：
所述步骤1.3中对初始菌悬液进行清洗后获得菌悬液的方法为：
将步骤1.2所得的初始菌悬液于3-5℃，3800-4200rpm离心20-40min后倒掉液体，再用等体积的灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮菌体，重复进行于3-5℃，3800-4200rpm离心20-40min的清洗两次，之后将洗净的菌体用等体积灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮制备菌悬液。
6.根据权利要求5所述的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于：
所述步骤1.3中对初始菌悬液进行清洗后获得菌悬液的具体方法为：
将步骤1.2所得的初始菌悬液于4℃，4000rpm离心30min后倒掉液体，再用等体积的灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮菌体，重复进行于4℃，4000rpm离心30min的清洗两次，之后将洗净的菌体用等体积的灭菌后0.85％NaCl溶液悬浮制备菌悬液。
7.根据权利要求1-6任一所述的生物炭负载促生菌的生物肥料的制备方法，其特征在于：
所述IAA产生菌为Agrobacterium vitis NBRC 15140或Bacillus aryabhattaiB8W22；
所述生物炭为松木生物炭。
8.利用如权利要求1-7任一所述的方法制备获得的生物炭负载促生菌的生物肥料。
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