CN108261564A - 脱细胞外基质及其制备方法和应用 - Google Patents

脱细胞外基质及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108261564A
CN108261564A CN201611262064.4A CN201611262064A CN108261564A CN 108261564 A CN108261564 A CN 108261564A CN 201611262064 A CN201611262064 A CN 201611262064A CN 108261564 A CN108261564 A CN 108261564A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extracellular matrix
solution
precursor
processing
immersed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611262064.4A
Other languages
English (en)
Inventor
李丽花
钟梅玲
朱勇军
朱光林
谭荣伟
佘振定
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHENZHEN LANDO BIOMATERIALS CO Ltd
Original Assignee
SHENZHEN LANDO BIOMATERIALS CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHENZHEN LANDO BIOMATERIALS CO Ltd filed Critical SHENZHEN LANDO BIOMATERIALS CO Ltd
Priority to CN201611262064.4A priority Critical patent/CN108261564A/zh
Publication of CN108261564A publication Critical patent/CN108261564A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种脱细胞外基质的制备方法，该脱细胞外基质的制备方法制得的脱细胞外基质以及该脱细胞外基质在制备医疗器械领域的应用。一种脱细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：对哺乳动物的组织器官进行预处理后得到组织前体；对组织前体分别进行病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理，得到脱细胞外基质前体；对脱细胞外基质前体依次进行梯度脱水处理和交联处理，最后定型干燥得到脱细胞外基质，梯度脱水处理为：对所述脱细胞外基质前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中。这种脱细胞外基质的制备方法，通过梯度脱水处理组织前体，可以使得最终制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构不被破坏。

Description

脱细胞外基质及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医疗材料领域，特别是涉及一种脱细胞外基质及其制备方法和应用。
背景技术
基于组织工程学原理的以动物组织为原料的细胞外基质材料是主要发展方向。细胞外基质是由多种大分子物质如胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白等成分构建的复杂有机的三维整体结构，为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所及微环境，调控组织器官功能。所以细胞外基质作为理想的组织修复材料，已经广泛用于临床，包括心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层等细胞外基质材料。
自体和异体组织的来源极为有限，异种(如：猪、牛、马)的脱细胞外基质就成为了当今软组织修复技术研究的一大主题。脱细胞外基质的制备方法有很多种，目的是能够去除组织内所有的细胞、脂肪等成分，而最大限度地保留胶原成分和结构的完整性。
脱细胞工艺和病毒灭活工艺是脱细胞外基质材料的主要工艺和技术难点，要求完全去除动物组织的病毒、细胞和动物源DNA成分，同时完整保留天然脱细胞外基质的成分和三维结构。制备脱细胞外基质的方法种类繁多，但大多不能完全去除所有的动物源性DNA成分，并且耗时长，需要使用多种有机和表面活性剂等溶剂，一方面导致了脱细胞基质材料中活性成分的破坏，另一方面，有害溶剂残留会导致细胞毒性、刺激和免疫反应，从而影响组织修复效果。且大多脱细胞外基质的亲水性和贴敷性不强，吸水速率慢，膜不够薄和柔软，从而不能适应各种表面轮廓组织的修复。
现有的脱细胞外基质的制备方法制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构遭到破坏，从而影响了后续应用。
发明内容
基于此，有必要提供一种可以避免胶原纤维的有序结构被破坏的脱细胞外基质的制备方法，以及该脱细胞外基质的制备方法制得的脱细胞外基质和应用。
一种脱细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
对哺乳动物的组织器官进行预处理后得到组织前体；
对所述组织前体分别进行病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理，得到脱细胞外基质前体，其中，所述病毒灭活处理、所述DNA清除处理、所述脱细胞处理和所述脱脂处理的操作顺序可以相互更换；
对所述脱细胞外基质前体依次进行梯度脱水处理和交联处理，最后定型干燥得到脱细胞外基质，其中，所述梯度脱水处理为：对所述脱细胞外基质前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min。
在一个实施例中，所述梯度脱水处理为：将所述脱细胞外基质前体依次浸泡在质量百分浓度为25％、50％、75％、90％和100％的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min，其中，所述有机物溶液的溶质为乙醇或丙酮。
在一个实施例中，所述对所述哺乳动物的组织器官进行预处理的操作为：用机械法对所述哺乳动物的组织器官进行初步去除脂肪、肌肉以及附属的其他器官后，用纯水清洗干净。
在一个实施例中，所述哺乳动物的组织器官为猪、牛或马的组织器官。
在一个实施例中，所述哺乳动物的组织器官包括哺乳动物的心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层。
在一个实施例中，所述哺乳动物的组织器官为猪的腹膜。
在一个实施例中，所述病毒灭活处理为：将所述组织前体浸泡在病毒灭活溶液中1h～10h进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为质量百分浓度为0.1％～5％的过氧化物溶液，或所述病毒灭活溶液为含有0.1wt％～5wt％的过氧化物和20wt％～70wt％的乙醇的混合溶液；
所述DNA清除处理为：将所述组织前体浸泡在碱溶液中1h～24h，再浸泡在酸溶液中1h～12h；
所述脱细胞处理为：将所述组织前体浸泡在质量百分浓度为0.05％～0.5％的蛋白酶溶液中6h～48h，再浸泡在浓度为0.5M～3M的NaCl溶液中6h～48h；
所述脱脂处理为：将所述组织前体浸泡在脱脂有机物中，浸泡次数为1次～5次，每次浸泡的时间为1h～24h；
所述交联处理为：在温度为90℃～150℃的条件下，对经过梯度脱水处理的所述脱细胞外基质前体进行高温真空交联1h～24h；
或者，所述交联处理为：将经过梯度脱水处理的所述脱细胞外基质前体浸泡在质量百分浓度为0.25％～3％的交联剂溶液中1h～24h。
在一个实施例中，所述过氧化物溶液选自过氧化氢溶液和过氧乙酸溶液中的至少一种；
所述过氧化物选自过氧化氢和过氧乙酸中的至少一种；
所述碱溶液选自碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，所述碱溶液的质量百分浓度为0.5％～4％；
所述酸溶液选自盐酸和醋酸溶液中的至少一种，所述酸溶液的质量百分浓度为0.05％～2％；
所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的至少一种；
所述脱脂有机物选自正己烷、异丙醇、乙二醇和***中的至少一种；
所述交联剂溶液选自戊二醛溶液、碳化二亚胺溶液、京尼平溶液和环氧化合物溶液中的至少一种。
一种脱细胞外基质，采用上述的脱细胞外基质的制备方法制备得到。
上述的脱细胞外基质，在制备医疗器械领域的应用。
这种脱细胞外基质的制备方法，通过病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理去除了组织前体的免疫原性，接着通过将组织前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中梯度脱水，接着交联处理和定性干燥，得到脱细胞外基质。通过梯度脱水处理组织前体，可以使得最终制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构不被破坏。此外，同时由于具有有序的胶原纤维结构，这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性和骨诱导能力，同时吸水速率快并且吸水不膨胀，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为一实施方式的脱细胞外基质的制备方法的流程图；
图2是实施例1制得的制备脱细胞外基质的光滑面的扫描电子显微镜照片；
图3是实施例1制得的制备脱细胞外基质的粗糙面的扫描电子显微镜照片；
图4是实施例1制得的制备脱细胞外基质经过苏木精-伊红染色后的倒置显微镜照片；
图5是实施例1制得的制备脱细胞外基质植入兔子体内一周后切片经过苏木精-伊红染色后的倒置显微镜照片。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
如图1所示，本发明公开了一实施方式的脱细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
S10、对哺乳动物的组织器官进行预处理后得到组织前体。
对哺乳动物的组织器官进行预处理的操作为：用机械法对哺乳动物的组织器官进行初步去除脂肪、肌肉以及附属的其他器官后，用纯水清洗干净(优选为清洗3～5遍)。其中，附属的其他器官指出了心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层之外的器官。
优选的，哺乳动物的组织器官为猪、牛或马的组织器官。
优选的，哺乳动物的组织器官包括哺乳动物的心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层。
特别优选的，哺乳动物的组织器官为猪的腹膜。
S10得到的组织前体可以储存在-20℃备用。
S20、对S10得到的组织前体分别进行病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理，得到脱细胞外基质前体。
S20中，病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理的操作顺序可以相互更换。
S20中，病毒灭活处理为：将组织前体浸泡在病毒灭活溶液中1h～10h(优选为3h)进行病毒灭活处理。
病毒灭活溶液为质量百分浓度为0.1％～5％(优选为2％)的过氧化物溶液。过氧化物溶液选自过氧化氢溶液和过氧乙酸溶液中的至少一种。
或者，病毒灭活溶液为含有0.1wt％～5wt％(优选为2wt％)的过氧化物和20wt％～70wt％(优选为50wt％)的乙醇的混合溶液。过氧化物选自过氧化氢和过氧乙酸中的至少一种。
S20中，DNA清除处理为：将组织前体浸泡在碱溶液中1h～24h(优选为12h)，再浸泡在酸溶液中1h～12h(优选为3h)。
碱溶液选自碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，碱溶液的质量百分浓度为0.5％～4％(优选为2％)。
酸溶液选自盐酸和醋酸溶液中的至少一种，酸溶液的质量百分浓度为0.05％～2％(优选为0.5％)。
S20中，脱细胞处理为：将组织前体浸泡在质量百分浓度为0.05％～0.5％(优选为0.25％)的蛋白酶溶液中6h～48h(优选为24h)，再浸泡在浓度为0.5M～3M(优选为1M)的NaCl溶液中6h～48h(优选为12h)。
蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的至少一种。
S20中，脱脂处理为：将组织前体浸泡在脱脂有机物中，浸泡次数为1次～5次，每次浸泡的时间为1h～24h。
优选的，脱脂处理为：将组织前体浸泡在正己烷中，浸泡次数为2次，每次浸泡的时间为6h；接着浸泡在异丙醇中，浸泡次数为2次，每次浸泡的时间为12h。
脱脂有机物选自正己烷、异丙醇、乙二醇和***中的至少一种。
S30、对S20得到的脱细胞外基质前体依次进行梯度脱水处理和交联处理，最后定型干燥得到脱细胞外基质。
S30中，梯度脱水处理为：对脱细胞外基质前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min。
优选的，梯度脱水处理为：将脱细胞外基质前体依次浸泡在质量百分浓度为25％、50％、75％、90％和100％的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min(优选为每次20min)，其中，有机物溶液的溶质为乙醇或丙酮。
交联处理为：在温度为90℃～150℃的条件下，对经过梯度脱水处理的脱细胞外基质前体进行高温真空交联1h～24h。
或者，交联处理为：将经过梯度脱水处理的脱细胞外基质前体浸泡在质量百分浓度为0.25％～3％(优选为2.5％)的交联剂溶液中1h～24h。
交联剂溶液选自戊二醛溶液、碳化二亚胺溶液、京尼平溶液和环氧化合物(优选为丁二醇二缩水甘油醚)溶液中的至少一种。
优选的，交联剂溶液为pH为5.5、质量百分浓度为2.5％的丁二醇二缩水甘油醚溶液。
定型干燥的操作为：按照产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将经过梯度脱水处理的脱细胞外基质前体固定于模具上，并对固定于模具上的材料进行干燥或干燥，干燥完成后得到脱细胞外基质。
干燥可以为冷冻干燥(18h～24h)或真空干燥(1h～24h，优选为3h)。
得到的脱细胞外基质在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照或电子束辐照进行灭菌。
这种脱细胞外基质的制备方法，通过病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理去除了组织前体的免疫原性，接着通过将组织前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中梯度脱水，接着交联处理和定性干燥，得到脱细胞外基质。通过梯度脱水处理组织前体，可以使得最终制得的脱细胞外基质的胶原纤维的有序结构不被破坏。此外，同时由于具有有序的胶原纤维结构，这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性和骨诱导能力，同时吸水速率快并且吸水不膨胀，具有良好的应用前景。
本发明还公开了一种脱细胞外基质，采用上述的脱细胞外基质的制备方法制备得到。
采用上述方法制备的脱细胞外基质的动物源DNA残留量少，并完整保留了天然细胞外基质的三维结构、免疫原性低、柔韧性和贴敷性好、吸水速率快且吸水不膨胀、具有良好的生物安全性和生物相容性，能够调节细胞的生长、形状、代谢、迁移、增值和分化，进而调控组织和器官功能，是理想的组织修复材料。
这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性和骨诱导能力，同时吸水速率快并且吸水不膨胀，具有良好的应用前景，可以应用于制备医疗器械领域。
以下为具体实施例。
实施例1
取新鲜猪的腹膜组织，用机械法对猪腹膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，制成猪腹膜厚度为0.3mm～1.0mm，用纯水清洗4遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的猪腹膜依次浸泡在2wt％的NaOH溶液中处理12h，处理之后用纯水清洗3～5遍，然后用浓度为0.5wt％的HCl溶液处理2h，处理之后用纯水清洗4遍，以清除动物组织大部分的DNA。
将DNA清除处理后的猪腹膜浸泡在2wt％的过氧化氢溶液中3h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的猪腹膜浸泡在0.25wt％的中性蛋白酶溶液中24h，纯水冲洗并浸泡在1M的高渗盐水中24h进行脱细胞处理。
将猪腹膜依次放入正己烷和异丙醇溶液中进行脱脂，正己烷处理时间为24h，重复处理1次；异丙醇处理时间为12h，重复处理2次。
将猪腹膜依次放入乙醇溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为20min。
将猪腹膜脱细胞基质浸泡在戊二醛中进行交联，戊二醛的浓度为0.25wt％，交联时间为1h。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行冷冻干燥，干燥时间为20h。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
将实施例1制得的脱细胞外基质在扫描电子显微镜(SEM)下观察，得到图2～图3。
由图2～图3可以看出，实施例1制得的脱细胞外基质具有有序的胶原纤维结构，光滑面致密，粗糙面为疏松的纤维结构，有利于后期成骨细胞在粗糙面的粘附与生长。
对实施例1制得的脱细胞外基质进行苏木精-伊红(HE)染色后在倒置显微镜下观察，得到图4。
由图4可以看出，实施例1制得的脱细胞外基质中没有细胞碎片残留，并且可以观察到纤维结构。
将实施例1制得的脱细胞外基质植入兔子体内一周后切片，经过苏木精-伊红(HE)染色后在倒置显微镜下观察，得到图5。
由图5可以看出，将实施例1制得的脱细胞外基质(胶原膜)植入兔子体内一周后没有炎症反应，且贴敷性能好，脱细胞外基质(胶原膜)没有膨胀。
实施例2
取新鲜牛的腹膜组织，用机械法对牛腹膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，制成牛腹膜厚度为0.3mm～1.0mm，用纯水清洗5遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的牛腹膜依次浸泡在2wt％的NaOH溶液中处理10h，处理之后用纯水清洗5遍，然后用浓度为0.25wt％的HCl溶液处理4h，处理之后用纯水清洗5遍，以清除动物组织大部分的DNA。
将DNA清除处理后的牛腹膜浸泡在1wt％的过氧乙酸和50wt％的乙醇的混合溶液中2h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的牛腹膜浸泡在0.25wt％的胰蛋白酶溶液中12h，纯水冲洗并浸泡在2M的高渗盐水中12h进行脱细胞处理。
将牛腹膜依次放入正己烷和异丙醇溶液中进行脱脂，正己烷处理时间为6h，重复处理2次；异丙醇处理时间为24h，重复处理1次。
将牛腹膜依次放入丙酮溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为20min。
将牛腹膜脱细胞基质浸泡在碳化二亚胺中进行交联，戊二醛的浓度为0.5wt％，交联时间为24h。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行真空干燥，干燥时间为12h。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
实施例3
取新鲜牛的心包膜组织，用机械法对牛心包膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，制成牛心包膜厚度为0.3mm～1.0mm，用纯水清洗3遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的牛心包膜依次浸泡在4wt％的NaOH溶液中处理6h，处理之后用纯水清洗3遍，然后用浓度为1wt％的HCl溶液处理6h，处理之后用纯水清洗3遍，以清除动物组织大部分的DNA。
将DNA清除处理后的牛心包膜浸泡在2wt％的过氧乙酸和70wt％的乙醇混合溶液中1h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的牛心包膜浸泡在0.5％的胃蛋白酶溶液中12h，纯水冲洗并浸泡在0.5M的高渗盐水中12h进行脱细胞处理。
将牛心包膜依次放入正己烷、乙二醇***溶液中进行脱脂，正己烷处理时间为12h，重复处理2次；乙二醇***处理时间为6h，重复处理1次。
将牛心包膜依次放入丙酮溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为10min。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行真空高温交联并干燥，干燥时间为24h，交联温度设置为100℃。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
实施例4
取新鲜猪的胸膜组织，用机械法对猪的胸膜进行初步去除脂肪、肌肉及附属的其他器官，去除附带的其他成分后，用纯水清洗4遍，储存在-20℃备用。
将预处理后的猪胸膜依次浸泡在3wt％的NaOH溶液中处理5h，处理之后用纯水清洗4遍，然后用浓度为0.1wt％的HCl溶液处理5h，处理之后用纯水清洗4遍，以清除动物组织大部分的DNA。
将DNA清除处理后的猪胸膜浸泡在1wt％的过氧乙酸和20％的乙醇混合溶液中2h进行病毒灭活处理。
对灭活处理后的猪胸膜浸泡在0.5wt％的胃蛋白酶溶液中12h，纯水冲洗并浸泡在0.5M的高渗盐水中12h进行脱细胞处理。
将猪胸膜放入异丙醇溶液中进行脱脂，异丙醇处理时间为12h，重复处理4次。
将猪胸膜依次放入乙醇溶液中进行梯度脱水，乙醇梯度脱水的质量百分浓度为25％、50％、75％、90％、100％，每次脱水的时间为30min。
将猪胸膜脱细胞基质浸泡在环氧化合物中进行交联，环氧化合物为丁二醇二缩水甘油醚，其交联溶液的浓度为2.5wt％，pH值为5.5。
按照不同产品要求设计相应尺寸和形状的模具，将材料固定于模具上，并将已固定于模具上的材料进行冷冻干燥，干燥时间为18h。
在万级洁净车间进行包装，采用内外吸塑盒进行包装，吸塑盒采用特卫强纸进行封口，包装完成后采用钴60辐照。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对哺乳动物的组织器官进行预处理后得到组织前体；
对所述组织前体分别进行病毒灭活处理、DNA清除处理、脱细胞处理和脱脂处理，得到脱细胞外基质前体，其中，所述病毒灭活处理、所述DNA清除处理、所述脱细胞处理和所述脱脂处理的操作顺序可以相互更换；
对所述脱细胞外基质前体依次进行梯度脱水处理和交联处理，最后定型干燥得到脱细胞外基质，其中，所述梯度脱水处理为：对所述脱细胞外基质前体依次浸泡在浓度依次增加的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min。
2.根据权利要求1所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述梯度脱水处理为：将所述脱细胞外基质前体依次浸泡在质量百分浓度为25％、50％、75％、90％和100％的有机物溶液中，每次浸泡的时间为10min～60min，其中，所述有机物溶液的溶质为乙醇或丙酮。
3.根据权利要求1所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述对所述哺乳动物的组织器官进行预处理的操作为：用机械法对所述哺乳动物的组织器官进行初步去除脂肪、肌肉以及附属的其他器官后，用纯水清洗干净。
4.根据权利要求1或3所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的组织器官为猪、牛或马的组织器官。
5.根据权利要求1或3所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的组织器官包括哺乳动物的心包膜、胸膜、隔膜、腹膜和小肠粘膜下层。
6.根据权利要求1或3所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物的组织器官为猪的腹膜。
7.根据权利要求1所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理为：将所述组织前体浸泡在病毒灭活溶液中1h～10h进行病毒灭活处理，所述病毒灭活溶液为质量百分浓度为0.1％～5％的过氧化物溶液，或所述病毒灭活溶液为含有0.1wt％～5wt％的过氧化物和20wt％～70wt％的乙醇的混合溶液；
所述DNA清除处理为：将所述组织前体浸泡在碱溶液中1h～24h，再浸泡在酸溶液中1h～12h；
所述脱细胞处理为：将所述组织前体浸泡在质量百分浓度为0.05％～0.5％的蛋白酶溶液中6h～48h，再浸泡在浓度为0.5M～3M的NaCl溶液中6h～48h；
所述脱脂处理为：将所述组织前体浸泡在脱脂有机物中，浸泡次数为1次～5次，每次浸泡的时间为1h～24h；
所述交联处理为：在温度为90℃～150℃的条件下，对经过梯度脱水处理的所述脱细胞外基质前体进行高温真空交联1h～24h；
或者，所述交联处理为：将经过梯度脱水处理的所述脱细胞外基质前体浸泡在质量百分浓度为0.25％～3％的交联剂溶液中1h～24h。
8.根据权利要求7所述的脱细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述过氧化物溶液选自过氧化氢溶液和过氧乙酸溶液中的至少一种；
所述过氧化物选自过氧化氢和过氧乙酸中的至少一种；
所述碱溶液选自碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，所述碱溶液的质量百分浓度为0.5％～4％；
所述酸溶液选自盐酸和醋酸溶液中的至少一种，所述酸溶液的质量百分浓度为0.05％～2％；
所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的至少一种；
所述脱脂有机物选自正己烷、异丙醇、乙二醇和***中的至少一种；
所述交联剂溶液选自戊二醛溶液、碳化二亚胺溶液、京尼平溶液和环氧化合物溶液中的至少一种。
9.一种脱细胞外基质，其特征在于，所述脱细胞外基质采用如权利要求1～8中任一项所述的脱细胞外基质的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的脱细胞外基质，在制备医疗器械领域的应用。
CN201611262064.4A 2016-12-30 2016-12-30 脱细胞外基质及其制备方法和应用 Pending CN108261564A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611262064.4A CN108261564A (zh) 2016-12-30 2016-12-30 脱细胞外基质及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611262064.4A CN108261564A (zh) 2016-12-30 2016-12-30 脱细胞外基质及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108261564A true CN108261564A (zh) 2018-07-10

Family

ID=62755148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611262064.4A Pending CN108261564A (zh) 2016-12-30 2016-12-30 脱细胞外基质及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108261564A (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109172866A (zh) * 2018-09-19 2019-01-11 杭州启明医疗器械有限公司 一种可快速吸水展平的干燥生物心脏瓣膜及其制备方法
CN109331228A (zh) * 2018-11-26 2019-02-15 陈德夫 一种抗感染的小肠粘膜下层生物材料的制备方法
CN109364298A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 江阴奔翔生物科技有限公司 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
CN109395164A (zh) * 2018-11-29 2019-03-01 四川大学 一种干化的动物细胞外基质材料的制备方法
CN109498841A (zh) * 2018-11-28 2019-03-22 冠昊生物科技股份有限公司 一种生物型骨膜修复材料及其制备方法
CN110638684A (zh) * 2019-09-02 2020-01-03 深圳兰度生物材料有限公司 一种可注射的胶原组合物及制备方法
CN110960731A (zh) * 2019-12-12 2020-04-07 成都奇璞生物科技有限公司 一种医用外科生物补片的制备方法
CN111375090A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 深圳兰度生物材料有限公司 脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用
CN111500663A (zh) * 2020-04-12 2020-08-07 江苏安泰康健康科技有限公司 一种水凝胶、制备方法及其三维细胞培养方法
CN111671976A (zh) * 2020-05-09 2020-09-18 深圳兰度生物材料有限公司 抗菌胶原膜及其制备方法
CN111686304A (zh) * 2020-06-11 2020-09-22 四川大学 一种小尺寸经导管人工心脏瓣膜及其制备方法
CN112675364A (zh) * 2021-01-05 2021-04-20 宁波瑞瑧生物科技有限公司 一种复合引导组织再生膜及其制备方法
CN113101415A (zh) * 2021-03-25 2021-07-13 北京桀亚生物医学研究有限公司 一种细胞结构完整降解可控的生物羊膜及其制备方法
CN114209886A (zh) * 2021-11-09 2022-03-22 江苏臻亿医疗科技有限公司 一种生物组织材料及其制备方法
CN114904055A (zh) * 2021-02-08 2022-08-16 诺一迈尔（苏州）医学科技有限公司 一种生物型巩膜修复材料及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012506A1 (en) * 2000-08-08 2002-02-14 Genesis Research And Development Corporation Limited Lactobacillus rhamnosus polynucleotides, polypeptides and methods for using them
WO2007126411A2 (en) * 2005-07-28 2007-11-08 Carnegie Mellon University Biocompatible polymers and methods of use
CN101306207A (zh) * 2007-05-14 2008-11-19 北京大学第三医院 组织工程化角膜上皮移植膜及其制备方法和应用
CN101947144A (zh) * 2010-09-29 2011-01-19 厦门大学 一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用
CN103041450A (zh) * 2013-01-25 2013-04-17 南通大学 用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法
CN103908700A (zh) * 2013-01-06 2014-07-09 陕西佰傲再生医学有限公司 一种脱细胞角膜的制备方法
CN104645415A (zh) * 2014-11-28 2015-05-27 南昌大学第一附属医院 一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012506A1 (en) * 2000-08-08 2002-02-14 Genesis Research And Development Corporation Limited Lactobacillus rhamnosus polynucleotides, polypeptides and methods for using them
WO2007126411A2 (en) * 2005-07-28 2007-11-08 Carnegie Mellon University Biocompatible polymers and methods of use
CN101306207A (zh) * 2007-05-14 2008-11-19 北京大学第三医院 组织工程化角膜上皮移植膜及其制备方法和应用
CN101947144A (zh) * 2010-09-29 2011-01-19 厦门大学 一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用
CN103908700A (zh) * 2013-01-06 2014-07-09 陕西佰傲再生医学有限公司 一种脱细胞角膜的制备方法
CN103041450A (zh) * 2013-01-25 2013-04-17 南通大学 用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法
CN104645415A (zh) * 2014-11-28 2015-05-27 南昌大学第一附属医院 一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109172866A (zh) * 2018-09-19 2019-01-11 杭州启明医疗器械有限公司 一种可快速吸水展平的干燥生物心脏瓣膜及其制备方法
WO2020057414A1 (zh) * 2018-09-19 2020-03-26 杭州启明医疗器械股份有限公司 一种可快速吸水展平的干燥生物心脏瓣膜及其制备方法
CN109364298A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 江阴奔翔生物科技有限公司 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
CN109331228A (zh) * 2018-11-26 2019-02-15 陈德夫 一种抗感染的小肠粘膜下层生物材料的制备方法
CN109498841A (zh) * 2018-11-28 2019-03-22 冠昊生物科技股份有限公司 一种生物型骨膜修复材料及其制备方法
CN109498841B (zh) * 2018-11-28 2021-07-16 冠昊生物科技股份有限公司 一种生物型骨膜修复材料及其制备方法
CN109395164A (zh) * 2018-11-29 2019-03-01 四川大学 一种干化的动物细胞外基质材料的制备方法
CN111375090A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 深圳兰度生物材料有限公司 脂肪细胞外基质支架及其制备方法和应用
CN110638684A (zh) * 2019-09-02 2020-01-03 深圳兰度生物材料有限公司 一种可注射的胶原组合物及制备方法
CN110960731A (zh) * 2019-12-12 2020-04-07 成都奇璞生物科技有限公司 一种医用外科生物补片的制备方法
CN111500663A (zh) * 2020-04-12 2020-08-07 江苏安泰康健康科技有限公司 一种水凝胶、制备方法及其三维细胞培养方法
CN111671976A (zh) * 2020-05-09 2020-09-18 深圳兰度生物材料有限公司 抗菌胶原膜及其制备方法
CN111686304A (zh) * 2020-06-11 2020-09-22 四川大学 一种小尺寸经导管人工心脏瓣膜及其制备方法
CN112675364A (zh) * 2021-01-05 2021-04-20 宁波瑞瑧生物科技有限公司 一种复合引导组织再生膜及其制备方法
CN114904055A (zh) * 2021-02-08 2022-08-16 诺一迈尔（苏州）医学科技有限公司 一种生物型巩膜修复材料及其制备方法
CN113101415A (zh) * 2021-03-25 2021-07-13 北京桀亚生物医学研究有限公司 一种细胞结构完整降解可控的生物羊膜及其制备方法
CN114209886A (zh) * 2021-11-09 2022-03-22 江苏臻亿医疗科技有限公司 一种生物组织材料及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108261564A (zh) 脱细胞外基质及其制备方法和应用
Bielli et al. Characterization of a new decellularized bovine pericardial biological mesh: Structural and mechanical properties
Kajbafzadeh et al. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue
CN106267346B (zh) 一种同时处理多种生物组织的方法
CN105126170B (zh) 脱细胞真皮基质及其制备方法
US10426868B2 (en) Method for preparing an animal decellularized tissue matrix material and a decellularized tissue matrix material prepared thereby
Crapo et al. An overview of tissue and whole organ decellularization processes
US7550152B2 (en) Tissue graft scaffold made from cholecyst-derived extracellular matrix
CN103990179B (zh) 一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品
WO2016180259A1 (zh) 一种干态动物源性胶原纤维组织材料及其制备方法和生物假体
Rémi et al. Pericardial processing: challenges, outcomes and future prospects
CN112236175B (zh) 制备用于外科手术植入的生物组织的方法
Shahabipour et al. Novel approaches toward the generation of bioscaffolds as a potential therapy in cardiovascular tissue engineering
CN114209886B (zh) 一种生物组织材料及其制备方法
Duarte et al. Contributions of supercritical fluid technology for advancing decellularization and postprocessing of viable biological materials
CN106474547B (zh) 一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法
CN109364298A (zh) 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
CN108144124A (zh) 一种脱细胞异体真皮基质及在口腔疾病中的应用
CN107412868A (zh) 一种脱细胞真皮基质的制备方法及制得的脱细胞真皮基质
CN108404212A (zh) 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
Fedoniuk et al. Morphological characteristics of acellular dermal matrix manufacturing
Copeland et al. Decellularization in heart valve tissue engineering
CN114848912B (zh) 一种脱细胞真皮及其制备方法
KR102451565B1 (ko) 수화형태 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법
Sembiring et al. Comparative Assessment of Various Concentration and Exposure Time of Sodium Dodecyl Sulfate as Decellularization Agents for Small-Vessels Vascular Tissue Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180710