CN108250320B - 一种低灰分灵芝多糖提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低灰分灵芝多糖提取物及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)酸提：取水漂洗后的灵芝药材，干燥，粉碎成粗粉，加入盐酸水溶液回流提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；(2)醇沉：向浓缩液中缓慢加入浓度95％的乙醇，边加边搅拌，室温下静置，抽滤，得滤渣1；(3)洗涤：用乙醇溶液洗涤步骤(2)所述滤渣1，重复两次，得滤渣2；(4)纯化：用水溶解步骤(3)所述滤渣2，室温下静置，离心，离心上清液过凝胶型阳离子交换树脂柱层析，收集下柱液，减压浓缩后真空干燥，粉碎，得灵芝多糖提取物。本发明灵芝多糖提取物中灵芝多糖含量高，灰分含量低；本发明工艺简便，生产过程绿色环保，适合工业化生产。

Description

一种低灰分灵芝多糖提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于植物提取领域，具体涉及一种低灰分灵芝多糖提取物及其制备方法。

背景技术

灵芝是中国名贵的中药材，具有滋补强身、扶正固本、轻身延年之功效，属多孔菌科类真菌，其水提物的主要活性组分是多糖。近年来，越来越多的研究表明，灵芝多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用。

灵芝多糖作为灵芝的主要有效成分之一，近年来逐渐受到研究人员的重视。目前，有诸多关于灵芝多糖提取工艺的相关报道，如：

现有技术CN101805414A将灵芝子实体粉碎成灵芝粉，然后依次采用微波辅助热水提取法、超声波辅助热水提取法进行提取，所得的提取液经浓缩、去杂、浓缩、醇沉和干燥后得到水溶性灵芝多糖，多糖含量为5.46％；再采用碱提取法对灵芝残渣进行提取，所得的提取液经中和、透析、浓缩、去杂、醇沉和干燥处理后得到碱溶性灵芝多糖，多糖含量为10.74％；

现有技术CN103073651A采用超声波结合酶法提取灵芝多糖，灵芝粉碎后，通过提取、超滤、浓缩和乙醇沉淀分离获得灵芝多糖，灵芝多糖提取率为3.14～4.21％；

现有技术CN101434660使用超声-微波协同萃取机，以水为溶剂进行萃取；萃取完成后进行过滤、浓缩醇沉，真空冷冻干燥后得到灵芝多糖，提取率为2.93％；

现有技术CN101367881使用超声波设备辅助提取，经过醇沉、有机溶剂(无水乙醇、丙酮、***)洗涤三次后干燥得到灵芝多糖样品，多糖纯度达到了47.88％。

灰分是物质在高温灼烧时，发生一系列物理和化学变化，最后有机成分挥发逸散，而无机成分(主要是无机盐和氧化物)残留下来，这些残留物称为灰分。它是产品中无机成分总量的一项指标，是控制食品或保健品成品或半成品质量的重要依据。灰分包括水溶性成分、水不溶性成分与酸不溶性成分。在提取灵芝多糖时，灰分会被一同提取出来，并形成富集，造成灵芝多糖提取物中灰分含量过高，影响最终产品的质量。现有技术还未有针对灵芝多糖提取物进行脱灰分的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种低灰分灵芝多糖提取物及其制备方法。本发明制得的灵芝多糖提取物中灵芝多糖含量高，灰分含量低，其中灵芝多糖含量≥60.8％，灰分≤1.2％；本发明生产工艺简便，易于操作，同时生产过程绿色环保，凝胶材料可反复多次利用，适合工业化生产。

本发明解决上述技术问题所采用的技术手段为：

一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)酸提：取水漂洗后的灵芝药材，干燥，粉碎成粗粉，加入盐酸水溶液回流提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；

(2)醇沉：向浓缩液中缓慢加入浓度为95％的乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置，抽滤，得滤渣1；

(3)洗涤：用乙醇溶液洗涤步骤(2)所述滤渣1，重复两次，得滤渣2；

(4)纯化：用水溶解步骤(3)所述滤渣2，室温下静置，离心，离心上清液过凝胶型阳离子交换树脂柱层析，收集下柱液，减压浓缩后真空干燥，粉碎，得到低灰分灵芝多糖提取物。

优选地，所述步骤(1)中，所述干燥温度为38～42℃，干燥时间为10～12h。

优选地，所述步骤(1)中，所述粗粉的目数为20～30目。

优选地，所述步骤(1)中，所述盐酸水溶液的pH为5～6。

优选地，所述步骤(1)中，所述加入盐酸水溶液回流提取两次，其中第一次盐酸水溶液的加入量为灵芝药材的10倍(v/m)，第二次盐酸水溶液的加入量为灵芝药材的8倍(v/m)。

优选地，所述步骤(1)中，所述加入盐酸水溶液回流提取两次，其中第一次回流提取的时间为2h，第二次回流提取的时间为1.5h。

优选地，所述步骤(1)中，所述过滤采用300目滤布进行。

优选地，所述步骤(1)中，所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09MPa，温度为60～80℃。

优选地，所述步骤(1)中，所述浓缩液体积为灵芝药材的1/5～1/10(v/m)。

优选地，所述步骤(2)中，所述浓度为95％的乙醇溶液的加入量为所述浓缩液体积的4～6倍量(v/v)。

优选地，所述步骤(2)中，所述静置时间为2～5h。

优选地，所述步骤(3)中，所述乙醇溶液浓度为70～80％。

优选地，所述步骤(3)中，所述乙醇溶液加入量为灵芝药材量的1～2倍(v/m)。

优选地，所述步骤(4)中，所述水的加入量为灵芝药材的2～3倍(v/m)。

优选地，所述步骤(4)中，所述静置时间为2～5h。

优选地，所述步骤(4)中，所述凝胶型阳离子交换树脂为732型或Dowex50型。

优选地，所述步骤(4)中，所述凝胶型阳离子交换树脂用量为凝胶型阳离子交换树脂∶灵芝药材＝4～5∶1(v/m)。

优选地，所述步骤(4)中，所述柱层析时的流速为0.5～1BV/h。

优选地，所述步骤(4)中，所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09MPa。

一种低灰分灵芝多糖提取物，采用上述方法制备得到。

上述技术方案中，所述乙醇溶液浓度为乙醇质量分数。

本发明的基本原理：

(1)本发明步骤(1)酸提时通过加入盐酸，不仅能使目标产物灵芝多糖更好的溶出，还能使部分灰分如金属氧化物类灰分转变成离子状态，便于后续工艺的处理；

(2)本发明步骤(1)酸提后的浓缩液主要成分为灵芝多糖、三萜类化合物、脂类、蛋白及呈离子态的灰分等，在步骤(2)醇沉中通过加入浓度为95％的乙醇溶液，使得滤渣成分得到精制(滤渣成分除灵芝多糖之外还包括与灵芝多糖溶解性相似的少量的三萜类化合物、蛋白及灰分等杂质)；

(3)本发明步骤(3)洗涤时通过采用浓度为70～80％的乙醇溶液洗涤滤渣两次，可以洗去与灵芝多糖溶解性相差较大的杂质，使得滤渣成分得到进一步精制，同时还可以将一部分可溶于乙醇溶液的灰分洗脱出去；

(4)本发明步骤(4)所得离心上清液主要成分为溶解性相似的灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白及水溶性灰分等，由于这些物质间理化性质的差异，如灵芝多糖与三萜类化合物及蛋白间分子量存在差异，可以通过分子筛原理进行分离，同时，样品水溶液中的呈阳离子状态的灰分可以被阳离子交换树脂吸附，因此，本发明采用732型或Dowex50型凝胶型阳离子交换树脂柱层对灵芝多糖进行纯化，综合利用其分子筛原理和阳离子交换原理，制备得到低灰分、高灵芝多糖含量的灵芝多糖提取物。

由以上分析可知，本发明酸提、醇沉、洗涤、纯化四步环环相扣、层层递进、协同作用，最终制备得到低灰分、高灵芝多糖含量的灵芝多糖提取物，任何增减本发明试验步骤的技术方案均无法得到本发明所述技术效果的灵芝多糖提取物。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：

(1)本发明制得的灵芝多糖提取物中灵芝多糖含量高，灰分含量低，其中灵芝多糖含量≥60.8％，灰分≤1.2％；

(2)本发明以灵芝子实体为原料，以盐酸水溶液作为提取溶剂进行回流提取，提取液过滤浓缩至一定体积，加入浓缩液4倍量的浓度为95％的乙醇溶液，室温下静置2h后抽滤，滤渣使用适量的浓度为80％的乙醇溶液洗涤两次，洗涤后的滤渣加入适量的水溶解，过凝胶型阳离子交换树脂，收集下柱液，浓缩干燥，即可得到低灰分灵芝多糖提取物；本发明生产工艺简便，易于操作，同时生产过程绿色环保，凝胶材料可反复多次利用，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例3和对比例1制得的灵芝多糖提取物对DPPH自由基的清除作用；

图2为本发明实施例3和对比例1制得的灵芝多糖提取物对羟自由基(·OH)的清除作用；

图3为本发明实施例3和对比例1制得的灵芝多糖提取物的还原能力；

图4为阳性对照Vc的还原能力。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1～3及对比例1所述灵芝子实体药材产于浙江龙泉。

实施例1～3及对比例1所述多糖含量、成品收率、相对收率计算公式如下所示：

实施例1～3及对比例1所述灰分计算公式如下所示：

式中：X-样品中灰分的含量，％；m₁-坩埚和灰分的质量，g；m₂-坩埚的质量，g；m₃-坩埚和样品的质量，g。

实施例1

将适量饮用水漂洗后的灵芝子实体药材在38～42℃条件下干燥10～12h，粉碎成20目的粗粉，称取500g，加入pH＝5的盐酸水溶液回流提取两次，加入的溶剂量分别为药材量的10倍、8倍(v/m)，提取时间分别为2h和1.5h，提取结束后300目滤布过滤，合并滤液，-0.07Mpa下减压浓缩至浓缩液体积为50ml。向浓缩液中缓慢加入300ml浓度为95％的乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置2h后抽滤，保留滤渣。将滤渣加入到500ml浓度为80％的乙醇溶液中，搅拌30min后静置15min，抽滤，保留滤渣，重复洗涤两次。用1L的水溶解沉淀，静置后离心，保留上清液，上清液过732凝胶型阳离子交换树脂柱层析，树脂用量∶药材量＝5∶1，流速1BV/h，收集下柱液，下柱液-0.09Mpa减压浓缩后真空干燥后粉碎即可。使用苯酚硫酸法检测样品灵芝多糖含量为61.4％，灰分检测为0.8％。

实施例2

将适量饮用水漂洗后的灵芝子实体药材在38～42℃条件下干燥10～12h，粉碎成30目的粗粉，称取500g，加入pH＝6的盐酸水溶液回流提取两次，加入的溶剂量分别为药材量的10倍、8倍(v/m)，提取时间分别为2h和1.5h，提取结束后300目滤布过滤，合并滤液，-0.08Mpa减压浓缩至浓缩液体积为100ml。向浓缩液中缓慢加入400ml浓度为95％的乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置4h后抽滤，保留滤渣。将滤渣加入到1000ml浓度为70％的乙醇溶液中，搅拌30min后静置30min，抽滤，保留滤渣，重复洗涤两次。用1L的水溶解沉淀，静置后离心，保留上清液，上清液过732型凝胶型阳离子交换树脂柱层析，树脂用量∶药材量＝4∶1，流速0.5BV/h，收集下柱液，下柱液-0.08Mpa减压浓缩后真空干燥后粉碎即可。使用苯酚硫酸法检测样品灵芝多糖含量为63.2％，灰分检测为1.2％。

实施例3

将适量饮用水漂洗后的灵芝子实体药材在38～42℃条件下干燥10～12h，粉碎成20目的粗粉，称取500g，加入pH＝5的盐酸水溶液回流提取两次，加入的溶剂量分别为药材量的10倍、8倍(v/m)，提取时间分别为2h和1.5h，提取结束后300目滤布过滤，合并滤液，-0.08Mpa减压浓缩至浓缩液体积为50ml。向浓缩液中缓慢加入300ml浓度为95％的乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置2h后抽滤，保留滤渣。将滤渣加入到500ml浓度为80％的乙醇溶液中，搅拌30min后静置15min，抽滤，保留滤渣，重复洗涤两次。用1.5L的水溶解沉淀，静置后离心，保留上清液，上清液过Dowex50型凝胶型阳离子交换树脂柱层析，树脂用量∶药材量＝5∶1，流速1BV/h，收集下柱液，下柱液-0.08Mpa减压浓缩后真空干燥后粉碎即可。使用苯酚硫酸法检测样品灵芝多糖含量为60.8％，灰分检测为1.1％。

对比例1

适量饮用水漂洗后的灵芝子实体药材在38～42℃条件下干燥10～12h，粉碎成20目的粗粉，称取500g，加入饮用水回流提取两次，加入水的量分别为药材量的10倍、8倍(v/m)，提取时间分别为2h和1.5h，提取结束后300目滤布过滤，合并滤液，-0.09Mpa减压浓缩至浓缩液体积为50ml。向浓缩液中缓慢加入300ml浓度为95％的乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置1.5h后抽滤，保留滤渣。将滤渣加入到500ml浓度为80％的乙醇溶液中，搅拌30min后静置30min，抽滤，保留滤渣，重复洗涤两次。用1.5L的水溶解沉淀，静置后离心，保留上清液，上清液过Dowex50型凝胶型阳离子交换树脂柱层析，树脂用量∶药材量＝5∶1，流速1BV/h，收集下柱液，下柱液-0.09Mpa减压浓缩后真空干燥后粉碎即可。使用苯酚硫酸法检测样品灵芝多糖含量为54.2％，灰分检测为4.4％。

实施例1～3及对比例1制得的灵芝多糖提取物中多糖含量及灰分含量见表1。

表1实施例1～3及对比例1制得的灵芝多糖提取物中多糖含量及灰分含量

产品	多糖含量％	成品收率％	相对收率％	灰分％
					实施例1	61.4	1.13	69.4	0.8
实施例2	63.2	1.20	75.8	1.2
					实施例3	60.8	1.17	71.1	1.1
对比例1	54.2	1.01	67.7	4.4

一、本发明灵芝多糖含量检测方法(苯酚-硫酸法)：

1.对照品溶液的制备：

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，加水制成每1ml含100μg的溶液，即得。

2.标准曲线的制备：

分别精密吸取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，置25ml具塞试管中，补加水至2.0ml，分别加入5％苯酚溶液1mL，混匀，迅速垂直加入硫酸7.0mL，摇匀，置沸水浴中显色2min，取出。置冰水浴中10min，取出，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，在490nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3.供试品溶液的制备：

取本品约1g，精密称定，置100mL量瓶中，加水20mL超声溶解并不时震摇，待样品分散均匀无结块后，再加40mL水，超声30min，待冷却后加水稀释至刻度，摇匀，室温放置1h。精密量取上清液2mL，垂直加入乙醇(浓度为95％的乙醇溶液)10ml，摇匀，4℃放置12h，取出，4000r/min离心20min，小心倾去上清液，离心管轻轻倒扣在滤纸上，待不再流下液体后，再加入水适量超声溶解沉淀，全部转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液2mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“分别加入5％苯酚溶液1mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中的无水葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。

二、灵芝多糖总灰分

参照《中国药典》2015年版四部通则2302灰分测定法检测。

三、灵芝多糖体外抗氧化活性

3.1实验灵芝多糖原料

灵芝多糖1：实施案例3制备的灵芝多糖样品(pH5～6HCl水溶液回流提取)；灵芝多糖2：对比例1制备的灵芝多糖样品(饮用水回流提取)。

3.2 DPPH自由基清除作用测定

分别精确吸取配置好的质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL的灵芝多糖1、灵芝多糖2、阳性对照Vc的样品溶液2mL加入到各个干燥洁净的具塞玻璃试管中，避光条件下向每个试管中分别加入2mL质量分数为0.004％的DPPH乙醇溶液，混匀，于黑暗环境中反应30min，反应结束后在波长为517nm处测定吸光度值，重复试验3次，结果取平均值。清除率计算公式如下：

式中：A₀为2mL纯水加2mL DPPH乙醇溶液吸光度值；A₁为2mL待测溶液加2mL DPPH乙醇溶液吸光度值；A₂为2mL待测溶液加2mL无水乙醇溶液吸光度值。

3.3羟自由基(·OH)清除作用测定

分别将1mL 9mmol/L的FeSO₄溶液与2mL 9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液逐次加入到各个干燥洁净的具塞玻璃试管中，混匀，再分别加入2mL配置好的质量浓度为0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/mL的灵芝多糖1、灵芝多糖2、阳性对照Vc溶液，最后分别加入2mL8.8mmol/L的H₂O₂溶液启动反应，室温下反应1h，在波长510nm处出测定其吸光度值。试验重复3次，结果取平均值。清除率计算公式如下：

式中：A₁为加入不同质量浓度的多糖溶液和H₂O₂溶液的吸光度；A₂为加入等体积的H₂O替代H₂O₂溶液的吸光度；A₀为加入等体积的H₂O替代多糖溶液和H₂O₂溶液的吸光度。

3.4还原能力的测定

分别吸取配置好的质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL的灵芝多糖1与灵芝多糖2样品溶液与阳性对照Vc溶液(浓度分别为0、20、40、60、80和100μg/mL)1mL加入到各个干燥洁净的具塞玻璃试管中，分别向各个试管中加入2.5mL的磷酸缓冲液(pH 6.6，0.2mol/L)和2.5mL 1％铁***溶液，混和均匀，50℃下水浴20min，然后再分别加入2.5mL质量分数为10％的三氯乙酸溶液，离心机转速为3000r/min下离心10min，再分别用移液枪精密吸取2.5mL的上清液，分别加入2.5mL纯水和2.5mL现配的0.1％FeCl₃溶液，混合均匀，室温放置30min后，于波长700nm处测定溶液的吸光度值。试验重复3次，结果取平均值。

四、抗氧化实验结果

4.1 DPPH自由基清除作用

DPPH自由基的清除率和抗氧化剂提供氢的能力有关。

由图1可以看出灵芝多糖1与灵芝多糖2都有一定的DPPH自由基的清除作用，且清除能力相对比较接近，当多糖浓度为1.0mg/ml时，灵芝多糖1与灵芝多糖2对DPPH自由基的清除率分别为87.3％、85.5％。

4.2羟自由基(·OH)清除作用

由图2可以看出灵芝多糖1与灵芝多糖2对羟自由基(·OH)具有清除作用，清除能力相对比较接近，当多糖浓度为5.0mg/ml时，灵芝多糖1与灵芝多糖2对DPPH自由基的清除率分别为91.2％、93.4％。

4.3还原能力

由图3可以看出灵芝多糖1与灵芝多糖2有一定程度上的还原能力，且还原能力相对接近，当多糖浓度为1.0mg/ml时，灵芝多糖1与灵芝多糖2的吸光度值分别为0.343、0.342，但是还原能力低于阳性对照Vc。

4.4总结

从以上的灵芝多糖得体外抗氧化实验结果可以看出，实施例3与对比例1的灵芝多糖样品都具有一定程度上的抗氧化活性，并且二者的抗氧化活性没有明显的差别，这表明本发明提取工艺不会对灵芝多糖生物活性产生大的影响，因此，采用本发明所述制备方法制备得到的灵芝多糖提取物附加值相较现有技术大为提高。

上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)酸提：取水漂洗后的灵芝药材，干燥，粉碎成粗粉，加入盐酸水溶液回流提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；

(2)醇沉：向浓缩液中缓慢加入浓度为95％的乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置，抽滤，得滤渣1；

(3)洗涤：用乙醇溶液洗涤步骤(2)所述滤渣1，重复两次，得滤渣2；

(4)纯化：用水溶解步骤(3)所述滤渣2，室温下静置，离心，离心上清液过凝胶型阳离子交换树脂柱层析，收集下柱液，减压浓缩后真空干燥，粉碎，得到低灰分灵芝多糖提取物；

所述步骤(1)中，所述盐酸水溶液的pH为5～6；

所述步骤(4)中，所述凝胶型阳离子交换树脂为732型或Dowex50型。

2.如权利要求1所述的一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述粗粉的目数为20～30目。

3.如权利要求1所述的一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述加入盐酸水溶液回流提取两次，其中第一次盐酸水溶液的加入量为灵芝药材的10倍(v/m)，第二次盐酸水溶液的加入量为灵芝药材的8倍(v/m)；第一次回流提取的时间为2h，第二次回流提取的时间为1.5h。

4.如权利要求1所述的一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述过滤采用300目滤布进行；所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09MPa，温度为60～80℃。

5.如权利要求1所述的一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述浓度为95％的乙醇溶液的加入量为所述浓缩液体积的4～6倍量(v/v)。

6.如权利要求1所述的一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述乙醇溶液浓度为70～80％；所述乙醇溶液加入量为灵芝药材量的1～2倍(v/m)。

7.如权利要求1所述的一种低灰分灵芝多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述凝胶型阳离子交换树脂用量为凝胶型阳离子交换树脂∶灵芝药材＝4～5∶1(v/m)。

8.一种低灰分灵芝多糖提取物，采用如权利要求1～7任意一项所述方法制备得到。

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