CN108289931B - 4’-取代的核苷逆转录酶抑制剂及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的4’‑取代的核苷衍生物及其在抑制HIV逆转录酶、预防HIV感染、治疗HIV感染和预防、治疗和延迟AIDS和/或ARC发作或进展中的用途。本发明还提供了制备式(I)的4’‑取代的核苷衍生物及其衍生物的方法。

Description

4’-取代的核苷逆转录酶抑制剂及其制备
背景技术
命名为人免疫缺陷病毒(HIV)(尤其称为1型HIV(HIV-1)和2型HIV(HIV-2)的株系)的逆转录病毒已与称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的免疫抑制疾病病因学关联。HIV血清阳性的个体最初无症状，但通常发展AIDS相关症候群(ARC)，随后是AIDS。受影响的个体展现严重免疫抑制，这使其对致虚弱和最终致命的机会性感染高度易感。由宿主细胞复制HIV需要将病毒基因组整合至宿主细胞的DNA中。由于HIV为逆转录病毒，所以HIV复制周期需要经由称为逆转录酶(RT)的酶将病毒RNA基因组转录成DNA。
逆转录酶具有三种已知酶促功能：所述酶充当RNA依赖性DNA聚合酶、核糖核酸酶和DNA依赖性DNA聚合酶。在其作为RNA依赖性DNA聚合酶的作用中，RT转录病毒RNA的单链DNA拷贝。作为核糖核酸酶，RT破坏初始病毒RNA且使刚刚由初始RNA产生的DNA游离。且作为DNA依赖性DNA聚合酶，RT使用第一DNA链作为模板产生第二互补DNA链。两条链形成双链DNA，其通过整合酶整合至宿主细胞的基因组中。
已知抑制HIV RT的酶促功能的化合物将抑制受感染细胞中的HIV复制。这些化合物可用于预防或治疗人中的HIV感染。批准用于治疗HIV感染和AIDS的化合物是核苷RT抑制剂(NRTI)，诸如3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)、2',3'-双脱氧肌苷(ddI)、2',3'-双脱氧胞苷(ddC)、d4T、3TC、阿巴卡韦(abacavir)、恩曲他滨(emtricitabine)和富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)，以及非核苷RT抑制剂(nNRTI)，诸如奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)和依法韦仑(efavirenz)。
尽管前述药物中的每一种都有效治疗HIV感染和AIDS，但仍需要开发额外的HIV抗病毒药物，包括额外的RT抑制剂。具体问题是产生对已知抑制剂耐药的突变HIV株系。使用抗逆转录病毒治疗AIDS通常导致病毒对抑制剂较不敏感。该耐药性通常是pol基因的逆转录酶区段中产生突变的结果。继续使用抗病毒化合物预防HIV感染将不可避免地导致出现新耐药的HIV株系。因此，持续需要有效针对突变HIV株系的新RT抑制剂。
此外，需要用于制备核苷RT抑制剂的新途径，特别是用于制备需要支持动物毒理学研究和随后的人类临床试验的多千克量的药物。例如，获得4’-取代的核苷衍生物4′-乙炔基-2-氟-2′-脱氧腺苷(EFdA)的若干途径
Figure BDA0001647981110000021
已经出现于文献中，包括公开于2011和2015年的Organic Letters的两篇报道(Kuwahara et al.,Org.Lett.2011,13,5264和Kuwahara/Ohrui et al.,Org.Lett.2015,17,828)。已经报道了EFdA提供针对野生型和多药耐药HIV-1株系的有效的抗病毒活性。公开的获得EFdA的途径具有关于产生需要用于进一步研究的多千克量的药物方面的缺陷。具体地，某些公开的途径使用手性起始物质(R)-甘油醛丙酮化合物，其不易于大规模获得且也倾向于立体化学缺失(erosion)。此外，公开的途径缺乏有效数目的晶体中间体以能够进行纯度控制而不借助于色谱纯化。公开的途径还使用有害的或不实用的试剂，且合成方法由于所述试剂的毒性或方法的有害性而并未优化以用于大规模实施。
发明内容
本发明涉及4’-取代的核苷衍生物将其在抑制HIV逆转录酶、预防HIV感染、治疗HIV感染以及预防、治疗和延迟AIDS和/或ARC发作或进展中的用途。
本发明还提供了制备4′-乙炔基-2′-脱氧核糖核苷诸如EFdA和具有结构式I的化合物的方法。此外，本发明提供了用于制备4′-乙炔基-2′-脱氧核糖核苷的某些合成中间体。
具体实施方式
本发明涉及具有结构式I的化合物或其药用盐：
Figure BDA0001647981110000031
其中：
R1为-H、-C(O)R3、-C(O)OR3、-C(O)N(R3)2、
Figure BDA0001647981110000032
或单、二或三磷酸酯的前药修饰形式；且
R2为-H、-C(O)R4、-C(O)OR4或-C(O)N(R4)2；
R3和R4在每次出现时各自独立选自-H、-C1-C6烷基、-卤代C1-C6烷基、-(C1-C3亚烷基)m-(C3-C7环烷基)、-(C1-C3亚烷基)m-(芳基)、-(C1-C3亚烷基)m-(4至7元杂环烷基)、-(C1-C3亚烷基)m-(5-或6-元单环杂芳基)或-(C1-C3亚烷基)m-(9-或10-元二环杂芳基)，其中所述-C1-C6烷基、所述-C3-C7环烷基、所述芳基、所述4至7元杂环烷基、所述5-或6-元单环杂芳基或所述9-或10-元二环杂芳基各自为未取代的或取代有R5；
m为0或1的整数；且
R5表示一至五个取代基，各自独立地选自-C1-C6烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、-卤代C1-C6烷基、芳基或5-6元杂芳基。
本发明的实施方案A为式I化合物或其药用盐，其中R1为-H、-C(O)R3、-C(O)OR3、-C(O)N(R3)2或以下单、二或三磷酸酯部分中的一种的前药修饰形式：
Figure BDA0001647981110000033
且
R2为-H、-C(O)R4、-C(O)OR4或-C(O)N(R4)2。
本发明的实施方案B为式I化合物或其药用盐，其中R1为-H、-C(O)R3、-C(O)OR3或-C(O)N(R3)2；且R2为-H、-C(O)R4、-C(O)OR4或-C(O)N(R4)2。
本发明的实施方案C为式I或实施方案A或B的化合物或其药用盐，其中R1或R2中的至少一个为–H。
本发明的实施方案D为式I化合物，其中R1为
Figure BDA0001647981110000041
且R2为–H。
本发明式I化合物的实例为以下化合物1或化合物2或其药用盐：
Figure BDA0001647981110000042
当提及作为本申请所述或要求的具体式或实施方案的化合物例如式I或其实施方案A、B或C或任何其他一般结构式或特定化合物的本发明化合物时，意在涵盖落入所述式或实施方案范围内的一种或多种特定化合物，包括其盐特别是药用盐、所述化合物的溶剂化物(包括水合物)及其溶剂化盐形式，其中所述形式为可能的，除非另作说明。本发明包括本申请所述的实施例中的每一个及其药用盐。本发明还涵盖药物组合物，包含有效量的本发明化合物或其药用盐和药用载体。
如本文所使用，术语"烷基"是指具有在指定范围内的数目的碳原子的单价直链或支链、饱和脂族烃基。因此，例如，"C1-6烷基"(或"C1-C6烷基")是指己基烷基和戊基烷基异构体以及正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基、正丙基和异丙基、乙基和甲基中的任一种。作为另一个实例，"C1-4烷基"是指正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基、正丙基和异丙基、乙基和甲基。
术语"烯基"是指含有一个碳-碳双键且具有指定范围内的数目的碳原子的单价直链或支链脂族烃基。因此，例如，"C2-6烯基"(或"C2-C6烯基")是指己烯基和戊烯基异构体以及1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、1-丙烯基、2-丙烯基和乙烯基中的全部。
术语"炔基"是指含有一个碳-碳三键且具有指定范围内的数目的碳原子的单价直链或支链脂族烃基。因此，例如，"C2-6炔基"(或"C2-C6炔基")是指己炔基和戊炔基异构体以及1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-丙炔基、2-丙炔基和乙炔基中的全部。
术语"亚烷基"是指具有指定范围内的数目的碳原子的任何二价直链或支链脂族烃基。因此，例如，"-C1-3亚烷基-"是指C1至C3直链或支链亚烷基中的任一种。特定类别的亚烷基包括-(CH2)1-3-、-(CH2)2-3-、-(CH2)1-2-、-CH2-、-CH(CH3)-和-C(CH3)2-。
术语"环烷基"是指具有指定范围内的数目的碳原子的任何单环烷烃。因此，例如，"C3-7环烷基"(或"C3-C7环烷基")是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。式I化合物和其实施方案的特别受关注类别为C3-C6环烷基。"杂环烷基"是指其中环中的一个或两个碳原子被独立选自N、O和S的杂原子替换的环烷基环。
术语"卤素"(或"卤代")是指氟、氯、溴和碘(或者称为氟代、氯代、溴代和碘代)。式I化合物和其实施方案的特别受关注类别氟或氯中的每一种。
术语"卤代烷基"是指如上文定义的烷基，其中一个或多个氢原子已替换为卤素(即-F、-Cl、-Br和/或-I)。因此，例如，"卤代C1-C6烷基"是指具有一个或多个卤素取代基的如上文定义的C1至C6直链或支链烷基。
术语"C(O)"是指羰基。
术语"芳基"(或"C6-C10芳基")是指(i)苯基，或(ii)9或10元双环稠合碳环环系，其中至少一个环为芳族的。合适的芳基包括例如苯基、萘基、四氢萘基(四氢化萘基(tetralinyl))或茚基。在式I化合物和其实施方案的一个特定类别中，芳基为苯基或萘基，且更具体地芳基为苯基。
术语"杂芳基"是指(i)含有1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5或6元杂芳环，其中各N任选地为化学上可能程度的氧化物形式，(ii)9或10元双环稠环环系，其中稠环环系含有1至6个独立地选自N、O和S的杂原子，其中稠环环系中的各环含有零、一个或多于一个杂原子，且至少一个环是芳族的，且各N任选地为化学上可能程度的氧化物形式，且不是芳族的环中的各S任选地是S(O)或S(O)2。合适的5和6元杂芳族环包括，例如，吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、***基***基(即1,2,3-***基或1,2,4-***基)、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(即1,2,3-、1,2,4-、1,2,5-(呋咱基)或1,3,4-异构体)、噁***基、噻唑基、异噻唑基和噻二唑基。合适的9和10元杂双环稠环环系包括，例如，苯并呋喃基、吲哚基、吲唑基、萘啶基、异苯并呋喃基、苯并哌啶基、苯并异噁唑基、苯并噁唑基、色烯基、喹啉基、异喹啉基、噌啉、喹唑啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、异吲哚基、苯并二氧杂环戊基(例如，苯并-1,3-二氧杂环戊基：
Figure BDA0001647981110000051
)、苯并哌啶基、苯并异噁唑基、苯并噁唑基、色满基、异色满基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并***基、二氢吲哚基、二氢异吲哚基、吲唑基、吲哚啉基、异吲哚啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、2,3-二氢苯并呋喃基和2,3-二氢苯并-1,4-二氧杂环己烯基(即
Figure BDA0001647981110000061
)。
应理解适用于本发明中的特定环和环系不限于前述段落中所列的那些。这些环和环系仅为代表性的。除非在特定上下文中明确规定为相反，否则本文所述的多种环和环系中的任一种可在任何环原子(即，任何碳原子或任何杂原子)处连接至化合物的其余部分，限制条件为该连接是化学允许的且导致稳定化合物。
当任何变量在描绘和描述本发明化合物的任何组分或式I或任何其它式中出现多于一次时，其在每次出现时的定义独立于其每一其它出现时的定义。另外，取代基和/或变量的组合仅当此类组合导致稳定化合物时才是允许的。
除非明确规定为相反，否则允许在环(例如环烷基、芳基或杂芳基)中任何原子上被指定取代基取代，只要此类环取代是化学允许的且导致稳定化合物。
除非明确规定为相反，否则本文引用的所有范围均为包括性的。例如，描述为含有"1至4个杂原子"的杂芳环意指该环可含有1、2、3或4个杂原子。还应理解本文引用的任何范围在其范围内包括该范围内的所有子范围。因此，例如，描述为含有"1至4个杂原子"的杂芳基意欲包括以下作为其方面：含有2至4个杂原子、3或4个杂原子、1至3个杂原子、2或3个杂原子、1或2个杂原子、1个杂原子、2个杂原子、3个杂原子或4个杂原子的杂芳环。“任选”取代是指化学部分可为未取代的或取代有指定的取代基。
如本领域普通技术人员所理解，某些本发明化合物可以作为互变异构体存在。这些化合物的所有互变异构形式，无论个别地分离还是在混合物中，都在本发明的范围内。例如，在杂芳环上允许-OH取代基且酮-烯醇互变异构可能的情况下，应理解取代基实际上可以所有或部分以氧代(＝O)形式存在。
"稳定"化合物是可制备和分离的化合物且其结构和特性保持或可使其基本上保持不变，持续足以允许将化合物用于本文所述的目的的时间段(例如，向受试者治疗或预防性给药)。本发明化合物限于式I和其实施方案涵盖的稳定化合物。
式I化合物可具有一个或多个手性(不对称)中心。式I化合物中存在的不对称中心可所有彼此独立地具有(R)或(S)构型，除了在结构式I中描述为具有特定立体构型的手性中心之外。本发明涵盖式I化合物的所有手术立体异构形式。
本发明包括所有可能的式I化合物的对映异构体和非对映异构体和两种或更多种立体异构体的所有比率的混合物(当R3、R4和/或R5中可能存在手性中心时，例如对映异构体和/或非对映异构体的混合物)。因此，对映异构体是本发明的主题，其为左旋和右旋对映体的对映异构纯形式、外消旋物形式和两种对映异构体的所有比率的混合物形式。在顺/反异构的情况下，本发明包括顺式形式和反式形式以及这些形式的所有比率的混合物。如果需要，可以通过经由惯用方法(例如通过色谱或结晶)分离混合物、通过使用立体化学性均匀的起始材料用于合成或通过立体选择性合成来进行单独立体异构体的制备。任选地，可在分离立体异构体之前进行衍生化。可在式I化合物合成期间的中间步骤进行立体异构体的混合物的分离，或者其可对最终外消旋产物进行。绝对立体化学可通过结晶产物或结晶中间体(如果必要)衍生的X-射线结晶学用含有已知构型的立体对称中心的试剂进行测定。或者，可通过振动圆二色性(VCD)光谱分析测定绝对立体化学。本发明包括所有所述异构体以及所述外消旋物、对映异构体、非对映异构体和互变异构体和其混合物的盐、溶剂化物(其包括水合物)和溶剂化盐。
式I化合物中的原子可展现其天然同位素丰度，或一种或多种原子可人工富集具有相同原子序数、但原子质量或质量数与自然界中主要存在的原子质量或质量数不同的特定同位素。本发明意欲包括通式I的化合物的所有合适同位素变体。例如，氢(H)的不同同位素形式包括氕(1H)和氘((2H)。氕是自然界中存在的主要氢同位素。针对氘的富集可提供某些治疗优势，诸如增加体内半衰期或减少剂量需求，或可提供可用作表征生物样品的标准品的化合物。通式I内的同位素富集化合物无需过度实验即可通过本领域技术人员众所周知的常规技术或通过与本文的方案和实施例中所述的方法类似的方法使用适当同位素富集试剂和/或中间体来制备。
化合物可以药用盐的形式给药。术语"药用盐"是指生物或其它方面没有不合需要的盐(例如对其接受者既无毒又无害)。当式I化合物含有一个或多个酸性或碱性基团时，本发明还包括相应药用盐。因此，含有酸性基团(例如-COOH)的式I化合物可根据本发明作为例如但不限于碱金属盐、碱土金属盐或铵盐使用。所述盐的实例包括但不限于钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或具有氨或有机胺(例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸)的盐。含有一个或多个碱性基团(即可质子化的基团)的式I化合物可根据本发明以其与无机或有机酸的酸加成盐形式使用，例如但不限于与以下物质的盐：盐酸、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸、苯磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、三氟乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸等。如果式I化合物在分子中同时含有酸性和碱性基团，则除了提及的盐形式外，本发明还包括内盐或内铵盐(两性离子)。可通过本领域技术人员已知的惯用方法，例如通过与有机或无机酸或碱在溶剂或分散剂中组合，或通过与其它盐阴离子交换或阳离子交换，由式I化合物获得盐。本发明还包括式I化合物的所有盐，其由于低生理学相容性而不适于直接用于药物中，但其可例如用作化学反应的中间体或用于制备药用盐。
本发明的另一个实施方案是式I化合物，其中该化合物或其盐为基本上纯形式。如本文所使用，"基本上纯"意指合适地至少约60重量％，通常至少约70重量％，优选至少约80重量％，更优选至少约90重量％(例如，约90重量％至约99重量％)，甚至更优选至少约95重量％(例如约95重量％至约99重量％，或约98重量％至100重量％)，且最优选至少约99重量％(例如100重量％)的含有式I化合物或其盐的产物(例如，从反应混合物分离、提供所述化合物或盐的产物)由所述化合物或盐组成。所述化合物和盐的纯度水平可使用标准分析方法(诸如薄层色谱、凝胶电泳、高效液相色谱和/或质谱)测定。如果采用多于一种分析方法且所述方法提供测定的纯度水平方面的实验上的显著差异，则以提供最高纯度水平的方法为准。100％纯度的化合物或盐是如标准分析方法测定不含可检测杂质的化合物或盐。基本上纯的化合物可以是立体异构体的基本上纯的混合物或基本上纯的单独非对映异构体或对映异构体。
此外，本发明化合物可以无定形形式和/或一种或多种结晶形式存在，且因此式I化合物的所有无定形和结晶形式和其混合物意欲包括于本发明的范围内。此外，本发明的一些化合物可与水(即水合物)或常见有机溶剂形成溶剂化物。本发明化合物的所述溶剂化物和水合物(尤其是药用溶剂化物和水合物)同样与非溶剂化和无水形式一起涵盖于本发明范围内。
应理解，式I化合物(或其任何实施方案和其药用盐)可通过一种或多种机制(例如酶催化化学反应)胞内/体内转化成相应核苷5'三磷酸酯(即其中R1是-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2且R2为H)。尽管不希望受任何特定理论束缚，但核苷5'三磷酸酯一般理解为对抑制HIV RT酶和向受试者给药式I化合物后产生抗病毒活性负责。例如，本申请所述的化合物2为化合物1的核苷5’三磷酸酯类似物。
因此，本发明化合物的前药涵盖于本文中。前药的讨论提供在T.Higuchi和V.Stella,Pro-drugs as Novel Delivery Systems(1987)14 of the A.C.S.SymposiumSeries,and in Bioreversible Carriers in Drug Design,(1987)Edward B.Roche,ed.,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press中。本文的术语"前药"意指化合物(例如药物前体(precursor))，其可为药用盐的形式，其可胞内/体内转化以提供作为HIV逆转录酶抑制剂的4'-取代的核苷衍生物。核苷5'三磷酸酯是4'-取代的核苷衍生物的实例。体内转换可通过多种机制发生，例如酶催化化学反应、代谢化学反应和/或自发化学反应(例如溶剂分解)，例如通过在血液中水解。本发明涵盖由于胞内/体内转化而转化为作为HIV逆转录酶的抑制剂的式I化合物的4'-取代的核苷衍生物的任何前药。例如，式I的4'-取代的核苷衍生物包括但不限于式I化合物，其中：
a)R1为-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2；或
b)R1为-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2且R2为–H。
式I化合物的前药相比于化合物本身可展现增强的溶解度、吸收和/或亲脂性，由此导致增加的生物利用度和效力。当式I化合物在5’和/或3’位含有羟基时(即当R1为–H和/或R2为–H时)，前药可以是羟基的衍生物，诸如当R1＝-C(O)R3、-C(O)OR3或-C(O)N(R3)2和/或R2＝-C(O)R4、-C(O)OR4或-C(O)N(R4)2时。
在式I中，R1也包括单、二或三磷酸酯的前药修饰形式。该前药修饰形式可为在单、二或三磷酸酯部分上的一个或多个羟基的衍生物，诸如酯(-OC(O)R)、碳酸酯(-OC(O)OR)、醚(-OR)、磷酸酯(-O-P(＝O)(OC(O)R)2)，或单磷酸酯前药诸如氨基磷酸酯(其可在体内转化为相应的核苷单磷酸酯)。所述单、二或三磷酸酯的前药修饰形式还包括但不限于5’-醇衍生的前药诸如-P(O)(-O-C1-C6烷基)2；-P(O)(-NH-(α-氨基酰基))(-O-芳基)，其已知为“McGuigan”型前药；-P(O)(-O-(C1-C6亚烷基)-(S–酰基)(-NH-芳基烷基)；S-酰基-2-硫基乙基(SATE)前药；或在两个核糖羟基之间形成桥的环磷酸酯，诸如：
Figure BDA0001647981110000101
例如
Figure BDA0001647981110000102
其中环磷酸酯在3'-OH基团与5'-OH基团之间形成桥；和美国专利7,879,815；国际公开WO2005/003047、WO2008/082602、WO2010/0081628、WO2010/075517和WO2010/075549；Mehellou,Chem.Med.Chem.,5:1841-1842(2005)；Bobeck et al.,Antiviral Therapy 15:935-950(2010)；Furman et al.,Future Medicinal Chemistry,1:1429-1452(2009)；和Erion,Microsomes and Drug Oxidations,Proceedings of the InternationalSymposium,17th,Saratoga Springs,NY,United States,July 6-10,2008,7-12(2008)中描述的那些。
作为前药的另一实例，如果式I化合物在该化合物的任一上述位置上含有醇官能团，前药可通过将醇基团的一个或多个氢原子替换为例如以下的基团来形成：(C1-C6)烷酰基氧基甲基、1-((C1-C6)烷酰基氧基)乙基、1-甲基-1-((C1-C6)烷酰基氧基)乙基、(C1-C6)烷氧基羰基氧基甲基、N-(C1-C6)烷氧基羰基氨基甲基、琥珀酰基、(C1-C6)烷酰基、α-氨基(C1-C4)烷基、α-氨基(C1-C4)亚烷基-芳基、芳基酰基和α-氨基酰基或α-氨基酰基-α-氨基酰基，其中每个α-氨基酰基独立选自天然存在的L-氨基酸或糖基(通过移除半缩醛形式的糖类的一个羟基得到的基团)。
式I化合物还含有胺官能团。式I化合物的前药可通过用以下基团替换氨基中的氢原子形成，所述基团为例如，R-羰基-、RO-羰基-、NRR’-羰基-，其中R和R’各自独立为(C1-C10)烷基、(C3-C7)环烷基、苄基、天然α-氨基酰基、-C(OH)C(O)OY1，其中Y1为H、(C1-C6)烷基或苄基、-C(OY2)Y3，其中Y2为(C1-C4)烷基且Y3为(C1-C6)烷基；羧基(C1-C6)烷基；氨基(C1-C4)烷基或单-N-或二-N,N-(C1-C6)烷基氨基烷基；-C(Y4)Y5，其中Y4为H或甲基且Y5为单-N-或二-N,N-(C1-C6)烷基氨基吗啉代；哌啶-1-基或吡咯烷-1-基等。
本发明化合物的药用酯包括以下组：(1)通过羟基化合物的羟基的酯化获得的羧酸酯，其中酯基的羧酸部分的非羰基基团选自直链或支链烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、仲丁基或正丁基)、烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)、芳基(例如，苄基)、芳氧基烷基(例如，苯氧基甲基)、芳基(例如，任选地被例如卤素、C1-4烷基、-O-(C1-4烷基)或氨基取代的苯基)；(2)磺酸酯，诸如烷基-或芳烷基磺酰基(例如，甲磺酰基)；(3)氨基酸酯(例如，L-缬氨酰基或L-异亮氨酰基)；(4)膦酸酯和(5)单、二或三磷酸酯。磷酸酯可进一步通过例如C1-20醇或其反应性衍生物或2,3-二(C6-24)酰基甘油酯化。
如果4'-取代的脱氧核糖衍生物含有羧酸官能团，则前药可包括通过用以下基团替换酸基的氢原子形成的酯，所述基团为例如：(C1–C8)烷基、(C2-C12)烷酰基氧基甲基、具有4至9个碳原子的1-(烷酰基氧基)乙基、具有5至10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰基氧基)-乙基、具有3至6个碳原子的烷氧基羰基氧基甲基、具有4至7个碳原子的1-(烷氧基羰基氧基)乙基、具有5至8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰基氧基)乙基、具有3至9个碳原子的N-(烷氧基羰基)氨基甲基、具有4至10个碳原子的1-(N-(烷氧基羰基)氨基)乙基、3-苯并[c]呋喃酮基(3-phthalidyl)、4-巴豆酸内酯基(4-crotonolactonyl)、γ-丁内酯-4-基、二-N,N-(C1-C2)烷基氨基(C2-C3)烷基(诸如β-二甲基氨基乙基)、氨基甲酰基-(C1-C2)烷基、N,N-二(C1-C2)烷基氨基甲酰基-(C1-C2)烷基和哌啶基-、吡咯烷基-或吗啉代(C2-C3)烷基等。
其它实例包括以下：当式I化合物含有羧酸基时，前药可以是酯或酰胺，且当式I化合物含有伯氨基或可衍生化的另一合适氮时，前药可以是酰胺、氨基甲酸酯、脲、亚胺或曼尼希碱(Mannich base)。用于选择和制备合适前药衍生物的常规操作描述于例如Design of Prodrugs,edited by H.Bundgaard,Elsevier,1985；J.J.Hale et al.,J.Med.Chem.2000,vol.43,pp.1234-1241；C.S.Larsen and J.Ostergaard,"Design andapplication of prodrugs"in:Textbook of Drug Design and Discovery,3rd edition,edited by C.S.Larsen,2002,pp.410-458；和Beaumont et al.,Current DrugMetabolism 2003,vol.4,pp.461-458中，其各自的公开内容以其整体通过引用并入本文。
因此，通用结构式、实施方案范围内的化合物和本文描述和请求保护的特定化合物涵盖其盐、所有可能立体异构体和互变异构体、物理形式(例如无定形和结晶形式)、溶剂化物和水合物形式和这些形式的任何组合，以及包括前药的立体异构体、互变异构体、溶剂化物、水合物、盐和/或物理形式的任何组合的其盐、其前药形式，其中除非另外规定，否则所述形式是可能的。
本发明还涵盖用于在有需要的受试者中治疗或预防HIV感染、抑制HIV逆转录酶、治疗、预防或延迟AIDS发作的方法，其包括将有效量的本发明化合物或其药用盐给药至所述受试者。
本发明还涵盖本发明化合物或其药用盐，其用于制备用于在有需要的受试者中治疗或预防HIV感染、用于抑制HIV逆转录酶或用于治疗、预防或延迟AIDS发作的药物。
本发明还涵盖药物组合物，其包含有效量的本发明化合物或其药用盐，和药学上可接受的载体，且进一步包含有效量的额外抗HIV剂，其选自HIV抗病毒剂、免疫调节剂和抗感染剂。在该实施方案内，抗HIV剂是选自以下的抗病毒剂：HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV融合抑制剂、HIV进入抑制剂和HIV成熟抑制剂。
实施方案A、B或C的化合物各自形成式I中包括的化合物的子集。上文或随后表示式I化合物的任何描述也适用于实施方案A、B或C各自和其各实施方案的化合物。
本发明的其它实施方案包括以下：
(a)药物组合物，包含有效量的如上文定义的式I化合物或其前药或药用盐和药用载体。
(b)药物组合物，其包含通过组合(例如，混合)有效量的如上文定义的式I化合物或其前药或药用盐和药用载体制备的产物。
(c)(a)或(b)的药物组合物，其还包含有效量的一种或多种选自HIV抗病毒剂、免疫调节剂和抗感染剂的抗HIV剂。
(d)(c)的药物组合物，其中所述抗HIV剂选自一种或多种选自以下的抗病毒剂：HIV蛋白酶抑制剂、核苷HIV逆转录酶抑制剂、非核苷HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV融合抑制剂、HIV进入抑制剂和HIV成熟抑制剂。
(e)组合，其为(i)如上文定义的式I化合物或其前药或药用盐，和(ii)选自HIV抗病毒剂、免疫调节剂和抗感染剂的抗HIV剂；其中所述化合物和抗HIV剂各自以使组合有效抑制HIV逆转录酶、用于治疗或预防HIV感染或用于治疗、预防或延迟AIDS发作或进展的量采用。
(f)(e)的组合，其中所述抗HIV剂是选自以下的抗病毒剂：HIV蛋白酶抑制剂、核苷HIV逆转录酶抑制剂、非核苷HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV融合抑制剂、HIV进入抑制剂和HIV成熟抑制剂。
(g)用于抑制有需要的受试者中的HIV逆转录酶的方法，其包括将有效量的式I化合物或其前药或药用盐给药至受试者。
(h)用于预防或治疗有需要的受试者中的HIV(例如，HIV-1)感染的方法，其包括将有效量的式I化合物或其前药或药用盐给药至受试者。
(i)(h)的方法，其中将式I化合物与有效量的至少一种选自以下的其它HIV抗病毒剂组合给药：HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、非核苷HIV逆转录酶抑制剂、核苷HIV逆转录酶抑制剂、HIV融合抑制剂、HIV进入抑制剂和HIV成熟抑制剂。
(j)用于预防、治疗或延迟有需要的受试者中的AIDS发作或进展的方法，其包括将有效量的式I化合物或其前药或药用盐给药至受试者。
(k)(j)的方法，其中将所述化合物与有效量的至少一种选自以下的其它HIV抗病毒剂组合给药：HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、非核苷HIV逆转录酶抑制剂、核苷HIV逆转录酶抑制剂、HIV融合抑制剂、HIV进入抑制剂和HIV成熟抑制剂。
(l)用于抑制有需要的受试者中的HIV逆转录酶的方法，其包括将(a)、(b)、(c)或(d)的药物组合物或(e)或(f)的组合给药至受试者。
(m)用于预防或治疗有需要的受试者中的HIV(例如，HIV-1)感染的方法，其包括将(a)、(b)、(c)或(d)的药物组合物或(e)或(f)的组合给药至受试者。
(n)用于预防、治疗或延迟有需要的受试者中的AIDS发作或进展的方法，其包括将(a)、(b)、(c)或(d)的药物组合物或(e)或(f)中组合给药至受试者。
本发明还包括式I化合物或其药用盐，其(i)用于以下，(ii)用作用于以下的药物或(iii)用于制备用于以下的药物：(a)治疗(例如，人体的治疗)，(b)药物，(c)抑制HIV逆转录酶，(d)治疗或预防HIV感染，或(e)治疗、预防或延迟AIDS发作或进展。在这些用途中，本发明化合物可任选地与一种或多种选自HIV抗病毒剂、抗感染剂和免疫调节剂的抗HIV剂组合使用。
本发明的其它实施方案包括上文(a)至(n)中所述的药物组合物、组合和方法以及前述段落中所述的用途(i)(a)-(e)至(iii)(a)-(e)，其中采用的本发明化合物是上文所述的实施方案、方面、类别、子类或特征之一的化合物。在所有这些实施方案等中，所述化合物可任选地以前药或药用盐或前药的药用盐的形式使用。
本发明的其它实施方案包括前述段落中所述的药物组合物、组合、方法和用途中的每一种，其中其中采用的本发明化合物或其盐是基本上纯的。关于包含式I化合物或其前药或盐以及药用载体和任选一种或多种赋形剂的药物组合物，应理解术语"基本上纯的"是关于式I化合物或其前药和/或盐本身。
本发明的其它实施方案包括上文(a)-(n)中所述的药物组合物、组合和方法以及上文所述的用途(i)(a)-(e)至(iii)(a)-(e)，其中受关注的HIV是HIV-1。因此，例如，在药物组合物(d)中，式I化合物以有效针对HIV-1的量采用，且抗HIV剂是选自以下的HIV-1抗病毒剂：HIV-1蛋白酶抑制剂、HIV-1逆转录酶抑制剂、HIV-1整合酶抑制剂、HIV-1融合抑制剂和HIV-1进入抑制剂。式I化合物也可以是针对HIV-2的有用药剂。
关于式I化合物的术语"给药(administration)"和其变体(例如"给药(administering)"化合物)意指向需要治疗或预防的个体提供化合物且包括自身给药和由另一人向患者给药。当化合物或其前药与一种或多种其它活性剂(例如，可用于治疗或预防HIV感染或AIDS的抗病毒剂)组合提供时，"给药"和其变体各自理解为包括同时或在不同时间提供提供化合物或前药和其它药剂。当组合的药剂同时给药时，其可在单个组合物中一起给药或其可分开给药。
如本文所使用，术语"组合物"意欲涵盖包含指定成分的产物以及由组合指定成分产生的任何产物。适合于包含于药物组合物中的成分是药学上可接受的成分，这意指所述成分必须彼此相容且对其接受者无害。"药学上可接受"意指药物组合物的成分必须彼此相容且对其接受者无害。
如本文所使用的术语"受试者"是指动物，优选哺乳动物，最优选人，其已为治疗、观察或实验的目标。
如本文所使用的术语"有效量"意指足以在给药后抑制HIV逆转录酶、抑制HIV复制、发挥预防作用和/或发挥治疗作用的量。"有效量"的一个实施方案是"治疗有效量"，其为化合物在患者中有效抑制HIV逆转录酶、抑制HIV复制(前述中的任一种也可在本文中称为"抑制有效量")、治疗HIV感染、治疗AIDS、延迟AIDS发作和/或减缓AIDS进展的量。"有效量"的另一个实施方案为"预防有效量"，其为化合物在患者中有效预防HIV感染或预防AIDS的量。应理解，有效量可同时为治疗有效量(例如，用于治疗HIV感染)和预防有效量(例如，用于预防或降低发展AIDS的风险)两者。当式I化合物作为盐给药时，所述化合物的量是指化合物的游离形式(即非盐形式)。
在本发明的方法(即，抑制HIV逆转录酶、治疗或预防HIV感染、抑制HIV复制、治疗或预防AIDS、延迟AIDS发作或延迟或减缓AIDS进展)中，任选地为盐形式的本发明化合物可通过使活性剂与药剂作用部位产生接触的方式给药。其可作为单独治疗剂或以治疗剂组合的形式通过适于与药物结合使用的常规方式给药。其可以单独给药，但通常与基于所选给药途径和标准药学实践选择的药学载体一起给药。本发明化合物可例如以含有有效量的化合物和常规无毒药用载体、辅助剂和媒介物的药物组合物的单位剂量形式经口、肠胃外(包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术)、吸入喷雾或经直肠给药，所述给药方法中的任一种都可以单次剂量每天一次或以较低频率(诸如每周一次或每月一次)以例如但不限于下文中描述的剂量范围和量提供。适于经口给药的液体制剂(例如悬浮液、糖浆、酏剂等)可根据本领域中已知的技术制备，且可采用任何常见介质，诸如水、二醇类、油类、醇类等。适于经口给药的固体制剂(例如，粉末、丸剂、胶囊和片剂)可根据本领域中已知的技术制备，且可采用固体赋形剂诸如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。肠胃外组合物可根据本领域中已知的技术制备且通常采用作为载体的无菌水和任选其它成分，诸如溶解助剂。可注射溶液可根据本领域中已知的方法制备，其中所述载体包含盐水溶液、葡萄糖溶液或含有盐水与葡萄糖的混合物的溶液。适用于制备用于本发明的药物组合物的方法以及适用于所述组合物的成分的进一步描述提供于Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,edited by A.R.Gennaro,Mack Publishing Co.,1990以及Remington-The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition,published byPharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University ofthe Sciences,2012,ISBN 978 0 85711-062-6和先前版本中。
导致药物过饱和和/或快速溶解的式I描述的化合物的配制可用于促进口服药物吸收。引起药物过饱和和/或快速溶解的配制方法包括但不限于纳米颗粒***、非晶形***、固溶体、固态分散体和脂质***。用于其制备的此类配制方法和技术是本领域众所周知的。例如，固态分散体可使用综述(例如A.T.M.Serajuddin,J Pharm Sci,88:10,pp.1058-1066(1999))中所述的赋形剂和方法制备。基于研磨和直接合成两者的纳米颗粒***也描述于综述，诸如Wu等人(F.Kesisoglou,S.Panmai,Y.Wu,Advanced Drug DeliveryReviews,59:7pp.631-644(2007))中。
式I化合物和其药用盐是HIV逆转录酶抑制剂。所述化合物可用于体外和体内抑制HIV逆转录酶和抑制HIV复制。更具体地，式I化合物抑制HIV-1逆转录酶的聚合酶功能。下文RT聚合酶测定中所述的测定法中的本发明的实施例的化合物的测试举例说明本发明化合物抑制HIV-1逆转录酶的RNA依赖性DNA聚合酶活性的能力。式I化合物也可以是针对HIV-2的有用药剂。
式I化合物可以单次剂量或分次剂量，以每天0.001至1000mg/kg哺乳动物(例如人)体重的剂量范围给药，或根据需要以其它时间间隔给药。剂量范围的一个实例是以单次剂量或分次剂量经口或经由其它给药途径，每天0.01至500mg/kg体重给药，或根据需要以其它时间间隔给药。剂量范围的另一个实例为以单次剂量或分次剂量经口或经由其它给药途径，每天0.1至100mg/kg体重给药，或根据需要以其它时间间隔给药。对于经口(例如，片剂或胶囊)或其它给药途径，可提供含有1.0至500毫克活性成分，尤其是1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400和500毫克活性成分(针对待治疗患者症状调整剂量)的组合物。用于任何特定患者的特定剂量水平和剂量频率可变化且将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药模式和时间、***速率、药物组合、特定病况的严重程度和经历治疗的主体。在一些情况下，根据化合物功效或个体反应，可必要向上或向下偏离给定剂量。本发明化合物可以作为单次剂量每天一次或以较低频率(诸如每周一次或每月一次)以例如但不限于上文指出的剂量范围和量给药。此外，所述化合物可配制用于立即释放或修改释放诸如延长或控制释放。
如上所示，本发明还涉及式I化合物与一种或多种抗HIV剂的用途。"抗HIV剂"是直接或间接有效抑制HIV、治疗或预防HIV感染和/或治疗、预防或延迟AIDS的发作或进展的任何药剂。应理解，抗HIV剂有效治疗、预防或延迟HIV感染或AIDS和/或由其产生或与其相关的疾病或病况的发作或进展。例如，无论在暴露前和/或暴露后的时段，本发明化合物均可与有效量的一种或多种选自HIV抗病毒剂、免疫调节剂、抗感染剂或可用于治疗HIV感染或AIDS的疫苗的抗HIV剂组合有效给药。用于与本发明化合物组合使用的合适的HIV抗病毒剂包括例如下表A中所列的那些：
表A:用于治疗HIV感染或AIDS的抗病毒剂
Figure BDA0001647981110000171
Figure BDA0001647981110000181
EI＝进入抑制剂；FI＝融合抑制剂；InI＝整合酶抑制剂；PI＝蛋白酶抑制剂；nRTI＝核苷逆转录酶抑制剂；nnRTI＝非核苷逆转录酶抑制剂。表中所列的一些药物以盐形式使用；例如阿巴卡韦硫酸盐、地拉韦啶甲磺酸盐、茚地那韦硫酸盐、阿扎那韦硫酸盐、奈非那韦甲磺酸盐、沙喹那韦甲磺酸盐。
应理解，本发明化合物与抗HIV剂的组合的范围不限于表A中所列的HIV抗病毒剂，但在原则上包括与可用于治疗或预防AIDS的任何药物组合物的任何组合。HIV抗病毒剂和其它药剂通常将以这些组合以本领域中所报道的其常规剂量范围和方案采用，包括例如Physicians'Desk Reference,Thomson PDR,Thomson PDR,57th edition(2003),the 58thedition(2004)或the 59th edition(2005)以及现行Physicians'Desk Reference(68thed.).(2014),Montvale,NJ:PDR Network中所述的剂量。本发明化合物在这些组合中的剂量范围可与上述剂量范围相同。
本发明化合物也可用于制备和执行针对抗病毒化合物的筛选测定。例如，本发明化合物可用于分离酶突变体，其为较强力抗病毒化合物的优异筛选工具。此外，本发明化合物可用于例如通过竞争抑制确定或测定其它抗病毒剂与HIV逆转录酶的结合位点。
在另一方面，本发明提供了用于制备式(IA)化合物的方法
Figure BDA0001647981110000182
其中X为H、F、Cl或Br；
Y为N、C(H)、C(F)、C(Cl)、C(Br)或C(CH3)；且
Z为NH2。因此，在实施方案1中，本发明提供了包括以下的方法：
(a.)使糖
Figure BDA0001647981110000183
与核碱基
Figure BDA0001647981110000184
偶联以提供经保护的核苷
Figure BDA0001647981110000191
和
(b.)将经保护的核苷(A)转化为式(IA)化合物；其中
Z1为Cl、N(H)PG或N(PG)2，
Rd为
(i)式
Figure BDA0001647981110000192
的基团，其中Rp为C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、卤素、CF3或N(CH3)2；
(ii)-Si(Rs)3；或
(iii)–C(O)C1-C3烷基；或
(iv)–C(O)CH2N(H)C(O)CH3；
每个Rs独立为C1-C6烷基；未取代的苯基；被一至三个C1-C3烷基、卤素或C1-C3烷氧基取代的苯基；
LG为OAc、OBz、卤素或-O-C2-C8烯基；且
PG为氨基保护基。
氨基保护基可为基于氨基甲酸酯的保护基，诸如–C(O)ORs(例如Boc,CBz)；甲硅烷基保护基诸如–Si(Rs)3(例如(–Si(CH3)3、-Si(CH3)2(C(CH3)3))；或酰胺保护基诸如–C(O)Rs(例如-C(O)CH3、-C(O)Ph)。
在实施方案2中，本发明提供了如在实施方案1中阐述的方法，其中Rd为4-甲基苯甲酰基(Tol)：
Figure BDA0001647981110000193
在实施方案3中，本发明提供了如在实施方案2中阐述的方法，其中在式(IA)化合物中，X为F，Y为N且Z为NH2。
在实施方案4中，本发明提供了如在实施方案3中阐述的方法，其中在步骤(a.)中，
在糖(C)中，LG为–OAc或-O(CH2)3C(H)＝CH2；且
在经保护的核苷(A)中，X为F，Y为N且Z1为N(H)PG。
在实施方案5中，本发明提供了如在实施方案4中阐述的方法，其中糖(C)中的LG为–OAc；且
经保护的核苷中的Z1为N(H)Si(Rs)3。
在实施方案6中，本发明提供了如在实施方案5中阐述的方法，其中在步骤(a)中，所述使偶联在路易斯酸或布郎斯台德酸的存在下在非质子溶剂中进行以提供核苷(A)。用于偶联的适当的路易斯酸包括TMSOTf、TiCl4和SnCl4。适当的布郎斯台德酸包括例如三氟甲磺酸。
在实施方案7中，本发明提供了如在实施方案6中阐述的方法，其中所述路易斯酸或布郎斯台德酸为TMSOTf。
在实施方案8中，本发明提供了如在实施方案6或7中阐述的方法，其中所述非质子溶剂为乙腈。
在实施方案9中，本发明提供了如在实施方案6-8中任一项阐述的方法，其中所述偶联在60至85℃的温度进行。
在实施方案10中，本发明提供了如在实施方案9中阐述的方法，其中所述非质子溶剂与糖(C)的体积比为至少10。例如，所述非质子溶剂与糖(C)的体积比为20至40。
在实施方案11中，本发明提供了如在实施方案6-10中任一项阐述的方法，其中步骤(a.)还包括通过由含有非质子溶剂和核碱基(B)的混合物使经保护的核苷(A)结晶来分离所述经保护的核苷(A)；且由所述混合物分离所述经保护的核苷(A)。
在实施方案12中，本发明提供了如在实施方案4-11中任一项阐述的方法，其中Z1为–N(H)Si(CH3)3.
在实施方案13中，本发明提供了如在实施方案12中阐述的方法，其中所述核碱基(B)通过使N,O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺与2-氟腺嘌呤反应来制备。
在实施方案14中，本发明提供了如在实施方案5-13中任一项阐述的方法，其中步骤(b)中的转化包括使经保护的核苷(A)与碱金属C1-C3醇盐反应。
在实施方案15中，本发明提供了如在实施方案14中阐述的方法，其中所述碱金属C1-C3醇盐为甲醇钠。在具体的实施方案中，转化用3至10mol.％NaOMe进行得到经保护的核苷(A)。
在实施方案16中，本发明提供了如在实施方案5-15中任一项阐述的方法，其中所述糖(C)通过使内半缩醛
Figure BDA0001647981110000211
与乙酸酐反应来制备。
在实施方案17中，本发明提供了如在实施方案4中阐述的方法，其中
糖(C)中的LG为-O(CH2)3C(H)＝CH2；且
核碱基(B)中和经保护的核苷(A)中的Z1为N(H)C(O)-ORs且X为F或Cl。在具体的实施方案中，核碱基(B)中和经保护的核苷(A)中的Z1为N(H)C(O)-ORs且X为F。
在实施方案18中，本发明提供了如在实施方案17中阐述的方法，其中在步骤(a)中，所述偶联通过将糖(C)用活化剂在核碱基(B)的存在下在非质子溶剂中处理来进行。通常，所述活化剂为碘、溴、N-碘琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、Balarenga试剂(Py2I)或二碘-二甲基乙内酰脲。例如在一个实施方案中，所述活化剂为碘。
在实施方案19中，本发明提供了如在实施方案18中阐述的方法，其中所述非质子溶剂为乙腈、丙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、THF、甲苯、1,4-二噁烷、乙腈-THF混合物、乙腈-二氯甲烷混合物、乙腈-甲苯混合物或乙腈-N-甲基吡咯烷酮混合物。
在实施方案20中，本发明提供了如在实施方案18或19中阐述的方法，其中所述偶联在-78至45℃的温度进行。例如，所述偶联可在-40至10℃进行。
在实施方案21中，本发明提供了如在实施方案17-20中任一项阐述的方法，其中Z1为N(H)C(O)-OC(CH3)3.
在实施方案22中，本发明提供了如在实施方案17-21中任一项阐述的方法，其中步骤(b)中的转化包括将经保护的核苷(A)用碱金属C1-C3醇盐(例如甲醇钠)和用强酸在分开的步骤中处理。所述强酸可为例如，三氟乙酸或无机酸。术语“无机酸”是指常规的无机酸诸如盐酸或硫酸。在一些实施方案中，将经保护的核苷(A)首先用强酸处理、然后用碱金属C1-C3醇盐处理。在其他实施方案中，将经保护的核苷(A)首先用碱金属C1-C3醇盐处理、然后用强酸处理。
在实施方案23中，本发明提供了如在实施方案17-22中任一项阐述的方法，其中所述糖(C)通过使内半缩醛
Figure BDA0001647981110000221
与戊-4-烯-1-醇反应以提供所述糖
Figure BDA0001647981110000222
来制备，其中LG为–O-(CH2)3CH＝CH3(本申请指作糖(C3)。
在实施方案24中，本发明提供了如在实施方案23中阐述的方法，其中所述反应还包括使内半缩醛(10A)与乙酸酐和戊-4-烯-1-醇反应以提供所述糖(C)。
在实施方案25中，本发明提供了如在实施方案2中阐述的方法，其中在式(IA)化合物中，X为Cl，Y为C(F)或C(H)且Z为NH2。
在实施方案26中，本发明提供了如在实施方案25中阐述的方法，其中在步骤(a.)中，
在糖(C)中，LG为–Cl(指作糖(C2))；且
在核碱基(B)中和在经保护的核苷(A)中的X为Cl，Y为C(F)且Z1为Cl。
在实施方案27中，本发明提供了如在实施方案25中阐述的方法，其中在步骤(a.)中，所述使偶联通过以下来进行：
将核碱基(B)用碱金属碱在非质子溶剂中处理以提供核碱基(B)的碱金属盐；和
使所述核碱基(B)的碱金属与糖(C)反应以提供经保护的核苷(A)。
用于处理核碱基(B)的适当的碱金属碱包括例如NaHMDS、NaH、KHMDS和LDA。在实施方案28中，所述碱金属碱为NaHMDS。
在实施方案29中，本发明提供了如在实施方案25-28中任一项阐述的方法，其中步骤(b)中的转化包括使经保护的核苷(A)与氨反应。例如，所述转化可在氨在C1-C3醇诸如甲醇中的溶液中进行。
在实施方案30中，本发明提供了如在实施方案26-29中任一项阐述的方法，其中所述糖(C2)通过使内半缩醛
Figure BDA0001647981110000231
与乙酸酐反应以提供糖
Figure BDA0001647981110000232
来制备；且
使糖(C1)与盐酸反应以提供糖(C2)。
在实施方案31中，本发明提供了如在实施方案2-30中任一项阐述的方法，其中所述糖(C)通过以下来制备：
将内酯
Figure BDA0001647981110000233
用选择性还原剂还原以提供内半缩醛
Figure BDA0001647981110000234
和
将内半缩醛(10A)转化为糖(C)。
在实施方案32中，本发明提供了如在实施方案31中阐述的方法，其中所述选择性还原剂为二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠。
在实施方案33中，本发明提供了如在实施方案31中阐述的方法，其中所述内酯(10)通过以下来制备：
使二氧杂环戊烷
Figure BDA0001647981110000235
与酸反应以提供脱保护的中间体；和
将脱保护的中间体用对甲基苯甲酰化剂酰化以提供内酯(10)。
在实施方案33中所述的脱保护的中间体的酰化可使用众多有机化学领域技术人员已知的方法进行，例如，通过使用对甲基苯甲酰化剂诸如对甲基苯甲酸酐或对甲基苯甲酰基氯。在实施方案34中，对甲基苯甲酰化剂为对甲基苯甲酰基氯。
在实施方案35中，本发明提供了如在实施方案33中阐述的方法，其中所述方法还包括通过结晶内酯(10)来分离内酯(10)。用于结晶和分离内酯(10)的适当的溶剂包括吡啶:水混合物和乙酸异丙酯:庚烷混合物。
在实施方案36中，本发明提供了如在实施方案33中阐述的方法，其中脱保护的中间体为
Figure BDA0001647981110000241
在实施方案37中，本发明提供了如在实施方案33-36中任一项阐述的方法，其中所述二氧杂环戊烷(9)通过使TIPS中间体
Figure BDA0001647981110000242
与氟化剂反应以提供二氧杂环戊烷(9)来制备。适当的氟化钾包括例如，四烷基氟化铵、氟化钾和氢氟酸。在实施方案38中，所述氟化钾为四丁基氟化铵。
在实施方案39中，本发明提供了如在实施方案37中阐述的方法，其中所述TIPS中间体(8)通过来将酮酯
Figure BDA0001647981110000243
还原制备。
在实施方案40中，在实施方案39中阐述的还原通过酮酯(7)与甲酸/三乙胺在手性催化剂的存在下的不对称转移氢化来进行。用于氢化的适当的手性催化剂包括例如，含有手性配体的基于钌的催化剂诸如DENEBTM，其可购自Takasago InternationalCorporation,Tokyo,Japan。在实施方案41中，所述手性催化剂为RuCl-(S,S)-Ts-DENEBTM。
在实施方案42中，本发明提供了如在实施方案39-41中任一项阐述的方法，其中所述酮酯(7)通过将醇
Figure BDA0001647981110000251
转化为酮酯(7)来制备。
在实施方案43中，本发明提供了如在实施方案42中阐述的方法，其中所述醇(4)向酮酯(7)的转化包括：
(i.)氧化醇(4)以提供羧酸
Figure BDA0001647981110000252
(ii.)酯化羧酸(5)提供甲酯
Figure BDA0001647981110000253
(iii.)使乙酸叔丁酯的碱金属烯醇盐与甲酯(6)反应以提供酮酯(7)。
氧化醇(4)且提供羧酸(5)的适当的氧化条件包括两步氧化方法或直接氧化方法。两步氧化方法包括氧化醇部分为醛，诸如通过使用Dess-Martin高碘烷或Parikh-Doering氧化(DMSO,SO3·pyr,三乙胺)，随后氧化醛为羧酸，使用例如，Pinnick氧化(NaClO2,叔丁醇,NaH2PO4)。直接氧化为醇(4)向羧酸(5)的一步氧化方法。通常该一步氧化方法包括用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)、NaOCl、NaOCl2在约4的pH处理醇(4)。
羧酸(5)的酯化以提供甲酯(6)可以众多方式进行。所述羧酸(5)可用适用于形成羧酸酯阴离子的碱(例如DBU)和甲基化剂诸如甲基碘或硫酸二甲酯处理。可替换地，所述羧酸(5)可用碳二亚胺试剂诸如N,N′-羰基二咪唑活化、然后用甲醇淬灭以提供甲酯(6)。
形成乙酸叔丁酯的碱金属烯醇盐可用碱金属碱诸如LDA或NaHMDS进行。使所述碱金属烯醇盐与甲酯(6)反应以形成酮酯(7)。
在一些实施方案中，可期望进一步改善所述酸(5)的纯度。因此，在实施方案44中，本发明提供了如在实施方案43中阐述的方法，其中所述方法还包括：
(i.)将羧酸(5)用胺处理以形成(5)与胺的盐
Figure BDA0001647981110000261
(胺-5)；
(ii.)分离所述盐(胺-5)；且
(iii.)使所述盐(胺-5)与酸(例如柠檬酸)反应以提供纯化的羧酸(5)。
在一些实施方案中，用于处理羧酸(5)的胺可为手性胺诸如叔丁基胺。在其他实施方案中，所述酸(5)用处理a手性胺诸如苯基甲基胺、苯基乙基胺、1-氨基-2-茚满醇、1-(1-萘基)乙基胺、1-(2-萘基)乙基胺、辛可宁或去甲麻黄碱(norephredine)。在实施方案45中，所述羧酸(5)用(1R,2S)-(+)-cis-1-氨基-2-茚满醇处理。
在实施方案46中，本发明提供了如在实施方案43-45中任一项阐述的方法，其中所述醇(4)通过以下来制备：
(i.)使二醇
Figure BDA0001647981110000262
与丙酮化合物形成剂和酸反应以形成丙酮化合物
Figure BDA0001647981110000263
和
(ii.)将丙酮化合物(3a)用碱金属C1-C3醇盐处理以形成醇(4)。
在实施方案47中，在实施方案46中的与二醇(3)反应的丙酮化合物形成剂为2,2-二甲氧基丙烷、2-甲氧基丙烯或丙酮。在实施方案48中，所述丙酮化合物形成剂为2,2-二甲氧基丙烷。
在实施方案49中，在实施方案46、47或48中的用于形成醇(4)的所述碱金属C1-C3醇盐为甲醇钠。
在实施方案50中，本发明提供了如在实施方案46-49中任一项阐述的方法，其中所述二醇(3)通过来使二乙酰氧基醇
Figure BDA0001647981110000264
与脂酶接触制备。
在实施方案51中，与二乙酰氧基醇(I-2)接触的脂酶为南极假丝酵母脂酶A。
在实施方案52中，本发明提供了如在实施方案50和51中任一项阐述的方法，其中所述二乙酰氧基醇(I-2)通过将锂化的炔加合物
Figure BDA0001647981110000271
Figure BDA0001647981110000272
添加至二乙酰氧基丙酮
Figure BDA0001647981110000273
来制备。
在另一方面，本发明提供了用于制备某些用于制备式(IA)化合物的合成中间体的方法。因此，在实施方案53中，本发明提供了使用在实施方案33-52中任一项阐述的条件用于制备内酯
Figure BDA0001647981110000274
的方法。在实施方案54中，本发明提供了使用在实施方案33和36-52中任一项阐述的条件用于制备内酯
Figure BDA0001647981110000275
的方法。
在实施方案55中，本发明提供了使用在实施方案5-13、16和31-52中任一项阐述的条件用于制备经保护的核苷
Figure BDA0001647981110000276
的方法，其中X为H、F、Cl或Br。在一类该方法的实施方案中，所述经保护的核苷(A2aa)为
Figure BDA0001647981110000281
在实施方案56中，本发明提供了使用在实施方案17-24和31-52中任一项阐述的条件用于制备经保护的核苷
Figure BDA0001647981110000282
的方法，其中X为H、F、Cl或Br。在一类该方法的实施方案中，所述经保护的核苷(A2bb)为
Figure BDA0001647981110000283
在实施方案57中，本发明提供了使用在实施方案25-52中任一项阐述的条件用于制备经保护的核苷
Figure BDA0001647981110000284
的方法，其中X为H、F、Cl或Br且RS7为H、F、Cl、Br或CH3。在具体的一类该方法的实施方案中，X为Cl且RS7为F。在具体的另一类该方法的实施方案中，X为Cl且RS7为H。
在另一方面，本发明提供了用于制备式(IA)化合物的合成中间体。因此，在实施方案58中，本发明提供了经保护的核苷(A2aa)、(A2bb)、(A2a)、(A2b)或(A3a)。
在实施方案59中，本发明提供了经保护的核苷(A2aa)。
在实施方案60中，本发明提供了经保护的核苷(A2b)。
在实施方案61中，本发明提供了经保护的核苷(A3a)，其中X为H、F、Cl或Br且RS7为H、F、Cl、Br或CH3。在一类该实施方案中，经保护的核苷(A3a)中的X为Cl且RS7为F。在另一类该实施方案中，X为Cl且RS7为H。
在实施方案62中，本发明提供了内酯
Figure BDA0001647981110000291
在实施方案63中，本发明提供了内酯
Figure BDA0001647981110000292
在实施方案64中，本发明提供了糖
Figure BDA0001647981110000293
在实施方案65中，本发明提供了糖
Figure BDA0001647981110000294
本申请采用的缩写和首字母缩写包括以下：
Figure BDA0001647981110000295
Figure BDA0001647981110000301
本发明化合物可通过有机化学领域中众所周知的方法制备。参见，例如，J.March,‘Advanced Organic Chemistry’6th Edition,John Wiley and Sons。在合成顺序期间，可必需和/或期望保护任何所涉及分子上的敏感或反应性基团。这借助常规保护基(诸如T.W.Greene and P.G.M.Wutts‘Protective Groups in Organic Synthesis’4thEdition,John Wiley and Sons中所述的那些)实现。保护基任选地在方便的后续阶段使用本领域众所周知的方法去除。
式I化合物可以容易地根据以下反应方案和实施例或其修改方案，使用容易可得的起始材料和试剂制备。在这些反应中，也可使用本身是本领域普通技术人员已知但未更详细地提及的变体。此外，根据以下反应方案和实施例，用于制备本发明化合物的其它方法对于本领域普通技术人员将显而易见。除非另外指明，否则所有变量均如上文定义。
方案1
Figure BDA0001647981110000311
当用类型R1-Cl的氯化物在碱诸如三乙胺的存在下处理时，化合物1可选择性地在5’-OH反应以提供类型1-2的化合物。
方案2
Figure BDA0001647981110000312
化合物1可选择性地用5’-OH保护基(PG)保护以提供中间体2-2。使2-2与类型R2-Cl的氯化物在碱诸如三乙胺的存在下反应以产生中间体2-3。移除5’-OH的保护基可提供类型2-4的化合物。
方案3
Figure BDA0001647981110000313
化合物1可用类型R1-Cl的氯化物在碱诸如三乙胺的存在下处理以产生中间体3-2。中间体3-2可用类型R2-Cl的氯化物在碱诸如三乙胺的存在下处理以产生类型3-3化合物。
方案4显示本发明方法的一个实施方案，其中制备内半缩醛10A。相比于公开的操作(其披露了制备适用于制备FdA的4-乙炔基-2-脱氧糖偶联配偶体)，诸如M.Kageyama etal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,76(6)1219-1225(2012)，方案4中所述方法采用更易获得的其实物质，且能够以更大规模进行而不进行色谱。
方案4
Figure BDA0001647981110000321
如在方案4所示，将二羟基丙酮用乙酸酐乙酰化以提供二乙酰氧基丙酮(I-1)。将乙炔基三异丙基甲硅烷的锂加合物添加至二乙酰氧基丙酮(I-1)中以得到二乙酰氧基醇(I-2)。用脂酶(诸如南极假丝酵母脂酶A)处理二乙酰氧基醇得到对映异构体富集的二醇(3)。酶水解选择性地得到R-二醇，其中对映异构体过量百分数(％ee)大于90％诸如92-96％ee。
通过如下发生二醇(3)向醇(4)的转化：首先将二醇(3)用丙酮化合物形成剂诸如2,2-二甲氧基丙烷、丙酮或2-甲氧基丙烯和酸诸如吡啶鎓对甲苯磺酸盐处理；随后将中间体丙酮化合物用碱金属C1-C3醇盐诸如甲醇钠处理以移去乙酸酯基团。本领域技术人员应认识到可使用可选择的缩酮形成剂诸如二乙基缩酮、环戊基缩酮和环己基缩酮来代替丙酮化合物形成剂，以形成相似地经缩酮保护的合成中间体。
由醇(4)形成酮酯(7)通过如下发生：用氧化剂氧化醇(4)，随后酯化所得的羧酸(5)；然后将酯与乙酸叔丁酯的碱金属烯醇盐缩合。在一个实施方案中，所使用的氧化条件包括试剂2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)、NaOCl、NaOCl2以及具有约4的pH的缓冲***。其他适当的氧化***包括Dess-Martin高碘烷、(二乙酰氧基)碘苯(DAIB)和Parikh-Doering氧化(DMSO、SO3·吡啶、三乙胺)。将羧酸(5)酯化以制备甲酯(6)，其通过使用硫酸二甲酯和碱或通过使用甲醇和碳二亚胺-偶联剂诸如N,N′-羰基二咪唑。
任选地，羧酸(5)的纯度可通过如下改善：用胺诸如手性胺形成羧酸的盐、分离胺盐，随后用酸处理以破坏所述盐。
将酮酯(7)诸如在不对称转移氢化条件下还原以提供TIPS中间体(8)。适当的手性催化剂包括基于钌的催化剂以及手性配体诸如来自Takasago InternationalCorporation,Tokyo,Japan的DENEBTM以及还原剂诸如甲酸/三乙胺。将三异丙基甲硅烷基团由TIPS中间体(8)移去，其通过用氟化剂诸如氟化钾或四丁基氟化铵处理以提供二氧杂环戊烷(9)。
在酸性条件(例如HCl)下脱保护和内酯化提供内酯(10D)，其可分离为固体。将内酯(10D)用对甲基苯甲酰化剂(方案4中的对甲基-Ph-C(O)X1，其中X1为离去基团)诸如对甲基苯甲酰基氯进行酰基化以提供内酯(10)。将内酯(10)用选择性还原剂诸如二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠还原以提供内半缩醛(10A)。
方案5
Figure BDA0001647981110000331
方案5显示以下方法的实施方案，其中将内半缩醛转化为偶联前体(C1)、(C2)和(C3)。糖(C1)通过使内半缩醛10A与乙酸酐反应来制备。糖(C2)通过用盐酸处理糖(C1)来制备。糖(C3)通过处理内半缩醛(10A)或糖(C1)来制备。
方案6显示了用于制备式(IA)化合物的方法的一种实施方案，其中X、Y、Z、Z1和LG如上阐述。
方案6
Figure BDA0001647981110000341
如在方案6中所示，使糖(C)与核碱基(B)偶联以提供经保护的核苷(A)。将经保护的核苷(A)转化为式(IA)化合物。
方案7显示了用于制备EFdA(其中在式IA化合物中，X为F，Y为N且Z为NH2)的方法的一种实施方案。
方案7
Figure BDA0001647981110000342
将2-氟腺嘌呤的氨基用保护基保护。在具体的实施方案中，所述氨基保护基为三甲基甲硅烷基。将含有核碱基的反应混合物与糖(C1)在路易斯酸的存在下合并以提供经保护的核苷(A1)。转化经保护的核苷(A1)以得到EFdA可通过如下实现：用碱金属C1-C3醇盐(例如NaOCH3)处理，其使对甲苯酰基和TMS基团同时断裂。在替代的实施方案中，所述转化可通过用NH3在C1-C3醇诸如甲醇中处理来实现。
在该实施方案的特定方面，将2-氟腺嘌呤用过量的BTMSA和路易斯酸诸如TMS-OTf处理。将含有核碱基的反应混合物与糖(C1)合并以提供经保护的核苷(A1)，其中氨基用TMS基团保护，以使得Z1为-N(H)Si(CH3)3。分离含有TMS-经保护的氨基的经保护的核苷(A1)是有利的，这是因为在浓缩反应混合物并冷却后，期望的β-端基异构体选择性地由反应混合物结晶。在一些实施方案中，分离的经保护的核苷(A1)显示有利于期望的β-端基异构体的超过99:1的比例。该特征避免了需要柱色谱纯化，并且由此降低了与使用大体积的用于洗脱柱的有机溶剂相关的环境和开支负担。
方案8显示了用于制备EFdA的方法的另一实施方案，其中Rs如上阐述。
方案8
Figure BDA0001647981110000351
如在方案8中所示，将糖(C3)用活化剂诸如碘活化，然后与经氨基甲酸酯保护的2-氟腺嘌呤偶联以提供经保护的核苷(A2)。经保护的核苷转化为EFdA通过移除氨基甲酸酯和对甲苯酰基保护基来实现。
在该实施方案的特定方面，将核碱基中的氨基和经保护的核苷用Boc基团保护。用碱金属C1-C3醇盐(例如NaOCH3)处理Boc-经保护的核苷(A2)使糖部分上的对甲苯酰基断裂，并且用强酸(例如TFA)处理移除了氨基甲酸酯保护基以提供EFdA。在一些实施方案中，将Boc-经保护的核苷(A2)用强酸处理，之后用碱金属C1-C3醇盐处理。在其他实施方案中，用碱金属C1-C3醇盐处理发生在用强酸处理之前。
方案9显示了适于制备具有经取代的7-脱氮腺嘌呤部分的4′-乙炔基-2′-脱氧核糖核苷的一般方法，其中RS7为H、F、Cl或Br。
方案9
Figure BDA0001647981110000361
如在方案9中所示，经保护的核苷(A3)通过使糖(C2)与核碱基(B2)的钠盐偶联形成。用氨诸如氨在C1-C3醇中的溶液处理经保护的核苷(A3)得到式(IA-2)化合物。
一般化学操作:所有试剂均购自常见商业来源或根据文献程序由市售试剂合成。市售试剂未经进一步纯化即使用。除非另外指示，否则百分比为鉴于组分和组合物总重量的重量百分比，温度以℃计或为环境温度，且压力为大气压或接近大气压。在Varian VNMR***400(400MHz)上获得1H NMR波谱，且报道为从Me4Si向低场的ppm，其中在括号中指示质子数、多样性和偶联常数＝ants(以赫兹计)。当呈现LC/MS数据时，使用Agilent 6110A MSD或Applied Biosystems API-100质谱仪进行分析。给出母体离子。在装配有WatersXselect.C18柱的Waters制备型HPLC***上，通常使用以水/乙腈(含有0.075％三氟乙酸)的梯度洗脱进行制备型HPLC。使用来自Biotage,Inc.的预装正相硅胶或来自FisherScientific的本体硅胶进行快速柱色谱。除非另外指示，否则使用石油醚100％至100％乙酸乙酯的石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱进行柱色谱。实施例中的术语"室温"是指通常在约20℃至约26℃范围内的环境温度。
实施例1
合成(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(1)
Figure BDA0001647981110000371
步骤1:合成2,4-二氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
将2,4-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1g,5.32mmol)称重于250mL圆底烧瓶中并经P2O5真空干燥过夜。在室温向其中注射乙腈(60mL)和乙酸(12mL)，随后在氩气气氛下加入1-(氯甲基)-4-氟-1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷-1,4-二鎓四氟硼酸盐(2.64g,7.45mmol)。将混合物加热至70℃并搅拌36小时。将所得的混合物冷却至25℃，用DCM(150mL)稀释，用水(2x 50mL)和盐水(2 x 50mL)先后洗涤。收集有机层，经无水硫酸钠干燥，滤过并将滤液减压浓缩。硅胶柱纯化(使用乙酸乙酯/石油醚(0％至20％EtOAc/石油醚))得到粗固体，将其进一步经C18硅胶柱反相色谱纯化，采用以下条件：柱,60A,120g；流动相,水(含有0.05％TFA)和乙腈(5％乙腈直至40％，15min,40％直至47％，5min，保持47％5min，直至95％，3min，降至5％，5min)；检测器,UV 254nm。收集含有产物的馏分，用EtOAc(2 x 50mL)萃取。收集有机层，用盐水(2 x 30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，滤过并将滤液减压浓缩得到2,4-二氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶。LC-MS:(ES,m/z):206.05[M+H]+.1H-NMR:(300MHz,d6-DMSO,ppm):δ12.71(brs,1H),7.77(d,J＝2.4Hz,1H).19F-NMR:(282MHz,d6-DMSO,ppm):δ-169.79(s,1F).
步骤2:合成二乙酸2-氧代丙-1,3-二基酯
在0℃向1,3-二羟基丙-2-酮(90g,999mmol)在吡啶(400ml)中的溶液中加入乙酸酐(408g,3997mmol)。在将所得的混合物在20℃搅拌16小时后，将其减压浓缩。将残留物用DCM(1000mL)稀释，用2N HCl(2 x 1000mL)、NaHCO3(3 x 1000mL)洗涤。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，滤过并减压浓缩。将残留物倒入搅拌的石油醚(1500mL)中，将产物沉淀析出并滤过得到二乙酸2-氧代丙-1,3-二基酯。H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm):δ4.76(s,4H),2.18(s,6H).
步骤3:合成二乙酸2-羟基-2-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)丙-1,3-二基酯
在氩气下在-78℃搅拌下向乙炔基三异丙基甲硅烷(58.6g,322mmol)在THF(500ml)中的溶液中逐滴加入正丁基锂(127mL,318mmol)。将所得的溶液在-60℃搅拌1小时。在-78℃搅拌下向该溶液中逐滴加入二乙酸2-氧代丙-1,3-二基酯(56g,322mmol)在THF(100mL)中的溶液。将所得的溶液在搅拌下在-60℃反应额外的1小时。然后将反应混合物在-78℃通过加入25mL AcOH淬灭。将所得的溶液用500mL MTBE稀释。将所得的混合物用1 x450mL柠檬酸(10％)洗涤。将合并的有机萃取物用2 x 300mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩得到二乙酸2-羟基-2-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)丙-1,3-二基酯，其为液体。H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm):δ4.26(d,d,J＝11.4Hz,13.2Hz,4H),3.22-3.05(bs,1H),2.11(s,6H),1.09-0.99(m,21H).
步骤4:合成(R)-乙酸2-羟基-2-(羟基甲基)-4-(三异丙基甲硅烷基)丁-3-炔-1-酯
在氩气下在环境温度向KH2PO4/KOH(240mL,0.1M,pH＝7.5)和NovoCor AD L(60g,140mmol)的混合物中加入二乙酸2-羟基-2-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)丙-1,3-二基酯(50g,140mmol)在甲醇(240ml)中的溶液。将所得的溶液在30℃搅拌16小时。反应进程经TLC监测。将所得的溶液用1000mL盐水和MTBE(1000mL)稀释，加入
Figure BDA0001647981110000391
545(50g)，并在30℃搅拌30分钟。然后将混合物滤过，并将滤液用3 x 1000mL MTBE萃取。将合并的有机层用盐水(3 x 500mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥并滤过。将滤液减压浓缩得到(R)-乙酸2-羟基-2-(羟基甲基)-4-(三异丙基甲硅烷基)丁-3-炔-1-基酯。H-NMR:(400MHz,CDCl3,ppm):δ4.35(d,J＝11.2Hz,1H),4.23(d,J＝11.2Hz,1H)3.75-3.65(d,d,J＝11.2Hz,26.0Hz,2H),2.70-2.50(bs,1H),2.13(s,3H),1.09-1.00(m,18H),0.92-0.89(m,3H).
步骤5:合成(S)-(2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)甲醇
向(R)-乙酸2-羟基-2-(羟基甲基)-4-(三异丙基甲硅烷基)丁-3-炔-1-基酯(70g,223mmol)在MTBE(350ml)和乙腈(280ml)中的溶液中加入PPTS(8.39g,33.4mmol)和2,2-二甲氧基丙烷(70g,672mmol)。将所得的溶液在50℃搅拌4小时。随后在0℃搅拌下向其中逐滴加入甲醇钠(111ml,111mmol)。将所得的溶液在25℃搅拌额外的30分钟，然后将pH值由10％柠檬酸调节为7。将所得的混合物用600ml MTBE稀释并用2 x 200mL碳酸氢钠洗涤。将合并的有机层用盐水(3 x 300mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩得到(S)-(2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)甲醇。H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm):δ5.30(s 1H),4.14-4.13(m,2H),3.75-3.70(m,1H),3.65-3.55(m,1H),1.85-1.95(m,1H),1.54(s,3H),1.44(s,3H),1.08-1.01(m,21H).
步骤6:合成(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸
在氩气下在环境温度向(S)-(2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)甲醇(52g,166mmol)在MTBE(200ml)和丙酮(165ml)中的混合物中加入TEMPO(2.86g,18.30mmol)、NaOCl(36.1g,399mmol)和NaClO2(124g,166mmol)在水中的溶液、NaH2PO4·H2O(120g)在水(600ml)中的溶液。将所得的混合物温热至35℃并在氩气下搅拌4小时。反应进程经TLC监测。将反应混合物冷却至环境温度。将有机层用200mL NaHSO3和2 x 200mL水洗涤，经无水硫酸钠干燥。将滤液减压浓缩得到(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸。H-NMR:(300MHz,d6-DMSO,ppm):δ13.50(s,1H),4.34(d,J＝8.7Hz,1H),4.09(d,J＝8.7Hz,1H),3.08(s,1H),1.41(s,3H),1.36(s,3H),1.03-0.96(m,21H).
步骤7:合成(1R,2S)-2-羟基-2,3-二氢-1H-茚-1-铵(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸盐
在氩气下在环境温度向(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸(120g,368mmol))在MTBE(1000ml)中的混合物中加入(1R,2S)-1-氨基-2,3-二氢-1H-茚-2-醇(49.3g,331mmol)。将所得的混合物温热至50℃并在氩气下搅拌4小时。4小时后，将溶液缓慢冷却至25℃并在氩气下搅拌24小时。将固体经滤过收集并用MTBE(3 x 300ml)洗涤得到(1R,2S)-2-羟基-2,3-二氢-1H-茚-1-铵(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸盐。H-NMR:(300MHz,d6-DMSO,ppm):δ7.66-7364(m,1H),7.26-7.17(m,3H),4.73-4.72(m,1H),4.51-4.49(m,1H),4.26-4.18(m,2H),3.16-3.12(m,2H),1.50(s,3H),1.3 7(m,3H),1.30-1.22(m,2H),0.97(s,18H),0.88-0.86(m,1H).
步骤8:合成(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸甲酯
在0℃向(1R,2S)-2-羟基-2,3-二氢-1H-茚-1-铵(R)-2,2-二甲基-4((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸盐(160g,336mmol)在MTBE(2000ml)中的混合物中加入1000mL柠檬酸(10％)。将混合物搅拌10分钟。收集有机层，用3 x 1000mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并滤过。将滤液减压浓缩得到100g(4R)-2,2-二甲基-4-[2-[三(丙-2-基)甲硅烷基]乙炔基]-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸，其为液体。在氩气下在环境温度向100g(4R)-2,2-二甲基-4-[2-[三(丙-2-基)甲硅烷基]乙炔基]-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸在DMF(1000ml)中的溶液中加入Cs2CO3(329g,1009mmol)和MeI(52.6ml,841mmol)。将所得的溶液在环境温度搅拌过夜。将固体滤出。将所得的滤液用2500mL EA稀释。将所得的混合物用3 x 1000mL盐水洗涤。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并滤过。将滤液减压浓缩得到(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸甲酯。H-NMR:(400MHz,CDCl3,ppm):δ4.48(d,J＝8.8Hz,1H),4.22(d,J＝8.8Hz,1H),3.83(s,3H),1.53(s,3H),1.49(s,3H),1.10-1.02(m,21H).
步骤9:合成(R)-3-(2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-氧代丙酸叔丁酯
历时40分钟向二异丙基胺(53.7g 532mmol)在THF(500ml)中的溶液中加入n-BuLi(212mL 2.5mol在己烷中)，同时内部温度保持低于-68℃。在氩气下在-78℃向LDA溶液中加入乙酸叔丁酯(61.4g,529mmol)在THF(1000ml)中的溶液。将所得的混合物在氩气下(-60℃)搅拌1小时。在-78℃向混合物中加入(R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊烷-4-羧酸甲酯(90g,264mmol)在THF(200ml)中的溶液。反应进程经TLC监测。将所得的溶液在搅拌下在-78℃反应额外的1小时。然后将反应混合物通过加入15ml AcOH淬灭。将所得的溶液用2500mL MTBE稀释。将合并的有机层用盐水(4 x 1000mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并滤过。将滤液减压浓缩得到(R)-3-(2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-氧代丙酸叔丁酯。H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm):δ4.52(d,J＝8.7Hz,1H),4.43(d,J＝8.7Hz,1H),3.68(dd,J＝16.5Hz,36.6Hz,2H),1.49-1.45(m,15H),1.09-0.98(m,21H).
步骤10:合成(S)-3-((R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-羟基丙酸叔丁酯
在氩气下向搅拌并冷却的Et3N(32.8ml,235mmol)在THF(50ml)中的0℃溶液中加入甲酸(27.1g,589mmol)。将混合物在环境温度搅拌10分钟(烧瓶1)。向含有(R)-3-(2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-氧代丙酸叔丁酯(100g,235mmol)在THF(1000ml)和MTBE(250ml)中的搅拌的溶液的第二个烧瓶中加入((S,S)-TS-DENEB(0.345g,0.530mmol)。将制备的甲酸/Et3N混合物由烧瓶1加入至烧瓶2。将反应混合物在38℃在氩气下搅拌。反应经TLC监测。11小时后，将反应混合物冷却至22℃，然后加入10％柠檬酸溶液(500mL)。将混合物搅拌并分离各层。将有机溶液用Ecosorb C-941(25g)处理。将浆液搅拌1小时并滤过。将滤液减压浓缩得到(S)-3-((R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-羟基丙酸叔丁酯。产物无需进一步纯化即可直接用于下一步。H-NMR:(400MHz,CDCl3,ppm):δ4.22(d,J＝8.4Hz,1H),4.11(d,J＝8.4Hz,1H),4.03-4.02(m,1H),2.78-2.70(m,2H),2.48-2.39(m,1H),1.50-1.41(m,15H),1.08-1.04(m,21H).
步骤11:合成(S)-3-((R)-4-乙炔基-2,2-二甲基-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-羟基丙酸叔丁酯
在氩气下在0℃在搅拌下向(S)-3-((R)-2,2-二甲基-4-((三异丙基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-羟基丙酸叔丁酯(40g,94mmol)在THF(300ml)中的混合物中逐滴加入1M TBAF/THF(94ml)。在将反应混合物在25℃搅拌20分钟后，将其在0℃通过饱和盐水(100mL)淬灭。将所得的混合物用MTBE(2500mL)稀释。将有机层用盐水(4 x 1000mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并滤过。将滤液减压浓缩得到(S)-3-((R)-4-乙炔基-2,2-二甲基-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-羟基丙酸叔丁酯。H-NMR:(400MHz,CDCl3,ppm):δ4.21(d,d,J＝8.4Hz,40.0Hz,2H),4.17-4.15(m,1H),3.30-3.20(brs,1H),2.72-2.71(m,1H),2.56-2.54(m,2H),1.50-1.47(m,15H).
步骤12:合成(4S,5R)-5-乙炔基-4-羟基-5-(羟基甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮
历时2分钟在搅拌下在0℃向(S)-3-((R)-4-乙炔基-2,2-二甲基-1,3-二氧代环戊-4-基)-3-羟基丙酸叔丁酯(40g,148mmol)在1,2-DME(200ml)中的混合物中逐滴加入HCl(36.5ml,444mmol)。在将混合物在45℃搅拌1小时后，将其减压浓缩。在搅拌下在环境温度将乙酸异丙酯(50ml)逐滴加入至残留物中且保持16h。将固体经滤过收集得到(4S,5R)-5-乙炔基-4-羟基-5-(羟基甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮。H-NMR:(400MHz,DMSO,ppm):δ5.82(d,J＝5.6Hz,1H),5.56(t,J＝6.0Hz,12.0Hz,1H),4.75(s,1H),4.38-4.34(m,2H),2.94-2.87(m,1H),2.39-2.34(m,1H).
步骤13:合成(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)-5-氧代四氢呋喃-3-基酯
在0℃在氩气下向(4S,5R)-5-乙炔基-4-羟基-5-(羟基甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮(8.5g,54.4mmol)在吡啶(90mL)中的混合物中加入4-甲基苯甲酰基氯(15.11mL,114mmol)。将所得的混合物在0℃在氩气气氛下搅拌2小时。将反应混合物倒入冰水(300mL)中并搅拌10分钟。将混合物滤过，将滤饼用冰水(10 x 100mL)洗涤，然后在25℃干燥24小时得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)-5-氧代四氢呋喃-3-基酯。LC-MS:(ES,m/z):393.20[M+H]+1,H-NMR(300MHz,CDCl3,ppm):δ8.00(d,J＝8.1Hz,2H),7.91(d,J＝8.1Hz,2H),7.30-7.25(m,4H),5.85-5.82(m,1H),4.77(dd,J＝9.0Hz,2H),3.27-3.18(m,1H),2.94-2.87(m,1H),2.73(s,1H),2.44(d,J＝3.9Hz,6H).
步骤14:合成(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-羟基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
在3分钟内在搅拌下在氩气下在-78℃在100-mL三颈圆底烧瓶中向(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)-5-氧代四氢呋喃-3-基酯(1160mg,2.96mmol)在无水甲苯(30mL)和DCM(6mL)中的搅拌的溶液中逐滴加入二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝(III)钠/甲苯溶液(70％w/w,0.598g,2.96mmol)。将所得的溶液在同一温度搅拌90分钟。反应进程经TLC监测。将反应混合物通过加入乙酸(1.7mL)淬灭，然后加入盐酸(1N,30mL)并将混合物用乙酸乙酯(3 x 30mL)萃取。将合并的有机馏分用盐水(饱和,2 x 30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，滤过并真空浓缩。将残留物经硅胶柱色谱纯化(使用乙酸乙酯/石油醚(15/85))得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-羟基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯。H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm):δ7.92-8.00(m,4H),7.19-7.27(m,4H),5.74-5.84(m,1H),5.65-5.70(m,1H),4.68(s,1H),4.54(dd,J＝11.4Hz,35.4Hz,1H),2.49-2.61(m,2.5H),2.36-2.42(m,6.5H).
替代性指标如下描述，其省略了色谱纯化。
在搅拌下在-60℃历时2小时向(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)-5-氧代四氢呋喃-3-基酯(4.5g,22.94mmol)在甲苯(67.5mL)和DCM(9mL)中的搅拌的溶液中逐滴加入二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝(III)钠/甲苯溶液(65％w/w,0.3.57g,11.47mmol)。将所得的溶液在同一温度搅拌2小时。反应进程经LC监测。将反应混合物通过历时20分钟加入乙酸(1.31mL,22.94mmol)淬灭，保持温度低于-60℃。加入MTBE(22.50mL)，随后加入柠檬酸水溶液(10wt％,22.5mL)和盐酸(1N；90.0mL)。分离有机相，经无水硫酸镁干燥，滤过并真空浓缩得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-羟基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯。产物无需进一步纯化即可用于下一转化。
步骤15:合成(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
在氩气下在100-mL三颈圆底烧瓶中向(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-羟基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(925mg,2.345mmol)在无水DCM(30mL)中的搅拌的溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(430mg,3.52mmol)，随后在搅拌下在0℃逐滴加入乙酸酐(0.332ml,3.52mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液。将所得的溶液在0℃搅拌1小时。将反应混合物用水(30mL)淬灭并用二氯甲烷(3 x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(2 x30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，滤过并真空浓缩。将残留物经硅胶柱色谱纯化(使用乙酸乙酯/石油醚(10/90))得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯。H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm):δ7.90-8.10(m,4H),7.19-7.27(m,4H),6.45-6.50(m,1H),5.84(t,J＝7.5Hz,1H),4.72-4.75(d,J＝11.7Hz,1H),4.50-4.61(m,1H),2.64-2.78(m,3H),2.40-2.43(m,6H),1.90(s,3H).
替代性制备如下描述，其省略了色谱纯化。
在0℃向(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-羟基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(26.0g,65.9mmol)在DCM(130mL)中的搅拌的混悬液中加入乙酸酐(9.35mL,99mmol)、三乙胺(11.91mL,86mmol)和4-二甲基氨基吡啶(1.61g,13.18mmol)。将所得的溶液在0℃搅拌2.5小时，然后用MTBE(650mL)和柠檬酸水溶液(10wt％；130mL)淬灭。将有机层用柠檬酸水溶液(10wt％；130mL)和水(3 x 130mL)洗涤，然后真空浓缩得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯。产物无需进一步纯化即可用于下一转化。
步骤16:合成(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-氯-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
将(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(7g,16.04mmol)经P2O5真空干燥过夜，然后加入至烘箱干燥的250ml圆底烧瓶中，随后在氩气气氛下在室温加入无水DCM(140mL)。将混合物搅拌直到其变澄清，然后冷却至0℃。使HCl气体鼓泡进入混合物，同时保持温度低于5℃。反应进程经LCMS监测。在鼓泡持续30分钟后，使氩气鼓泡进入混合物10分钟以除去溶解的残留的HCl。将所得的DCM溶液在冷的MTBE(210mL)和NaHCO3水溶液(饱和,105mL)的二相混合物之间分配。收集有机层，用冷的NaHCO3水溶液(饱和,2×105mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥并滤过。将滤液减压浓缩得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-氯-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(α/β＝2/1)，其无需进一步纯化即可直接用于下一反应步骤。LC-MS:(ES,m/z):1)Cl转化为OH,417.25[M+Na]+,377.36[M-OH]+。2)Cl转化为OMe,431.34[M+Na]+,377.36[M-OMe]+。H-NMR:(400MHz,CD3CN,ppm):δ8.02(d,J＝8.0Hz,41H),7.96-7.93(m,3H),7.36-7.26(m,4H),6.50-6.48(m,1H),5.94(t,J＝8.0Hz,0.3H),5.79(dd,J＝1.2Hz,J＝7.2Hz,0.6H),4.78(d,J＝11.6Hz,0.32H),4.57(d,J＝12.0Hz,0.32H),4.50(dd,J＝11.2Hz,J＝14.4Hz,1.21H),4.51-4.47(m,1H),3.06-3.04(m,1H),2.98-2.91(m,1.4H),2.74(d,J＝15.6Hz,0.6H),2.42-2.39(m,6H).
步骤17:合成(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(2,4-二氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
在氩气气氛下在-20℃在5分钟内向2,4-二氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(550mg,2.67mmol)在无水THF(18mL)中的搅拌的溶液中注射1M NaHMDS/THF(2.67mL,2.67mmol)。将所得的混合物在-20℃保持30分钟，然后逐渐温热至20℃。在5分钟内向其中注射(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-氯-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(918mg,2.223mmol)在无水THF(18mL)中的溶液。将所得的混合物在20℃搅拌6小时。将反应混合物通过加入稀HCl水溶液(0.5N,5mL)淬灭并用MTBE(3 x 50mL)萃取。收集有机层，用盐水(2 x 30mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥并滤过。将滤液减压浓缩，将残留物经硅胶柱纯化(使用乙酸乙酯/石油醚(0％至10％EtOAc/石油醚))得到粗产物。将粗产物(α+β混合物)用搅拌的MTBE(4mL)在室温处理15小时。固体由介质析出并经滤过收集，用冷的MTBE(2mL)洗涤，并真空干燥得到(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(2,4-二氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯。1H-NMR-(β异构体):(300MHz,CDCl3,ppm):δ8.02(d,J＝8.1Hz,2H),7.90(d,J＝8.1Hz,2H),7.29(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝8.1Hz,2H),7.09(d,J＝2.7Hz,1H),6.83(t,J＝6.0Hz,1H),5.90(t,J＝6.3Hz,1H),4.83(d,J＝12.0Hz,1H),4.61(d,J＝12.0Hz,1H),2.87(t,J＝6.3Hz,2H),2.71(s,1H),2.45,2.43(2s,6H)。19F-NMR(β异构体):(282MHz,CDCl3,ppm):δ-165.25(s,1F)。LC-MS:(ES,m/z):582.40[M+H]+.
步骤18:合成(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(1)
将(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(2,4-二氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(240mg,0.412mmol)称重于烘箱干燥的80ml钢瓶中并冷却至-40℃。向其中加入异丙醇/氨(i-PrOH/液体NH3＝1/1,v/v,在-40℃混合,30mL)。在将所得的混合物加热至80℃并搅拌16小时后，将其冷却至室温，然后减压浓缩。将残留物经硅胶柱色谱纯化(使用)DCM/MeOH(94/6)得到粗固体。将粗固体用DCM/MeOH(20/1,v/v,4mL)研磨并在室温搅拌2小时。形成析出物，然后经滤过收集，用DCM/MeOH(v/v,20/1,2 x 2mL)洗涤并冻干过夜得到(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇。1H-NMR:(300MHz,d6-DMSO,ppm):δ7.68(brs,2H),7.32(d,J＝2.0Hz,1H),6.44(t,J＝5.8Hz,1H),5.52(d,J＝5.6Hz,1H),5.27(t,J＝6.0Hz,1H),4.44(q,J＝6.4Hz,1H),3.60(q,J＝6.0Hz,1H),3.53(q,J＝6.4Hz,1H),3.48(s,1H),2.48-2.41(m,1H),2.37-2.30(m,1H).19F-NMR:(282MHz,d6-DMSO,ppm):δ-166.67(s,1F)。LC-MS:(ES,m/z):327.00[M+H]+.
实施例2
合成((2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸盐铵(2)
Figure BDA0001647981110000461
步骤1:合成2-((4,4,6,6-四氧化-1,3,5,2,4,6-三氧杂三膦烷-2-基)氧基)苯甲酸盐
在手套箱中在氩气气氛下将无水三丁基胺(0.4ml,1.679mmol)加入至含有溶于0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)中的三丁基铵焦磷酸盐(112mg,0.205mmol)的烧瓶中得到澄清溶液。然后在剧烈搅拌下将澄清的溶液注射至含有无水2-氯-4H-苯并[d][1,3,2]二氧杂膦-4-酮(27.6mg,0.136mmol)在二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液的烧瓶中。将所得的混合物在30℃搅拌30min得到2-((4,4,6,6-四氧化-1,3,5,2,4,6-三氧杂三膦烷-2-基)氧基)苯甲酸盐，其无需任何后处理即可直接用于下一反应。
步骤2:合成((2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸盐铵(2)
将(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(20mg,0.061mmol)称重于10mL烘箱干燥的圆底烧瓶中，然后经P2O5在高真空干燥过夜。向该烧瓶中加入活化的分子筛
Figure BDA0001647981110000471
(300mg)。在氩气气氛下将2-((4,4,6,6-四氧化-1,3,5,2,4,6-三氧杂三膦烷-2-基)氧基)苯甲酸盐(1.8eq,新鲜制备)在无水DMF(0.6ml)中的溶液经注射器转移至上述烧瓶中并将混合物在30℃搅拌3h。反应进程经TLC监测(乙腈:0.1M氯化铵＝7:3)。当大部分起始的核苷消耗时，将混合物冷却至0℃，随后注射碘溶液[3％碘/吡啶/水(9/1),～0.5mL]。随着碘消耗，持续逐滴加入碘溶液直到保护碘为永久的棕色。在15min后，在搅拌下在10℃加入三乙基碳酸氢铵缓冲液(1.0M,1.0mL)并将混合物搅拌15min。将挥发物减压除去(内部温度不超过25℃)。将残留物重新溶于水(2mL)中并用氯仿(2 x 2mL)萃取。然后将含有粗产物的收集的水层经制备性HPLC纯化，其采用以下条件(1#-Pre-HPLC-011(Waters)):柱:X Bridge Prep Amide,19*150mm,5um；流动相:含有50mmol碳酸氢铵的水和乙腈(90％乙腈至55％，10min,直至30％，2min)；检测器,UV 254&220nm。将含有产物的馏分收集并浓缩为约10mL的体积。然后将ACN(1mL)和TEAB缓冲液(2M,0.05mL)加入至溶液中，然后将混合物冻干40h得到((2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-乙炔基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸盐铵。LC-MS:(ES,m/z):564.95[M-H-4NH3]-.H-NMR:(400MHz,D2O,ppm):δ7.07(s,1H),6.46(s,1H),4.15-4.05(m,2H),2.56-2.49(m,2H)。P-NMR:(161MHz,D2O,ppm):δ-5.81(s,1P),-11.49--11.41(d,J＝13.20Hz,1P),-19.28(s,1P).
实施例3
由(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯合成(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(EFdA)
Figure BDA0001647981110000481
步骤1:合成(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-(2-氟-6-((三甲基甲硅烷基)氨基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
向2-氟-7H-嘌呤-6-胺(4.79g,31.3mmol)在MeCN(210mL)中的搅拌的溶液中加入N,O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(35.3mL,144mmol)。将反应混合物加热至81℃并搅拌1小时。将所得的溶液冷却至室温并加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(7.84mL,43.3mmol)，随后加入乙腈(105mL)。历时2小时向其中加入(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(10.5g,24.06mmol)在MeCN(100mL)中的溶液。将所得的混合物在81℃搅拌14小时，然后通过单蒸馏浓缩为150mL体积。将反应混合物用产物(0.1wt％)接种并缓慢冷却至室温得到浆液。将固体经滤过收集得到(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-(2-氟-6-((三甲基甲硅烷基)氨基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(6.73g)。1H-NMR-(β异构体):(400MHz,CDCl3,ppm):δ8.04(d,J＝8.0Hz,2H),7.94(d,J＝8.0Hz,2H),7.87(s,1H),7.20(d,J＝8.0Hz,2H),7.24(d,J＝8.0Hz,2H),6.52(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),6.07(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),5.50(s,1H),4.84(d,J＝12.0Hz,1H),4.69(d,J＝12.0Hz,1H),3.25–3.18(m,1H),2.91–2.85(m,1H),2.70(s,1H),2.46(s,3H),2.42(s,3H),0.41(s,9H).
步骤2:合成(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(EFdA)
将(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-(2-氟-6-((三甲基甲硅烷基)氨基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(6.0g,9.97mmol)溶于THF(60mL)并冷却至-25℃。缓慢加入甲醇钠/甲醇(30wt％；1.80g,9.97mmol)，保持内部温度低于-20℃。将反应混合物在-25℃搅拌16小时，然后用乙酸(1.14mL,19.94mmol)淬灭。将所得的溶液加热至45℃并浓缩为60mL。加入水(0.90g,49.9mmol)并将溶剂变更为CAN。将所得的浆液浓缩为50mL，冷却至室温并老化30分钟。将固体经滤过收集，用ACN(3 x 30mL)和水(2 x 6mL)洗涤，并干燥得到(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(2.93g)。1H-NMR:(600MHz,d6-DMSO,ppm):δ8.29(s,1H),7.82(br s,2H),6.24(dd,J＝7.2,5.0Hz,1H),5.55(d,J＝5.5,1H),5.27(dd,J＝6.8,5.7Hz,1H),4.57(m,1H),3.65(dd,J＝11.9,5.7Hz,1H),3.56(dd,J＝11.9,6.8Hz,1H),3.49(s,1H),2.70(m,1H),2.43(m,1H).19F-NMR:(282MHz,d6-DMSO,ppm):LC-MS:(ES,m/z):316.0818[M+Na]+.
实施例4
由(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-[4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯合成(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(EfdA)
Figure BDA0001647981110000501
步骤1:合成(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-[4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯.
在0℃向对甲苯磺酸一水合物(0.76g,4mmol)和4-戊烯-1-醇(0.38g,4.4mmol)在甲苯(20mL)中的搅拌的溶液中加入(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-5-羟基-2-[(4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]四氢呋喃-3-基酯(11.15wt％在甲苯中,14.15g,4mmol)。将反应混合物搅拌1小时并用水(30mL)淬灭。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)、水(30mL)和饱和氯化钠水溶液(30mL)洗涤。将所得的甲苯溶液经HPLC针对标准物进行测定得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-[4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯,(1.6g)。HRMS(QTof)m/z:[M+Na]+C28H30O6Na的计算值485.1940,实测值485.1926.
步骤2:合成(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-[4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯.
在0℃向(2R,3S)-4-甲基苯甲酸5-乙酰氧基-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(2.0g,4.58mmol)和4-戊烯-1-醇(0.395g,4.58mmol)在乙腈(20mL)中的搅拌的溶液中加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.083ml,0.458mmol)。将反应混合物搅拌45分钟并用饱和碳酸氢钠溶液(20mL)淬灭。将有机层用5％盐水溶液(20mL)洗涤，并浓缩有机相得到(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-[4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯。(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-[4-甲基苯甲酰基)氧基甲基]-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯(2.1g)。1H-NMR:(400MHz,DMSO,ppm,端基异构体混合物):δ8.01-7.88(m,8H),7.40-7.32(m,83),5.92-5.58(m,4H),5.40-5.27(m,2H),5.09-4.87(m,4H),4.64-4.35(m,4H),3.78-3.32(m,6H),2.70-2.41(m,4H),2.40-2.35(m,12H),2.20-2.12(m,2H),2.04-1.93(m,2H),1.69-1.61(m,2H),1.56-1.42(m,2H).
步骤3:合成(2-氟-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸叔丁酯.
在0℃向2-氟-9H-嘌呤-6-胺(20g,131mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(1.6g,13mmol)在THF(200mL)中的搅拌的混悬液中加入先前溶解于THF(100mL)中的一缩二碳酸二叔丁酯(100g,457mmol)。将所得的混悬液在0℃搅拌12小时，然后用MTBE(200mL)稀释并用水(200mL)淬灭。将有机层用柠檬酸水溶液(10wt％；100mL)、水(2 x 100mL)和饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤。然后将所得的溶液减压浓缩为100mL体积并用乙醇(无水,400mL)稀释。然后在20℃历时1小时加入氢氧化钠水溶液(2.5M,313mL,784mmol)并将该批次在该温度老化48小时。将溶剂减压蒸馏并将水溶液冷却至0℃并用盐酸(1N,705mL)中和得到浆液。将固体经滤过收集，用水(2 x 50mL)洗涤并干燥得到(2-氟-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸叔丁酯(20g,79mmol)。1H-NMR:(400MHz,DMSO,ppm):δ8.42(s,1H),1.954(s,9H).HRMS(QTof)m/z:[M+H]+C10H13FN5O2的计算值254.1052,实测值254.1053.
步骤4:合成(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
将(2R,3S)-4-甲基苯甲酸2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)-5-(戊-4-烯-1-基氧基)四氢呋喃-3-基酯(3.63g,7.85mmol)和(2-氟-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸叔丁酯(2.29g,9.04mmol)在乙腈(80mL)中的干燥的搅拌的混合物冷却至-25℃。加入碘(6.30g,24.8mmol)并将所得的混合物在氮气气氛下在-25℃搅拌17h。然后将反应混合物温热至0℃并在该温度搅拌另外的6h。将反应混合物用亚硫酸钠水溶液(10wt％；30mL)淬灭，用水(40mL)稀释，然后用甲基叔丁基醚(80mL)萃取。将所得的有机层用碳酸氢钠水溶液(7wt％；40mL)、然后氯化钠水溶液(2wt％；42mL)洗涤。将所得的有机层浓缩为35mL的体积，以形成浆液。向该搅拌的浆液中在环境温度缓慢加入水(12mL)。将所得的浆液在环境温度老化，然后滤过，用1:1乙腈/水(2 x 10mL)洗涤固体。将所得的固体干燥得到(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(3.00g)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3,ppm):δ8.06–-8.02(m,4H),7.92–7.89(m,2H),7.33–7.29(m,2H),7.26–7.22(m,2H),6.56(t,J＝6.5Hz,1H),6.08(dd,J＝7.2,5.5Hz,1H),4.89(d,J＝12.0Hz,1H),4.67(d,J＝12.0Hz,1H),3.24(ddd,J＝13.9,7.4,6.3Hz,1H),2.95(ddd,J＝14.0,6.9,5.4Hz,1H),2.73(s,1H),2.47(s,3H),2.43(s,3H),1.59(s,9H).HRMS(QTof)m/z:[M+H]+C33H33FN5O7的计算值630.2364,实测值630.2295.
步骤5:合成(9-((2R,4S,5R)-5-乙炔基-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-2-氟-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸叔丁酯
将(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(1.5g,2.382mmol)在四氢呋喃(10mL)和甲醇(5ml)的混合物中的搅拌的溶液冷却至–20℃。加入甲醇钠(1.634mL，25wt％在甲醇中的溶液,7.15mmol)并将反应混合物搅拌4h，同时经HPLC监测反应进程。将反应混合物通过加入磷酸(0.489ml,7.15mmol)淬灭并将反应混合物温热至室温并将固体滤过，用甲醇洗涤滤饼。将滤液浓缩得到(9-((2R,4S,5R)-5-乙炔基-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-2-氟-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸叔丁酯(0.47g)。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm).8.16(s,1H),7.97(s,1H),6.42-6.39(dd,J＝8.68,5.78Hz,1H),5.05-5.03(m,1H),4.74-4.73(m,1H),4.13-4.06(m,1H),3.91-3.85(m,1H),3.13-3.07(m,1H),2.82(S,1H)2.61(bs,1H),2.54-2.50(m,1H),1.57(s,9H)HRMS(QTof)m/z:[M+H]+C17H21FN5O5的计算值394.1527,实测值394.1526.
步骤6:合成(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(EFdA)
向(9-((2R,4S,5R)-5-乙炔基-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-2-氟-9H-嘌呤-6-基)氨基甲酸叔丁酯(0.05g,0.127mmol)在二氯甲烷(0.5ml)中的搅拌的溶液中加入三氟乙酸(0.1mL)。将反应混合物在20℃老化16h，然后浓缩得到(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(1)(0.012g)，其经HPLC测定证实为已知的标准物。
步骤7:合成(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯
在20℃向(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(0.5g,0.794mmol)在甲苯(5ml)中的搅拌的溶液中加入三氟乙酸(0.5mL)。将反应混合物老化24h，同时经HPLC监测反应进程。将反应混合物通过加入饱和碳酸氢钠(10mL)淬灭并加入乙酸乙酯(10mL)。将有机相用水(10mL)洗涤并浓缩得到(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(0.40g)。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm).8.3-8.1(d,J＝8.29Hz,2H),7.93-7.91(d,J＝8.29Hz,2H),7.89(s,1H),7.30-7.28(d,J＝8.29Hz,2H),7.23-7.21(d,J＝8.29Hz,2H),6.52-6.49(t,J＝6.68Hz,1H),6.07-6.04(dd,J＝7.22,5.35Hz,1H),5.89(bs,2H),4.86-4.83(d,J＝11.76Hz,1H),4.67-4.64(d,J＝11.76Hz,1H),3.22-3.18(m,1H),2.90-2.87(m,1H),2.69(s,1H),2.45(s,3H).2.44-2.43(m,1H),2.45(s,1H).HRMS(QTof)m/z:[M+H]+C28H25FN5O5的计算值530.1840,实测值530.1885.
步骤8:合成(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(EfdA)
将(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(0.084g,0.159mmol)在四氢呋喃(0.84mL)和甲醇(0.42ml)的混合物中的搅拌的溶液冷却至–20℃。加入甲醇钠(0.109mL，25wt％在甲醇中的溶液,0.476mmol)并反应混合物搅拌16h，同时经HPLC监测反应进程。将反应混合物通过加入磷酸(0.47g,0.476mmol)淬灭并将反应混合物温热至室温并将固体滤过，用甲醇洗涤滤饼。将滤液浓缩得到(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇(EfdA)(0.039g)，其经HPLC测定证实为已知的标准物。
RT聚合酶测定
在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达全长野生型和2种突变RT蛋白并纯化。简而言之，通过将生物素化的DNA引物退火至500核苷酸RNA模板来产生用于HIV-1RT聚合酶反应中的异二聚核酸底物。在测定缓冲液(62.5mM Tris-HCl,pH 7.8,1.25mM二硫苏糖醇,7.5mMMgCl2,100mM KCl,0.03％CHAPS,0.125mM EGTA)中组合HIV-1RT酶(50pM的最终浓度)与抑制剂化合物或DMSO(最终反应混合物中的10％DMSO)。将该混合物在室温在微量滴定板中预孵育30分钟。通过添加模板/引物底物(最终浓度：16.6nM)和dNTP(最终浓度：2μM dCTP、dGTP、dATP和66.6nM Ru-dUTP)来引发聚合反应。在37℃孵育90分钟后，通过添加EDTA(25mM)来淬灭反应混合物。将所得混合物在室温再孵育5分钟，随后将溶液(50μL)转移至来自Meso Scale Discovery(MSD)的封闭的抗生物素蛋白板中。在室温孵育混合物60分钟，然后经由ECL 6000成像仪器定量反应产物。所得数据显示于表1中。
表1
Figure BDA0001647981110000541
Viking测定:
在多轮HIV-1感染测定中评价抗病毒效力 使用MT4-gag-GFP克隆D3(下文命名为MT4-GFP)监测HIV-1复制，所述MT4-gag-GFP克隆D3是经修饰以携带GFP报告基因的MT-4细胞，其表达取决于HIV-1表达的蛋白tat和rev。MT4-GFP细胞被HIV-1的生产性感染导致在感染后约24小时的GFP表达。
将MT4-GFP细胞在37℃/5％CO2/90％相对湿度下维持在补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素和400μg/mL G418的RPMI 1640中以维持报告基因。对于感染，将MT4-GFP细胞放置于缺乏G418的相同培养基中并在相同孵育条件下以约0.01感染复数用H9IIIB病毒感染过夜。然后将细胞洗涤以1.6 x 105个细胞/mL再悬浮于含有10％或50％正常人血清的RPMI1640中(10％或50％NHS条件)或以2 x 105个细胞/mL再悬浮于100％正常人血清中(100％NHS条件)。通过使用ECHO声学分配器将溶解于DMSO中的化合物分配至384孔聚D赖氨酸涂覆的板的孔(0.2μl/孔)中来制备化合物板。以10点连续3倍稀释(典型最终浓度：8.4μM-0.43nM)测试各化合物。对照不包含抑制剂(仅DMSO)和三种抗病毒剂的组合(依法韦仑、茚地那韦和整合酶链转移抑制剂，最终浓度各自为4μM)。将细胞添加(50μL/孔)至化合物板中并将感染的细胞维持在37℃/5％CO2/90％相对湿度下。
在两个时间点(感染后～48小时和～72小时)通过使用Acumen eX3扫描仪计数各孔中绿色细胞的数目来定量感染的细胞。绿色细胞数目经～24小时时段的增加给出复制比率R0，其通常为5-15且已实验显示处于对数期(数据未显示)。对各孔计算R0的抑制，并通过非线性4参数曲线拟合测定IC50。
CTG测定:
在CellTiter-Glo发光细胞生存力测定(CTG)中评价细胞毒性
在37℃/5％CO2/90％相对湿度下将MT4-GFP细胞接种于补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素的RPMI 1640中过夜。然后洗涤细胞并以0.8 x 105个细胞/mL的密度再悬浮于含有10％正常人血清的RPMI 1640中。通过使用ECHO声学分配器(0.2μl/孔)将溶解于DMSO中的化合物分配至384孔固体黑色板(Corning 3571)的孔中来制备化合物板。以10点连续3倍稀释(最终浓度：8.4μM-0.43nM)测试各化合物。对照包含DMSO。将细胞添加(50μL/孔)至化合物板并维持在37℃/5％CO2/90％相对湿度下。在48小时孵育后，根据制造商的描述将CTG试剂(Promega，G7573)添加至细胞板中。在EnVision板读取器(PerkinElmer)上记录发光信号。通过非线性4参数曲线拟合测定LD50。所得数据显示于表2中，其中包括市售HIV核苷逆转录酶抑制剂AZT(叠氮胸苷、齐多夫定)作为对照。
表2
Figure BDA0001647981110000551
Figure BDA0001647981110000561
在人外周血单核细胞(PBMC)中的抗病毒持久性
PBMC获自Biological Specialty Corporation，其用5μg/ml PHA-P(SigmaL1668)活化72hrs，然后用新鲜培养基洗涤。活化后，将PBMC在含有10IU/ml IL-2(Roche11011456001)的培养基中培养。将细胞用化合物滴定处理6或24hrs并用新鲜培养基洗涤。为了评价洗涤后的抗病毒活性的持久性，将PBMC保持24h或72h，然后通过向板中加入野生型HIV-1-GFP病毒(17μL/孔)并在37℃/5％CO2/90％相对湿度下孵育来进行感染。通过使用Acumen eX3扫描仪计数各孔中的绿色细胞的数目，在感染后24小时定量感染的细胞。表3中的EC50值通过非线性4参数曲线拟合测定。
抗病毒持久性测定意欲评价去除核苷后抗病毒活性的持久性。表3中的数据表明本发明化合物相比于市售核苷AZT的抗病毒持久性。出版物AIDS Research and Therapy,2009,6:5强调了抗病毒持久性的价值。
表3
Figure BDA0001647981110000562
腺苷脱氨酶(ADA)半衰期
表4中的数据通过使底物化合物与1型人ADA在40℃在Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)存在下反应并通过LCMS监测起始材料的消耗来产生。50％转化成相应肌苷产物所必需的时间在表4中标注为T1/2。已知腺苷脱氨酶的脱氨基作用尤其在体内降低腺苷样核苷抑制剂的治疗潜力(参见以下参考文献)。当与EDA((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-乙炔基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇)和天然脱氧腺苷相比时，表4中显示的化合物已显示具有不同程度的对腺苷脱氨酶的稳定性。对ADA更耐受的化合物可能将具有更好的药代动力学特性。
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表4
Figure BDA0001647981110000571
NA:底物对腺苷脱氨酶不敏感。在用ADA孵育10天后观察到100％的底物。
尽管前述说明书教导本发明的原理(其中实施例出于举例说明的目的提供)，但本发明的实践涵盖随附权利要求书的范围内的所有通常变化、改编和/或修改。权利要求中无指定特定立体构型或少于全部手性中心具有此类指定的特定化合物(即物质)的记载或描述意欲涵盖化合物的外消旋物、外消旋混合物、各个别对映异构体、非对映异构混合物和各个别非对映异构体，其中此类形式由于存在一个或多个不对称中心而是可能的。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以其整体通过引用并入本公开。

Claims (8)

1.结构式I的化合物或其药用盐
Figure FDA0003656646480000011
其中：
R1为-H、
Figure FDA0003656646480000012
且R2为–H。
2.权利要求1的化合物，其为
Figure FDA0003656646480000013
或其药用盐。
3.权利要求1的化合物，其为
Figure FDA0003656646480000014
4.药物组合物，包含有效量的权利要求2的化合物或其药用盐和药用载体。
5.药物组合物，包含有效量的权利要求2的化合物或其药用盐和药用载体，且还包含有效量的选自抗HIV抗病毒剂、免疫调节剂或抗感染剂的抗HIV剂。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述抗HIV抗病毒剂是HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV融合抑制剂、HIV进入抑制剂或HIV成熟抑制剂。
7.权利要求2的化合物或其药用盐在制备用于治疗或预防HIV感染或治疗、预防或延迟AIDS发作的药物中的用途。
8.权利要求2的化合物或其药用盐在制备用于抑制HIV逆转录酶、治疗或预防HIV感染或治疗、预防或延迟AIDS发作的药物中的用途。
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