CN108264538B - 门冬氨酸缩合物的固相合成方法 - Google Patents

门冬氨酸缩合物的固相合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种门冬氨酸缩合物的固相合成方法，包括以下步骤：（1）在脱保护剂作用下，脱除王树脂固载氨基酸的保护基；（2）在缩合剂作用下，两种保护型氨基酸发生缩合反应；（3）在裂解试剂作用下，脱除保护基，得到门冬氨酸缩合物。本发明提供的固相合成方法原料易得价廉，合成周期短，生产成本低，后处理容易，副产物少，产品收率高，有利于门冬氨酸缩合物的大规模制备。

Description

门冬氨酸缩合物的固相合成方法
技术领域
本发明涉及有机合成技术领域，尤其涉及一种门冬氨酸缩合物的制备方法。
背景技术
门冬氨酸钾作为电解质补充药，主要用于治疗各种原因引起的低钾血症，低钾血症引起的周期性四肢麻痹以及洋地黄中毒引起的心律失常。门冬氨酸鸟氨酸主要用于治疗因急、慢性肝病引起的血氨升高，如各型肝炎、肝硬化。脂肪肝和肝炎后综合症等。特别适用于因肝脏病引起的中枢***神经***症状的解除及昏迷的抢救。门冬氨酸缩合物为门冬氨酸钾和门冬氨酸鸟氨酸的主要杂质。其化学名为2-[(3-氨基-3-羧基丙酮基)氨基]丁二酸，结构式如下所示：
中国专利CN105566141A（申请号201510965114.4）公开了一种门冬氨酸缩合物的制备方法，采用门冬氨酸与醇发生酯化反应，得到门冬氨酸二酯，然后与Boc-L-天冬氨酸-1-苄酯缩合，再水解得到门冬氨酸缩合物粗品，最后通过柱层析，重结晶得到门冬氨酸缩合物。该方法操作繁琐，反应时间长，每步中间体都是油状物，难以纯化，直接导致门冬氨酸缩合物粗品中含有大量杂质，即使经过柱层析和重结晶后也只能得到纯度不高的粘性固体。
1963年美国化学家Merrifield用固相树脂为载体，发明了在树脂上合成肽类化合物的方法，开辟了有机合成化学的一个崭新领域：固相合成化学，对化学和生命科学的开展产生了重要的影响，于1984年获得诺贝尔化学奖。固相合成就是通过某种方式连接在固相载体的化学组分通过溶剂介质同其他化学组分进行的化学反应。首先把反应底物连接到表面经过官能化修饰的固相载体上，然后置于溶剂中同其他非固载化化学组分于固液交界处进行化学反应。反应结束后经过简单的过滤，洗涤和干燥后，就可进行下一步反应或经过适当的反应把最终产物从固相载体上切割下来。
同传统的液相化学反应相比，固相合成简化了反应后处理过程，经过滤和洗涤就能除去溶液中残留的化学试剂和可溶性杂质；其次，可应用大大过量的反应试剂，提高转化率，或通过重复相同的反应，使反应趋于完全；第三，反应底物通过连接基团固定在固定相载体上，限制了底物分子间相互碰撞，也称为“假稀释效应”，避免了底物分子间反应产生的副产物。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种门冬氨酸缩合物的固相合成方法。该方法原料易得价廉，合成周期短，生产成本低，后处理容易，副产物少，产品收率高，有利于门冬氨酸缩合物的大规模制备。
一种门冬氨酸缩合物的固相合成方法，包括以下步骤：
（1）在脱保护剂作用下，脱除王树脂固载氨基酸的保护基；
（2）在缩合剂作用下，两种保护型氨基酸发生缩合反应；
（3）在裂解试剂作用下，脱除保护基，得到门冬氨酸缩合物。
其中，步骤（1）的具体操作为：将树脂加入DMF中浸泡2h充分溶胀，加入脱保护剂，搅拌45min，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为***，则保护基脱除完全，若树脂为浅红色或黄色，则需延长脱保护时间。
所述树脂为Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin，Fmoc-Asp-OAll-Wang Resin，所述树脂的替代度为0.3-0.8mmol/g。
所述脱保护剂为25%PIP的DMF溶液。
所述脱保护剂与王树脂固载氨基酸的比例优选为20-80（ml：mmol），进一步优选为40-60（ml：mmol）。
所述试剂A为5%茚三酮的无水乙醇溶液。
所述试剂B为80%苯酚的无水乙醇溶液。
其中，步骤（2）的具体操作为：树脂加入DMF中，加入缩合剂C、缩合剂D、另一种保护型门冬氨酸，室温搅拌2h，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为浅红色或黄色，则缩合反应完全，若树脂为***，则需延长缩合时间。
所述另一种保护型氨基酸为Ac-Asp-OtBu，Boc-Asp-OMe，Boc-Asp-OBzl，Boc-Asp-OtBu。
所述另一种保护型氨基酸与王树脂固载氨基酸的比例优选为1-2（mmol：mmol），进一步优选为1-1.5（mmol：mmol）。
所述缩合剂C为0.48mol/molHOBT的DMF溶液。
所述缩合剂D为0.48mol/molDIC的DMF溶液。
所述缩合剂C与王树脂固载氨基酸的比例优选为6-10（ml：mmol），进一步优选为8-10（ml：mmol）。
所述缩合剂D与王树脂固载氨基酸的比例优选为6-10（ml：mmol），进一步优选为8-10（ml：mmol）。
所述试剂A为5%茚三酮的无水乙醇溶液。
所述试剂B为80%苯酚的无水乙醇溶液。
其中，步骤（3）的具体操作为：取树脂肽，加入裂解试剂，室温搅拌2h，过滤，滤液加入无水***中，过滤，无水***洗涤，得到门冬氨酸缩合物。
所述裂解试剂为TFA：乙二硫醇：茴香硫醚：苯酚：水=85：5：5：4：1。
所述裂解试剂与王树脂固载氨基酸的比例优选为20-80（ml：mmol），进一步优选为40-60（ml：mmol）。
具体实施方式
说明书和权利要求书中所使用的英文缩写的含义列于下表中。
DMF 二甲基甲酰胺
Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸4-叔丁酯王树脂
Fmoc-Asp-OAll-Wang Resin N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸1-烯丙酯王树脂
PIP 哌啶
Ac-Asp-OtBu N-乙酰基-L-天门冬氨酸 1-甲酯
Boc-Asp-OMe N-叔丁氧羰基-L-天门冬氨酸 1-甲酯
Boc-Asp-OBzl N-叔丁氧羰基-L-天门冬氨酸 1-苄酯
Boc-Asp-OtBu N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸 1-叔丁酯
DIC 二异丙基碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
将Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin（替代度0.3mmol/g）1.00g加入到DMF15ml中，浸泡2h充分溶胀，加入脱保护剂15ml，搅拌45min，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A0.02ml和试剂B0.08ml，沸水浴加热5min，若树脂为***，则保护基脱除完全，若树脂为浅红色或黄色，则需延长脱保护时间。
脱保护完全后，将脱保护树脂加入到DMF15ml中，加入Ac-Asp-OtBu83mg（0.36mmol），缩合剂C2.5ml，缩合剂D2.5ml，室温搅拌2h，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为浅红色或黄色，则缩合反应完全，若树脂为***，则需延长缩合时间。
缩合完全后，取树脂肽，加入裂解试剂15ml，室温搅拌2h，过滤，滤液加入到无水***15ml中，过滤，无水***洗涤，得到白色固体67mg，收率90.1%。
实施例2
将Fmoc-Asp-OAll-Wang Resin（替代度0.3mmol/g）1.00g加入到DMF15ml中，浸泡2h充分溶胀，加入脱保护剂15ml，搅拌45min，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A0.02ml和试剂B0.08ml，沸水浴加热5min，若树脂为***，则保护基脱除完全，若树脂为浅红色或黄色，则需延长脱保护时间。
脱保护完全后，将脱保护树脂加入到DMF15ml中，加入Boc-Asp-OMe89mg（0.36mmol），缩合剂C2.5ml，缩合剂D2.5ml，室温搅拌2h，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为浅红色或黄色，则缩合反应完全，若树脂为***，则需延长缩合时间。
缩合完全后，取树脂肽，加入裂解试剂15ml，室温搅拌2h，过滤，滤液加入到无水***15ml中，过滤，无水***洗涤，得到白色固体64mg，收率86.0%。
实施例3
将Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin（替代度0.3mmol/g）100.00g加入到DMF1500ml中，浸泡2h充分溶胀，加入脱保护剂15ml，搅拌45min，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A2ml和试剂B8ml，沸水浴加热5min，若树脂为***，则保护基脱除完全，若树脂为浅红色或黄色，则需延长脱保护时间。
脱保护完全后，将脱保护树脂加入到DMF1500ml中，加入Ac-Asp-OtBu8.32g（36mmol），缩合剂C250ml，缩合剂D250ml，室温搅拌2h，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为浅红色或黄色，则缩合反应完全，若树脂为***，则需延长缩合时间。
缩合完全后，取树脂肽，加入裂解试剂1500ml，室温搅拌2h，过滤，滤液加入到无水***150ml中，过滤，无水***洗涤，得到白色固体7.06g，收率94.9%。
实施例4
将Fmoc-Asp-OAll-Wang Resin（替代度0.3mmol/g）100.00g加入到DMF1500ml中，浸泡2h充分溶胀，加入脱保护剂15ml，搅拌45min，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A2ml和试剂B8ml，沸水浴加热5min，若树脂为***，则保护基脱除完全，若树脂为浅红色或黄色，则需延长脱保护时间。
脱保护完全后，将脱保护树脂加入到DMF1500ml中，加入Boc-Asp-OBzl11.63g（36mmol），缩合剂C250ml，缩合剂D250ml，室温搅拌2h，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为浅红色或黄色，则缩合反应完全，若树脂为***，则需延长缩合时间。
缩合完全后，取树脂肽，加入裂解试剂1500ml，室温搅拌2h，过滤，滤液加入到无水***150ml中，过滤，无水***洗涤，得到白色固体6.74g，收率90.6%。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改和改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种门冬氨酸缩合物的固相合成方法，其特征在于，所述固相合成方法包括以下步
骤：
（1）在脱保护剂作用下，脱除王树脂固载氨基酸的保护基；
（2）在缩合剂作用下，两种保护型氨基酸发生缩合反应；
（3）在裂解试剂作用下，脱除保护基，得到门冬氨酸缩合物；
步骤（1）的具体操作为：将树脂加入DMF中浸泡2h充分溶胀，加入脱保护剂，搅拌45min，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为***，则保护基脱除完全，若树脂为浅红色或黄色，则需延长脱保护时间；
所述树脂为Fmoc-Asp(OtBu)-Wang resin，Fmoc-Asp-OAll-Wang Resin；
所述树脂的替代度为0.3-0.8mmol/g；
所述脱保护剂为25%PIP的DMF溶液；
所述脱保护剂与王树脂固载氨基酸的比例为40-60ml：mmol；
所述试剂A为5%茚三酮的无水乙醇溶液；
所述试剂B为80%苯酚的无水乙醇溶液；
步骤（2）的具体操作为：树脂加入DMF中，加入缩合剂C、缩合剂D、另一种保护型氨基酸，室温搅拌2h，过滤，用DMF洗涤，取出少量树脂，加入试剂A和试剂B，沸水浴加热5min，若树脂为浅红色或黄色，则缩合反应完全，若树脂为***，则需延长缩合时间；
所述另一种保护型氨基酸为Ac-Asp-OtBu，Boc-Asp-OMe，Boc-Asp-OBzl，Boc-Asp-OtBu；
所述另一种保护型氨基酸与王树脂固载氨基酸的比例为1-1.5mmol：mmol；
所述缩合剂C为0.48mol/molHOBT的DMF溶液；
所述缩合剂D为0.48mol/molDIC的DMF溶液；
所述缩合剂C与王树脂固载氨基酸的比例为8-10ml：mmol；
所述缩合剂D与王树脂固载氨基酸的比例为8-10ml：mmol；
所述试剂A为5%茚三酮的无水乙醇溶液；
所述试剂B为80%苯酚的无水乙醇溶液；
步骤（3）的具体操作为：取树脂肽，加入裂解试剂，室温搅拌2h，过滤，滤液加入无水***中，过滤，无水***洗涤，得到门冬氨酸缩合物；
所述裂解试剂为TFA：乙二硫醇：茴香
硫醚：苯酚：水=85：5：5：4：1；
所述裂解试剂与王树脂固载氨基酸的比例为40-60ml：mmol。
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