CN108287202A - 一种检测蜜醋黑豆中原花青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种蜜醋黑豆中原花青素的检测方法。该检测方法是先取浓盐酸用甲醇定容摇匀，配成盐酸‑甲醇溶液；再将烘干的蜜醋黑豆粉碎后过筛得干粉，取干粉加入盐酸‑甲醇溶液充分混匀，避光置于室温下静置，然后用滤膜过滤后，过滤液放置在4℃中保存，残渣再用提取剂浸泡，并重复上述操作后，合并得滤液；称取原花青素标准品，加入色谱纯甲醇溶液摇匀，用滤膜过滤，得到原花青素标准品溶液；将滤液加入色谱纯甲醇定容，摇匀，超声处理，冷至室温后用滤膜过滤，滤液于容量瓶中，经高效液相色谱分析，检测蜜醋黑豆中原花青素。利用该方法可以从蜜醋黑豆中快速、简单的提取得到原花青素，高效液相色谱法检测含量为1.34～1.81μg/kg。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化染料木苷技术领域，更具体地，涉及一种检测蜜醋黑豆中原花青素的方法。
背景技术
黑豆顾名思议就是黑色的大豆，黑豆籽粒中人体所必需的5种氨基酸的含量在0.244～2％，黑豆中脂肪含量在1％以下，含有丰富的维生素、矿物质等营养素，黑豆中含有多种微量元素，多种氨基酸、碘、硒、支链淀粉、可溶性色素等均为普通作物的数倍以上。
原花青素为黑豆中的主要黄酮类物质，这是一种广泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，在自然状态下常与各种单糖形成糖苷，称为花色苷。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力。有实验证明，花青素是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有多种保健功能。最近美国的一份研究报告指出，蓝莓所含有的花青素是所有的水果与蔬菜之中含量最高的，而蓝莓的花青素最丰富的部分就是在它特有的紫色果皮部位。
目前，有关利用黑豆制品提取原花青素的方法主要有以下几种：水提取法、传统有机溶剂提取法、超临界CO2、微波提取法等。这些提取法存在的主要不足是：水提取法以水作为提取剂，浸提时间长，温度高容易造成原花青素的损失，同时水的极性较大，溶出杂质较多；传统有机溶剂提取法的缺陷是有机溶剂消耗过多，耗时长，生产成本高，得到的产品或多或少都存在溶剂的残留；超临界CO2萃取成本高，对操作条件要求比较高；微波提取法一旦微波泄漏具有较高的危险性，安全性较差。
国内对黑豆提取物中花青素含量测定方面的研究报道极少，仅有(铁铵盐)比色法、分光光度法、薄层扫描法等，比色法和分光光度法专属性差，误差大，采用高效液相色谱法测定蜜醋黑豆中花青素含量的相关报道较少。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种检测蜜醋黑豆中原花青素的方法。该方法采用盐酸甲醇提取法提取蜜醋黑豆中的原花青素，经提取溶剂制备、样品前处理、标准溶液制备、样品溶液制备，获得原花青素。并用高效液相色谱法对蜜醋黑豆提取物中花青素的含量的测定。该方法简便准确，可用于测定蜜醋黑豆中花青素含量，是一种有效的检测方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，包括如下具体步骤：
S1.提取剂的配制：取浓盐酸用甲醇定容摇匀，配成盐酸-甲醇溶液；
S2.样品前处理：将烘干的蜜醋黑豆粉碎后过筛得干粉，取干粉加入盐酸-甲醇溶液充分混匀，避光置于室温下静置，然后用滤膜过滤后，过滤液放置在4℃中保存，残渣再用提取剂浸泡，并重复上述操作后，合并得滤液；
S3.原花青素标准溶液配制：称取原花青素标准品，加入甲醇溶液摇匀，用滤膜过滤，得到原花青素标准品溶液；
S4.样品溶液的制备：取步骤S2制备的滤液加入色谱纯甲醇定容，摇匀，超声处理，冷至室温后用滤膜过滤，滤液于容量瓶中，经高效液相色谱分析，检测蜜醋黑豆中原花青素。
优选地，步骤S1中所述盐酸-甲醇溶液的浓度为0.5～1.5％。
优选地，步骤S2中所述筛的孔径为40～60目，所述干粉的质量和盐酸-甲醇溶液的体积比为1g：180～220mL；所述烘干的温度为50～70℃，所述静置的时间为8～15h，所述滤膜的孔径为0.45～0.5μm。
优选地，步骤S3中所述原花青素标准品溶液的浓度为1mg/mL，所述滤膜的孔径为0.45～0.5μm。
优选地，步骤S4中所述的高效液相色谱仪检测的色谱条件为：色谱柱的柱温为室温；流动相为甲醇和水；流动相的流速为10mL/min，检测的波长为510～530nm。
更为优选地，所述甲醇和水的体积比为(4～6)：1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用高效液相色谱法对其含量进行检测的方法，在较高温度和超声下溶解干粉样品，使之完全溶解，所需时间短，适于在现场实时进行检测，检测结果准确，真正做到准确快速简便，提高产品的生产效率。相对于之前的测定花青素的方法更加便捷、操作更加简单、结果重复性好、准确性高，特别适用于产品生产过程原花青素含量的实时监测，利用该方法可以从蜜醋黑豆中快速、简单的提取得到原花青素，高效液相色谱法检测含量为1.34～1.81μg/kg。
说明书附图
图1为本发明的原花青素标准曲线。
图2为本发明的原花青素的含量测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
1.提取溶剂制备：用移液器准确量取1.0mL的浓盐酸，沿着玻璃棒注入100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为1.0％的盐酸-甲醇溶液。
2.样品前处理：称取一定量的依标准Q/LQ00025-2017生产的蜜醋黑豆，在烘箱内60℃低温烘干，备用，称取100g烘干的蜜醋黑豆，用多功能食品粉碎机粉碎，用50目的标准筛过筛，准确称取干粉0.5g(精确至0.001g)，于250mL锥形瓶中，加入100mL1％的盐酸-甲醇溶液，摇匀，充分混匀，将浸泡液避光置于室温下静置12h，然后使用0.45μm滤膜过滤浸泡液后，将过滤液放置在4℃冰箱中保存，残渣再使用100mL的提取液浸泡12h，并重复上述操作，将2次的滤液移入棕色瓶中，备用。
3.标准溶液配制：在常温下，精确称取原花青素标准品1mg，于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液，定容于10mL，摇匀，得到1mg/mL原花青素标准品溶液，用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10mL容量瓶中备用。
4.样品溶液的制备：准确量取样品静置后的上清液10mL，置于50mL容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，超声处理20min，冷至室温后用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10mL容量瓶中，供高效液相色谱(HPLC)分析。
5.高效液相色谱仪检测：高效液相色谱仪检测的色谱条件如下：色谱柱：250mm*4.6mmZOBCDEFG-C18，5μm；柱温：室温；流动相：甲醇+水，按甲醇:水＝5:1(体积比)；流速：10mL/min；进样量：10μl；检测波长：520nm。
6.标准曲线绘制：精确吸取2、4、6、8、10mL标准品储备液(1mg/mL)，用甲醇溶液分别配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10(1mg/mL)几种溶液。按仪器色谱条件测其峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。
7.样品含量测定：准确量取样品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容至100mL，吸取样品溶液10μL进入液相色谱仪，在525nm色谱条件下，测定其峰面积，与标准系列比较，测得样品中染料木苷含量为139.080mg/kg。
实施例2
1.提取溶剂制备：用移液器准确量取1.5mL的浓盐酸，沿着玻璃棒注入100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为1.5％的盐酸-甲醇溶液。
2.样品前处理：称取一定量的依标准Q/LQ00025-2017生产的蜜醋黑豆，在烘箱内60℃低温烘干，备用，称取100g烘干的蜜醋黑豆，用多功能食品粉碎机粉碎，用50目的标准筛过筛，准确称取干粉0.5g(精确至0.001g)，于250mL锥形瓶中，加入100mL1％的盐酸-甲醇溶液，摇匀，充分混匀，将浸泡液避光置于室温下静置8h，然后使用0.45μm滤膜过滤浸泡液后，将过滤液放置在4℃冰箱中保存，残渣再使用100mL的提取液浸泡8h，并重复上述操作，将2次的滤液移入棕色瓶中，备用。
3.标准溶液配制：在常温下，精确称取原花青素标准品1mg，于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液，定容于10mL，摇匀，得到1mg/mL原花青素标准品溶液，用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10mL容量瓶中备用。
4.样品溶液的制备：准确量取样品静置后的上清液10mL，置于50mL容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，超声处理20min，冷至室温后用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10mL容量瓶中，供高HPLC分析。
5.高效液相色谱仪检测：高效液相色谱仪检测的色谱条件如下：色谱柱：250mm*4.6mmZOBCDEFG-C18，5μm；柱温：室温；流动相：甲醇+水，按甲醇:水＝5:1(体积比)；流速：10mL/min；进样量：10μl；检测波长：520nm。
6.标准曲线绘制：精确吸取2、4、6、8、10mL标准品储备液(1mg/mL)，用甲醇溶液分别配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10(1mg/mL)几种溶液。按仪器色谱条件测其峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。
7.样品含量测定：准确量取样品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容至100mL，吸取样品溶液10μl进入液相色谱仪，在525nm色谱条件下，测定其峰面积，与标准系列比较，测定样品中花青素的含量，如图2中所示，测定样品中花青素含量为1.81μg/kg。
实施例3
1.提取溶剂制备：用移液器准确量取0.5mL的浓盐酸，沿着玻璃棒注入100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为0.5％的盐酸-甲醇溶液。
2.样品前处理：称取一定量的依标准Q/LQ00025-2017生产的蜜醋黑豆，在烘箱内60℃低温烘干，备用，称取100g烘干的蜜醋黑豆，用多功能食品粉碎机粉碎，用50目的标准筛过筛，准确称取干粉0.5g(精确至0.001g)，于250mL锥形瓶中，加入100mL1％的盐酸-甲醇溶液，摇匀，充分混匀，将浸泡液避光置于室温下静置15h，然后使用0.45μm滤膜过滤浸泡液后，将过滤液放置在4℃冰箱中保存，残渣再使用100mL的提取液浸泡15h，并重复上述操作，将2次的滤液移入棕色瓶中，备用。
3.标准溶液配制：在常温下，精确称取原花青素标准品1mg，于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液，定容于10mL，摇匀，得到1mg/mL原花青素标准品溶液，用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10mL容量瓶中备用。
4.样品溶液的制备：准确量取样品静置后的上清液10mL，置于50mL容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，超声处理20min，冷至室温后用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10mL容量瓶中，供高效液相色谱(HPLC)分析。
5.高效液相色谱仪检测：高效液相色谱仪检测的色谱条件如下：色谱柱：250mm*4.6mmZOBCDEFG-C18，5μm；柱温：室温；流动相：甲醇+水，按甲醇:水＝5:1(体积比)；流速：10mL/min；进样量：10μl；检测波长：520nm。
6.标准曲线绘制：精确吸取2、4、6、8、10mL标准品储备液(1mg/mL)，用甲醇溶液分别配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10(1mg/mL)几种溶液。按仪器色谱条件测其峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。
7.样品含量测定：准确量取样品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容至100mL，吸取样品溶液10μl进入液相色谱仪，在525nm色谱条件下，测定其峰面积，与标准系列比较，测定样品中花青素的含量，如图2中所示，测定样品中花青素的含量为1.66μg/kg。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1.提取剂的配制：取浓盐酸用甲醇定容摇匀，配成盐酸-甲醇溶液；
S2.样品前处理：将烘干的蜜醋黑豆粉碎后过筛得干粉，取干粉加入盐酸-甲醇溶液充分混匀，避光置于室温下静置，然后用滤膜过滤后，过滤液放置在4℃中保存，残渣再用提取剂浸泡，并重复上述操作后，合并得滤液；
S3.原花青素标准溶液配制：称取原花青素标准品，加入色谱纯甲醇溶液摇匀，用滤膜过滤，得到原花青素标准品溶液；
S4.样品溶液的制备：取步骤S2制备的滤液加入色谱纯甲醇定容，摇匀，超声处理，冷至室温后用滤膜过滤，滤液于容量瓶中，经高效液相色谱分析，检测蜜醋黑豆中原花青素。
2.根据权利要求1所述的蜜醋黑豆中提取原花青素的方法，其特征在于，步骤S1中所述盐酸-甲醇溶液的浓度为0.5～1.5％。
3.根据权利要求1所述的检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，其特征在于，步骤S2中所述筛的孔径为40～60目，所述干粉的质量和盐酸-甲醇溶液的体积比为1g：180～220mL；所述烘干的温度为50～70℃，所述静置的时间为8～15h，所述滤膜的孔径为0.45～0.5μm。
4.根据权利要求1所述的检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，其特征在于，步骤S3中所述原花青素标准品溶液的浓度为1mg/mL，所述滤膜的孔径为0.45～0.5μm。
5.根据权利要求1所述的检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，其特征在于，步骤S4中所述超声处理的时间为20～25min。
6.根据权利要求1所述的检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，其特征在于，步骤S4中所述的高效液相色谱仪检测的色谱条件为：色谱柱的柱温为室温；流动相为甲醇和水；流动相的流速为10mL/min，检测的波长为510～530nm。
7.根据权利要求6所述的检测蜜醋黑豆中原花青素的方法，其特征在于，所述甲醇和水的体积比为(4～6)：1。
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