CN108220271B

CN108220271B - 蛋白质AxMan113A作为β-甘露聚糖酶的应用

Info

Publication number: CN108220271B
Application number: CN201810073244.0A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 李延啸; 闫巧娟; 游鑫; 杨绍青
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN108220271A

Abstract

本发明公开了蛋白质AxMan113A作为β‑甘露聚糖酶的应用。本发明所提供蛋白质AxMan113A，为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质或氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质。实验证明，蛋白质AxMan113A具有β‑甘露聚糖酶活性，可高效水解富含甘露聚糖的植物胶，如槐豆胶、魔芋粉。同时蛋白质AxMan113A具有良好的耐酸性、耐热性及水解特性，与现有的β‑甘露聚糖酶相比存在明显不同。蛋白质AxMan113A及其编码基因在食品、饲料等行业中具有重要的经济价值和现实意义。

Description

蛋白质AxMan113A作为β-甘露聚糖酶的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及蛋白质AxMan113A作为β-甘露聚糖酶的应用。

背景技术

甘露聚糖是甘露糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的线性多糖，其主链还含有通过β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖残基和通过α-1，6-糖苷键连接的半乳糖残基。甘露聚糖在自然界中广泛存在，是除木聚糖外含量最丰富的半纤维素(Srivastava andKapoor.Biotechnology Advances，2017，35：1-19)。甘露聚糖是半纤维素的第二大组成部分，广泛存在于自然界中，是多种植物细胞壁的主要组成成分和多种植物种子胚乳中主要贮能物质。因其结构复杂，甘露聚糖的完全降解需要多种酶的协同作用，其中最重要的是β-甘露聚糖酶。β-甘露聚糖酶来源广泛，植物、低等动物、微生物中均发现β-甘露聚糖酶的存在。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有产酶条件简单、产酶量大、酶学性质多样等诸多优点，已广泛用于食品、饲料等多种行业，是一种重要的生物酶制剂(Dhawan and Kaur.CriticalReviews in Biotechnology，2007，27：197-216)。

根据氨基酸序列的相似性，β-甘露聚糖酶分属于糖苷水解酶5、26、113和134家族。迄今，绝大多数β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶5家族和26家族。与糖苷水解酶5家族和26家族不同，糖苷水解酶113家族中确定功能特性的只有β-甘露聚糖酶一类酶。目前，对于该家族β-甘露聚糖酶功能应用的研究很少，只有两个来源于脂环酸芽孢杆菌属的β-甘露聚糖酶被报道(Xia et al.Applied and Environmental Microbiology，2016，82：2718-2727；Zhang et al.Journal of Biological Chemistry，2008，283：31551-31558)。尚未见其它属微生物来源的糖苷水解酶113家族的β-甘露聚糖酶报道。

甘露寡糖是由2-10个甘露糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的寡糖，其来源不同还会含有数量不等的葡萄糖残基和半乳糖残基。甘露寡糖具有性质稳定、低热量、不引发龋齿、降血糖等特点，是新一代功能食品配料(Srivastava et al.Journal of Agriculturaland Food Chemistry，2017，65：2827-2838)。目前，甘露寡糖的制备方法主要有酸碱降解、辐照降解、超声波降解及酶法水解。酶法水解过程可控、条件温和、副反应少，是目前制备甘露寡糖最为经济、高效、环保的方法。槐豆胶、魔芋粉、瓜尔胶等富含甘露聚糖的植物胶均是制备甘露寡糖的优良原料(Zang et al.Enzyme and Microbial Technology，2015，78：1-9；Kurakake et al.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2006，54：7885-7889)。因此，利用β-甘露聚糖酶水解槐豆胶、魔芋粉、瓜尔胶等植物胶制备甘露寡糖具有非常广阔的市场前景。

迄今，甘露寡糖的制备和功能受到国内外研究者的广泛关注，文献中多利用底物浓度5％以下的植物胶制备甘露寡糖(Chen et al.International Journal ofBiological Macromolecules，2016，82：1-6；Liu et al.Carbohydrate Polymers，2015.130：398-404)。此外，也有一些关于制备甘露寡糖的专利报道，如：中国专利申请号200910014349.X、申请号201310428885.0和申请号201510465107.8中公开的生产甘露寡糖所用的原料均为魔芋粉，而中国专利申请号201510174562.2、申请号201510175963.X和申请号201510175978.6中制备甘露寡糖的原料则为瓜尔胶。但是，仍需发掘一些新型β-甘露聚糖酶并利用其制备甘露寡糖，以丰富我国的β-甘露聚糖酶和甘露寡糖市场。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供水解富含甘露聚糖的植物胶的β-甘露聚糖酶。

为解决上述技术问题，本发明首先保护蛋白质AxMan113A的应用；蛋白质AxMan113A的应用可为如下c1)至c12)中至少一种：

c1)作为β-甘露聚糖酶的应用；

c2)在制备具有β-甘露聚糖酶活性的产品中的应用；

c3)在生产甘露寡糖中的应用；

c4)在制备用于生产甘露寡糖的产品中的应用；

c5)在水解甘露聚糖中的应用；

c6)在制备用于水解甘露聚糖的产品中的应用；

c7)在水解植物胶中的应用；

c8)在制备用于水解植物胶的产品中的应用；

c9)在生产甘露糖中的应用；

c10)在制备用于生产甘露糖的产品中的应用；

c11)在生产甘露二糖中的应用；

c12)在制备用于生产甘露二糖的产品中的应用。

上述应用中，所述蛋白质AxMan113A，来源于木聚糖兼性芽孢杆菌(Amphibacillusxylanus)NBRC15112，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a3)在序列表中序列2或序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-甘露聚糖酶活性的蛋白质。

其中，序列表中序列2由309个氨基酸残基组成；序列表中序列4由345个氨基酸残基组成。

为了使a1)或a2)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2或序列4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a4)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a4)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a4)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1或序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质AxMan113A的核酸分子的应用也属于本发明的保护范围；编码所述蛋白质AxMan113A的核酸分子的应用可为如下c1)至c12)中至少一种：

c1)作为β-甘露聚糖酶的应用；

c2)在制备具有β-甘露聚糖酶活性的产品中的应用；

c3)在生产甘露寡糖中的应用；

c4)在制备用于生产甘露寡糖的产品中的应用；

c5)在水解甘露聚糖中的应用；

c6)在制备用于水解甘露聚糖的产品中的应用；

c7)在水解植物胶中的应用；

c8)在制备用于水解植物胶的产品中的应用；

c9)在生产甘露糖中的应用；

c10)在制备用于生产甘露糖的产品中的应用；

c11)在生产甘露二糖中的应用；

c12)在制备用于生产甘露二糖的产品中的应用。

上述应用中，所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于芽孢杆菌且编码所述蛋白质AxMan113A的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，来源于芽孢杆菌且编码所述蛋白质AxMan113A的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由930个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列；序列表中序列3由1038个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质AxMan113A的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质AxMan113A的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要来源于芽孢杆菌且编码所述蛋白质且具有β-甘露聚糖酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2或序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述芽孢杆菌可为木聚糖兼性芽孢杆菌。所述木聚糖兼性芽孢杆菌具体可为木聚糖兼性芽孢杆菌NBRC15112。

所述c3)或c4)中，所述甘露寡糖可为2-10个甘露糖聚合而成。所述c3)或c4)中，所述甘露寡糖可为2-6个甘露糖聚合而成。所述甘露寡糖具体可为2-10个甘露糖通过β-1，4-糖苷键聚合而成。所述甘露寡糖具体可为2-6个甘露糖通过β-1，4-糖苷键聚合而成。

所述c3)或c4)中，所述“生产甘露寡糖”可以甘露聚糖或植物胶作为底物。

所述c9)或c10)中，所述“生产甘露糖”可以甘露聚糖或植物胶作为底物。

所述c11)或c12)中，所述“生产甘露二糖”可以甘露聚糖或植物胶作为底物。

上述任一所述植物胶可为d1)或d2)或d3)或d4)：d1)槐豆胶；d2)魔芋粉；d3)瓜尔胶；d4)富含甘露聚糖的植物胶。

上述任一所述甘露寡糖具体可为甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖或甘露六糖。

实验证明，蛋白质AxMan113A具有β-甘露聚糖酶活性，可高效水解富含甘露聚糖的植物胶，如槐豆胶、魔芋粉。同时蛋白质AxMan113A具有良好的耐酸性、耐热性及水解特性(可在广泛的pH值范围内和温度范围内发挥催化作用)，与现有的β-甘露聚糖酶相比存在明显不同；而且对于糖苷水解酶113家族β-甘露聚糖酶功能应用的研究很少，只有两个来源于脂环酸芽孢杆菌属的β-甘露聚糖酶被报道，蛋白质AxMan113A是一个新的糖苷水解酶113家族的β-甘露聚糖酶。蛋白质AxMan113A及其编码基因在食品、饲料等行业中具有重要的经济价值和现实意义。

附图说明

图1为重组菌甲的粗酶液和重组β-甘露聚糖酶溶液的SDS-PAGE结果。

图2为重组β-甘露聚糖酶的最适pH值。

图3为重组β-甘露聚糖酶的pH稳定性。

图4为重组β-甘露聚糖酶的最适温度测定曲线图。

图5为重组β-甘露聚糖酶的温度稳定性测定曲线图。

图6为重组β-甘露聚糖酶水解槐豆胶的产物的薄层层析色谱分析图。

图7为重组β-甘露聚糖酶水解魔芋粉的产物的薄层层析色谱分析图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

测定β-甘露聚糖酶活力的方法命名为通用方法，具体测定步骤如下：(1)取0.9mL槐豆胶溶液(由0.5质量份槐豆胶和100质量份pH6.5、50mM的柠檬酸磷酸缓冲液混合而成)，加入0.1mL待测样品溶液，置于45℃恒温水浴中反应10min；(2)完成步骤(1)后，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定所释放的还原糖量(以甘露糖作为标准)。β-甘露聚糖酶的活力单位定义为在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol还原糖(以甘露糖计)所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。

比酶活力定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

实施例1、重组β-甘露聚糖酶的制备

一、重组质粒pET28a-AxMan113A的构建

1、提取木聚糖兼性芽孢杆菌NBRC15112的基因组DNA并以其作为模板，以人工合成的上游引物：5’-CCGGAATTCATGGAATTTATTAAGGGTTTTACAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRI的酶切位点)和下游引物：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACGTGATTGGTAATAAGCTTTA-3’(下划线为限制性内切酶NotI的酶切位点)为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收约950bp的DNA片段。

3、将步骤2回收的DNA片段和pMD-18T载体(Takara公司产品)连接，得到中间载体。

4、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切中间载体，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切载体pET-28a(+)(Novagen公司产品，产品目录号为69864-3CN)，回收约5300bp的载体骨架。

6、将酶切产物与载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-AxMan113A。

将重组质粒pET28a-AxMan113A进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET28a-AxMan113A进行结构描述如下：将载体pET-28a(+)的EcoRI识别序列和NotI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的DNA分子。重组质粒pET28a-AxMan113A中，序列表的序列1所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，表达序列表的序列4所示的具有His-tag标签的融合蛋白。

二、重组β-甘露聚糖酶的表达

1、将重组质粒pET28a-AxMan113A导入大肠杆菌BL21，得到重组菌甲。

2、将重组菌甲接种于200mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀值0.6～0.8，加入IPTG并使其浓度为1mM，然后30℃、200rpm振荡培养12h，10000g离心收集菌体。

3、取步骤2得到的菌体，加入10mL pH8.0、20mM的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，重悬后超声破碎(超声波功率200W，循环程序为：破碎3s，停4s，共180个循环)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，上清液即为即重组菌甲的粗酶液。

按照上述方法，将重组质粒pET28a-AxMan113A替换为载体pET-28a(+)，得到重组菌乙(作为对照菌)，然后进一步得到重组菌乙的粗酶液。

三、重组β-甘露聚糖酶的纯化

采用琼脂糖Ni-IDA为层析柱填料，采用1×5cm的层析柱进行纯化，具体如下：先用5～10个柱体积的缓冲液A平衡层析柱(流速为1mL/min)，然后上样步骤二得到的重组菌甲的粗酶液(流速为0.5mL/min)，然后用缓冲液A冲洗层析柱(流速为1mL/min)直至OD_280nm＜0.05以洗去未结合的蛋白，然后用缓冲液B冲洗层析柱(流速为1mL/min)直至OD_280nm＜0.05，最后用缓冲液C冲洗层析柱(流速为1mL/min)并收集OD₂₈₀≥1.0的过柱后溶液，过柱后溶液即为重组β-甘露聚糖酶溶液。

缓冲液A：含300mM NaCl和20mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH8.0、含20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)。

缓冲液B：含300mM NaCl和50mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH8.0、含20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)。

缓冲液C：含300mM NaCl和200mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH8.0、含20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)。

按照上述步骤，将重组菌甲的粗酶液替换为重组菌乙的粗酶液，其它步骤均不变，收集的过柱后溶液即为对照溶液。

将重组菌甲的粗酶液、重组菌乙的粗酶液、重组β-甘露聚糖酶溶液和对照溶液进行SDS-PAGE。部分结果见图1(M为高分子量标准蛋白质，1为重组菌甲的粗酶液，2为重组β-甘露聚糖酶溶液)。结果表明，重组β-甘露聚糖酶溶液显示单一分子量条带，对应分子量为35kDa，与预期大小一致；重组菌甲的粗酶液中也有分子量为35kDa的条带，而重组菌乙的粗酶液和对照溶液中则没有分子量为35kDa的条带。

实施例2、重组β-甘露聚糖酶的酶学性质的测定

待测缓冲液：pH3.0的柠檬酸磷酸缓冲液、pH3.5的柠檬酸磷酸缓冲液、pH4.0的柠檬酸磷酸缓冲液、pH4.5的柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.0的柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.5的柠檬酸磷酸缓冲液、pH6.0的柠檬酸磷酸缓冲液、pH6.5的柠檬酸磷酸缓冲液、pH7.0的柠檬酸磷酸缓冲液、pH3.0的柠檬酸缓冲液、pH3.5的柠檬酸缓冲液、pH4.0的柠檬酸缓冲液、pH4.5的柠檬酸缓冲液、pH5.0的柠檬酸缓冲液、pH5.5的柠檬酸缓冲液、pH6.0的柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸缓冲液、pH6.5的磷酸缓冲液、pH7.0的磷酸缓冲液、pH7.5的磷酸缓冲液、pH8.0的磷酸缓冲液、pH8.0的CHES缓冲液、pH8.5的CHES缓冲液、pH9.0的CHES缓冲液、pH9.5的CHES缓冲液、pH10.0的CHES缓冲液、pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH10.0的CAPS缓冲液、pH10.5的CAPS缓冲液或pH11.0的CAPS缓冲液。待测缓冲液的浓度均为50mmol/L。

一、重组β-甘露聚糖酶的最适pH值

将实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液作为待测样品溶液，测定β-甘露聚糖酶活力，方法如下：(1)取0.9mL槐豆胶溶液(由0.5质量份槐豆胶和100质量份待测缓冲液混合而成)，加入0.1mL待测样品溶液，置于45℃恒温水浴中反应10min；其它同通用方法。

以酶活力的最高点作为100％，在各个pH值条件下β-甘露聚糖酶的相对活力见图2(实心圆形代表柠檬酸磷酸缓冲液，实心正方形代表柠檬酸缓冲液，实心菱形代表磷酸缓冲液，空心正方形代表CHES缓冲液，空心圆形代表甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，空心菱形代表CAPS缓冲液)。结果表明，重组β-甘露聚糖酶的最适pH值为6.5。

二、重组β-甘露聚糖酶的pH稳定性

用待测缓冲液稀释实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液，得到重组β-甘露聚糖酶溶液稀释液；将重组β-甘露聚糖酶溶液稀释液30℃水浴30min，再迅速置于冰水中冷却30min，然后作为待测样品液，采用通用方法测定β-甘露聚糖酶活力。将未经上述处理(上述处理指的是30℃水浴30min，再迅速置于冰水中冷却30min)的重组β-甘露聚糖酶溶液稀释液作为对照。以对照的酶活力作为100％，采用各个pH值条件处理后的相对活力见图3(实心圆形代表柠檬酸磷酸缓冲液，实心正方形代表柠檬酸缓冲液，实心菱形代表磷酸缓冲液，空心正方形代表CHES缓冲液，空心圆形代表甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，空心菱形代表CAPS缓冲液)。结果表明，重组β-甘露聚糖酶在pH4.5～10.5范围内保持稳定，处理30min后残余酶活力在80％以上。

三、重组β-甘露聚糖酶的最适温度

将实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液作为待测样品液，测定β-甘露聚糖酶活力，方法如下：将通用方法步骤(1)中的45℃替换为30℃、35℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃，其它同通用方法。以酶活力最高点为100％，在各个反应温度下的相对活力见图4。

结果表明，重组β-甘露聚糖酶的最适温度为45℃。

四、重组β-甘露聚糖酶的温度稳定性

用pH6.5、50mM的柠檬酸磷酸缓冲液稀释实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液，得到重组β-甘露聚糖酶溶液稀释液；将重组β-甘露聚糖酶溶液稀释液水浴30min(水浴温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)，再迅速置于冰水中冷却30min，然后作为待测样品液，采用通用方法测定β-甘露聚糖酶活力。将未经上述处理(上述处理指的是水浴30min，再迅速置于冰水中冷却30min)的重组β-甘露聚糖酶溶液稀释液作为对照。以对照的酶活力作为100％。采用各个温度处理后的相对活力见图5。

结果表明，重组β-甘露聚糖酶在30℃～45℃范围内保持稳定。

五、底物特异性的测定

将实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液作为待测样品液，测定不同底物的β-甘露聚糖酶活力，方法如下：将通用方法步骤(1)中的槐豆胶替换为魔芋粉或瓜尔胶，其它同通用方法。

将实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液作为待测样品液，采用通用方法测定β-甘露聚糖酶的酶活力。

以槐豆胶为底物时重组β-甘露聚糖酶的酶活力为100％，计算β-甘露聚糖酶对魔芋粉或瓜尔胶的相对活力和比酶活力。

结果见表2。重组β-甘露聚糖酶对魔芋粉的比酶活力最高，达54.4U/mg；其次为槐豆胶，比酶活力达22.4U/mg；对瓜尔胶的比酶活力最低，为1.2U/mg。

表2.重组β-甘露聚糖酶的底物特异性

底物	比酶活力(U/mg)	相对活力(％)
			槐豆胶	22.4	100
魔芋粉	55.4	242.8
			瓜尔胶	1.2	5.4

实施例3、重组β-甘露聚糖酶水解槐豆胶生产甘露寡糖

薄层层析色谱分析：将2μL待测样本点样于TLC分析板，滴加展层剂展层两次，然后用显色液完全浸湿吹干，100℃显色。展层剂由2体积份正丁醇、1体积份乙醇和1体积份水组成。显色剂由95体积份甲醇和5体积份硫酸组成。以甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖的标准品的混合品作为标准对照。

反应体系(总体积为1mL)：将pH6.5、50mM的柠檬酸磷酸缓冲液、槐豆胶和实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液混合，得到反应体系。反应体系中，重组β-甘露聚糖酶的初始浓度为5U/mL，槐豆胶的浓度为1％(w/v)。

反应条件：45℃水浴12h。

间隔时间取样，在沸水浴中加热灭活得到待测样本，然后进行薄层层析色谱分析。

实验结果见图6(Mn为标准对照，从上至下依次为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖)。结果表明，重组β-甘露聚糖酶水解槐豆胶主要产生甘露糖、甘露二糖以及聚合度大于3的甘露寡糖。

由此可知，采用重组β-甘露聚糖酶水解槐豆胶，可以生产甘露寡糖。

实施例4、利用重组β-甘露聚糖酶水解魔芋粉生产甘露寡糖

反应体系(总体积为1mL)：将pH6.5、50mM的柠檬酸磷酸缓冲液、魔芋粉和实施例1制备的重组β-甘露聚糖酶溶液混合，得到反应体系。反应体系中，重组β-甘露聚糖酶的初始浓度为5U/mL，魔芋粉的浓度为1％(w/v)。

反应条件：45℃水浴12h。

实验结果见图7(Mn为标准对照，从上至下依次为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖)。结果表明，重组β-甘露聚糖酶水解魔芋粉主要产生甘露糖、聚合度2-5的甘露寡糖和少量高聚合度甘露寡糖。

由此可知，采用重组β-甘露聚糖酶水解魔芋粉，可以生产甘露寡糖。

<110> 中国农业大学

<120> 蛋白质AxMan113A作为β-甘露聚糖酶的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 930

<212> DNA

<213> 木聚糖兼性芽孢杆菌（Amphibacillus xylanus）

<400> 1

atggaattta ttaagggttt tacatttggt tgggatagcc aaaaaggcta ctttaaaact 60

gagcgagcga aagagagttt acgcttaatg caagaaagaa cggcgagtga atatgtaatt 120

gttgctttag cggcgttgca ggatacggct cactcgactg aagttgattt tcagggctcg 180

cacatggttg atgatgacga actgattgag ctgattgatt atgcgaaatc cttaggtttg 240

aaagtaattt taaagccaac agtaaattgc cgtaatggta cgtggcgagc tcatattaat 300

ttctttgata tggatattcc gggtgaacca acgtgggatg aatggtttga aagttatatt 360

aattatcaga aacattatgc gaaaattgcc gaaaaaacga actgtgaaat gtttgtcgtt 420

ggttgtgaga tggtacaagc ggaaagaaga gaagataaat ggcgtgaact catcgcagaa 480

gtgcgtaaag attatcgagg tcttgtgact tataatacgg ataagtatca agaggataat 540

gtgaagtttt gggatgcact tgatgtcatt tcatctagtg ggtattaccc gataaatgat 600

tgggatcgac aattagatcg gattgaagcg gtcgtaaaac aatatgataa accgtttttc 660

tttgtcgagg caggttgtcc aagtcgctct ggctctgctt tactaccgaa taaatgggat 720

ttagaaggtg cgattaattt acaagagcaa gcagattatt accaagtcat gtttgaaaag 780

acagcgtcga gatcgtgggt tggtggtttt ggtttatggg actggcagac ctatttatac 840

gacgagaaag atgcaactaa aaatgatgat tacggggtat ttggtaagcc ggcggagcgg 900

gttattaaag cttattacca atcacgttaa 930

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 木聚糖兼性芽孢杆菌（Amphibacillus xylanus）

<400> 2

Met Glu Phe Ile Lys Gly Phe Thr Phe Gly Trp Asp Ser Gln Lys Gly

1 5 10 15

Tyr Phe Lys Thr Glu Arg Ala Lys Glu Ser Leu Arg Leu Met Gln Glu

20 25 30

Arg Thr Ala Ser Glu Tyr Val Ile Val Ala Leu Ala Ala Leu Gln Asp

35 40 45

Thr Ala His Ser Thr Glu Val Asp Phe Gln Gly Ser His Met Val Asp

50 55 60

Asp Asp Glu Leu Ile Glu Leu Ile Asp Tyr Ala Lys Ser Leu Gly Leu

65 70 75 80

Lys Val Ile Leu Lys Pro Thr Val Asn Cys Arg Asn Gly Thr Trp Arg

85 90 95

Ala His Ile Asn Phe Phe Asp Met Asp Ile Pro Gly Glu Pro Thr Trp

100 105 110

Asp Glu Trp Phe Glu Ser Tyr Ile Asn Tyr Gln Lys His Tyr Ala Lys

115 120 125

Ile Ala Glu Lys Thr Asn Cys Glu Met Phe Val Val Gly Cys Glu Met

130 135 140

Val Gln Ala Glu Arg Arg Glu Asp Lys Trp Arg Glu Leu Ile Ala Glu

145 150 155 160

Val Arg Lys Asp Tyr Arg Gly Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Lys Tyr

165 170 175

Gln Glu Asp Asn Val Lys Phe Trp Asp Ala Leu Asp Val Ile Ser Ser

180 185 190

Ser Gly Tyr Tyr Pro Ile Asn Asp Trp Asp Arg Gln Leu Asp Arg Ile

195 200 205

Glu Ala Val Val Lys Gln Tyr Asp Lys Pro Phe Phe Phe Val Glu Ala

210 215 220

Gly Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser Ala Leu Leu Pro Asn Lys Trp Asp

225 230 235 240

Leu Glu Gly Ala Ile Asn Leu Gln Glu Gln Ala Asp Tyr Tyr Gln Val

245 250 255

Met Phe Glu Lys Thr Ala Ser Arg Ser Trp Val Gly Gly Phe Gly Leu

260 265 270

Trp Asp Trp Gln Thr Tyr Leu Tyr Asp Glu Lys Asp Ala Thr Lys Asn

275 280 285

Asp Asp Tyr Gly Val Phe Gly Lys Pro Ala Glu Arg Val Ile Lys Ala

290 295 300

Tyr Tyr Gln Ser Arg

305

<210> 3

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat ggaatttatt 120

aagggtttta catttggttg ggatagccaa aaaggctact ttaaaactga gcgagcgaaa 180

gagagtttac gcttaatgca agaaagaacg gcgagtgaat atgtaattgt tgctttagcg 240

gcgttgcagg atacggctca ctcgactgaa gttgattttc agggctcgca catggttgat 300

gatgacgaac tgattgagct gattgattat gcgaaatcct taggtttgaa agtaatttta 360

aagccaacag taaattgccg taatggtacg tggcgagctc atattaattt ctttgatatg 420

gatattccgg gtgaaccaac gtgggatgaa tggtttgaaa gttatattaa ttatcagaaa 480

cattatgcga aaattgccga aaaaacgaac tgtgaaatgt ttgtcgttgg ttgtgagatg 540

gtacaagcgg aaagaagaga agataaatgg cgtgaactca tcgcagaagt gcgtaaagat 600

tatcgaggtc ttgtgactta taatacggat aagtatcaag aggataatgt gaagttttgg 660

gatgcacttg atgtcatttc atctagtggg tattacccga taaatgattg ggatcgacaa 720

ttagatcgga ttgaagcggt cgtaaaacaa tatgataaac cgtttttctt tgtcgaggca 780

ggttgtccaa gtcgctctgg ctctgcttta ctaccgaata aatgggattt agaaggtgcg 840

attaatttac aagagcaagc agattattac caagtcatgt ttgaaaagac agcgtcgaga 900

tcgtgggttg gtggttttgg tttatgggac tggcagacct atttatacga cgagaaagat 960

gcaactaaaa atgatgatta cggggtattt ggtaagccgg cggagcgggt tattaaagct 1020

tattaccaat cacgttaa 1038

<210> 4

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Met Glu Phe Ile Lys Gly Phe Thr Phe Gly Trp Asp

35 40 45

Ser Gln Lys Gly Tyr Phe Lys Thr Glu Arg Ala Lys Glu Ser Leu Arg

50 55 60

Leu Met Gln Glu Arg Thr Ala Ser Glu Tyr Val Ile Val Ala Leu Ala

65 70 75 80

Ala Leu Gln Asp Thr Ala His Ser Thr Glu Val Asp Phe Gln Gly Ser

85 90 95

His Met Val Asp Asp Asp Glu Leu Ile Glu Leu Ile Asp Tyr Ala Lys

100 105 110

Ser Leu Gly Leu Lys Val Ile Leu Lys Pro Thr Val Asn Cys Arg Asn

115 120 125

Gly Thr Trp Arg Ala His Ile Asn Phe Phe Asp Met Asp Ile Pro Gly

130 135 140

Glu Pro Thr Trp Asp Glu Trp Phe Glu Ser Tyr Ile Asn Tyr Gln Lys

145 150 155 160

His Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Lys Thr Asn Cys Glu Met Phe Val Val

165 170 175

Gly Cys Glu Met Val Gln Ala Glu Arg Arg Glu Asp Lys Trp Arg Glu

180 185 190

Leu Ile Ala Glu Val Arg Lys Asp Tyr Arg Gly Leu Val Thr Tyr Asn

195 200 205

Thr Asp Lys Tyr Gln Glu Asp Asn Val Lys Phe Trp Asp Ala Leu Asp

210 215 220

Val Ile Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Pro Ile Asn Asp Trp Asp Arg Gln

225 230 235 240

Leu Asp Arg Ile Glu Ala Val Val Lys Gln Tyr Asp Lys Pro Phe Phe

245 250 255

Phe Val Glu Ala Gly Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser Ala Leu Leu Pro

260 265 270

Asn Lys Trp Asp Leu Glu Gly Ala Ile Asn Leu Gln Glu Gln Ala Asp

275 280 285

Tyr Tyr Gln Val Met Phe Glu Lys Thr Ala Ser Arg Ser Trp Val Gly

290 295 300

Gly Phe Gly Leu Trp Asp Trp Gln Thr Tyr Leu Tyr Asp Glu Lys Asp

305 310 315 320

Ala Thr Lys Asn Asp Asp Tyr Gly Val Phe Gly Lys Pro Ala Glu Arg

325 330 335

Val Ile Lys Ala Tyr Tyr Gln Ser Arg

340 345

Claims

1.蛋白质AxMan113A的应用，为如下c1）或c2）：

c1）作为β-甘露聚糖酶的应用；

c2）在制备具有β-甘露聚糖酶的功能的产品中的应用；

所述蛋白质AxMan113A，为如下a1）或a2）或a3）：

a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2）氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a3）在序列表中序列2或序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质AxMan113A的核酸分子在制备具有β-甘露聚糖酶的功能的产品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1）或b2）或b3）所示的DNA分子：

b1）编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3）核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子。

4.蛋白质AxMan113A的应用，为如下D1）至D10）中至少一种：

D1）在生产甘露寡糖中的应用；

D2）在制备用于生产甘露寡糖的产品中的应用；

D3）在水解甘露聚糖中的应用；

D4）在制备用于水解甘露聚糖的产品中的应用；

D5）在水解植物胶中的应用；

D6）在制备用于水解植物胶的产品中的应用；

D7）在生产甘露糖中的应用；

D8）在制备用于生产甘露糖的产品中的应用；

D9）在生产甘露二糖中的应用；

D10）在制备用于生产甘露二糖的产品中的应用；

所述蛋白质AxMan113A，为如下a1）或a2）或a3）：

a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2）氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

5.编码权利要求1所述蛋白质AxMan113A的核酸分子的应用，为如下D1）至D10）中至少一种：

D1）在生产甘露寡糖中的应用；

D2）在制备用于生产甘露寡糖的产品中的应用；

D3）在水解甘露聚糖中的应用；

D4）在制备用于水解甘露聚糖的产品中的应用；

D5）在水解植物胶中的应用；

D6）在制备用于水解植物胶的产品中的应用；

D7）在生产甘露糖中的应用；

D8）在制备用于生产甘露糖的产品中的应用；

D9）在生产甘露二糖中的应用；

D10）在制备用于生产甘露二糖的产品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1）或b2）或b3）所示的DNA分子：

b1）编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3）核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子。

7.如权利要求4至6任一所述的应用，其特征在于：所述D1）或D2）中，所述甘露寡糖为2-10个甘露糖聚合而成。

8.如权利要求4至6任一所述的应用，其特征在于：所述D1）或D2）中，所述“生产甘露寡糖”以甘露聚糖或植物胶作为底物。

9.如权利要求4至6任一所述的应用，其特征在于：所述D7）或D8）中，所述“生产甘露糖”以甘露聚糖或植物胶作为底物。

10.如权利要求4至6任一所述的应用，其特征在于：所述D9）或D10）中，所述“生产甘露二糖”以甘露聚糖或植物胶作为底物。

11.如权利要求4至6任一所述的应用，其特征在于：所述植物胶为d1）或d2）或d3）或d4）：d1）槐豆胶；d2）魔芋粉；d3）瓜尔胶；d4）富含甘露聚糖的植物胶。