CN108226540B - 一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、aptt试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒，涉及临床诊断试剂领域。配制方法是将鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散；加入碱性缓冲液或无机碱；在加入鞣花酸后10分钟内快速加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸；加入金属离子；加入氨基酸及其衍生物，得缓冲液；另外在兔脑磷脂中加入无钙纯化水，混匀乳化得乳化磷脂；将乳化磷脂加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到鞣花酸试剂，该工艺简单快捷，且均有详细说明。活化部分凝血活酶时间测定试剂包括上述的鞣花酸试剂和氯化钙试剂，具有良好的稳定性。包括上述活化部分凝血活酶时间测定试剂的APTT试剂盒能直接取代进口高稳定性APTT试剂盒。

Description

一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定 试剂、APTT试剂盒

技术领域

本发明涉及临床诊断试剂领域，且特别涉及一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒。

背景技术

在临床检查的领域中，已知通过测定血液的凝固时间来研究血液凝固因子的异常等检查，其中，APTT测定作为一般的血液凝固能力的临床检查之一。APTT(activatedpartial thromboplastin time)即活化部分凝血活酶时间，是指反映出血时血液通过与有阴性电荷的异物接触而开始的内因性凝固途径的功能的凝固时间。APTT测定不仅是在内因性凝固因子的缺乏或异常的筛选检查中利用，还在肝素疗法的监测等中利用。

现有APTT试剂大多采用兔脑磷脂，该磷脂在空气中易变为红棕色，有吸湿性，不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和***，因此存在溶解问题，若强行搅拌溶解会产生不均匀的不溶物，从而导致工艺不可控，若加热溶解则可能使磷脂失活甚至氧化。通过检索，部分现有专利并未详细说明磷脂处理过程，另外一些现有专利公开的磷脂处理均存在一些问题，例如：申请号CN200710036410.1的发明专利中的兔脑提取脑磷脂用蒸馏水溶解，这很难实现，因此该专利存在工艺误导；申请号CN200810083554.7的发明专利公开的液体白陶土APTT试剂虽表明其37℃下可稳定至少30天，但并未披露其具体工艺，再加之激活剂的不同，试剂的敏感性亦不同，该APTT试剂的性能未可知。

出于临床灵敏度、疾病鉴别或品质升高的目的，近年，将多种合成磷脂混合使用(参照例如，US2011/159597)。另外，作为合成磷脂的种类，将磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰丝氨酸(PS)的3种混合而含在试剂中成为主流，但合成磷脂种类较多，不易获取且价格昂贵，另外各组分比例亦较难把控，同样存在溶解问题，部分会导致沉淀生成，影响试剂品质。现有试剂会存在鞣花酸及磷脂沉淀问题，鞣花酸缓冲液，原料处理如鞣花酸在碱性条件下会失去活性，磷脂乳化是否均匀，鞣花酸缓冲液与磷脂的配比问题等都直接影响了国产试剂的品质，导致市场仍被以西门子、思塔高、沃芬等巨头占有。

因此，一种制作工艺简单，稳定性高，能直接取代进口高稳定性活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒被市场所期待。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鞣花酸试剂及其配制方法，包括磷脂乳化，鞣花酸溶解，各原料添加顺序、APTT时间调节等的生产工艺，该工艺简单快捷，且均有详细说明。

本发明的另一目的在于提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，该试剂具有良好的稳定性，37℃下可稳定至少30天，试剂开盖后于5±3℃下至少稳定30天以上。

本发明的另一目的在于提供一种APTT试剂盒，能直接取代进口高稳定性活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种鞣花酸试剂的配制方法，其包括以下步骤：

将鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散；首先加入碱性缓冲液或无机碱；然后在加入鞣花酸后10分钟内快速加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸，调pH至7.1±0.1；之后加入金属离子；接着加入氨基酸及其衍生物，得缓冲液；

另外，在兔脑磷脂中加入2～8℃的无钙纯化水，并于2～8℃混匀乳化，得乳化磷脂；

将所述乳化磷脂加入所述缓冲液中，快速搅拌混匀，得到鞣花酸试剂。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述混匀乳化是采用中空的混匀管和中空的研磨管进行的，具体方法是：将研磨管***混匀管内，在研磨管中加入2～8℃冰水，同时在混匀管中加入兔脑磷脂，随后在混匀管中加入2～8℃的无钙纯化水，保证整个乳化过程处于2～8℃环境中，使用研磨管研磨混匀管中的物质。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述碱性缓冲液为乙酸钠、Tris-base、Hepes-Na中的至少一种；无机碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述酸性缓冲液为Tris-hcl、Hepes、磷酸二氢盐中的至少一种；有机酸为甲酸、乙酸、乙二酸中的至少一种；无机酸为盐酸。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述金属离子为镁离子、铁离子、锰离子中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，氨基酸及其衍生物为丙氨酸、甘氨酸、丁酮酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸及其盐中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，在加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸之后的任意时间内加入防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠、proclin300、庆大霉素中的至少一种。

本发明提出一种鞣花酸试剂，其是采用上述的鞣花酸试剂的配制方法制得。

本发明提出一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其包括上述的鞣花酸试剂和氯化钙试剂，所述氯化钙试剂为氯化钙配制的磷酸盐缓冲液。

本发明提出一种APTT试剂盒，其包括上述的活化部分凝血活酶时间测定试剂。

本发明实施例的鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒的有益效果是：本发明实施例的鞣花酸试剂配制方法是将鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散；首先加入碱性缓冲液或无机碱；然后在加入鞣花酸后10分钟内快速加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸，调pH至7.1±0.1；之后加入金属离子；接着加入氨基酸及其衍生物，得缓冲液；另外，在兔脑磷脂中加入2～8℃的无钙纯化水，并于2～8℃混匀乳化，得乳化磷脂；将乳化磷脂加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到鞣花酸试剂，该工艺简单快捷，且均有详细说明。本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂包括上述的鞣花酸试剂和氯化钙试剂，氯化钙试剂为氯化钙配制的磷酸盐缓冲液，该试剂具有良好的稳定性，37℃下可稳定至少30天，试剂开盖后于5±3℃下至少稳定30天以上。本发明实施例的APTT试剂盒包括上述活化部分凝血活酶时间测定试剂，能直接取代进口高稳定性APTT试剂盒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的一种鞣花酸试剂的配制方法的流程图；

图2为本发明实施例中不同样品的相关性散点图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、APTT试剂盒进行具体说明。

本发明实施例提供一种鞣花酸试剂的配制方法，参见图1所示，其包括以下步骤：

(1)配制缓冲液：

将鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使均匀分散，转数约为500～1000r/min，具体转速视搅拌转子大小而定，以溶液不溢出为标准，例如：配制1000ml鞣花酸试剂，搅拌转子为15*100mm(直径-长度)，则转数500r/min，搅拌转子为8*40mm(直径-长度)，则转数1000r/min。因鞣花酸溶解度小且纯化水pH约为5.6，故即使加速搅拌达到24小时，亦不能完全溶解。所用鞣花酸无特殊要求，分析纯即可，本实施例优选采用0.2～0.5mmol鞣花酸。

首先加入碱性缓冲液或无机碱，由于鞣花酸在碱性条件下快速溶解，因此，加入碱性缓冲液或无机碱后约2分钟即可完全溶解。所用的碱性缓冲液为乙酸钠、Tris-base、Hepes-Na中的至少一种；无机碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。本实施例优选加入0.3～0.8mmol乙酸钠。

然后在加入鞣花酸后10分钟内快速加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸，调pH至7.1±0.1，鞣花酸虽然易溶于碱，但在碱性溶液中的稳定性差，容易分解，因此不适合配成溶液进行长时间的分析、科研工作，因此需快速加入酸性缓冲液，保证鞣花酸的稳定，进而构成了APTT试剂的最适pH。所用的酸性缓冲液为Tris-hcl、Hepes、磷酸二氢盐中的至少一种；有机酸为甲酸、乙酸、乙二酸中的至少一种；无机酸为盐酸。本实施例优选加入0.8～1.3mmolTris-hcl。

之后加入金属离子，金属离子与鞣花酸形成稳定螯合物，加速鞣花酸激活效力，金属离子的加入量直接影响形成试剂的测值及同对比西门子试剂的相关性。所用的金属离子为镁离子、铁离子、锰离子中的至少一种，本实施例优选加入0.02～0.03mmol铁离子。

接着加入氨基酸及其衍生物，防止鞣花酸沉淀，保证试剂品质，得缓冲液。所用的氨基酸及其衍生物为丙氨酸、甘氨酸、丁酮酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸及其盐中的至少一种，本实施例优选加入精氨酸盐酸盐1.5％和甘氨酸1.5％。

配制缓冲液时，在加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸之后的任意时间内均可加入防腐剂，防腐剂为叠氮钠、proclin300、庆大霉素中的至少一种。

(2)配制乳化磷脂：在兔脑磷脂中加入2～8℃的无钙纯化水，并于2～8℃冰浴混匀乳化，得乳化磷脂。本实施例采用的动物磷脂取自兔脑，优选为0.3～0.35克/升的兔脑磷脂，该原料市场大量有售。

本实施例的混匀乳化是采用中空的混匀管和中空的研磨管进行的，具体方法是：将研磨管***混匀管内，在研磨管中加入2～8℃冰水，同时在混匀管中加入兔脑磷脂，随后在混匀管中加入2～8℃的无钙纯化水，保证整个乳化过程处于2～8℃环境中，使用研磨管研磨混匀管中的物质。该混匀管和研磨管组成与研磨装置类似的装置，在液态低温环境下将磷脂快速乳化，保证乳化彻底、均匀、快速，采用这种独特且方便快捷的乳化工艺，使乳化完全，磷脂微粒均匀，且不破坏其活性，配制成均一的液体乳剂。

(3)将乳化磷脂以特定比例加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到呈黄色的均匀分散液，即鞣花酸试剂。

本发明实施例提供一种鞣花酸试剂，其是采用上述的鞣花酸试剂的配制方法制得。

本发明实施例提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其主要由两部分组成，即鞣花酸试剂和氯化钙试剂，氯化钙试剂为氯化钙配制的适量浓度磷酸盐缓冲液，本实施例所用的氯化钙试剂是由0.03mmol氯化钙与0.5mmol磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制而成，pH＝7.10。活化部分凝血活酶时间测定试剂的使用方法是：将50ul样品加入血凝杯中，于37℃孵育60S；随后向其中添加上述的APTT测定用鞣花酸试剂50ul，于37℃孵育60S；最后加入上述氯化钙液50ul至血凝杯中，将样本、APTT试剂、氯化钙试剂混匀后240S后测定凝固时间。

本发明实施例提供一种APTT试剂盒，其包括活化部分凝血活酶时间测定试剂。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其是采用以下制备方法制得：

(1)将0.4mmol鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散。

加入0.5mmol乙酸钠。

在加入鞣花酸后10分钟内快速加入1mmol Tris-hcl，调pH至7.1±0.1。

加入0.025mmol铁离子。

加入精氨酸盐酸盐1.5％和甘氨酸1.5％。

加入防腐剂叠氮钠。

(2)配制乳化磷脂：在0.32克/升兔脑磷脂中加入5℃的无钙纯化水，并于5℃冰浴混匀乳化，得乳化磷脂。

(3)将乳化磷脂以特定比例加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到呈黄色的均匀分散液，即鞣花酸试剂。

本实施例还提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其包括上述鞣花酸试剂和氯化钙试剂。

实施例2

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其是采用以下制备方法制得：

(1)将0.2mmol鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散。

加入0.4mmol Tris-base。

在加入鞣花酸后10分钟内快速加入0.8mmol Hepes，调pH至7.1±0.1。

加入0.02mmol镁离子。

加入丙氨酸。

加入防腐剂proclin300。

(2)配制乳化磷脂：在0.3克/升兔脑磷脂中加入3℃的无钙纯化水，并于3℃冰浴混匀乳化，得乳化磷脂。

(3)将乳化磷脂以特定比例加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到呈黄色的均匀分散液，即鞣花酸试剂。

本实施例还提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其包括上述鞣花酸试剂和氯化钙试剂。

实施例3

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其是采用以下制备方法制得：

(1)将0.5mmol鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散。

加入0.8mmol氢氧化钠。

在加入鞣花酸后10分钟内快速加入约0.5ml乙酸，调pH至7.1±0.1。

加入0.03mmol锰离子。

加入组氨酸和谷氨酸。

加入防腐剂庆大霉素。

(2)配制乳化磷脂：在0.35克/升兔脑磷脂中加入8℃的无钙纯化水，并于8℃冰浴混匀乳化，得乳化磷脂。

(3)将乳化磷脂以特定比例加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到呈黄色的均匀分散液，即鞣花酸试剂。

本实施例还提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其包括上述鞣花酸试剂和氯化钙试剂。

实施例4

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其是采用以下制备方法制得：

(1)将1.5mmol鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散。

加入2.5mol/L乙酸钠。

在加入鞣花酸后10分钟内快速加入1mol/L Tris-hcl，调pH至7.1±0.1。

加入0.02mmol氯化铁。

加入精氨酸盐酸盐1.5％和甘氨酸1.5％。

加入防腐剂庆大霉素0.5g/L。

(2)配制乳化磷脂：在0.32g/L兔脑磷脂中加入5℃的无钙纯化水，并于5℃冰浴混匀乳化，得乳化磷脂。

(3)将乳化磷脂以特定比例加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到呈黄色的均匀分散液，即鞣花酸试剂。

实施例5

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其制备方法与实施例4的制备方法大致相同，不同之处在于：本实施例采用3mmol鞣花酸、0.04mmol氯化铁。

实施例6

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其制备方法与实施例4的制备方法大致相同，不同之处在于：本实施例采用6mmol鞣花酸、0.06mmol氯化铁。

实施例7

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其是采用以下制备方法制得：

(1)将3mmol鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散。

加入2.5mol/L乙酸钠。

在加入鞣花酸后10分钟内快速加入1mol/L Tris-hcl，调pH至7.1±0.1。

加入0.04mmol氯化铁。

加入精氨酸盐酸盐0.5％和甘氨酸0.5％。

加入防腐剂庆大霉素0.5g/L。

(2)配制乳化磷脂：在0.16g/L兔脑磷脂中加入5℃的无钙纯化水，并于5℃冰浴混匀乳化，得乳化磷脂。

(3)将乳化磷脂以特定比例加入缓冲液中，快速搅拌混匀，得到呈黄色的均匀分散液，即鞣花酸试剂。

实施例8

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其制备方法与实施例7的制备方法大致相同，不同之处在于：本实施例采用精氨酸盐酸盐1.5％和甘氨酸1.5％。

实施例9

本实施例提供一种鞣花酸试剂，其制备方法与实施例7的制备方法大致相同，不同之处在于：本实施例采用精氨酸盐酸盐3％和甘氨酸3％。

以下通过试验对不同鞣花酸试剂和活化部分凝血活酶时间测定试剂进行测试。

1、分别采用冰浴乳化、常温乳化、用其他方式溶解处理磷脂，具体方法如下：

a.冰浴乳化：在研磨管中加入2～8℃冰水，同时在混匀管中加入兔脑磷脂，随后在混匀管中加入2～8℃的无钙纯化水，将研磨管***混匀管内，使用研磨管研磨混匀管中的物质。

b.常温乳化：在研磨管常温无钙纯化水，将研磨管***混匀管内，使用研磨管研磨混匀管中的物质。

c.其他方式溶解：在10ml离心管内加入兔脑磷脂，随后加入无钙纯化水(无温度限定)，用玻璃棒将兔脑磷脂尽量捣成小颗粒，随后手动摇匀或借助其他形式震动混匀。

对比冰浴乳化、常温乳化、用其他方式溶解处理磷脂的数据与西门子试剂做对比：质控测值1/2，质控重复性10组数据，溶液分散状态(均匀分散，颗粒是否可见)，对比结果如表1所示：

表1不同乳化方式处理磷脂的数据对比结果

由表1可以看出，与常温乳化或其他方式溶解处理磷脂的方式相比，采用冰浴乳化方式处理的磷脂性状好、变异系数最低，满足产品需求。

2、鞣花酸-金属离子添加量数据三组，质控1/2，与西门子试剂做质控进行对比，对比结果如表2所示：

表2鞣花酸-金属离子不同添加量的数据对比结果

由表2可以看出，鞣花酸-金属离子的不同添加量:实施例5中鞣花酸与金属离子形成了最佳配比，质控测值与进口西门子APTT鞣花酸试剂测值一致。

3、磷脂-精氨酸盐酸盐-甘氨酸添加量数据三组，质控1/2，与西门子试剂做质控进行对比，37℃～30天稳定性，5±3℃开盖30天稳定性，对比结果如表3所示：

表3磷脂-精氨酸盐酸盐-甘氨酸不同添加量的数据对比结果

由表3可以看出，磷脂-精氨酸盐酸盐-甘氨酸的不同添加量：实施例7-9中，实施例8质控测值与西门子APTT鞣花酸试剂一致，通过与西门子APTT鞣花酸试剂进行37℃热稳定性实验以及2-8℃开盖实验，实施例8均具有良好的稳定性，且与进口试剂稳定性一致。

4，用本发明试剂测病人样本与西门子试剂测病人样本(共计50例样本，1-30号为30例正常样本，31-40号为10例肝病科样本，41-50号为10例心血管科样本)进行方法学相关性比对，相关系数R＝0.998(R²＝0.996)，对比结果如表4所示：

表4不同样本的相关性对比结果

对表4的数据进行相关性分析，图2为相关性散点图，由表4及图2可以看出，同时对比50例临床凝血样本，通过测值及相关性分析，本发明的鞣花酸试剂与进口西门子APTT鞣花酸试剂的相关性高。

综上所述，本发明实施例的鞣花酸试剂及其配制方法包括磷脂乳化，鞣花酸溶解，各原料添加顺序、APTT时间调节等的生产工艺，该工艺简单快捷，且均有详细说明；本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂具有良好的稳定性，37℃下可稳定至少30天，试剂开盖后于5±3℃下至少稳定30天以上；本发明实施例的APTT试剂盒能直接取代进口高稳定性活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (4)

1.一种鞣花酸试剂的配制方法，其特征在于，其包括以下步骤：

将鞣花酸加入无钙纯化水中，快速搅拌，使其均匀分散；首先加入碱性缓冲液或无机碱；然后在加入鞣花酸后10分钟内快速加入酸性缓冲液或有机酸、无机酸，调pH至7.1±0.1，之后的任意时间内加入防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠、proclin300、庆大霉素中的至少一种；之后加入金属离子；接着加入氨基酸及其衍生物，得缓冲液；

所述碱性缓冲液为乙酸钠、Tris-base、Hepes-Na中的至少一种；无机碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种；所述酸性缓冲液为Tris-hcl、Hepes、磷酸二氢盐中的至少一种；有机酸为甲酸、乙酸、乙二酸中的至少一种；无机酸为盐酸；所述金属离子为镁离子、铁离子、锰离子中的至少一种；氨基酸及其衍生物为丙氨酸、甘氨酸、丁酮酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸及其盐中的至少一种；

另外，在兔脑磷脂中加入2～8℃的无钙纯化水，并于2～8℃混匀乳化，得乳化磷脂；所述混匀乳化是采用中空的混匀管和中空的研磨管进行的，具体方法是：将研磨管***混匀管内，在研磨管中加入2～8℃冰水，同时在混匀管中加入兔脑磷脂，随后在混匀管中加入2～8℃的无钙纯化水，保证整个乳化过程处于2～8℃环境中，使用研磨管研磨混匀管中的物质；

将所述乳化磷脂加入所述缓冲液中，快速搅拌混匀，得到鞣花酸试剂。

2.一种鞣花酸试剂，其特征在于，其是采用如权利要求1所述的鞣花酸试剂的配制方法制得。

3.一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，其包括如权利要求2所述的鞣花酸试剂和氯化钙试剂，所述氯化钙试剂为氯化钙配制的磷酸盐缓冲液。

4.一种APTT试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求3所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂。

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