CN108220315A - 一种小分子蛋白或多肽的制备方法及融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小分子蛋白或多肽的制备方法，所述方法包括：（a）构建基因工程菌株，该基因工程菌株包含具有融合蛋白编码核酸序列的重组表达载体，所述融合蛋白为F‑L‑多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽‑1、人胰高血糖素样肽‑1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP‑1或其类似物、GLP‑2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽；（b）培养所述基因工程菌株，以表达所述融合蛋白；和（c）纯化所述融合蛋白并通过蛋白酶切割得到具有生物活性的所述小分子蛋白或多肽。本发明的方法克服了小分子蛋白或多肽难以表达的缺点，为此类蛋白表达提供了新的思路。

Description

一种小分子蛋白或多肽的制备方法及融合蛋白
技术领域
本发明涉及一种小分子蛋白或多肽的制备方法，还涉及该制备方法中使用到的编码序列、重组表达载体和融合蛋白。
背景技术
根据国际糖尿病联盟发布的糖尿病地图(第7版)统计数据显示，2015年全球糖尿病患者人数已经高达4.15亿，平均每11个人中就有1个人患病，预计到2040年全球糖尿病患者将增至6.42亿。2015年全球共有500万人死于糖尿病，平均每6秒钟就有1人死亡。对各个国家和地区的患病率和发病趋势的估计显示，中国糖尿病患者数较2013年增加1120万，达1.096亿，居全球首位。根据目前的发展趋势，预计到2040年中国糖尿病患者数将达1.507亿。全球健康费用的12％被用于糖尿病治疗及并发症预防，2015年花费达到6730亿美元。因此，研究疗效好，价格便宜的糖尿病治疗药物刻不容缓。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。GLP-1有GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺两种活性形式，分别是由31个氨基酸和30个氨基酸组成的小肽。然而，人体自身产生的天然GLP-1极易被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，其血浆半衰期不足2分钟，在临床上不能成药。
GLP-1类似物不仅具有GLP-1相同的药理作用，还具有更长的血浆半衰期，可以显著降低血糖水平及修复胰岛细胞功能。GLP-1类似物能模仿人GLP-1葡萄糖浓度依赖性的降糖活性，抑制患者胃肠运动和排空，避免口服类降糖药和胰岛素类降糖药的不足，如体重增加、长期血糖浓度及HbA1c水平控制不佳、严重低血糖等不良反应，显著提高患者的生活质量，是治疗2型糖尿病的重要药物。
艾塞那肽(Exendin-4)是一种GLP-1类似物，由美国礼来公司开发，是肠促胰岛素类似物家族的第一个成员。艾塞那肽是从北美洲西北部钝尾毒蜥唾液中分离得到的，由39个氨基酸组成，与GLP-1氨基酸序列具有约53％的同源性，在哺乳动物体内，该多肽的生理功能与GLP-1相似，能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌。艾塞那肽对二肽基肽酶IV不敏感，体内半衰期长达2-3个小时，对2型糖尿病具有较好的临床治疗效果。临床上主要用于治疗二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍和磺酰脲类联合应用不能很好控制血糖的II型糖尿病。
利拉鲁肽(Liraglutide)也是一种GLP-1类似物，由丹麦诺和诺德公司开发，由31个氨基酸和一条脂肪酸侧链组成，其氨基酸序列与人GLP-1具有97％的序列同源性。与天然GLP-1不一样，利拉鲁肽不会被二肽基肽酶降解，皮下给药后血浆半衰期约13小时。利拉鲁肽适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。每日注射一次，可在任意时间注射，无需根据进餐时间给药。
索玛鲁肽(semaglutide)也是一种GLP-1类似物，由31个氨基酸和一条脂肪酸侧链组成，由丹麦诺和诺德公司开发，是在利拉鲁肽基础上进行优化得到。它采用谷氨酸-2*OEG连接子，18碳二羧酸脂肪酸链，序列上34位突变为精氨酸，8位丙氨酸突变为非天然氨基酸Aib。三期临床研究证实，索玛鲁肽的半衰期为40h，远高于利拉鲁肽的15h，给药频率可达到一周一次。
小分子蛋白或多肽的制备方法有化学合成法和生物合成法两种。化学合成法是以保护的氨基酸为原料，依次逐个接上氨基酸，然后经过裂解、纯化，获得成品。生物合成法，又叫DNA重组法，通过培养含有目的基因的微生物表达小分子蛋白或多肽，然后经过分离、纯化，得到成品。
WO2006119388先用固相法合成GLP-1类似物前体，再在液相中合成GLP-1类似物；WO2011006644公开了用固相化学合成四个GLP-1类似物片段，再将几个片段在液相中偶联得到GLP-1类似物。US6902744、CN101538324、CN101357938中均公开了采用固相化学合成GLP-1类似物的方法。中国专利CN102286092、CN102875665和CN102584982公布了一种GLP-1类似物的固相合成方法和纯化方法。
专利US7595172B2、US2003144471A1公布了一种制备GLP-1类似物的方法。包括以下主要步骤：1)培养包含编码GLP-1类似物前体的核苷酸序列的酿酒酵母细胞，在合适的条件下表达GLP-1类似物前体分子，2)从发酵液中分离GLP-1类似物前体分子，3)用脂肪酸活化物对目标肽的赖氨酸残基进行酰化，并且避免N末端延伸肽的赖氨酸残基发生酰化，4)用赖氨酸特异性内切酶(ALP)切割去掉酰化肽的N段延伸肽，5)用合适的方式分离GLP-1类似物。专利WO2005019262A1详细公布了将GLP-1类似物前体转化为GLP-1类似物的制备方法。然而，酿酒酵母容易使表达产物发生高度糖基化，增加了人体发生免疫反应的风险。另外，酿酒酵母生长缓慢，必然导致生产周期长，客观上增加了生产的成本。
专利CN104894196A公布了一种制备GLP-1类似物的方法，该方法以水蛭素为融合伴侣，将GLP-1类似物拼接于其下游进行融合表达，并在水蛭素融合伴侣与GLP-1类似物之间设计一个连接肽，该连接肽包含TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)识别切割序列，这样融合蛋白表达后便可通过TEV酶切割释放出GLP-1类似物。
专利CN102618552B公布了一种制备GLP-1类似物的方法，该方法GB1蛋白为融合伴侣，将GLP-1类似物拼接于其下游进行融合表达，并在GB1蛋白与GLP-1类似物之间设计一个连接肽，该连接肽包含肠激酶酶切位点编码序列，通过在大肠杆菌中表达融合蛋白，然后通过肠激酶酶切释放出GLP-1类似物。
专利CN103819546A公布了一种多肽露那辛的制备方法，该方法以水蛭素III(HV3)为融合伴侣，将露那辛连接于水蛭素III的下游，二者之间通过连接肽GGGDDDDK相连，在大肠杆菌中表达水蛭素III-露那辛融合蛋白，在体外通过牛肠激酶酶切释放露那辛。
专利CN100579986C公布了一种制备GLP-1类似物的方法，将2-32个GLP-1类似物串联表达，并通过后续的融合蛋白裂解及分离纯化得到GLP-1类似物单体分子。不过该方法表达 某些特定氨基酸序列的药物分子时，单体分子的C-末端可能会残留多余的氨基酸。
化学合成法存在诸多缺陷，例如，需要使用大量的有机溶剂，容易造成环境污染，且不利于操作人员的健康，例如，固相多肽合成中每个氨基酸延长都需要充分的洗涤操作。通常，掺入一个氨基酸涉及多达10次用NMP、DMF或DCM等这类溶剂的洗涤步骤。此外，合成过程中产生的杂质与目的蛋白性质非常接近，在纯化的过程中很难去除，产品收率无法得到有效的提高，导致产品纯度降低，影响产品的质量以及用药安全。例如化学法合成GLP-1类似物、胰岛素及类似物时，合成期间二级结构的形成常常导致各个合成步骤的效率降低。因此，常常以低纯度和收率生产出较大的肽或含有某些氨基酸序列的肽。杂质常常是在最终序列中失去一个或多个氨基酸的缺失肽。这些杂质可能非常难以与所需要的肽相分离，导致产物被缺失肽污染。而且，化学合成法需要使用保护氨基酸以及连续使用过量反应物，使得该方法相对昂贵。
与化学合成法相比，生物合成法有着污染较小、工艺简单以及成本低廉等方面的优势。但是，目前生物合成法存在生产周期长，工艺复杂和产量不高的问题。
发明内容
本发明一方面提供一种小分子蛋白或多肽的制备方法，所述方法包括：(a)构建基因工程菌株，该基因工程菌株包含具有融合蛋白编码核酸序列的重组表达载体，所述融合蛋白为F-L-多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽-1、人胰高血糖素样肽-1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽；(b)培养所述基因工程菌株，以表达所述融合蛋白；和(c)纯化所述融合蛋白并通过蛋白酶切割得到具有生物活性的所述小分子蛋白或多肽。
在一些实施方式中，所述基因工程菌株选自细菌、酵母和真菌，优选的是细菌，更优选的是大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些实施方式中，所述连接肽具有以下通式：Xn------X3-X2-X1-X0，其中，n为2～8之间的整数；X0为蛋白酶酶切位点，选自Arg、Lys，优选为Lys；X1和X2是酸性氨基酸，即Glu或Asp；X3～Xn可以选自除Lys和Arg以外的任何氨基酸，优选为His、Glu、Ala、Asp、Gly、Leu、Val或Met。
在一些实施方式中，所述重组表达载体具有T7启动子或T7lac启动子，优选T7lac启动子。优选地，所述表达载体还额外具有T7终止子。
在一些实施方式中，步骤(c)具体包括获得所述融合蛋白的包涵体，通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过蛋白酶酶切释放小分子蛋白或多肽。例如，在一个实施方式中， 本发明提供一种重组小分子蛋白或多肽的制备方法，该方法可以获得高水平表达的小分子蛋白或多肽，该方法包括：(1)构建含有所述融合蛋白编码核酸序列的重组质粒；(2)将重组质粒转化大肠杆菌宿主菌，获得重组工程菌；(3)培养重组工程菌，获得含有小分子蛋白或多肽融合蛋白的包涵体；和(4)通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过蛋白酶酶切释放小分子蛋白或多肽。
在一些实施方式中，步骤(c)具体包括获得所述融合蛋白的包涵体，通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过侧链修饰得到小分子蛋白或多肽的前体，最后通过蛋白酶切割得到具有生物活性的小分子蛋白或多肽。例如，在一个实施方式中，本发明提供一种重组小分子蛋白或多肽的制备方法，该方法可以获得高水平表达的小分子蛋白或多肽，该方法包括：(1)构建含有所述融合蛋白编码核酸序列的重组质粒；(2)将重组质粒转化大肠杆菌宿主菌，获得重组工程菌；(3)培养重组工程菌，获得含有小分子蛋白或多肽融合蛋白的包涵体；(4)使用脂肪酸链活化物修饰小分子蛋白或多肽融合蛋白；和(5)通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过侧链修饰得到小分子蛋白或多肽的前体，最后通过蛋白酶切割得到具有生物活性的小分子蛋白或多肽。
本发明另一方面提供一种融合蛋白，其通式为F-L-多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽-1、人胰高血糖素样肽-1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽。在一些实施方式中，融合蛋白的编码核酸序列如SEQ ID NO.15所示。在一些实施方式中，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
在一些实施方式中，所述醛固酮异构酶蛋白突变体或人胰高血糖素样肽-1突变体是由相应的野生型蛋白经过一个或多个氨基酸突变得到，以消除特定蛋白酶切割位点，或者消除侧链修饰位点。在一些实施方式中，所述蛋白酶选自胰蛋白酶、肠激酶、赖氨酸特异性内切酶和精氨酸特异性内切酶。在一些实施方式中，所述的侧链修饰位点是指侧链官能团能与脂肪酸链活化物发生反应的氨基酸残基，例如赖氨酸残基。在一些实施方式中，融合伴侣醛固酮异构酶蛋白或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。在一些实施方式中，融合伴侣人胰高血糖素样肽-1或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在一些实施方式中，所述连接肽具有以下通式：Xn------X3-X2-X1-X0，其中，n为2～8之间的整数；X0为蛋白酶酶切位点，选自Arg、Lys，优选为Lys；X1和X2是酸性氨基酸，即Glu或Asp；X3～Xn可以选自除Lys和Arg以外的任何氨基酸，优选为His、Glu、Ala、Asp、Gly、Leu、Val 或Met。
在一些所述方式中，所述连接肽为选自以下序列：
在一些实施方式中，连接肽选自SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.46,SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.43。
本发明另一方面提供一种基因工程菌株，其包含具有本发明所述的融合蛋白的编码核酸序列的重组表达载体。
本发明另一方面提供一种重组表达载体，其包含编码本发明所述的融合蛋白的核酸序列。
本发明的方法相比于现有技术具有诸多优势。例如，本发明的方法克服了小分子蛋白或多肽难以表达的缺点，为此类蛋白表达提供了新的思路：小分子蛋白或多肽由于分子太小，极易被宿主菌降解而难以成功表达。本发明使用了醛固酮异构酶作为融合伴侣，使蛋白分子增大2～5倍，从而降低了被降解的风险。本发明人实验发现多种小分子蛋白和多肽在大肠杆菌中免于降解，实现了正确表达。又如，本发明的方法目的蛋白表达量高：融合蛋白含有较高比例的疏水性氨基酸，容易在大肠杆菌中形成结构非常稳定的包涵体，避免了被宿主蛋白酶破坏的问题。融合蛋白可以在细胞中大量积累，获得较高的表达量，一般情况可达到18～28g/L。此外，本发明的方法生长周期短，培养成本低。大肠杆菌无需特殊营养成分，能在简单的无机盐培养基中进行生长，在常用宿主菌中大肠杆菌生长周期最短，一般25～35h，因此成本较低。再者，本发明使用的宿主菌遗传背景清楚，安全性高：大肠杆菌属于四类菌毒种，培养过程中未使用动物源成分，不会引入对人体有害的病毒因子。另外大肠杆菌表达的外源蛋白糖基化程度低，人体发生免疫反应的风险低。而且，本发明的目的蛋白形成包涵体结构，提取方法简单：目的蛋白以包 涵体形式存在，可以通过破碎和离心等简单方法提取出来，且包涵体结构稳定，可以在冷冻条件下存放较长时间。最后，本发明的融合蛋白经简单处理即可得到小分子蛋白或多肽：融合蛋白无需变复性等复杂处理过程，只需在合适条件下溶解、酶切即可得到小分子蛋白或多肽。并且，由于小分子蛋白或多肽结构简单，在此过程中可形成正确的空间结构，具有生物活性。
附图说明
图1是醛固酮异构酶蛋白突变体表达质粒pKSI的结构示意图。
图2显示了人胰岛素样品的MALDI-TOF-MS分析结果。
图3显示了工程菌eGLP6和eGLP8摇床培养样品的SDS-PAGE电泳图。
图4显示了工程菌eGLP6和eGLP8发酵培养样品的SDS-PAGE电泳图。
图5显示了工程菌eGLP11摇床培养样品的SDS-PAGE电泳图。
图6显示了工程菌eGLP12摇床培养样品的SDS-PAGE电泳结果。
图7工程菌eGLP15摇床培养样品的SDS-PAGE电泳结果。
图8工程菌eGLP15发酵培养样品的SDS-PAGE电泳结果。
图9显示了GLP-1类似物的RP-HPLC分析结果。
图10显示了GLP-1类似物的MALDI-TOF-MS分析结果。
图11显示了GLP-1类似物的RP-HPLC分析结果。
图12显示了GLP-1类似物的MALDI-TOF-MS分析结果。
具体实施方式
本发明将接合以下具体实施例做进一步说明，要理解的是，说明书中所给出的实施例仅是示例性的，不应解释为对本发明的范围的限制。本领域技术人员在阅读说明书后，可以对本发明的实施例作出适当改变，而这些改变仍然属于本发明的范围之内。
在本发明中，当涉及氨基酸序列时，字母代表以下含义。
中文名称 英文名称 三字母 单字母 中文名称 英文名称 三字母 单字母
甘氨酸 Glycine Gly G 苏氨酸 Threonine Thr T
丙氨酸 Alanine Ala A 半胱氨酸 Cysteine Cys C
缬氨酸 Valine Val v 甲硫氨酸 Methionine Met M
亮氨酸 Leucine Leu L 天冬酰胺 Asparagine Asn N
异亮氨酸 Isoleucine Ile I 谷氨酰胺 Glutamine Gln Q
脯氨酸 Proline Pro P 色氨酸 Tryptophan Trp w
苯丙氨酸 Phenylalanine Phe F 丝氨酸 Serine Ser S
酪氨酸 Tyrosine Tyr Y 赖氨酸 Lysine Lys K
天冬氨酸 Aspartic acid Asp D 精氨酸 Arginine Arg R
谷氨酸 Glutamic acid Glu E 组氨酸 Histidine His H
α-氨基异丁酸(中文名称) 2-methylalanine(英文名称) Aib(三字母)
实施例1融合伴侣表达质粒的构建
表达质粒含有T7lac型启动子和T7终止子，可实现无诱导剂时关闭表达，有诱导剂存在时启动表达。质粒还含有选择标记，用于维持目的基因在大肠杆菌中的稳定性。
使用醛固酮异构酶(KSI)为融合伴侣蛋白，人工合成融合伴侣的编码基因序列，其5’端掺入起始密码子ATG，为了方便不同目的蛋白分子的克隆，在起始密码子前掺入限制酶NdeI位点，在3’端掺入限制酶AlwNI位点，随后掺入XhoI位点。合成DNA用NdeI和XhoI消化，并与消化过的T7lac型表达质粒的NdeI-XhoI片段连接。上述质粒在筛选标记存在下的大肠杆菌中增值，采用常规方法分离。通过限制酶NdeI和XhoI检查显示质粒DNA中含有***序列，序列分析显示所述质粒DNA含有醛固酮异构酶的正确序列，获得表达质粒pKSI(图1)。
使用醛固酮异构酶蛋白突变体(mKSI)为融合伴侣蛋白，人工合成其编码基因序列，采用上述方法，获得表达质粒pmKSI。使用人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)为融合伴侣蛋白，人工合成其编码基因序列，采用上述方法，获得表达质粒pGLP。使用人胰高血糖素样肽-1突变体(mGLP-1)为融合伴侣蛋白，人工合成其编码基因序列，采用上述方法，获得表达质粒pmGLP。
实施例2大肠杆菌表达***的构建和人胰岛素的产生
在人胰岛素前体分子的氨基端添加合适的连接肽，用人工合成的方式获得编码基因，具体为L-B(1-29)-AAK-A(1-21)、L-B(1-30)-KWK-A(1-21)，其3’端掺入终止密码子TAA，在终止密码子后掺入限制酶XhoI位点，在5’端掺入限制酶AlwNI位点。合成DNA用XhoI和AlwNI消化，并与消化过的pKSI质粒的XhoI-AlwNI片段连接。将连接产物导入大肠杆菌中，并在氨苄青霉素存在条件下进行增值，采用常规方法分离质粒。通过合适的限制性核酸酶(例如XhoI、AlwNI、NdeI)检查显示质粒DNA中含有***序列，序列分析显示所述质粒DNA含有人胰岛素前体分子L-B(1-29)-AAK-A(1-21)(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.3)、L-B(1-30)-KWK-A(1-21)(SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.4)的正确序列。
将重组质粒转入大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的LB平板(0.5％酵母提取物、1％蛋白胨、 1％氯化钠，2％琼脂粉)上选出含有重组质粒的大肠杆菌转化子。获得2株工程菌：eINS12、eINS16，分别表达醛固酮异构酶-人胰岛素前体融合蛋白KSI-L-B(1-29)-AAK-A(1-21)、KSI-L-B(1-30)-KWK-A(1-21)。
将工程菌eINS12、eINS16分别接种到LB培养基(0.5％酵母提取物、1％蛋白胨、1％氯化钠)，37℃培养5～8h，加入0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导，28℃培养10h。取1ml培养液离心后，收集菌体，加入8M尿素，超声波破碎(超声5s，停10s，共10分钟)后，用SDS-PAGE电泳分析，证实融合蛋白的存在。通过lowry法测定菌体破碎液的总蛋白浓度，结合SDS-PAGE结果测定融合蛋白的浓度。
工程菌eINS12菌体用80MPa高压均质破碎，9000rpm离心获得包涵体，经8M尿素溶解后，用赖氨酸特异性内切酶消化得到desB30人胰岛素，经转肽反应连接苏氨酸，即获得人胰岛素。转肽反应按照本领域常规方法进行，也可按照专利CN105418755A提供的方法进行。
工程菌eINS16菌体用80MPa高压均质破碎，9000rpm离心获得包涵体，经8M尿素溶解后，用赖氨酸特异性内切酶消化释放人胰岛素前体分子B(1-30)-K-A(1-21)，再经羧肽酶B消化即得到人胰岛素。
取得到的人胰岛素样品，用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析发现样品质荷比m/z为5807.355，减去1个质子分子量(1.0073Da)，计算出样品分子量为5806.35Da(理论值为5807.69Da)。
图2显示了人胰岛素样品的MALDI-TOF-MS分析结果。
实施例3大肠杆菌表达***的构建和融合蛋白KSI-L-Arg34GLP-1(7-37)的表达
在GLP-1类似物前体分子的氨基端添加合适的连接肽，用人工合成的方式获得编码基因，具体为L-Arg34GLP-1(7-37)，3’端掺入终止密码子TAATGA，在终止密码子后掺入限制酶XhoI位点，在5’端掺入限制酶AlwNI位点。合成DNA用XhoI和AlwNI消化，并与消化过的质粒pKSI和质粒pmKSI的XhoI-AlwNI片段连接。将连接产物导入大肠杆菌中，并在氨苄青霉素存在条件下进行增值，采用常规方法分离质粒。通过合适的限制性核酸酶(例如XhoI、AlwNI、NdeI)检查显示质粒DNA中含有***序列，序列分析显示所述质粒DNA含有GLP-1类似物前体分子L-Arg34GLP-1(7-37)的正确序列(SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)。
将重组质粒转入大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的LB平板上选出含有重组质粒的大肠杆菌转化子。获得2株工程菌：eGLP6和eGLP8，分别表达醛固酮异构酶-GLP-1类似物融合蛋白KSI-L-Arg34GLP-1(7-37)和醛固酮异构酶蛋白突变体-GLP-1类似物融合蛋白mKSI-L-Arg34GLP-1(7-37)。
将工程菌eGLP6和eGLP8接种到LB培养基，37℃培养5～8h，加入0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导，在摇床中28℃培养10h。1ml培养液离心后，收集菌体，加入8M尿素，超声波破碎(超声5s，停10s，共10分钟)后，用于SDS-PAGE分析，证实融合蛋白的存在，用Gel-Pro凝胶分析软件计算融合蛋白纯度。通过Lowry法测定菌体破碎液 的总蛋白浓度，结合SDS-PAGE结果测定融合蛋白的浓度(图3)。结果显示工程菌eGLP6的融合蛋白浓度为0.37g/L，工程菌eGLP8的融合蛋白浓度为0.48g/L。
将工程菌eGLP6和eGLP8接种到发酵培养基(4g/L葡萄糖，1mM硫酸镁，0.5g氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L磷酸二氢钾，6g/L七水磷酸氢二钠)，在20L发酵罐中37℃培养，控制溶氧20％以上，甘油耗尽后补加质量体积分数为50％的甘油溶液，培养约15h后加入IPTG进行诱导，继续培养约15h放罐。按照上述方法用SDS-PAGE表征融合蛋白(图4)，用Gel-Pro凝胶分析软件计算融合蛋白纯度，用Lowry法测定总蛋白浓度。结果显示，工程菌eGLP6的融合蛋白浓度为25.8g/L，工程菌eGLP8的融合蛋白浓度为28.2g/L。
图3显示了工程菌eGLP6和eGLP8摇床培养样品的SDS-PAGE电泳图。其中泳道1～2为工程菌eGLP6(1ml，稀释5倍)；泳道3为蛋白质标准品，由上至下蛋白质分子量分别为66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD；泳道4～5为工程菌eGLP8(1ml，稀释5倍)。
图4显示了工程菌eGLP6和eGLP8发酵培养样品的SDS-PAGE电泳图。其中泳道1为蛋白质标准品，由上至下蛋白质分子量分别为66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD、9.5KD、6.5KD和4.1KD；泳道2为工程菌eGLP6(1ml，未稀释)；泳道3为工程菌eGLP8(1ml，未稀释)。
实施例4大肠杆菌表达***的构建和融合蛋白GLP-L-Arg34GLP-1(7-37)的产生
用P1(5’-atacagatgctggacgatgatgacaaacatgcagaaggca-3’)和P2(5’-atactcgagtcattaaccgcggcc-3’)为引物，用含有L-Arg34GLP-1(7-37)编码序列的质粒为模板，PCR扩增获得GLP-1类似物分子L-R34GLP-1(7-37)的编码基因，用XhoI和AlwNI消化，并与消化过的pGLP质粒的XhoI-AlwNI片段连接。将连接产物导入大肠杆菌中，并在氨苄青霉素存在条件下进行增值，采用常规方法分离质粒。通过合适的限制性核酸酶(例如XhoI、AlwNI、NdeI)检查显示质粒DNA中含有***序列，序列分析显示所述质粒DNA含有GLP-1类似物前体分子L-Arg34GLP-1(7-37)的正确序列(SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8)。
用实施例3中的方法，获得1株工程菌eGLP11，表达人胰高血糖素样肽-GLP-1类似物融合蛋白GLP-L-Arg34GLP-1(7-37)。将工程菌eGLP11在LB培养基培养时，融合蛋白浓度为0.08g/L。
图5显示了工程菌eGLP11摇床培养样品的SDS-PAGE电泳图。其中泳道7为蛋白质标准品，由上至下蛋白质分子量分别为66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD、9.5KD、6.5KD和4.1KD；泳道1～3为工程菌eGLP11诱导前菌液样品(1ml，未稀释)和泳道4～6为工程菌eGLP11诱导后菌液样品(1ml，未稀释)。
实施例5大肠杆菌表达***的构建和融合蛋白KSI-L-Gly8GLP-1(7-37)的产生
在GLP-1类似物前体分子的氨基端添加合适的连接肽，用人工合成的方式获得编码基因，具体为L-Gly8GLP-1(7-37)，3’端掺入终止密码子TAATGA，在终止密码子后掺入限制酶XhoI 位点，在5’端掺入限制酶AlwNI位点。合成DNA用XhoI和AlwNI消化，并与消化过的质粒pKSI片段连接。将连接产物导入大肠杆菌中，并在氨苄青霉素存在条件下进行增值，采用常规方法分离质粒。通过合适的限制性核酸酶(例如XhoI、AlwNI、NdeI)检查显示质粒DNA中含有***序列，序列分析显示所述质粒DNA含有GLP-1类似物分子L-Gly8GLP-1(7-37)的正确序列(SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10)。
将重组质粒转入大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的LB平板上选出含有重组质粒的大肠杆菌转化子。获得1株工程菌eGLP12，表达醛固酮异构酶-GLP-1类似物融合蛋白KSI-L--Gly8GLP-1(7-37)。将工程菌eGLP12在LB培养基摇床培养时，融合蛋白浓度为0.41g/L。
图6显示了工程菌eGLP12摇床培养样品的SDS-PAGE电泳结果。其中泳道4为蛋白质标准品，由上至下蛋白质分子量分别为66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD、9.5KD、6.5KD和4.1KD；泳道1～3为工程菌eGLP12诱导前菌液样品(1ml，未稀释)和泳道4～6为工程菌eGLP12诱导后菌液样品(1ml，未稀释)。
实施例6大肠杆菌表达***的构建和融合蛋白KSI-L-Arg34GLP-1(9-37)的产生
在GLP-1类似物前体分子的氨基端添加合适的连接肽，用人工合成的方式获得编码基因，具体为L-Arg34GLP-1(9-37)，3’端掺入终止密码子TAATGA，在终止密码子后掺入限制酶XhoI位点，在5’端掺入限制酶AlwNI位点。合成DNA用XhoI和AlwNI消化，并与消化过的质粒pKSI的XhoI-AlwNI片段连接。将连接产物导入大肠杆菌中，并在氨苄青霉素存在条件下进行增值，采用常规方法分离质粒。通过合适的限制性核酸酶(例如XhoI、AlwNI、NdeI)检查显示质粒DNA中含有***序列，序列分析显示所述质粒DNA含有GLP-1类似物前体分子L-Arg34GLP-1(9-37)的正确序列(SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12)。
将重组质粒转入大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的LB平板上选出含有重组质粒的大肠杆菌转化子。获得1株工程菌eGLP15，表达醛固酮异构酶-GLP-1类似物融合蛋白KSI-L--Arg34GLP-1(9-37)。
用实施例3中的方法，获得1株工程菌eGLP15，表达醛固酮异构酶-GLP-1类似物融合蛋白GLP-L-Arg34GLP-1(9-37)。
将工程菌eGLP15接种到LB培养基培养时，融合蛋白的表达量为0.33g/L。将工程菌eGLP10接种到发酵培养基(4g/L葡萄糖，1mM硫酸镁，0.5g氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L磷酸二氢钾，6g/L七水磷酸氢二钠)培养时，融合蛋白的表达量为24.6g/L。培养方法同实施例3。
图7工程菌eGLP15摇床培养样品的SDS-PAGE电泳结果。其中泳道4为蛋白质标准品，由上至下蛋白质分子量分别为66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD、9.5KD、6.5KD和4.1KD；泳道1～3为工程菌eGLP15诱导前菌液样品(1ml，未稀释)和泳道4～6为工程菌eGLP15诱导后菌液样品(1ml，未稀释)。
图8工程菌eGLP15发酵培养样品的SDS-PAGE电泳结果。其中泳道1为蛋白质标准品，由上至下蛋白质分子量分别为66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD、9.5KD、6.5KD和4.1KD；泳道2为工程菌eGLP15诱导14h样品(1ml，稀释20倍)；泳道3为工程菌eGLP15诱导12h样品(1ml，稀释20倍)；泳道3为工程菌eGLP15诱导16h样品(1ml，稀释20倍)。
实施例7GLP-1类似物Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]的产生
取含融合蛋白KSI-L-Arg34GLP-1(7-37)的发酵液，9000rpm离心获得菌体，80MPa高压均质破碎得到匀浆液，然后9000rpm离心获得包涵体。用洗涤液(100mM Tris、5mM EDTA、50mM NaCl、0.1mMβ-巯基乙醇、1％Triton X-100)将清洗一次除去包涵体中的核酸、外膜蛋白及多糖等杂质。用8M尿素溶解包涵体，得到含有醛固酮异构酶-GLP-1类似物前体融合蛋白的溶液。
向融合蛋白液加入1.2倍体积的二甲基亚砜(DMSO)，用N，N-二异丙基乙胺(DIEA)调节pH值至10.5-11.5。每摩尔融合蛋白加入5摩尔脂肪酸活化物(N-十六碳酰-Glu(ONHS)-OH)，搅拌反应2-3小时，即得到融合蛋白修饰物KSI-L-Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]。
每克融合蛋白加入10AU的赖氨酸特异性内切酶，用氢氧化钠和盐酸调pH至7.5～8.5，室温反应18～24h，切除融合伴侣(KSI)和连接肽序列(L)即得到GLP-1类似物Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]。
取酶切反应液，用高效液相色谱(RP-HPLC)分析发现Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]纯度为86.76％(图9)。收集RP-HPLC流出液，用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析发现样品质荷比m/z为3753.375，减去1个质子分子量(1.0073Da)，计算出样品分子量为3752.37Da(理论值为3752.20Da)(图10)。
图9显示了GLP-1类似物的RP-HPLC分析结果。其中峰3表示GLP-1类似物Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]，纯度为86.76％。
图10显示了GLP-1类似物的MALDI-TOF-MS分析结果。
实施例8GLP-1类似物Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]的产生
取含融合蛋白mKSI-L-Arg34GLP-1(7-37)的发酵液，按实施例7中方法处理得到融合蛋白溶液。向融合蛋白液加入1.2倍体积的二甲基亚砜(DMSO)，用N，N-二异丙基乙胺(DIEA)调节pH值至10.8-11.8。每摩尔融合蛋白加入2摩尔脂肪酸活化物(N-十六碳酰-Glu(ONHS)-OH)，搅拌反应2-3小时，即得到融合蛋白修饰物mKSI-L-Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]。
用赖氨酸特异性内切酶切除融合伴侣(mKSI)和连接肽序列(L)即得到GLP-1类似物Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]，方法同实施例7。
取酶切反应液，用高效液相色谱(RP-HPLC)分析发现Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]纯度为83.26％(图11)。收集RP-HPLC流出液，用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析发现样品 质荷比m/z为3752.957，减去1个质子分子量(1.0073Da)，计算出样品分子量为3751.95Da(理论值为3752.20Da)(图12)。
图11显示了GLP-1类似物的RP-HPLC分析结果。其中峰3表示GLP-1类似物Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]，纯度为83.26％。
图12显示了GLP-1类似物的MALDI-TOF-MS分析结果。
实施例9GLP-1类似物Gly8GLP-1(7-37)的产生
取含融合蛋白KSI-L-Gly8GLP-1(7-37)的发酵液，9000rpm离心获得菌体，80MPa高压均质破碎得到匀浆液，然后9000rpm离心获得粗包涵体。用洗涤液(100mM Tris、5mMEDTA、50mM NaCl、0.1mMβ-巯基乙醇、1％Triton X-100)清洗一次，然后9000rpm离心获得精包涵体。用包涵体溶解液(25mM Tris-HCl，8M尿素，pH8.0)溶解精包涵体，使融合蛋白浓度为1.0mg/ml，按每毫克融合蛋白加入2U肠激酶，25℃反应24h，即得到GLP-1类似物Gly8GLP-1(7-37)。
实施例10GLP-1类似物N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)-丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)-乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽的制备
取含融合蛋白KSI-L-Arg34GLP-1(9-37)的发酵液，按实施例9中的方法处理，获得GLP-1类似物Arg34GLP-1(9-37)。用酰化试剂17-{(S)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸叔丁酯与GLP-1类似物[Arg34]GLP-1-(9-37)肽进行酰化反应，得到N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-叔丁氧基羰基十七烷酰基-氨基)-4(S)-叔丁氧基羰基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]-[Arg34]GLP-1-(9-37)肽。Boc-His(Boc)-Aib-OH与N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-叔丁氧基羰基十七烷酰基氨基)-4(S)-叔丁氧基羰基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)-乙氧基]乙氧基)乙酰基]-[Arg34]GLP-1-(9-37)肽进行反应得到GLP-1类似物N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)-丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)-乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)。实验方法参考专利CN105154498A进行。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海冀百康生物科技有限公司
<120> 一种小分子蛋白或多肽的制备方法及融合蛋白
<130> 16617CN
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatattcacg catgccagat gctggaagaa aagtttgtta accaacattt gtgtggttct 60
catttggttg aagctttgta cttggtttgt ggtgaaagag gtttcttcta cactccaaag 120
gctgctaagg gtattgttga acaatgttgt acttctattt gttctttgta ccaattggaa 180
aactactgta actaatagct cgagcaccac c 211
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatattcacg catgccagat gctggaagaa aagtttgtta accaacattt gtgtggttct 60
catttggttg aagctttgta cttggtttgt ggtgaaagag gtttcttcta cactccaaag 120
actaagtgga agggtattgt tgaacaatgt tgtacttcta tttgttcttt gtaccaattg 180
gaaaactact gtaactaata gctcgagcac cacc 214
<210> 3
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Glu Glu Lys Phe Val Asn Gln His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln
35 40 45
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 4
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Glu Glu Lys Phe Val Asn Gln His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Lys Trp Lys Gly Ile Val Glu
35 40 45
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55 60
Asn
65
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aatattcacg catgccagat gctggacgat gacaaacatg cagaaggcac ctttacgagt 60
gatgtgagct cttatctgga aggccaggcg gccaaggaat tcattgcgtg gctggttcgt 120
ggccgcggtt aatgactcga gcaccacc 148
<210> 6
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Asp Asp Asp Lys His Ala Glu Gly
1 5 10 15
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
20 25 30
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatattcacg catgccagat gctggacgat gatgacaaac atgcagaagg cacctttacg 60
agtgatgtga gctcttatct ggaaggccag gcggccaagg aattcattgc gtggctggtt 120
cgtggccgcg gttaatgact cgagcaccac c 151
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Asp Asp Asp Asp Lys His Ala Glu
1 5 10 15
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
20 25 30
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40
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<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgtgagct cttatctgga aggccaggcg gccaaggaat tcattgcgtg gctggttcgt 120
ggccgcggtt aatgactcga gcaccacc 148
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Asp Asp Asp Lys His Gly Glu Gly
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Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
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Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgagctctt atctggaagg ccaggcggcc aaggaattca ttgcgtggct ggttcgtggc 120
cgcggttaat gactcgagca ccacc 145
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gly Thr
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Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
20 25 30
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60, 92, 108, 119)
<223> Xaa=Glu或Asp或Lys或Arg或His，优选Lys或Arg
<400> 13
Met His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gln Arg Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ala Gly Asp Leu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp
20 25 30
Asp Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Xaa Leu Pro Leu Ala
50 55 60
Val Glu Leu Thr Gln Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe
65 70 75 80
Ala Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gln Gly Arg Xaa Thr Val Val Ala
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Pro Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Xaa Val Val Ser Ile
100 105 110
Arg Ala Leu Phe Gly Glu Xaa Asn Ile His Ala Cys Gln
115 120 125
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20, 28, 30)
<223> Xaa=Glu或Gln或Asp
<400> 14
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly Xaa
20 25 30
<210> 15
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgcataccc cagaacacat caccgccgtg gtacagcgct ttgtggctgc gctcaatgcc 60
ggcgatctgg acggcatcgt cgcgctgttt gccgatgacg ccacggtgga agaccccgtg 120
ggttccgagc ccaggtccgg tacggctgcg attcgtgagt tttacgccaa ctcgctcaaa 180
ctgcctttgg cggtggagct gacgcaggag gtacgcgcgg tcgccaacga agcggccttc 240
gctttcaccg tcagcttcga gtatcagggc cgcaagaccg tagttgcgcc catcgatcac 300
tttcgcttca atggcgccgg caaggtggtg agcatccgcg ccttgtttgg cgagaagaat 360
attcacgcat gccagatgct ggacgatgac aaacatgcag aaggcacctt tacgagtgat 420
gtgagctctt atctggaagg ccaggcggcc aaggaattca ttgcgtggct ggttcgtggc 480
cgcggt 486
<210> 16
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gln Arg Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ala Gly Asp Leu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp
20 25 30
Asp Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala
50 55 60
Val Glu Leu Thr Gln Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe
65 70 75 80
Ala Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gln Gly Arg Lys Thr Val Val Ala
85 90 95
Pro Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile
100 105 110
Arg Ala Leu Phe Gly Glu Lys Asn Ile His Ala Cys Gln Met Leu Asp
115 120 125
Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
130 135 140
Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly
145 150 155 160
Arg Gly
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Asp Asp Lys
1 5
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Glu Glu Glu Lys
1
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Glu Glu Asp Lys
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Glu Asp Glu Lys
1
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Asp Glu Glu Lys
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Glu Asp Asp Lys
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Asp Glu Asp Lys
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Asp Asp Glu Lys
1
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Asp Asp Asp Lys
1
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Glu Glu Glu Glu Lys
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Glu Glu Glu Asp Lys
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Glu Glu Asp Glu Lys
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Glu Asp Glu Glu Lys
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Asp Glu Glu Glu Lys
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Glu Glu Asp Asp Lys
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Glu Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Asp Glu Glu Asp Lys
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Glu Asp Asp Glu Lys
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Asp Glu Asp Glu Lys
1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Asp Asp Glu Glu Lys
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Met Leu Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Asp Glu Asp Asp Lys
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Asp Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Asp Asp Asp Glu Lys
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 42
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Met Leu Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 44
Met Leu Glu Glu Glu Glu Lys
1 5

Claims (17)

1.一种小分子蛋白或多肽的制备方法，所述方法包括：
（a）构建基因工程菌株，该基因工程菌株包含具有融合蛋白编码核酸序列的重组表达载体，所述融合蛋白为F-L-多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽-1、人胰高血糖素样肽-1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽；
（b）培养所述基因工程菌株，以表达所述融合蛋白；和
（c）纯化所述融合蛋白并通过蛋白酶切割得到具有生物活性的所述小分子蛋白或多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因工程菌株选自细菌、酵母和真菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因工程菌株是细菌。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因工程菌株是大肠杆菌（Escherichia coli）。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接肽具有以下通式：Xn------X3-X2-X1-X0，其中，n为2~8之间的整数；X0为蛋白酶酶切位点，选自Arg、Lys；X1和X2是酸性氨基酸，即Glu或Asp；X3~Xn选自除Lys和Arg以外的任何氨基酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组表达载体具有T7启动子或T7 lac启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达载体还额外具有T7终止子。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（c）具体包括获得所述融合蛋白的包涵体，通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过蛋白酶酶切释放小分子蛋白或多肽。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（c）具体包括获得所述融合蛋白的包涵体，通过破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白粗品，再通过侧链修饰得到小分子蛋白或多肽的前体，最后通过蛋白酶切割得到具有生物活性的小分子蛋白或多肽。
10.一种融合蛋白，其通式为F-L-多肽，其中F为融合伴侣蛋白，选自醛固酮异构酶蛋白、醛固酮异构酶蛋白突变体、人胰高血糖素样肽-1、人胰高血糖素样肽-1突变体；L为连接肽，多肽为胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、抗菌肽、或胸腺肽。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述醛固酮异构酶蛋白突变体或人胰高血糖素样肽-1突变体是由相应的野生型蛋白经过一个或多个氨基酸突变得到，以消除特定蛋白酶切割位点，或者消除侧链修饰位点。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中融合伴侣醛固酮异构酶蛋白或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
13.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中融合伴侣人胰高血糖素样肽-1或其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
14.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述连接肽具有以下通式：Xn------X3-X2-X1-X0，其中，n为2~8之间的整数；X0为蛋白酶酶切位点，选自Arg、Lys；X1和X2是酸性氨基酸，即Glu或Asp；X3~Xn选自除Lys和Arg以外的任何氨基酸。
15.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述连接肽选自SEQ ID NO. 17至SEQ IDNO. 46中的任何一个。
16.一种基因工程菌株，其包含具有权利要求10至15任何一项所述的融合蛋白的编码核酸序列的重组表达载体。
17.一种重组表达载体，其包含编码权利要求10至15任何一项所述的融合蛋白的核酸序列。
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