CN108191947B - 一种藏丹参丹参酮类有效成分及提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种藏丹参丹参酮类有效成分及提取方法和应用，提取方法包括以下步骤：将藏丹参干燥、粉碎，然后加水浸泡，向浸泡后的藏丹参中加入6‑8倍量60‑90％乙醇，超声提取60‑90min，提取1‑2次；对超声提取液进行浓缩，然后用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，然后再将浸膏溶解成相应浓度，通过中压制备色谱法分离纯化，制得。本发明方法操作简单，可有效分离纯化目标成分，大大提高了其纯度和提取效率，可充分发挥其药用价值。

Description

一种藏丹参丹参酮类有效成分及提取方法和应用
技术领域
本发明属于藏丹参活性成分的提取技术领域，具体涉及一种藏丹参丹参酮类有效成分及提取方法和应用。
背景技术
藏丹参学名为绒毛鼠尾草(Salvia castaneaDiels f.tomentosaStib)，是唇形科鼠尾草属植物粟色鼠尾草(Salvia castaneaDiefs)的一个变种，产于西藏林芝地区。2005年12月，绒毛鼠尾草被西藏自治区食品药品监督管理局收录到地方药材标准，并命名为“藏丹参”。研究表明，藏丹参含有脂溶性和水溶性成分，脂溶性成分含有隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA等丹参酮类二萜脂溶性化学成分，并具有抗心肌缺血、改善心肌梗死、抗血栓形成、预防和延缓老年痴呆、减轻高血氨症及肝性脑病等药理活性。但按现有的从藏丹参中提取丹参酮类二萜脂溶性化学成分，其提取出的有效成分纯度低，操作较繁琐，提取时间长。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种藏丹参丹参酮类有效成分及提取方法和应用，可有效解决现有的提取方法提取的有效成分纯度低，操作繁琐，提取时间长等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，包括以下步骤：
(1)超声提取：将藏丹参干燥、粉碎，加2-4倍藏丹参重量的去离子水浸泡1.5-2.5h，然后向浸泡后的藏丹参中加入6-8倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为60-90％乙醇，超声提取60-90min，提取1-2次；
(2)制备脂溶性浸膏：将步骤(1)所得滤液减压浓缩为1:1-2的浓缩液，加入乙酸乙酯萃取3-5次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，最后干燥，得干浸膏；其中，乙酸乙酯与浓缩液的体积比为1-2:1-2；
(3)中压柱分离纯化：将干浸膏溶于甲醇，经0.22μm滤膜过滤，然后过反向中压柱，用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集并合并洗脱液，然后对其重结晶，制得。
进一步地，丹参酮类有效成分主要为隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA。
进一步地，步骤(1)中将藏丹参干燥、粉碎，加3倍藏丹参重量的去离子水浸泡2h，然后向浸泡后的藏丹参中加入6倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为90％的乙醇，超声提取60min，提取2次。
进一步地，步骤(1)中超声提取时超声频率为35kHz，温度为40℃，功率为250W。
进一步地，步骤(2)中将步骤(1)所得滤液减压浓缩为1:1的浓缩液，向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏。
进一步地，步骤(3)中梯度洗脱参数为：0-15min，70％甲醇水溶液；15-25min，70-80％甲醇水溶液；25-35min，80-90％甲醇水溶液；35-45min，90-70％甲醇水溶液；流速为20mL/min。
本发明提供的藏丹参丹参酮类有效成分及提取方法和应用，具有以下
有益效果：
(1)本发明先经正交实验筛选出最佳提取条件，得到提取液，然后再经过乙酸乙酯萃取，浓缩，干燥得到脂溶性浸膏，最后经过中压制备色谱法分离纯化以及重结晶，可高效、快捷、大量的从藏丹参中制备分离纯化高纯度的隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA，本发明方法操作简单，可有效分离纯化目标成分，大大提高了其纯度和提取效率，所得隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA纯度分别为98.5％、98.2％、98.4％。
(2)隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA对光、热敏感，因此在提取时，采用避光条件，且提取温度不高于40℃，提取溶剂选择乙醇，其价格便宜，无毒，更适合工业化大生产。
(3)现有的浸膏纯化方法主要有碳酸钠溶液洗涤、大孔树脂吸附等，这些纯化方法存在很多缺陷，如碳酸钠溶液不易进入浸膏内，使得洗涤的溶剂消耗量增大，洗涤次数增加；大孔树脂吸附易引入树脂残留物等。本发明通过中压制备色谱法分离纯化藏丹参中的脂溶性成分，可大大缩短分离时间，还可以分离更大量的化合物，明显提高了分离制备的效率。
(4)本发明在超声提取前，先测定药材吸水率，确定合适的溶媒量，这样操作可以节约能源，避免由于药材吸水对提取条件的优化造成影响，此外，还可以提高有效成分的收率。
具体实施方式
实施例1
一种藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，包括以下步骤：
(1)超声提取：将藏丹参干燥、粉碎，过50目筛，向粉末中加3倍藏丹参重量的去离子水浸泡2h，然后向浸泡后藏丹参中加入6倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为90％的乙醇，超声提取60min，过滤，得第一滤液和第一滤渣，向第一滤渣中加入6倍第一滤渣重量且体积分数为90％的乙醇超声提取60min，过滤，得第二滤液和第二滤渣，合并第一滤液和第二滤液，其中，超声条件为避光，超声频率为35kHz，温度为40℃，功率为250W；
(2)制备脂溶性浸膏：将合并的滤液减压浓缩为1:1的浓缩液，向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯，避光萃取3次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，最后干燥，得干浸膏；
(3)中压柱分离纯化：将干浸膏溶于甲醇，制成浓度为0.2g/mL的溶液，然后经0.22μm滤膜过滤，然后过反向中压柱(Daisogel 60-ODS-BC18，480mm×45mm,5μm)，用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集并合并洗脱液，然后对其重结晶，制得；其中梯度洗脱参数为：0-15min，70％甲醇水溶液；15-25min，70-80％甲醇水溶液；25-35min，80-90％甲醇水溶液；35-45min，90-70％甲醇水溶液；流速为20mL/min，上样量为5mL，检测波长为270nm。
实施例2
一种藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，包括以下步骤：
(1)超声提取：将藏丹参干燥、粉碎，过50目筛，向粉末中加3倍藏丹参重量的去离子水浸泡2h，然后向浸泡后藏丹参中加入8倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为90％的乙醇，超声提取90min，过滤，得滤液，其中，超声条件为避光，超声频率为35kHz，温度为40℃，功率为250W；
(2)制备脂溶性浸膏：将步骤(1)所得滤液减压浓缩为1:1的浓缩液，向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯，避光萃取3次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，最后干燥，得干浸膏；
(3)中压柱分离纯化：将干浸膏溶于甲醇，制成浓度为0.2g/mL的溶液，然后经0.22μm滤膜过滤，然后过反向中压柱，用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集并合并洗脱液，然后对其重结晶，制得；其中梯度洗脱参数为：0-15min，70％甲醇水溶液；15-25min，70-80％甲醇水溶液；25-35min，80-90％甲醇水溶液；35-45min，90-70％甲醇水溶液；流速为20mL/min，上样量为5mL。
实施例3
一种藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，包括以下步骤：
(1)超声提取：将藏丹参干燥、粉碎，过50目筛，向粉末中加3倍藏丹参重量的去离子水浸泡2h，然后向浸泡后藏丹参中加入7倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为60％的乙醇，超声提取80min，过滤，得第一滤液和第一滤渣，向第一滤渣中加入7倍第一滤渣重量且体积分数为60％的乙醇超声提取80min，过滤，得第二滤液和第二滤渣，合并第一滤液和第二滤液，其中，超声条件为避光，超声频率为35kHz，温度为40℃，功率为250W；
(2)制备脂溶性浸膏：将合并的滤液减压浓缩为1:1的浓缩液，向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯，避光萃取3次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，最后干燥，得干浸膏；
(3)中压柱分离纯化：将干浸膏溶于甲醇，制成浓度为0.2g/mL的溶液，然后经0.22μm滤膜过滤，然后过反向中压柱，用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集并合并洗脱液，然后对其重结晶，制得；其中梯度洗脱参数为：0-15min，70％甲醇水溶液；15-25min，70-80％甲醇水溶液；25-35min，80-90％甲醇水溶液；35-45min，90-70％甲醇水溶液；流速为20mL/min，上样量为5mL。
对比例1
一种藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，包括以下步骤：
(1)超声提取：将藏丹参干燥、粉碎，过50目筛，向粉末中加3倍藏丹参重量的去离子水浸泡2h，然后向浸泡后藏丹参中加入10倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为90％的乙醇，超声提取30min，提取3次，合并滤液，其中，超声条件为避光，超声频率为35kHz，温度为40℃，功率为250W；
(2)制备脂溶性浸膏：将合并的滤液减压浓缩为1:1的浓缩液，向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯，避光萃取3次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，最后干燥，得干浸膏；
(3)中压柱分离纯化：将干浸膏溶于甲醇，制成浓度为0.2g/mL的溶液，然后经0.22μm滤膜过滤，然后过反向中压柱，用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集并合并洗脱液，然后对其重结晶，制得；其中梯度洗脱参数为：0-15min，70％甲醇水溶液；15-25min，70-80％甲醇水溶液；25-35min，80-90％甲醇水溶液；35-45min，90-70％甲醇水溶液；流速为20mL/min，上样量为5mL。
对比例2
本对比例与实施例1不同的是，在超声提取过程中向浸泡后藏丹参中加入10倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为60％的乙醇，超声提取60min，提取1次。
对比例3
本对比例与实施例1不同的是，在超声提取过程中向浸泡后藏丹参中加入6倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为60％的乙醇，超声提取90min，提取3次。
对比例4
本对比例与实施例1不同的是，在超声提取过程中向浸泡后藏丹参中加入8倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为60％的乙醇，超声提取30min，提取2次。
对比例5
本对比例与实施例1不同的是，在超声提取过程中向浸泡后藏丹参中加入8倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为30％的乙醇，超声提取60min，提取3次。
对比例6
本对比例与实施例1不同的是，在超声提取过程中向浸泡后藏丹参中加入10倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为30％的乙醇，超声提取90min，提取2次。
对比例7
本对比例与实施例1不同的是，在超声提取过程中向浸泡后藏丹参中加入6倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为30％的乙醇，超声提取30min，提取1次。
测定实施例1-3以及对比例1-7步骤(1)超声提取后的物质中隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量，测定结果见表1。
表1各实施例超声提取后有效成分含量
Figure BDA0001551784170000061
Figure BDA0001551784170000071
由表1可知，超声提取时，提取时间、提取次数、乙醇浓度和料液比都会影响隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的收率，实施例1-3要明显优于其他实施例，尤其是实施例1效果最佳，因此最佳的提取工艺为：用6倍量90％乙醇超声提取2次，每次60min，可显著提高隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的收率。
将实施例1中用中压柱纯化后五段洗脱液合并，经HPLC检测分析，第二、三、五段分别为隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA，含量均在85％以上，经重结晶可得晶体，取适量晶体，经HPLC检测，测得隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的纯度分别为98.5％、98.2％、98.4％。
综上所述，本发明经过正交试验法得出超声提取的最佳条件为用6倍量90％乙醇超声提取2次，每次60min，然后再用乙酸乙酯萃取，得到脂溶性浸膏，最后通过中压制备色谱法对脂溶性浸膏进行分离纯化，得到丹参酮类有效成分，尤其是高纯度的隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA。因隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA对光、热表现出不稳定特性，因此，全部操作均应采取避光措施，且控制提取温度不超过40℃。
通过本发明方法制得的藏丹参丹参酮类有效成分，其纯度高、药效好，可以用于制备心系疾病药物，有效发挥其药用价值。

Claims (3)

1.一种藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）超声提取：将藏丹参干燥、粉碎，加3倍藏丹参重量的去离子水浸泡2h，然后向浸泡后的藏丹参中加入6倍浸泡后藏丹参重量且体积分数为90%的乙醇，超声提取60min，提取2次；
所述超声提取时超声频率为35kHz，温度为40℃，功率为250W；
（2）制备脂溶性浸膏：将步骤（1）所得滤液减压浓缩为1:1-2的浓缩液，加入乙酸乙酯萃取3-5次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏，最后干燥，得干浸膏；其中，乙酸乙酯与浓缩液的体积比为1-2:1-2；
（3）中压柱分离纯化：将干浸膏溶于甲醇，经0.22μm滤膜过滤，然后过反向中压柱，用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集并合并洗脱液，然后对其重结晶，制得丹参酮类有效成分；
所述丹参酮类有效成分为隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA。
2.根据权利要求1所述的藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，其特征在于，步骤（2）中将步骤（1）所得滤液减压浓缩为1:1的浓缩液，向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液，减压浓缩，得脂溶性浸膏。
3.根据权利要求1所述的藏丹参丹参酮类有效成分的提取方法，其特征在于，步骤（3）中梯度洗脱参数为：0-15min，70%甲醇水溶液；15-25min，70-80%甲醇水溶液；25-35min，80-90%甲醇水溶液；35-45min，90-70%甲醇水溶液；流速为20mL/min。
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