CN108220349A - 用于高效联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基及使用其的发酵方法 - Google Patents

用于高效联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基及使用其的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黑曲霉发酵联产柠檬酸和氨基葡萄糖所采用的发酵培养基，以及使用该发酵培养基的发酵方法。具体而言，该发酵培养基包含碳源、氮源和磷酸盐等营养成分以及余量的水，其中，所述碳源的含量以其中的总糖计为7wt％‑20wt％，所述氮源的含量以其中的氮元素计为0.04wt％‑0.3wt％，所述磷酸盐的含量以其中的磷酸根计为0.05wt％‑0.2wt％。在将处于对数生长期的黑曲霉接种入该发酵培养基中后，经过发酵培养，能够高效地联产得到柠檬酸和氨基葡萄糖。

Description

用于高效联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基及使用其的 发酵方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体而言，本发明涉及利用黑曲霉进行发酵联产柠檬酸和氨基葡萄糖所采用的发酵培养基，以及使用该发酵培养基的发酵方法。
背景技术
柠檬酸，化学名为2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是目前世界范围内生产量最大的食用有机酸，也是世界上消耗量最大的有机酸，被广泛应用于日用化工、食品、医药等行业。中国是目前柠檬酸产量最大的国家。多数生产柠檬酸的方法首先将淀粉质原料(如玉米、大米和豆类等)制成发酵培养基，随后利用黑曲霉(Aspergillus Niger)进行深层发酵。发酵结束后分离菌体与发酵上清液，将发酵上清液用于提取柠檬酸，而由菌体形成的菌渣被用于饲料、肥料原料或进一步加工。
黑曲霉是重要的工业菌种，被广泛用于发酵生产有机酸、酶制剂、调味品和饲料等产品。由于黑曲霉菌丝体细胞壁中含有甲壳素，除发酵生产获得目的产品外，还可对发酵过程中积累的黑曲霉本身加以利用。甲壳素在医疗卫生、农业养殖、工业制造领域均具有广泛用途。甲壳素经过化学法或生物法脱除乙酰基后形成的壳聚糖，并经进一步水解形成壳寡糖和氨基葡萄糖单体，均为有益的营养保健产品，并且能够用作医疗、养殖业、制造业的重要原料或添加物。
目前市场上的氨基葡萄糖绝大部分是通过对甲壳类动物外壳进行加工而获得的，其存在原料来源不稳定、质量波动大、易致敏等问题。而最近开发微生物来源的氨基葡萄糖已成为新的发展趋势。特别是，如果能够将柠檬酸发酵的副产物黑曲霉菌渣(在本文中也称为“柠檬酸发酵菌渣”、“发酵菌渣”、“柠檬酸废渣”或“废渣”等)作为原料提取获得氨基葡萄糖，将会同时实现显著的经济效益。
目前报道的通过对柠檬酸发酵菌渣进行常规处理来获得氨基葡萄糖的工艺技术可分为化学法和酶法两类。其中，化学法主要通过酸或者碱将甲壳素中的糖苷键打断得到壳聚糖或者壳寡糖，随后脱除乙酰并进一步降解获得氨基葡萄糖。酶法则是使用酶催化替代化学法中的部分或全部的反应，获得氨基葡萄糖终产物。由于酶法技术尚不成熟，规模和成本尚不能满足产业化要求，目前工业生产过程中一般选择化学法对菌渣进行处理以获得氨基葡萄糖产品。
化学法的工艺设计主要包括前处理、降解、脱色纯化精制等步骤。具体而言，在实施降解之前，先通过除盐、碱煮、清洗除杂等工艺进行前处理。随后采用酸性介质将原料降解，获得产物；常用的酸包括盐酸、硫酸、以及在极性溶剂中的刘易斯酸，辅助加入的酸有冰醋酸、草酸，或者辅助超声处理以使原料充分降解。最后，采用浓缩、吸附脱色、膜过滤、重结晶等操作对降解混合物进行纯化和精制，获得产物。
就利用黑曲霉发酵获得柠檬酸的现有技术而言，《补料分批发酵生产柠檬酸的研究》(王友旭，河北科技大学硕士学位论文，2013年)通过实验研究了黑曲霉柠檬酸分批发酵过程中的生物量、比生长速率、发酵液含氮量、酸度、溶氧和总糖浓度变化趋势，对黑曲霉柠檬酸发酵过程中柠檬酸合成与生长偶联关系进行了分析，并结合调控发酵液含氮量、DO值和总糖浓度对黑曲霉柠檬酸发酵进行了优化。其采用的种子培养基为：玉米液化液与自来水按照体积比1:1的重量比混合，添加2.5％的(NH4)2SO4和0.1％的乳化硅油；发酵培养基为：初始含氮量120mg/100mL、初总糖浓度(16.15-20.15)g/100mL。
另外，专利申请CN102864182A公开了利用黑曲霉发酵玉米淀粉制备柠檬酸的方法，确定了最佳培养条件为玉米淀粉20％、(NH4)2SO4 0.2％、KH2PO4 0.2％、MgSO4·7H2O0.05％、甲醇4％，初始pH 3.0。同时，专利申请CN104087624A公开了一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤：(1)黑曲霉经过逐级扩大培养，获得成熟的孢子；(2)孢子液接种至种子培养基，培养成为成熟的种子液；(3)成熟的种子液转接至发酵培养基F1；(4)发酵培养后，分割发酵液为两部分；其中一部分发酵液继续发酵完毕，获得柠檬酸；(5)分割出的另一部分发酵液经分散器分散处理，获得分散菌丝的发酵液；(6)将分散菌丝发酵液接入发酵培养基F2；发酵培养后，回到步骤(4)，如此重复实现连续发酵。其中，种子培养基种后总糖控制在8-12％，总氮为0.15-0.4％。发酵培养基F1种后总糖控制在14-16％，总氮为0.05-0.2％。发酵培养基F2种后总糖控制在14-16％，总氮为0.10-0.25％。
就以柠檬酸发酵菌渣为原料生产氨基葡萄糖的现有技术而言，专利申请CN102167713A(南通市外贸医药保健品有限公司)公开了一种以发酵法生产柠檬酸过程中产生的副产物柠檬酸废渣为原料来生产氨基葡萄糖的方法，其中，在90-105℃下以30-35％的盐酸对原料水解2-2.5h，投料比为废渣重量:盐酸重量＝1:1.6-2.5；其后直接将母液浓缩至结晶，生成氨基葡萄糖盐酸盐粗品，并最终精制获得产品。专利申请CN103319547A(扬州日兴生物科技股份有限公司)采用类似的方法，首先将黑曲霉菌丝体从废渣中分离出来，然后利用15-20％的盐酸溶液辅以微波处理10-30分钟，单独水解则为70-80℃水解1.8-2.3h，水解后获得含有氨基葡萄糖的溶液，再用活性炭进行脱色，结晶干燥。专利申请CN101497634A(连云港泰鼎生物有限公司)通过在酸溶液中加入发酵法产生的含有几丁质的物质和能促进真菌细胞壁破坏以及壳聚糖链断裂的催化剂，从柠檬酸发酵废渣生产氨基葡萄糖。其中，所述催化剂为有机物与无机物的组合物，优选重量比为1:(0.1-10)，使得催化剂与真菌几丁质在60-110℃的条件下反应0.5-16小时，投料比重为原料的0.1-30％；在进行催化反应后，进行过滤、浓缩、冷却结晶；再进行重结晶得到氨基葡萄糖产品。
上述通过化学法从柠檬酸发酵菌渣中提取氨基葡萄糖的方案均存在酸碱废水排放量大、环保成本高的问题。在现有的酸碱处理生产方案中，也注意到废酸后处理的问题。以甲壳素酸解生产氨基葡萄糖为例，生产一吨产品大概需要产生5-8吨的废酸，其中含有16-25％的盐酸以及4-5％的乙酸，无法直接将其回收利用，而直接作为废水处理会给污水处理***带来巨大的压力。专利CN1019930411B提供了一种回收废水体系中盐酸的方法，通过在废酸液中加入10-12％体积的二氯甲烷并萃取，在40-50℃蒸发下层液中的二氯甲烷获取乙酸；而将上层液中残留的二氯甲烷蒸发并通入氯化氢气体使得其酸浓度达到31％以上，以回收利用。使用该技术可有效降低酸废水的排放，然而增加的工艺步骤会显著增加成本。同时，由于菌渣成分和含量更为复杂，直接将该工艺转用于利用黑曲霉菌渣生产氨基葡萄糖的流程难以获得令人满意的结果，也不利于对菌渣中蛋白成分的资源化利用。
根据现有文献数据，黑曲霉是细胞壁甲壳素含量最丰富的真菌菌种，其中的甲壳素可占细胞壁成分的40wt％。然而，当使用未经优化的黑曲霉菌渣作为原料来生产氨基葡萄糖时，存在原料中的甲壳素含量较低且氨基葡萄糖提取率低的问题。因此，使用未经优化的菌渣原料会导致相同的工艺条件和得率下的物资单耗增加和单位污水量增大的问题，综合效益不高。
现有技术中还没有针对柠檬酸发酵环节进行改进以平衡柠檬酸产量和黑曲霉菌体的甲壳素含量的研究，然而，本发明人发现对通过黑曲霉发酵来得到柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵环节进行优化，将有助于在降低后处理的废水量和能量消耗的前提下，同时以高的效率联产柠檬酸和氨基葡萄糖。
发明内容
为了解决现有的黑曲霉发酵产柠檬酸并利用黑曲霉菌渣制备氨基葡萄糖的工艺中废水多(环保压力大)、氨基葡萄糖得率低、副产物利用率低和综合效益不高的缺点，提供了一种用于高效联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基及相应的发酵方法。
在一方面，本文提供了一种用于黑曲霉发酵来联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基，所述发酵培养基包含碳源、氮源和磷酸盐以及余量的水，其中，所述碳源的含量以其中的总糖计为7wt％-20wt％，所述氮源的含量以其中的氮元素计为0.04wt％-0.3wt％，所述磷酸盐的含量以其中的磷酸根计为0.05wt％-0.2wt％。
另一方面，本文提供了一种使用上述发酵培养基来发酵制备柠檬酸和氨基葡萄糖的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将处于对数生长期的黑曲霉接种于上述发酵培养基中进行发酵，从而得到发酵液和发酵菌渣，分离所述发酵液和所述发酵菌渣；
(2)从所述发酵液提取柠檬酸；
(3)对所述发酵菌渣进行处理，从而得到氨基葡萄糖。
具体而言，本发明的示例性技术方案是通过如下条目中记载的内容而实现：
1.一种用于黑曲霉发酵来联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基，所述发酵培养基包含碳源、氮源和磷酸盐以及余量的水，其中，所述碳源的含量以其中的总糖计为7wt％-20wt％，所述氮源的含量以其中的氮元素计为0.04wt％-0.3wt％，所述磷酸盐的含量以其中的磷酸根计为0.05wt％-0.2wt％。
2.如段落1所述的发酵培养基，其中，所述碳源选自糊精、麦芽糖和/或淀粉质原料的液化滤液。
3.如段落1或2所述的发酵培养基，其中，所述氮源为无机氮源、有机氮源或者二者的混合物。
4.如段落3所述的发酵培养基，其中，所述无机氮源为无机铵盐。
5.如段落4所述的发酵培养基，其中，所述无机铵盐为硫酸铵和/或硝酸铵。
6.如段落3所述的发酵培养基，其中，所述有机氮源为尿素、蛋白、淀粉质原料的液化滤渣或它们的混合物。
7.如段落6所述的发酵培养基，其中，所述液化滤渣的蛋白含量为20w％-45wt％。
8.如段落6所述的发酵培养基，其中，所述蛋白来自玉米浆。
9.如段落2或6所述的发酵培养基，其中，所述淀粉质原料为选自于由玉米、大米、小麦、豆类、马铃薯和木薯所组成的组中的一种或多种。
10.如段落9所述的发酵培养基，其中，所述液化滤液和所述液化滤渣通过如下得到：利用淀粉酶对所述淀粉质原料进行液化处理形成液化溶液，对所述液化溶液过滤分别得到所述液化滤液和所述液化滤渣。
11.如段落10所述的发酵培养基，其中，所述液化滤液和所述液化滤渣来源于相同或不同的所述淀粉质原料。
12.如段落10或11所述的发酵培养基，其中，在进行所述液化处理前，对所述淀粉质原料进行如下预处理中的一种或多种：筛分、除杂、破碎和调浆。
13.如段落12所述的发酵培养基，其中，在进行所述液化处理前，依次对所述淀粉质原料进行筛分、除杂、破碎和调浆。
14.如段落12或13所述的发酵培养基，其中，所述筛分和除杂包括使所述淀粉质原料通过初清筛和永磁筒，以除去所述淀粉质原料中的杂质。
15.如段落12-14中任一段所述的发酵培养基，其中，所述破碎包括通过机械磨压进行破碎。
16.如段落12-15中任一段所述的发酵培养基，其中，所述调浆包括将破碎后的淀粉质原料用水调配成浓度为12.0波美-19.0波美且pH值为5.8-6.2的淀粉浆。
17.如段落16所述的发酵培养基，其中，将所述淀粉浆与所述淀粉酶相接触，以使所述淀粉浆中的淀粉转化为糊精和低聚糖。
18.如段落16或17所述的发酵培养基，其中，相对于所述淀粉浆中的每克淀粉，所述淀粉酶的用量为5酶活单位-60酶活单位、优选为10酶活单位-50酶活单位。
19.如段落10-18中任一段所述的发酵培养基，其中，所述淀粉酶选自α-淀粉酶和/或β-淀粉酶。
20.如段落19所述的发酵培养基，其中，采用所述α-淀粉酶在80℃-110℃的温度下进行所述液化处理。
21.如段落10-20中任一段所述的发酵培养基，其中，所述液化处理的时间为90min-140min。
22.如段落2-21中任一段所述的发酵培养基，其中，所述液化滤液中的总糖含量为16wt％-25wt％。
23.如段落1-22中任一段所述的发酵培养基，其中，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钾。
24.如段落1-23中任一段所述的发酵培养基，其中，所述发酵培养基包含以总糖计为16wt％-20wt％的碳源、以氮元素计为0.04wt％-0.15wt％的氮源以及以磷酸根计为0.05wt％-0.1wt％的磷酸盐。
25.一种使用段落1-24中任一段所述的发酵培养基来发酵制备柠檬酸和氨基葡萄糖的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将处于对数生长期的黑曲霉接种于段落1-24中任一段所述的发酵培养基中进行发酵，从而得到发酵液和发酵菌渣，分离所述发酵液和所述发酵菌渣；
(2)从所述发酵液提取柠檬酸；
(3)对所述发酵菌渣进行处理，从而得到氨基葡萄糖。
26.如段落25所述的发酵培养基，其中，所述黑曲霉为选自于由黑曲霉Co827、黑曲霉T01和黑曲霉HN-2004所组成的组中的一种或多种。
27.如段落25或26所述的方法，其中，在步骤(1)中，通过接种环将所述黑曲霉接种于所述发酵培养基中。
28.如段落25-27中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，通过向所述黑曲霉加入无菌水得到所述黑曲霉的悬液并随后利用移液装置将所述悬液加入所述发酵培养基中来进行所述接种。
29.如段落25-28中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵采用选自深层液体发酵或分批发酵的发酵方式进行。
30.如段落25-29中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，在使用前，将所述发酵培养基于121℃和0.1MPa下灭菌25min。
31.如段落25-30中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，相对于每克所述发酵培养基，接种1×104-1.5×105个菌落形成单位、优选5×104-1×105个菌落形成单位的所述黑曲霉。
32.如段落25-31中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵在30-40℃、优选36-38℃下进行。
33.如段落25-32中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵进行40小时-70小时、优选50小时-65小时。
34.如段落25-33中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，通过离心或过滤分离所述发酵液和所述发酵菌渣。
35.如段落34所述的方法，其中，通过在8000rpm的转速下离心15min分离所述发酵液和所述发酵菌渣。
本发明的联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵方法通过采用特定的发酵培养基，从而解决了黑曲霉发酵过程中产酸和产糖平衡的问题，不仅保证了发酵菌液中具有高的柠檬酸含量，同时能够使黑曲霉菌体的甲壳素含量提高，从而使得在后续处理制备氨基葡萄糖时能够有效降低污水排放量，提高了从菌渣中提取获得氨基葡萄糖的得率，提升了产业的综合效益。本发明所述的方法能够实现95％以上的柠檬酸转化率以及10％以上的氨基葡萄糖得率。在一些优选的实施方式中，本发明所述的方法甚至能够实现98％以上的柠檬酸转化率以及12％以上的氨基葡萄糖得率。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，除非另有说明，术语“对数生长期”具有本领域技术人员所通常理解的含义，又称为指数生长期，是指微生物经过迟缓期后以最大的速率生长和***使得该微生物的数量呈对数增加的时期。本发明所述的处于对数生长期的黑曲霉可通过例如但不限于如下方式获得：将黑曲霉菌株接种在本领域已知的曲霉培养基或者本发明的发酵培养基中，随后在适宜的温度(例如30-40℃)下培养，并通过分光光度计等测量吸光度(OD)值来确定黑曲霉处于对数生长期。
在本发明中，除非另有说明，术语“转化率”指的是发酵结束后的发酵液中的柠檬酸的量(等于发酵液中的柠檬酸的浓度×发酵液的体积)相对于发酵前的培养基中的总糖的重量而言的百分比。
在本发明中，除非另有说明，术语“得率”指的是从菌渣中提取获得的氨基葡萄糖相对于发酵菌渣干重的重量百分比。
一方面，本文提供了一种用于黑曲霉发酵来联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基。在本发明中，除非另有说明，术语“发酵培养基”是指在黑曲霉的发酵工艺中用来联产柠檬酸和氨基葡萄糖的液体培养基。所述发酵培养基包含氮源、碳源和无机盐等营养成分，其中，所述无机盐可以为磷酸盐。由于发酵培养基中的碳源为提供碳元素的营养源，其中，主要通过糖类来提供碳元素，因此，出于更加明确的目的，通过计算发酵培养基中用作碳源的物质中所包含的总糖的百分质量含量来表明发酵培养基中的碳源含量，即，将本发明所述的发酵培养基中的碳源含量以该碳源中所含的总糖的百分质量含量示出。优选所述发酵培养基包含碳源、氮源和磷酸盐以及余量的水，其中，所述碳源的含量以其中的总糖计为7wt％-20wt％，所述氮源的含量以其中的氮元素计为0.04wt％-0.3wt％，所述磷酸盐的含量以其中的磷酸根计为0.05wt％-0.2wt％。
可用于本发明的黑曲霉包括但不限于黑曲霉Co827(购自上海新立工业微生物科技有限公司)、黑曲霉T01(购自天津工业微生物研究所)和黑曲霉HN-2004(购自中科院微生物所)。
在一些实施方式中，发酵培养基中的碳源可为糊精、麦芽糖等。为了进一步降低生产成本，发酵培养基中的碳源可为淀粉质原料的液化滤液。本领域知晓的是，利用淀粉酶对淀粉质原料进行液化处理可形成液化溶液，对该液化溶液过滤得到的滤液即为液化滤液，而除该液化滤液外的部分为液化滤渣。液化滤液中主要含有糖并因此可被用作发酵培养基中的碳源，而液化滤渣中主要含有蛋白并因此可被用作发酵培养基中的氮源。可以理解的是，发酵培养基中采用的液化滤液和液化滤渣可来源于相同或不同的淀粉质原料。
所述淀粉质原料可为含有大量淀粉的任何常规原料，例如玉米、大米、小麦、豆类、马铃薯和木薯等。在实际生产中，还可使用商购的淀粉产品作为淀粉质原料。
取决于具体使用的淀粉质原料，在液化处理前也可对淀粉质原料进行如下预处理中的一种或多种：筛分、除杂、破碎和调浆。例如，在液化处理前可依次进行筛分、除杂、破碎和调浆。对淀粉质原料进行筛分、除杂、破碎、调浆和液化的工艺为本领域的常规工艺，为本领域技术人员所熟知。例如，所述筛分、除杂工艺可包括使淀粉质原料通过初清筛、永磁筒等常规设备，以除去原料中的石块、金属等杂质。所述破碎的方法可包括通过机械磨压进行破碎。所述调浆的方法可包括将破碎后的淀粉质原料用水调配成例如浓度为12.0波美-19.0波美且pH值为5.8-6.2的淀粉浆。
上述的液化处理包括将液体的淀粉浆与淀粉酶接触，使该淀粉浆中的淀粉转化为糊精和低聚糖。在优选的实施方式中，相对于淀粉浆中的每克淀粉(该淀粉来自淀粉质原料)，淀粉酶的用量可为5酶活单位-60酶活单位、优选为10酶活单位-50酶活单位。在本发明中，可采用能够水解淀粉的任何淀粉酶，包括但不限于α-淀粉酶、β-淀粉酶等。根据所采用的淀粉酶本身有效温度范围的不同(例如，中温α-淀粉酶有效温度范围为35℃-90℃的、高温α-淀粉酶有效温度范围为80℃-110℃等)，可采用不同的液化处理温度对淀粉质原料或淀粉浆进行液化处理。例如，优选采用高温α-淀粉酶在80℃-110℃的温度下进行液化处理。另外，液化处理的时间优选为90min-140min。
在优选的实施方式中，作为发酵培养基的碳源的淀粉质原料的液化滤液中的总糖含量为16wt％-25wt％。
在一些实施方式中，发酵培养基中的氮源可为无机氮源或有机氮源或二者的混合物。所述无机氮源可为无机铵盐，例如硫酸铵和/或硝酸铵。所述有机氮源可为例如尿素、蛋白、上述淀粉质原料的液化滤渣或它们的混合物。所述蛋白的来源没有限制，例如来自玉米浆。特别地，为了对淀粉质原料进行更有效地利用，优选将液化滤渣用作所述有机氮源。优选地，所采用的液化滤渣的蛋白含量为20wt％-45wt％，此时发酵培养基中的氮元素含量为相对于该发酵培养基的总重量而言的液化滤渣中的氮元素的百分含量。其中，所述液化滤渣中的蛋白的含量是通过凯氏定氮法测定试样中的含氮量然后乘以换算系数6.25而计算出来的粗蛋白含量。
在一些实施方式中，所述发酵培养基中的磷酸盐可以选自磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钾，但并不仅限于此。
在本发明中，为了进一步提高柠檬酸的转化率，发酵培养基包含以总糖计为16wt％-20wt％的碳源、以氮元素计为0.04wt％-0.15wt％的氮源和以磷酸根计为0.05wt％-0.1wt％的磷酸盐。其中，所述总糖的含量是指通过国家标准GB6194-86中规定的方法测得的可溶性总糖的含量，该总糖来自淀粉质原料的液化滤液。
另一方面，本文提供了一种使用上述发酵培养基来发酵制备柠檬酸和氨基葡萄糖的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将处于对数生长期的黑曲霉接种于上述发酵培养基中进行发酵，从而得到发酵液和发酵菌渣，分离所述发酵液和所述发酵菌渣；
(2)从所述发酵液提取柠檬酸；
(3)对所述发酵菌渣进行处理，从而得到氨基葡萄糖。
在一些实施方式中，步骤(1)中的黑曲霉接种和发酵方式没有特别的要求，可为本领域常规的接种手段和发酵方式。例如，通过接种环等接种装置将黑曲霉直接接种于发酵培养基中，或者通过向黑曲霉加入无菌水得到黑曲霉悬液并利用移液装置将该悬液加入发酵培养基中。另外，对于发酵方式而言，可以采用深层液体发酵或分批发酵等常规的发酵方式。
在优选的实施方式中，在使用前，将步骤(1)中的发酵培养基于121℃和0.1MPa下灭菌25min。
在优选的实施方式中，处于对数生长期的黑曲霉的接种量为：相对于每克所述发酵培养基而言，接种1×104-1.5×105个菌落形成单位、更优选5×104-1×105个菌落形成单位的黑曲霉。优选地，步骤(1)的发酵在30-40℃、更优选36-38℃下进行。进一步优选所述发酵进行40小时-70小时、优选50小时-65小时。
可通过离心、过滤等常规的手段分离发酵菌渣和发酵液。优选地，通过在8000rpm的转速下离心15min分离发酵菌渣和发酵液。
本发明旨在通过对发酵培养基的配方进行调整从而使发酵过程中的柠檬酸生成和菌体中的甲壳素积累得以平衡，由此优化发酵液中的柠檬酸含量和菌体中的甲壳素的量，而无需对柠檬酸提取或氨基葡萄糖制备本身的工艺进行优化，因此，可使用本领域已知的任何适用的方法从发酵液提取柠檬酸以及对黑曲霉的发酵菌渣进行处理以得到氨基葡萄糖，例如但不限于本发明背景技术中所列举的方法。
本发明的其它特征和优点将在随后的实施例部分予以详细说明。
实施例
以下通过一系列实施例对本发明作进一步的详细说明。这些实施例仅仅是说明性的，而不应该理解为是对本发明的范围的限制。凡是基于本发明上述内容所实现的技术方案及其变形均落入本发明的范围内。
实施例1
下述的制备例、实验例和对比例中使用的黑曲霉为黑曲霉T01，购自天津工业微生物研究所。玉米种子(玉米粒)为市售普通玉米种子，淀粉酶为购自诺维信公司的α-淀粉酶(有效温度范围为80℃-110℃)。
玉米种子的机械磨压破碎采用购自江苏牧羊集团有限公司的968-3型粉碎器进行。压滤机购自无锡鑫顺化工机械厂。
下述制备例、实验例和对比例中使用的液化滤液和液化滤渣的制备方法如下：利用上述的粉碎器将干燥的玉米种子粉碎并通过40目网筛，得到玉米粉。对玉米粉进行称重。将该玉米粉与水调浆至浓度为19波美，并用0.5％(w/w)稀盐酸将其pH值调整为6.0，得到淀粉浆。相对于淀粉浆中的每克淀粉，加入25酶活单位的α-淀粉酶，随后升温至95℃进行液化处理，处理140分钟后将得到的溶液利用压滤机过滤，滤液即为液化滤液，滤渣即为液化滤渣。
按照国家标准GB 6194-86中规定的方法，测得所述液化滤液中的总糖含量为25wt％。根据凯氏定氮法，测得所述液化滤渣中的蛋白含量为40wt％。
参照《柠檬酸提取工艺的探索和氢钙法工业实践》(刘辰等，精细与专用化学品，2015年1月第23卷第1期)中公开的工艺，利用其中的氢钙方法从发酵液中提取柠檬酸。
利用专利申请CN1496408A(卡吉尔公司)中公开的化学酸解方法从发酵菌渣中提取氨基葡萄糖。
根据GB 1987-2007标准测定如下的各实验例和对比例中获得的柠檬酸浓度(简称酸度)，并根据如下公式计算柠檬酸的转化率：
转化率(％)＝发酵液中的柠檬酸的浓度×发酵液的体积/进行发酵前的培养基中的总糖的重量×100％。
根据2015版中国药典(征求意见稿)中的HPLC方法检测各实验例和对比例中获得的氨基葡萄糖的质量，并按照如下公式计算氨基葡萄糖的得率：
得率(％)＝从发酵菌渣中提取获得的氨基葡萄糖质量/发酵菌渣干重×100％。
制备例1
将320g所述液化滤液、0.43g有机氮源(尿素)和0.60g磷酸氢二钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基1，在该发酵培养基1中，总糖含量为16wt％、氮元素的含量为0.04wt％且磷酸根的含量为0.05wt％。
制备例2
将400g所述液化滤液、2.21g混合氮源(等重量混合的尿素和硫酸铵)和0.72g磷酸二氢钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基2，在该发酵培养基2中，总糖含量为20wt％、氮元素的含量为0.15wt％且磷酸根的含量为0.1wt％。
制备例3
将140g所述液化滤液、3.07g无机氮源(硫酸铵)和1.20g磷酸氢二钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基3，在该发酵培养基3中，总糖含量为7wt％、氮元素的含量为0.13wt％且磷酸根的含量为0.1wt％。
制备例4
将300g所述液化滤液、3.21g有机氮源(尿素)和1.43g磷酸二氢钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基4，在该发酵培养基4中，总糖含量为15wt％、氮元素的含量为0.3wt％且磷酸根的含量为0.2wt％。
制备例5
将360g所述液化滤液、19.53g所述液化滤渣和0.96g磷酸氢二钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基5，在该发酵培养基5中，总糖含量为15wt％、氮元素的含量为0.25wt％且磷酸根的含量为0.08wt％。
制备例6
将240g所述液化滤液、17.2g所述液化滤渣和1.07g磷酸二氢钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基6，在该发酵培养基6中，总糖含量为15wt％、氮元素的含量为0.22wt％且磷酸根的含量为0.15wt％。
制备例7
将320g所述液化滤液、0.32g有机氮源(尿素)和0.60g磷酸氢二钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基7，在该发酵培养基7中，总糖含量为16wt％、氮元素的含量为0.03wt％且磷酸根的含量为0.05wt％。
制备例8
将400g所述液化滤液、2.21g混合氮源(等重量混合的尿素和硫酸铵)和0.29g磷酸二氢钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基8，在该发酵培养基8中，总糖含量为20wt％、氮元素的含量为0.15wt％且磷酸根的含量为0.04wt％。
制备例9
将120g所述液化滤液、3.07g所述无机氮源(硫酸铵)和1.20g磷酸氢二钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基9，在该发酵培养基9中，总糖含量为6wt％、氮元素的含量为0.13wt％且磷酸根的含量为0.1wt％。
制备例10
将300g所述液化滤液、4.28g所述有机氮源(尿素)和1.43g磷酸二氢钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基10，在该发酵培养基10中，总糖含量为15wt％、氮元素的含量为0.4wt％且磷酸根的含量为0.2wt％。
制备例11
将420g所述液化滤液、19.53g所述液化滤渣和0.96g磷酸氢二钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基11，在该发酵培养基11中，总糖含量为21wt％、氮元素的含量为0.25wt％且磷酸根的含量为0.08wt％。
制备例12
将240g所述液化滤液、17.2g所述液化滤渣和1.79g磷酸二氢钾混合，随后向其中加入水至总重量为500g，由此得到发酵培养基12，在该发酵培养基12中，总糖含量为15wt％、氮元素的含量为0.22wt％且磷酸根的含量为0.25wt％。
实验例1
将制备例1得到的发酵培养基在121℃和0.1MPa下灭菌25min，而后自然冷却至36℃，相对于每克所述发酵培养基，将处于对数生长期的黑曲霉以5×104个菌落形成单位的接种量接种入所述发酵培养基中，摇床转速200rpm，然后在37℃下培养60小时，发酵结束，通过压滤机过滤分离发酵液和发酵菌渣。取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。
实验例2
将制备例2得到的发酵培养基在121℃和0.1MPa下进行灭菌25min，而后自然冷却至36℃，相对于每克所述发酵培养基，将处于对数生长期的黑曲霉以1×104个菌落形成单位的接种量接种入所述发酵培养基中，摇床转速200rpm，然后在36℃下培养70小时，发酵结束，通过在8000rpm的转速下离心15min分离发酵菌渣和发酵液。取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。
实验例3
将制备例3得到的发酵培养基在121℃和0.1MPa下进行灭菌25min，而后自然冷却至36℃，相对于每克所述发酵培养基，将处于对数生长期的黑曲霉以1.5×105个菌落形成单位的接种量接种入所述发酵培养基中，摇床转速200rpm，然后在38℃下培养40小时，发酵结束，通过在8000rpm的转速下离心15min分离发酵菌渣和发酵液。取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。
实验例4
将制备例4得到的发酵培养基在121℃和0.1MPa下进行灭菌25min，而后自然冷却至36℃，相对于每克所述发酵培养基，将处于对数生长期的黑曲霉以1×105个菌落形成单位的接种量接种入所述发酵培养基中，摇床转速200rpm，然后在37.5℃下培养50小时，发酵结束，通过真空抽滤过滤分离发酵液和发酵菌渣。取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。实验例5
将制备例5得到的发酵培养基在121℃和0.1MPa下进行高压灭菌25min，而后自然冷却至36℃，相对于每克所述发酵培养基，将处于对数生长期的黑曲霉以7×104个菌落形成单位的接种量接种入所述发酵培养基中，摇床转速200rpm，然后在36.5℃下培养65小时，发酵结束，通过压滤机过滤分离发酵液和发酵菌渣。取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。
实验例6
将制备例6得到的发酵培养基在121℃和0.1MPa下进行灭菌25min，而后自然冷却至36℃，相对于每克所述发酵培养基，将处于对数生长期的黑曲霉以1.2×105个菌落形成单位的接种量接种入所述发酵培养基中，摇床转速200rpm，然后在37.8℃下培养55小时，发酵结束，通过在8000rpm的转速下离心15min分离发酵菌渣和发酵液。取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。
对比例1-6
除了分别将实验例1-6中采用的发酵培养基替换为制备例7-12中得到的发酵培养基外，分别按照实验例1-6的方法进行发酵。发酵结束，取发酵液和发酵菌渣进行处理和检测。
实施例1部分的各实验例和对比例的柠檬酸转化率和氨基葡萄糖得率如表1所示。
表1
发酵液及菌渣 柠檬酸转化率(％) 氨基葡萄糖得率(％)
实验例1 98.2 10.7
实验例2 98.8 12.1
实验例3 97.9 11.8
实验例4 98.1 12.9
实验例5 98.4 12.5
实验例6 98.0 12.3
对比例1 75.3 6.5
对比例2 72.5 5.4
对比例3 69.2 6.2
对比例4 67.1 4.6
对比例5 71.0 6.7
对比例6 73.2 5.8
实施例2
下述的制备例、实验例和对比例中使用的黑曲霉为黑曲霉Co827，购自上海新立工业微生物科技有限公司。玉米种子为来自安徽的市售普通玉米种子，淀粉酶为购自诺维信公司的α-淀粉酶(有效温度范围为80℃-110℃)。
玉米种子的机械磨压破碎采用购自江苏牧羊集团有限公司的968-3型粉碎器进行。压滤机购自无锡鑫顺化工机械厂。
下述制备例、实验例和对比例中使用的液化滤液和液化滤渣的制备方法如下：利用上述的粉碎器将干燥的玉米种子粉碎并通过40目网筛，得到玉米粉。对玉米粉进行称重。将该玉米粉与水调浆至浓度为12波美，并用0.5％(w/w)稀盐酸将其pH值调整为6.2得到淀粉浆。相对于淀粉浆中的每克淀粉，加入50酶活单位的α-淀粉酶，随后升温至80℃进行液化处理，处理90分钟后将得到的溶液利用压滤机过滤，滤液即为液化滤液，滤渣即为液化滤渣。
按照国家标准GB 6194-86中规定的方法，测得所述液化滤液中的总糖含量为16wt％。根据凯氏定氮法，测得所述液化滤渣中的蛋白含量为25wt％。
按照与实施例1相同的方法从发酵液中提取柠檬酸以及从发酵菌渣中提取氨基葡萄糖。
柠檬酸的转化率和氨基葡萄糖的得率的计算公式同实施例1。
实施例2所设置的制备例13-24中的发酵培养基的总糖、氮元素和磷酸根的组成分别与实施例1部分的制备例1-12中的发酵培养基的相应组成相同(即，根据实施例2部分上述获得的液化滤液中的总糖含量和液化滤渣中的蛋白含量，调整实施例2部分的各制备例中的液化滤液和液化滤渣的添加量，保证实施例2中各制备例获得的发酵培养基的总糖含量、氮元素含量和磷酸根含量与实施例1中对应制备例获得的发酵培养基的相应物质的含量相同)，同时，实施例2部分的实验例7-12和对比例7-12与实施例1部分的实验例1-6和对比例1-6相同。
实施例2部分的各实验例和对比例的柠檬酸转化率和氨基葡萄糖得率如表2所示。
表2
发酵液及菌渣 柠檬酸转化率(％) 氨基葡萄糖得率(％)
实验例7 98.1 10.2
实验例8 98.2 12.6
实验例9 97.4 12.4
实验例10 98.1 12.2
实验例11 98.5 12.3
实验例12 98.0 12.5
对比例7 75.5 6.5
对比例8 72.8 5.5
对比例9 69.3 6.7
对比例10 67.0 4.9
对比例11 71.7 6.0
对比例12 73.3 5.6
实施例3
下述的制备例、实验例和对比例中使用的黑曲霉为黑曲霉HN-2004，购自中科院微生物所。玉米种子为市售普通玉米种子，淀粉酶为购自诺维信公司的α-淀粉酶(有效温度范围为80℃-110℃)。
玉米种子的机械磨压破碎采用购自江苏牧羊集团有限公司的968-3型粉碎器进行。压滤机购自无锡鑫顺化工机械厂。
下述制备例、实验例和对比例中使用的液化滤液和液化滤渣的制备方法如下：利用上述的粉碎器将干燥的玉米种子粉碎并通过40目网筛，得到玉米粉。对玉米粉进行称重。将该玉米粉与水调浆至浓度为16波美，并用0.5％(w/w)稀盐酸将其pH值调整为5.8得到淀粉浆。相对于淀粉浆中的每克淀粉，加入5酶活单位的α-淀粉酶，随后升温至110℃进行液化处理，处理120分钟后将得到的溶液利用压滤机过滤，滤液即为液化滤液，滤渣即为液化滤渣。
按照国家标准GB 6194-86中规定的方法，测得所述液化滤液中的总糖含量为22wt％。根据凯氏定氮法，测得所述液化滤渣中的蛋白含量为45wt％。
按照与实施例1相同的方法从发酵液中提取柠檬酸以及从发酵菌渣中提取氨基葡萄糖。
柠檬酸的转化率和氨基葡萄糖的得率的计算公式同时实施例1。
实施例3所设置的制备例25-36中的发酵培养基的总糖、氮元素和磷酸根的组成分别与实施例1部分的制备例1-12中的发酵培养基的相应组成相同(即，根据实施例3部分上述获得的液化滤液中的总糖含量和液化滤渣中的蛋白含量，调整实施例3部分的各制备例中的液化滤液和液化滤渣的添加量，保证实施例3中各制备例获得的发酵培养基的总糖含量、氮元素含量和磷酸根含量与实施例1中对应制备例获得的发酵培养基的相应物质的含量相同)，同时，实施例3部分的实验例13-18和对比例13-18与实施例1部分的实验例1-6和对比例1-6相同。
实施例3部分的各实验例和对比例的柠檬酸转化率和氨基葡萄糖得率如表3所示。
表3
发酵液及菌渣 柠檬酸转化率(％) 氨基葡萄糖得率(％)
实验例13 98.5 10.8
实验例14 98.6 12.3
实验例15 97.8 12.1
实验例16 98.5 12.5
实验例17 98.2 12.2
实验例18 98.3 12.0
对比例13 75.2 6.2
对比例14 72.9 5.9
对比例15 69.5 6.0
对比例16 67.8 4.5
对比例17 71.8 6.2
对比例18 73.9 5.2
从上表1-表3中的结果可以看出，相比于采用未落入本发明范围内的发酵培养基进行培养时，采用本发明所述的发酵培养基能够同时实现高的柠檬酸转化率和高的氨基葡萄糖得率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于黑曲霉发酵来联产柠檬酸和氨基葡萄糖的发酵培养基，所述发酵培养基包含碳源、氮源和磷酸盐以及余量的水，其中，所述碳源的含量以其中的总糖计为7wt％-20wt％，所述氮源的含量以其中的氮元素计为0.04wt％-0.3wt％，所述磷酸盐的含量以其中的磷酸根计为0.05wt％-0.2wt％。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述碳源选自糊精、麦芽糖和/或淀粉质原料的液化滤液。
3.如权利要求1或2所述的发酵培养基，其中，所述氮源为无机氮源、有机氮源或者二者的混合物。
4.如权利要求3所述的发酵培养基，其中，所述无机氮源为无机铵盐、优选为硫酸铵和/或硝酸铵；或者所述有机氮源为尿素、蛋白、淀粉质原料的液化滤渣或它们的混合物。
5.如权利要求2或4所述的发酵培养基，其中，所述淀粉质原料为选自于由玉米、大米、小麦、豆类、马铃薯和木薯所组成的组中的一种或多种。
6.如权利要求1-5中任一项所述的发酵培养基，其中，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钾。
7.一种使用权利要求1-6中任一项所述的发酵培养基来发酵制备柠檬酸和氨基葡萄糖的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将处于对数生长期的黑曲霉接种于权利要求1-6中任一项所述的发酵培养基中进行发酵，从而得到发酵液和发酵菌渣，分离所述发酵液和所述发酵菌渣；
(2)从所述发酵液提取柠檬酸；
(3)对所述发酵菌渣进行处理，从而得到氨基葡萄糖。
8.如段落4所述的方法，其中，所述黑曲霉为选自于由黑曲霉Co827、黑曲霉T01和黑曲霉HN-2004所组成的组中的一种或多种。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，在步骤(1)中，相对于每克所述发酵培养基，接种1×104-1.5×105个菌落形成单位、优选5×104-1×105个菌落形成单位的所述黑曲霉。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵在30-40℃、优选36-38℃下进行。
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