CN105296427A

CN105296427A - 造血干细胞的体外扩增培养方法

Info

Publication number: CN105296427A
Application number: CN201510696303.6A
Authority: CN
Inventors: 曾宪卓; 鲁菲
Original assignee: ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Current assignee: ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明涉及一种造血干细胞的体外扩增培养方法，获取造血干细胞；采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养；其中，所述小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂。通过小分子抑制剂使得造血干细胞能够一直处于增殖不分化的状态；而小分子抗氧化剂，也可消除造血干细胞在增殖过程中产生的自由基，对细胞起到保护作用，使得造血干细胞在增殖的同时也能够保持其细胞活性，有利于提高造血干细胞的扩增率及细胞活性，并使得造血干细胞能够处于增殖不分化的状态，进而达到临床移植需求，解决了现有技术中造血干细胞扩增率低、活性差且易分化等缺陷。

Description

造血干细胞的体外扩增培养方法

技术领域

本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种造血干细胞的体外扩增培养方法。

背景技术

目前造血干细胞通常有三个来源:骨髓、外周血及脐带血。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有富含更早期的造血干细胞、采集方便，造血干细胞免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例较高等优点，因而脐带血造血干细胞具有极大的临床应用价值。但是，单份脐血的造血干细胞含量低，在临床中很难用于正常体重成人患者的移植。因此，造血干细胞在移植前需要进行体外扩增。

目前，造血干细胞的扩增培养常采用加入血清和多种细胞因子的液体培养基、与基质细胞共同培养或在生物反应器中培养等方法，但上述方法仍不能获得充足的具有植活能力的造血干细胞用于临床治疗，且造血干细胞很快便发生分化、衰竭。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用多种细胞因子培养造血干细胞的方式存在造血干细胞扩增率低且活性较低、易分化等缺陷，提供一种能够提高造血干细胞扩增率及细胞活性并保持其干细胞特性的造血干细胞的体外扩增方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种造血干细胞的体外扩增培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

获取造血干细胞；

采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养；

其中，所述小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述小分子抑制剂为MEK1/2抑制剂或MAPKK抑制剂。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述小分子抑制剂为PD184352或U0126。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述小分子抗氧化剂为维生素C、海藻糖和透明质酸中的一种。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞的获取过程包括以下步骤：

采集脐血，与PBS混匀稀释后，沉降红细胞，吸出上清液；并对所述上清液离心后弃上清，重悬细胞后，加入人淋巴细胞分离液，静置，离心，收集下层的单个核细胞。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，沉降红细胞的过程步骤为：将稀释后的脐血与甲基纤维素按(2～4)：1的比例混匀，室温下静置30～45分钟。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述甲基纤维素的质量分数为0.1％～1.0％。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞的获取过程还包括以下步骤：

调整所述单个核细胞密度为(0.5～3)×10⁸个/m1，加入CD34抗体，混匀，室温孵育，加入抗人CD34磁珠混匀，孵育，用含有FBS和EDTA的PBS洗涤后置于磁场中，静置后倒掉上清液，即收获造血干细胞CD34⁺细胞。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，采用所述小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养的过程步骤为：调整所述造血干细胞CD34⁺细胞的密度为(0.5～3)×10⁵个/ml，然后将造血干细胞CD34⁺细胞接种于培养基中，并添加(100～200)ng/ml的小分子抗氧化剂和2μM～4μM的小分子抑制剂进行扩增培养。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述体外扩增培养时间为4～8天。

实施本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法，可以达到以下有益效果：采用小分子抑制剂和小分子抗氧化剂共同进行造血干细胞的体外扩增培养，使得造血干细胞能够一直处于增殖不分化状态，并能够避免造血干细胞在增殖过程中分泌大量氧化产物促使细胞凋亡的问题，通过加入小分子抗氧化剂能够很好的保持细胞的活性，对造血干细胞起到保护的作用，从而不仅提高了造血干细胞的扩增率，而且也提高了造血干细胞的细胞活性，并使造血干细胞能够保持其干细胞特性。

具体实施方式

为解决现有技术中采用多种细胞因子共同作用进行造血干细胞的体外扩增培养方式存在造血干细胞扩增率低，细胞活性差且易分化等缺陷，本发明的创新点在于采用小分子化合物培养造血干细胞，通过小分子抑制剂使得造血干细胞能够一直处于增殖不分化的状态；而小分子抗氧化剂，也可消除造血干细胞在增殖过程中产生的自由基，对细胞起到保护作用，使得造血干细胞在增殖的同时也能够保持其细胞活性，有利于提高造血干细胞的扩增率及细胞活性，并使得造血干细胞能够处于增殖不分化的状态，进而达到临床移植需求，解决了现有技术中造血干细胞扩增率低、活性差且易分化等缺陷。

具体地，本发明提供的一种造血干细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：

S1、获取造血干细胞；

S2、采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养；

其中，小分子化合物是指相对分子质量小于10000的化合物；相较于细胞因子，小分子化合物的性质更为稳定，给药较为方便，其作用效果能够通过调节化合物的结构和浓度来改变；由于小分子化合物调节作用单一，不易引发免疫反应，因此，易于在生理功能恢复后撤出，对病理和生理过程的调节主动方便，有助于维持正常的机体生理功能，对后期造血干细胞的移植具有重要的意义。

本发明中的小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂，由于造血干细胞在增殖过程中会分泌大量氧化产物，氧化产物的自由基会使造血干细胞凋亡，因此，通过加入小分子抗氧化剂来消除自由基，从而能够很好地保持造血干细胞的活性；除此之外，抗氧化剂也使得造血干细胞在增殖的过程始终处于低氧环境中，以模拟造血干细胞在人体内的低氧生存环境，从而更有利于造血干细胞的增殖；而小分子抑制剂则能够使造血干细胞一直处于增殖不分化的状态。优选地，本发明中所采用的小分子抗氧化剂为维生素C、海藻糖和透明质酸中的一种；小分子抑制剂为MEK1/2抑制剂或MAPKK抑制剂，如PD184352或U0126等。PD184352可购于Sigma公司，其分子式：C₁₇H₁₄ClF₂IN₂O₂，分子量：478.66，是一种ATP非竞争性的MEK1/2抑制剂，能够抑制ERK磷酸化，抑制造血干细胞的分化信号通路。U0126可购于Sigma公司，即1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-aminophenylmercapto)butadiene，分子量为380.50，分子式为C₁₈H₁₆N₆S₂，是一种MAPKK抑制剂，即MAPKkinase抑制剂或MEK1/2抑制剂。U0126可以通透细胞，选择性抑制MEK1/2信号通路，从而抑制MAPkinase(Erk1/2即p44/42MAPK)的磷酸化和激活，同时可以抑制AP-1依赖的基因转录激活，从而能够抑制造血干细胞的分化。

进一步地，在步骤S1中，造血干细胞可来源于骨髓、外周血及脐带血，与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，采集方便，免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例较高等优点；因此，在本发明中，优先采用脐带血造血干细胞，具体地，造血干细胞的来源过程为：

S11、采集脐带血；

S12、分离获取脐带血单个核细胞；

S13、从单个核细胞中分选出造血干细胞CD34⁺细胞。

在步骤S11中，脐带血均来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次采集量为50～100mL；

步骤S12的具体过程为：首先将步骤S11中采集的脐带血与PBS缓冲液以1：1的体积比混合稀释得到脐带血稀释液；再按(2～4)：1体积比与甲基纤维素混匀，室温下静置，待红细胞沉降后，吸出上清液；然后将上清液置于离心管中离心，弃上清，重悬细胞后，获得细胞悬液，在新的离心管中加入人淋巴细胞分离液，静置，再加入细胞悬液进行离心，收集下层单个核细胞。

其中，甲基纤维素来源于瑞士FLUNK公司，它是一种不对称的链型巨分子，粘度大，平均粘度为4000cP，不进入细胞，它的分子结构中有较多的亲水、非极性基团，使红细胞互相靠拢，快速沉降，其结构较稳定，易保存，在体外可作为细胞培养的支持剂，输入体内无毒性，用甲基纤维素沉降红细胞操作较简便快速，且对设备技术无特殊要求。

甲基纤维素的配制方法为：用预冷的4℃生理盐水配制，置4℃过夜，再反复振荡摇匀，至甲基纤维素溶解，0.1MPa高压消毒15分钟，冷却至4℃后再用力振荡，甲基纤维素完全溶解后呈无色透明状，置4℃保存备用。优选地，甲基纤维素的质量分数为0.1％～1.0％。

该步骤中，同时采用甲基纤维素和人淋巴细胞分离液不仅能够提高脐带血单个核细胞的回收率，而且能够提高造血干细胞CD34⁺细胞的回收率。

S13的具体过程为：调整步骤S12获得的单个核细胞密度至(0.5～3)×10⁸个/m1，按每毫升单个核细胞悬液加入100μL抗体的比例加入CD34抗体混合物，混匀，室温孵育5～20分钟，加入抗人CD34磁珠混匀，孵育5～20分钟，用含有FBS(胎牛血清，fetalcalfserum)和EDTA(乙二胺四乙酸，EthyleneDiamineTetraaceticAcid)的PBS洗涤后置于磁场中，静置后倒掉上清液，即收获造血干细胞CD34⁺细胞。

步骤S2的具体过程为：调整步骤S13所获得的造血干细胞CD34⁺细胞的密度至(0.5～3)×10⁵个/ml，将细胞接种到含有培养基的细胞培养板上，然后再添加(100～200)ng/ml的小分子抗氧化剂和2μM～4μM的小分子抑制剂，培养4～8天。

其中，该步骤所采用的培养基为用于扩增造血干细胞且不含有细胞因子的培养基，如血清培养基或无血浆干细胞培养基等。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式为：

实施例1

本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：

S1A、脐血造血干细胞的分离与分选的过程：

S11A、脐血单个核细胞的分离

将脐血按1：1的体积比与PBS混匀，再按4：1的体积比与0.5％甲基纤维素混匀，室温下静置30～45分钟，待红细胞自然沉降至界限分明时，吸出上清，需注意不要吸出下面沉淀的红细胞；

将吸出的上清置于50ml离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，加入5ml的PBS重悬细胞，获得细胞悬液；然后，在新的15ml离心管中加入5ml人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/ml)，静置3～5min后再缓慢沿着管壁加入5ml细胞悬液，1500rpm离心20min；

离心结束后取出离心管，收集下层单个核细胞，用5～10ml的PBS洗涤，重悬细胞，备用。

S12A、分选出造血干细胞细胞CD34⁺细胞；

将步骤S11A中获得的脐带血单个核细胞以台盼蓝染色计数活细胞后调为2×10⁸个/m1的细胞悬液，按每毫升细胞悬液加入100μL抗体的比例，加入CD34抗体混合物，用移液器上下吹打充分混匀，室温孵育15分钟；然后按每毫升细胞悬液加入50μL磁珠的比例，加入CD34⁺磁珠充分吹打混匀，室温孵育10分钟后，将细胞转入聚苯乙烯试管(12×75rnm)，加PBS洗涤液(含2％FBS、0.01％EDTA)至2.5ml，在试管内用移液器上下轻轻吹打2～3次，混匀细胞。再将试管***磁极中，静置五分钟；然后将磁极连试管一起拿起，以连续缓慢的动作倾倒磁极至倒置状态，倒出上清部分。磁性标记的细胞由于磁极磁场的吸引，仍然留在试管内。保持磁极及试管倒置2～3秒，然后使试管口恢复向上的位置。从磁极中取出试管，加入2.5ml洗涤液，用移液器轻轻吹打细胞悬液2～3次，混匀细胞，再将试管放回磁极中，静置五分钟。重复洗涤4次后，试管中保留的为造血干细胞CD34⁺细胞，备用。

S2A、添加小分子化合物对步骤S12A中获得的造血干细胞CD34⁺细胞进行扩增培养；

调整CD34⁺细胞的细胞悬液密度为1×10⁵个/ml，并接种于含有培养基的12孔的培养板上，接种前做流式分析检测接种前CD34⁺细胞含量在90％以上；再添加150ng/ml的小分子抗氧化剂和3μM的小分子抑制剂，培养4天。

该实施例中，培养基为含硒的培养基，其本身即有抗氧化的作用；所采用的小分子抗氧化剂为维生素C，不仅能够起到抗氧化的作用，而且能够降低造血干细胞的氧分压，使造血干细胞在增殖的过程中始终处于低氧环境中，有利于造血干细胞的增殖；小分子抑制剂为PD184352，从而可使得造血干细胞能够一直处于增殖状态而不分化。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，该实施例中所采用的小分子抑制剂为3μM的U0126。

为进一步验证本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法的显著效果，通过以下实验进行检测验证。

检测对象：

对照组：与本发明实施例1不同之处在于，采用现有技术中的细胞因子进行造血干细胞扩增培养4天后所获得的细胞；

检测组1-2：分别为本发明实施例1-2培养造血干细胞4天后所获得的细胞。

1、CD34⁺细胞的流式细胞仪分析

应用BectonDickinson型流式细胞仪对扩增后细胞进行计数，并对扩增前后的细胞进行CD34-FITC抗体检测，细胞标记方法为：细胞用PBS缓冲盐溶液洗涤一次，加入CD34-FITC抗体10μL，4℃避光孵育30分钟；孵育结束后用PBS缓冲盐溶液再洗涤一次，使用流式细胞仪分析CD34⁺细胞的含量，检测结果如下表1。

表1

检测对象	检测组1	检测组2	对照组
				细胞总数(个/ml)	8.63×10⁷	1.20×10⁸	5.38×10⁷
CD34⁺细胞比例(％)	95.23±9.67	94.56±11.28	61.34±10.23

由以上结果可以看出，通过本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法所获得的细胞数量及CD34⁺细胞比例均明显提高。

2、细胞周期检测

分别取检测组1-2和对照组培养第4天所获得的细胞，经流式细胞术分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比，分别各取5组标本进行检测分析，检测数据见下表2：

表2

检测结果：由表2中数据可知，检测组1-2中处于G₀/G₁期细胞百分比均大于对照组，由此可知，检测组1-2所获得的活细胞数量多于对照组；且实验组处于G₀/G₁期的细胞百分比远大于G₂/M期，由此说明，本发明提供的造血干细胞的扩增培养方法能够延长造血干细胞的G₀/G₁期，使其能够一直处于增殖状态而不分化，从而保持造血干细胞的干细胞特性。

综上所述，本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法，通过采用小分子化合物代替现有技术中的细胞因子进行造血干细胞的扩增培养，不仅能够提高造血干细胞的细胞活性，提高造血干细胞的扩增率，而且还能够使得造血干细胞一直处于增殖不分化的状态，以维持造血干细胞的干细胞特性，对于临床移植造血干细胞具有重要的意义。

以上结合本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims

1.一种造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述培养方法包括以下步骤：

获取造血干细胞；

采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养；

2.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述小分子抑制剂为MEK1/2抑制剂或MAPKK抑制剂。

3.根据权利要求2所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述小分子抑制剂为PD184352或U0126。

4.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述小分子抗氧化剂为维生素C、海藻糖和透明质酸中的一种。

5.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细胞的获取过程包括以下步骤：

采集脐血，与PBS混匀稀释，沉降红细胞后，吸出上清液；并对所述上清液离心后弃上清，重悬细胞后，加入人淋巴细胞分离液，静置，离心，收集下层的单个核细胞。

6.根据权利要求5所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，沉降红细胞的过程步骤为：将稀释后的脐血与甲基纤维素按(2～4)：1的体积比混匀，室温下静置30～45分钟。

7.根据权利要求6所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述甲基纤维素的质量分数为0.1％～1.0％。

8.根据权利要求7所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细胞的获取过程还包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，采用所述小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养的过程步骤为：调整所述造血干细胞CD34⁺细胞的密度为(0.5～3)×10⁵个/ml，然后将造血干细胞CD34⁺细胞接种于培养基中，并添加(100～200)ng/ml的小分子抗氧化剂和2μM～4μM的小分子抑制剂进行扩增培养。

10.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述体外扩增培养时间为4～8天。