CN108303480A - 一种甘松活性成分的定量检测方法及甘松活性成分与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种甘松活性成分的定量检测方法，包括采用超高效液相色谱法测定甘松新酮含量的步骤，该方法还包括了采用超高效液相色谱法测定去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松香酮H与(‑)‑马兜铃酮含量的步骤，特异性高、稳定性好、重现性高、分析效率高。甘松甲醇提取物与定量的六种成分均具有不同程度的5‑羟色胺转运体(SERT)增强或抑制活性，可在制备用于抗抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性等疾病的药物方面进行应用、以及药物成瘾性和消化***功能紊乱等疾病的治疗药物制备方面进行应用，具有重要的药物开发价值。

Description

一种甘松活性成分的定量检测方法及甘松活性成分与应用
技术领域
本发明涉及中药检测分析领域，尤其是一种甘松活性成分的定量检测方法及甘松活性成分与应用。
背景技术
甘松(Nardostachys chinensis Batal.)是败酱科甘松属植物，具有理气止痛，开郁醒脾；外用祛湿消肿的功效，在中医，印度阿育吠陀和尤纳尼医学体系广泛运用于治疗胃肠消化道及神经精神类疾病。甘松已经报道的生物活性包括(1)作用于神经***，如抗抑郁、镇静和抗惊厥、抗帕金森和记忆恢复；(2)作用于心血管***，如降血压、抗心律失常、抗心肌缺血、抗心血管损伤；(3)作用于呼吸***，如增强耐缺氧能力；(4)抑菌；(5)抗肝损伤等。植物化学研究表明其化学成分主要为甘松新酮型倍半萜、马兜铃烷型倍半萜和愈创木烷型倍半萜，以及其它类型萜类化合物。此外，还含有木脂素、黄酮等其他化学成分。
2015年版中国药典仅对于甘松中甘松新酮的含量进行定量检测，而对于蒙花苷等其他主要成分未做含量检测。为了进一步保证甘松的内在质量，本发明在甘松新酮含量的基础上增加了高效液相色谱法测定去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量，使甘松的质量控制的指标更加全面。
SERT属于Na+/Cl-依赖型转运蛋白,主要位于5-HT能神经元。SERT从神经突触间隙中重新摄取5-HT进入突触前神经元，直接影响突触间隙5-HT浓度，改变突触后受体介导信号的量和作用持续时间。此外，发现SERT在胎盘组织、骨髓、肾、肺、心、肾上腺、肝、甲状旁腺、甲状腺、胰腺和小肠等器官亦有分布，与情绪、食欲、睡眠、记忆、学习等许多生理心理功能相关。SERT及5-HT表达改变可引起焦虑、抑郁、强迫症、恐惧症，甚至精神***症，并与药物成瘾性密切相关。此外，发现SERT在胃肠道功能性疾病中扮演了重要角色，如临床上慢传输性便秘、肠道易激综合征、功能性腹胀等胃肠功能性疾病，采用针对SERT的抗抑郁药、抗焦虑药物取得了疗效。
SERT是临床药物研发的重要靶点。基于SERT靶点的经典抗抑郁药多属于选择性SERT抑制剂(SSRI)，如氟西汀(Fluoxetine)等；5-羟色胺再摄取促进剂(SSRE)则少有报道，至今已报道SSRE有噻奈普汀(tianeptine)，别名达体朗(stablon)，其化学结构属三环类抗抑郁药，临床主要用于抗抑郁和抗焦虑。实验研究发现噻奈普汀可促进5-HT再摄取，在神经结构可塑性方面，噻奈普汀对应激/皮质酮诱导的海马神经元树突萎缩具有预防作用，能够对抗应激诱发的海马前体细胞增殖、海马体积下降和N-乙酰天冬氨酸浓度下降，并防止杏仁核树突过度增生。在神经兴奋性方面，噻奈普汀能够克服应激阻断海马长时程增强作用，逆转应激对海马-前皮层突触的抑制作用等。在神经保护方面，噻奈普汀能够降低海马和颞叶皮层的细胞凋亡。在记忆功能方面，噻奈普汀对应激诱导空间记忆损害具有阻断作用，增加记忆保留，有助于注意力集中行为，拮抗酒精的有害作用等(McEwen BS,OlieJP.2005.Neurobiology of mood,anxiety,and emotions as revealed by studies of aunique antidepressant:tianeptine.Molecular Psychiatry 10,525–537)。此外，噻奈普汀能使中枢5-HT代谢物5-羟吲哚乙酸升高，推断可能由于突触前膜再摄取-5-HT增加后，神经内5-HT分解代谢相应增高有关；噻奈普汀可作用于下丘脑-垂体-肾上腺轴,使下丘脑皮质激素释放因子及垂体前叶肾上腺皮质激素浓度下降。
噻奈普汀对重度抑郁症有效，对抑郁症长期疗效优于氟西汀，且安全性高，不良反应少，适合于老年抑郁症，抗焦虑效果优于氟西汀(胡萌，李臻.2007.噻奈普汀药理研究和临床应用进展.广东医学28(7)：1192-1193.)噻奈普汀对人体的作用特点包括：对心境紊乱有一定作用，介于镇静性抗抑郁药和兴奋性抗抑郁药之间；对躯体不适，尤其是对于焦虑和心境紊乱有关的胃肠不适有明显作用；对酒精中毒病人在戒酒期间出现的人格和行为紊乱有一定作用；而且，噻奈普汀对下列方面无不良作用：睡眠和警觉；心血管***；胆碱能***(无抗胆碱能症状)；药物成瘾。以上研究提示了5-羟色胺再摄取促进剂(SSRE)在临床应用中的特点和优势。
专利申请201510749938.8、201510629121.7、201510037564.7公开了去氧甘松香醇A、甘松新酮、甘松香酮H和异甘松新酮，这些甘松提取物具有显著的5-羟色胺转运体(SERT)增强活性，同时蒙花苷和(-)-马兜铃酮也具有不同程度的5-羟色胺转运体(SERT)增强活性。这些发现提高了甘松在制备抗抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性疾病、药物成瘾性和消化***功能紊乱等疾病的治疗药物方面的应用价值，使甘松在靶向SERT相关疾病防治方面的质量控制的指标更加完善。因此，对于甘松活性成分的定量检测方法是非常必要和重要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种甘松活性成分的定量检测方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种甘松活性成分。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种甘松活性成分的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种甘松活性成分的定量检测方法，包括如下步骤：
(a)混合标准对照品溶液的制备：取去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮，精密称定，加甲醇溶解，配制成去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的混合标准对照品溶液，即得；
(b)供试品溶液的制备：取甘松粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇称定重量，浸泡，超声处理，放冷后滤过，用甲醇补足减失的重量，量取续滤液，摇匀，即得；
(c)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为A流动相，以0.05％甲酸水为B流动相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为10-95：90-5，进行线性梯度洗脱；柱温35-45℃；流速0.2-0.4mL/min；进样量3μL，检测波长280nm，理论板数按甘松新酮峰计算应不低于5000；
(d)色谱峰测定：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各3μL，注入超高效液相色谱仪，计算同一保留时间下的峰面积，代入标准曲线方程，即计算出去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量。
优选的，上述甘松活性成分的定量检测方法，所述步骤(a)混合标准对照品溶液的制备中，去氧甘松香醇A浓度为21-1394μg/mL、蒙花苷浓度为17-1142μg/mL、异甘松新酮浓度为17-1097μg/mL、甘松新酮浓度为122-7820μg/mL、甘松香酮H浓度为82-5250μg/mL、(-)-马兜铃酮浓度为41-2632μg/mL。
优选的，上述甘松活性成分的定量检测方法，所述步骤(b)供试品溶液的制备中，甘松粉末过40目筛；所用甲醇为20倍于甘松样品的重量；超声处理的功率300-600W，频率为40-60kHz，处理时间为120-180min。
优选的，上述甘松活性成分的定量检测方法，所述步骤(c)的色谱条件为，所述填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶桥式亚乙基杂化颗粒，所述流动相A相为乙腈，所述流动相B相为0.05％甲酸水，其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：0min→13min→21min→26min，流动相A所占的体积比为：10％→40％→50％→95％，流动相B所占的体积比为：90％→60％→50％→5％；流速0.3mL/min；柱温40℃。
优选的，上述甘松活性成分的定量检测方法，所述步骤(d)中具体测定法为：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各3μL，注入超高效液相色谱仪，计算同一保留时间下的峰面积，代入标准曲线方程，即计算出去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量；甘松样品中，去氧甘松香醇A的含量范围为0.15-0.55mg/g、蒙花苷的含量范围为0.05-0.58mg/g、异甘松新酮的含量范围为0.06-0.47mg/g、甘松新酮的含量范围为1.18-20.01mg/g、甘松香酮H的含量范围为1.73-8.59mg/g、(-)-马兜铃酮的含量范围为2.23-8.07mg/g。
优选的，上述甘松活性成分的定量检测方法，所述标准曲线方程的绘制：将上述制备的混合标准对照品溶液稀释0、2、4、8、16、32、64倍，分别注入工作状态的UPLC***，进样为3μL，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。做出标准曲线方程：y＝f(x)，r值评价其线性关系是否良好。
上述的去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮化合物中，除去氧甘松香醇A、异甘松新酮、甘松新酮及甘松香酮H具有不同程度的5-羟色胺转运体(SERT)增强或抑制活性外，蒙花苷和(-)-马兜铃酮也具有不同程度的5-羟色胺转运体(SERT)增强或抑制活性；详细SERT活性数据见具体实施方式部分表11和表12。
上述去氧甘松香醇A活性成分的制备方法为：甘松药材饮片购自安徽济人药业有限公司(批号：110709，规格：1kg/袋，产地：四川)，约20kg。甘松根茎20kg用70％(v/v)乙醇浸提3次，每次48小时，合并提取液，减压浓缩，得粗提物浸膏3kg；然后用70％乙醇热提上述药渣3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，得粗提物浸膏400g；合并两次粗提物得总浸膏3.4kg；所得粗提物总浸膏，经水分散后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，水层经70％乙醇醇沉，所得上清液浓缩回收成浸膏并与正丁醇萃取物合并，再通过D101大孔吸附树脂柱乙醇-水(水、30％、50％、70％和95％)梯度洗脱。95％乙醇洗脱部位合并入乙酸乙酯萃取物得乙酸乙酯部位。将乙酸乙酯部位(1.2kg)经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇＝100:0-0:100溶剂***梯度洗脱，其中，所述100：0指100％二氯甲烷洗脱情况，0：100指100％甲醇洗脱情况，得15个流份Fr.1-15；二氯甲烷-甲醇＝100:5-100:7溶剂洗脱流份—流份Fr.9(40g)经反复硅胶柱层析，100％乙酸乙酯洗脱，分离得到去氧甘松香醇A。
经测定，去氧甘松香醇A(desoxo-narchinol A)，黄色油状物质(甲醇)，C12H16O2。254nm紫外灯下有暗斑，365nm紫外灯下无荧光，10％硫酸乙醇显红色。V(MeOH)λmax:333、228、204nm；CD(c 0.38,MeOH)λ(Δε):257(-4.53)、219(+6.73)nm。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH：7.04(1H,dd,J＝10.0,6.0Hz,H-7),6.77(1H,t,J＝4.0Hz,H-1),6.00(1H,d,J＝10.0Hz,H-8),2.28(1H,m,H-4),2.20(2H,m,H-3),1.44(2H,m,H-2),0.87(3H,d,J＝6.8Hz,H-12),0.84(3H,s,H-11),5.19(1H,d,J＝5.3Hz,-OH),3.93(1H,br s,H-6)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC：186.6(C-9),148.4(C-8),139.5(C-10),137.5(C-7),128.7(C-1),66.7(C-6),41.5(C-5),30.2(C-4),25.6(C-2),25.3(C-3),19.5(C-11),14.9(C-12)。所述去氧甘松香醇A属甘松新酮型倍半萜6-位降解产物，母核上6-位羟基可被取代基酰化、酚醚化、酰胺化成酯、酚醚或含氮化合物。结构式如下：
该去氧甘松香醇A具有促进5-羟色胺转运体(SERT)活性，可作为治疗抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性疾病、药物成瘾性等神经***疾病以及慢传输性便秘、肠道易激综合征、和功能性腹胀等消化***功能紊乱疾病的治疗药物，具有重要的药物开发价值。
上述甘松甲醇提取物，具有5-羟色胺转运体(SERT)增强活性，在制备抗抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性疾病、药物成瘾性和消化***功能紊乱等疾病的治疗药物方面的应用。
上述的蒙花苷和(-)-马兜铃酮在制备促进5-羟色胺转运体(SERT)活性药物方面的应用。
上述的蒙花苷和(-)-马兜铃酮在制备抗抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性疾病、药物成瘾性和消化***功能紊乱等疾病的治疗药物方面的应用。
具有上述甘松甲醇提取物的药物组合物，包含治疗和/或预防有效量的上述化合物以及任选的药学可接受的赋形剂。
具有上述六种化合物的药物组合物，包含治疗和/或预防有效量的六种化合物以及任选的药学可接受的赋形剂。
上述药学可接受的赋形剂可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂，特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态，用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等，必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
上述药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射乳剂、注射用无菌粉针等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的有益效果是：
上述甘松活性成分的定量检测方法，通过超高效液相色谱结合SERT活性检测同时对甘松中去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量进行测定，进一步提高甘松相关应用的质量控制标准，使甘松的质量控制体系更加完善与科学。其中，
1.在甘松新酮含量检测的基础上增加了超高效液相色谱法测定去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量，使甘松的质量控制的指标更加全面，提高其在靶向SERT相关疾病防治方面的应用。
2.通过特定方法条件所建立的超高效液相色谱法的精密度(RSD％<1.76％)、稳定性(RSD％<2.25％)、重现性(RSD％<2.71％)，在97.43％-103.97％范围，加回收良好；该实验结果，表明该检测方法具有操作简便，准确度高，稳定性好的优点。
3.进一步发现，甘松(Nardostachys chinensis Batal.)的根茎提取物及其主要成分，具有调节(抑制或增强)5-羟色胺转运体(SERT)的活性，可作为抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性疾病、药物成瘾性和消化***功能紊乱等疾病的治疗药物，具有重要的药物开发价值。
附图说明
图1为供试品(甘松)的超高效液相色谱图：其中1-去氧甘松香醇A；2-蒙花苷；3-异甘松新酮；4-甘松新酮；5-甘松香酮H；6-(-)-马兜铃酮；
图2为混合标准对照品的超高效液相色谱图：其中1-去氧甘松香醇A；2-蒙花苷；3-异甘松新酮；4-甘松新酮；5-甘松香酮H；6-(-)-马兜铃酮。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附近图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
试验中所使用到的材料说明如下：
甘松药材样品批次及购置地区情况：S1(甘肃兰州),S2(贵州贵阳),S3(河北，批次10410101),S4(河北，批次20100601),S5(河南开封),S6(内蒙古自治区呼和浩特),S7(四川阿坝地区阿),S8(天津利平药店),S9(天津北塘药店),S10(北京同仁堂)和S11(中国食品药品检定研究院)；方法学考察样品批号S10(北京同仁堂)。
实验仪器与试剂：Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，PDA检测器。
实施例1
测定甘松中去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量
1、仪器与试剂
仪器：Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，PDA检测器，药理实验仪器。
试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品：蒙花苷购买于天津一方科技有限公司(产品批号：AW366B)，纯度>98％；去氧甘松香醇A、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H、(-)马兜铃酮均由本课题组分离制备得到，经HPLC分析测试其纯度均>95％。
2、色谱条件的选择：
色谱柱：ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)；流动相：乙腈为A流动相，0.05％甲酸水为B流动相；
本发明采用梯度洗脱方法，流动相为乙腈-0.05％甲酸水；梯度洗脱：0min→13min→21min→26min，乙腈10％→40％→50％→95％；柱温40℃；流速0.3mL/min；进样体积3μL；光电二极管矩阵(PDA)检测器，检测波长280nm。
3、线性范围的考察
标准对照品溶液的制备：取去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H与(-)-马兜铃酮适量，精密称定，加甲醇配制成每1mL含有去氧甘松香醇A 1.394mg、蒙花苷1.142mg、异甘松新酮1.097mg、甘松新酮7.820mg、甘松香酮H 5.250mg和(-)-马兜铃酮2.632mg的混合溶液，即得。
测定：将混合标准对照品溶液稀释0、2、4、8、16、32、64倍，分别注入液相色谱仪(图1、图2)，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。回归方程：去氧甘松香醇A：y＝12837x+1946.1，r＝0.9999，对照品在1.21-77.44μg/mL线性关系良好；蒙花苷：y＝11324x+1272.9，r＝1，对照品在0.99-63.44μg/mL线性关系良好；异甘松新酮：y＝6948x+2680.5，r＝0.9999，对照品在0.95-60.94μg/mL线性关系良好；甘松新酮：y＝1884.7x+34557，r＝0.9999，对照品在61.09-3910.00μg/mL线性关系良好；甘松香酮H：y＝2794.4x+106893，r＝0.9998，对照品在82.03-5250.00μg/mL线性关系良好；(-)-马兜铃酮：y＝3462.5x+28628，r＝1，对照品在41.12-2631.67μg/mL线性关系良好。
4、供试品溶液的制备：取甘松粉末(过40目筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)120min，放冷，再称定重量，滤过，取续滤液，用甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。
5、精密度试验
取甘松药材粉末适量，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样3μL，重复进样6次，测定去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H和(-)-马兜铃酮的峰面积，结果见表1。
表1为精密度实验结果
以上实验结果表明，所用液相色谱仪的精密度良好。
6、稳定性试验
取甘松药材粉末适量，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、14、24h的时间间隔，精密吸取3μL，注入液相色谱仪，测定去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H和(-)-马兜铃酮的峰面积，结果见表2。
表2为稳定性试验结果
实验结果表明，供试品溶液在24小时内相对偏差分别为1.36％、1.60％、1.49％、0.91％、0.21％、2.25％，说明供试品溶液在24小时内测定，结果保持稳定。
7、重现性试验
平行精密称取6份甘松药材，分别按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测得各定量成分的峰面积，计算其RSD(％)值，考察该方法的重现性。结果见表3。
表3为重现性实验结果
以上实验结果表明，方法重现性好。
8、加样回收率试验
取已知含量的甘松样品约0.1g，精密称定5份，加入与样品中各成分含有量相当的去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定峰面积并计算回收率值；取已知含量的甘松样品约0.25g，精密称定1份，加入与样品中各成分含有量相当的(-)-马兜铃酮对照品的溶液，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定峰面积并计算回收率值。结果见表4、表5、表6、表7、表8、表9。
表4去氧甘松香醇A加样回收率实验结果
表5蒙花苷加样回收率实验结果
表6异甘松新酮加样回收率实验结果
表7甘松新酮加样回收率实验结果
表8甘松香酮H加样回收率实验结果
表9(-)-马兜铃酮加样回收率实验结果
实验结果表明：回收率在97.43％-103.97％之间，加样回收良好。
9、样品测定
按照上述发明内容的方法(第2-4部分，第2部分为液相条件，第3部分为标曲的制定，第4部分是药材供试品的制备方法)测定11批甘松药材中去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H和(-)-马兜铃酮的峰的含量，测定结果见表10。
表10甘松11批药材含量测定结果
根据以上测定结果，所测得11批甘松中去氧甘松香醇A的波动范围为0.15-0.55mg/g、蒙花苷的波动范围为0.05-0.58mg/g、异甘松新酮的波动范围为0.06-0.47mg/g、甘松新酮的波动范围为1.18-20.01mg/g、甘松香酮H的波动范围为1.73-8.59mg/g、(-)-马兜铃酮的波动范围为2.23-8.07mg/g。为避免样品采收、样品存储和操作等因素造成的含量波动，所用甘松药材样品中去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H和(-)-马兜铃酮的含量应控制在以上测定含量的80％-120％限度以内(80％-120％限度是药典或通常含量测定的方法的标准要求，上述含量测定的80％-120％以内对应的波动范围分别为：去氧甘松香醇A的波动范围为0.12-0.66mg/g、蒙花苷的波动范围为0.04-0.696mg/g、异甘松新酮的波动范围为0.048-0.564mg/g、甘松新酮的波动范围为0.944-24.01mg/g、甘松香酮H的波动范围为1.384-10.308mg/g、(-)-马兜铃酮的波动范围为1.784-9.684mg/g)。
实施例2
考察甘松甲醇提取物及其定量成分对5-羟色胺转运体(SERT)的影响
采用稳定转染的hSERT-HEK293细胞株，以4-(4-(dimethylamino)phenyl)-1-methylpyridinium(APP+)为荧光底物，在高内涵***上检测化合物双甘松烯酮A对SERT活性的影响。
1、实验仪器与试剂
实验仪器：高内涵Operetta***和Columbus数据管理和分析***(PerkinElmer),超净台，移液枪(1000μL,200μL,20μL,10μL,2.5μL，美国Eppendorf公司)
试剂和材料：人胚肾细胞系HEK293(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，hSERT pcDNA3质粒(Addgene,plasmid 15483),MEM培养基(Gibco),APP+(Sigma)，Hoechst33342(Cell Signaling Technology)，96孔板(Costar 3605)
2、实验操作过程
首先建立并鉴定了稳定表达hSERT-HEK293细胞株。以APP+为荧光底物，基于高内涵***检测SERT的功能{刘艳庭,应树松,武艺静,董鹏志,吴红华,徐砚通.一种改良的5-羟色胺转运体活性化合物高内涵筛选方法[J].天津中医药大学学报,2016,35(03):180-186.}
具体步骤：
(a)精密称取实施例1所得甘松提取物(S10批次)用DMSO配制成72mg/ml的母液，甘松定量成分用DMSO配制成20mM的母液，用无酚红MEM基础培基稀释药物至10.0μM，1.0μM，0.1μM。
(b)按1.0×104细胞/孔的密度接种稳定转染的hSERT-HEK293细胞至96孔板中，在37℃，5％CO2条件下培养24h。
(c)实验设立空白对照组，阳性对照2.0μM氟西汀组和1.0μM噻奈普汀组，测试药物甘松浸膏设立72.0μg/ml，7.2μg/ml，0.72μg/ml组，甘松定量成分分别设立10.0μM，1.0μM，0.1μM组。细胞弃去培养基，用PBS缓冲液洗2遍，按照80μL/孔体积加入各待测样品，每个浓度3个复孔，在37℃，5％CO2条件下避光孵育2-3h。
(4)孵育完成后，每孔加入20μL APP+，孵育10分钟。
(5)弃去孔内的液体，用PBS缓冲液洗2遍，每孔加入1.0μg/mL Hoechst50μL，避光孵育20min。
(6)弃去孔板内的液体，PBS洗2-3遍，采用高内涵***检测细胞内的荧光强度：
激发光波长(Hoechst 33342 Excitation)：360-400nm，发射光波长(Emission)：410-480nm
激发光波长(APP+Excitation)：460-490nm，发射光波长
(Emission)：505-550nm。
3)数据分析：
采用Columbus数据管理和分析***进行图像分析，根据Hoechst 33342荧光识别细胞核方式来确定细胞，根据胞内APP+荧光强度来确定SERT转运活性，计算相对荧光强度＝(药物组的胞内APP+荧光强度/对照组的胞内APP+荧光强度)进行单因素方差分析(OneWay ANOVA)。
4)实验结果
表11 甘松提取物SERT活性测定结果
*,p<0.05；***,p<0.001
表12 甘松6个定量成分的SERT活性测定结果
*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001
综上可知，所述5-羟色胺转运体(SERT)是一种对5-HT有高度亲和力的Na+/Cl-依赖型转跨膜转运蛋白，在中枢神经***主要位于5-HT能神经元，通过从神经突触间隙中重新摄取5-HT进入突触前神经元，直接影响突触间隙5-HT浓度，改变突触后受体介导信号的量和作用持续时间，从而参与多种生理心理功能(如情绪、食欲、睡眠、记忆、学习等)；在消化***SERT主要位于肠粘膜上皮细胞，重新摄取肠道黏膜层嗜铬细胞释放的5-HT来调节胃肠功能，此外，在胎盘组织、生殖道、骨髓、肾、肺、心、肾上腺、肝、甲状旁腺、甲状腺和胰腺等器官均有分布，提示SERT参与多种生理功能。
SERT是临床药物研发的重要靶点，至今报道的5-羟色胺再摄取促进剂(SSRE)有噻奈普汀(tianeptine)，临床主要用于抗抑郁和抗焦虑。噻奈普汀对人体的作用特点包括：对心境紊乱有一定作用，介于镇静性抗抑郁药和兴奋性抗抑郁药之间；对躯体不适，尤其是对于焦虑和心境紊乱有关的胃肠不适有明显作用；对酒精中毒病人在戒酒期间出现的人格和行为紊乱有一定作用；而且，噻奈普汀对下列方面无不良作用：睡眠和警觉；心血管***；胆碱能***(无抗胆碱能症状)；药物成瘾。噻奈普汀属于一种SSRE，其作用特点提示了5-羟色胺再摄取促进剂(SSRE)在临床应用中的特点和优势。
实施例3
制备方法：按上述比例将甘松提取物或定量成分、乳糖和淀粉均匀混合，过200目筛，用水均匀润湿，把润湿后的混合物干燥再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量为10mg。
实施例4
胶囊剂：甘松提取物或定量成分 20mg
半乳糖 188mg
硬脂酸镁 2mg
制备方法：按上述比例将甘松提取物或定量成分与半乳糖均匀混合，过200目筛，把得到的混合物，加入硬脂酸镁，装入2号胶囊，即得。
上述参照具体实施方式对该一种甘松活性成分的定量检测方法及甘松活性成分与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甘松活性成分的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(a)混合标准对照品溶液的制备：取去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮，精密称定，加甲醇溶解，配制成去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的混合标准对照品溶液，即得；
(b)供试品溶液的制备：取甘松粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇称定重量，浸泡，超声处理，放冷后滤过，用甲醇补足减失的重量，量取续滤液，摇匀，即得；
(c)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为A流动相，以0.05％甲酸水为B流动相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为10-95：90-5，进行线性梯度洗脱；柱温35-45℃；流速0.2-0.4mL/min；进样量3μL，检测波长280nm，理论板数按甘松新酮峰计算应不低于5000；
(d)色谱峰测定：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各3μL，注入超高效液相色谱仪，计算同一保留时间下的峰面积，代入标准曲线方程，即计算出去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量。
2.根据权利要求1所述的甘松活性成分的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(a)混合标准对照品溶液的制备中，去氧甘松香醇A浓度为21-1394μg/mL、蒙花苷浓度为17-1142μg/mL、异甘松新酮浓度为17-1097μg/mL、甘松新酮浓度为122-7820μg/mL、甘松香酮H浓度为82-5250μg/mL、(-)-马兜铃酮浓度为41-2632μg/mL。
3.根据权利要求1所述的甘松活性成分的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(b)供试品溶液的制备中，甘松粉末过40目筛；所用甲醇为20倍于甘松样品的重量；超声处理的功率300-600W，频率为40-60kHz，处理时间为120-180min。
4.根据权利要求1所述的甘松活性成分的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(c)的色谱条件为：所述填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶桥式亚乙基杂化颗粒，所述流动相A相为乙腈，所述流动相B相为0.05％甲酸水，其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：0min→13min→21min→26min，流动相A所占的体积比为：10％→40％→50％→95％，流动相B所占的体积比为：90％→60％→50％→5％；流速0.3mL/min；柱温40℃。
5.根据权利要求1所述的甘松活性成分的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(d)中具体测定法为：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各3μL，注入超高效液相色谱仪，计算同一保留时间下的峰面积，代入标准曲线方程，即计算出去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮的含量；甘松样品中，去氧甘松香醇A的含量范围为0.15-0.55mg/g、蒙花苷的含量范围为0.05-0.58mg/g、异甘松新酮的含量范围为0.06-0.47mg/g、甘松新酮的含量范围为1.18-20.01mg/g、甘松香酮H的含量范围为1.73-8.59mg/g、(-)-马兜铃酮的含量范围为2.23-8.07mg/g。
6.根据权利要求1所述的甘松活性成分的定量检测方法，其特征在于：所述标准曲线方程的绘制：将上述制备的混合标准对照品溶液稀释0、2、4、8、16、32、64倍，分别注入工作状态的UPLC***，进样为3μL，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。做出标准曲线方程：y＝f(x)，r值评价其线性关系是否良好。
7.权利要求1所述定量检测方法中甘松活性成分的应用，其特征在于：所述去氧甘松香醇A、蒙花苷、异甘松新酮、甘松新酮、甘松香酮H及(-)-马兜铃酮在制备5-羟色胺转运体活性调节剂方面的应用。
8.根据权利要求7所述的甘松活性成分的应用，其特征在于：所述5-羟色胺转运体活性调节剂为用于治疗抑郁症、焦虑症、精神***症、强迫症、神经退行性疾病、药物成瘾性神经***疾病的药物以及用于治疗消化***功能紊乱疾病的药物。
9.一种具有5-羟色胺转运体活性调节作用的药物组合物，其特征在于：包含治疗和/或预防有效量的权利要求7所述甘松活性成分以及任选的药学可接受的赋形剂。
10.一种甘松活性成分，其特征在于：为去氧甘松香醇A，具有(Ⅰ)所示结构式，
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