CN108165540A - 一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种米黑根毛霉α‑淀粉酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质具有α‑淀粉酶活力，该蛋白质的基因在毕赤酵母中高效表达，经毕赤酵母高密度发酵后的最高酶活为29794.2U/mL，纯化后的比酶活为3502.1U/mg，最适反应pH为6.0，在pH 4.5‑8.0保持稳定；最适反应温度为75℃，在65℃以下保持较高酶活力，具有较好的耐热性。所述酶应用于馒头中，能使馒头比容增大7.7％，同时能延缓馒头老化；应用于麦芽糖生产中，麦芽糖含量能够达到54.1％。所述酶在食品行业中具有良好的应用潜力。

Description

一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体说是一种米黑根毛霉α-淀粉 酶及其编码基因与应用。

背景技术

α-淀粉酶[EC.3.2.1.1]属于糖苷水解酶类第13家族，是作用于淀 粉分子内部切开α-1,4-糖苷键生成糊精和还原糖的一种淀粉酶，其产 物的末端残基碳原子为α构型，故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶的来源广 泛，存在于动物、植物和微生物中。微生物易培养和大规模发酵，能 够大量生产淀粉酶，部分微生物菌株已经被用作工业生产菌株。

由于α-淀粉酶的需求量日益增大，分子生物学和生物化学的发展 使基因工程技术在酶制剂方面的应用越来越多。已有多种α-淀粉酶在 大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和黑曲霉等表达*** 中成功表达。如来源于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的α- 淀粉酶BlAmy-opt在毕赤酵母中表达后，在5L发酵罐中经高密度发酵，酶活和蛋白含量分别达到8100U/mL和8.3g/L；在50L发酵罐 中经高密度发酵，酶活和蛋白含量分别达到11000U/mL和12.2g/L (Wang J,Li Y,Liu N,et al.Codon optimizationsignificantly improves the expression level of α-amylase gene from Bacilluslicheniformis in Pichia pastoris.2015,2015:1～9)。

α-淀粉酶广泛应用于食品工业中。如Rhizopus oryzae FSIS4来源 的α-淀粉酶添加到面包中，比容和高径比分别比对照增加了0.72 mL/g和0.20(Ait A,Gagaoua M,Bourekoua H,et al.Improving bread quality with the application of a newlypurified thermostableα-amylase from Rhizopus oryzae FSIS4.Foods,2017,6(1):1)。来源于埃默森篮状 菌和棒曲霉的α-淀粉酶的最适pH分别为3.5和4.5，且在30-70℃范 围酶活力较高，在淀粉糖化过程中，这两种酶可以与葡糖淀粉酶组合 用于糖化反应，以消除在糖化过程中因必须对pH和温度重新调整而 实施分批过程的需求(丹尼斯科美国公司.使用来自埃默森篮状菌 (Talaromyces emersonii)的α-淀粉酶进行糖化的方法.中国专利，201380052438.8；丹尼斯科美国公司.使用来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α-淀粉酶进行糖化.中国专利，201380024428.3)。来源 于Streptomyces badius DB-1的α-淀粉酶可以水解生淀粉，将淀粉可 以不用预糊化而直接水解，从而降低淀粉加工过程中的生产能耗，在 淀粉加工业中具有一定的应用潜力(Shivlata L,Satyanarayana T.Characteristics of raw starch-digesting alpha-amylase of Streptomyces badiusDB-1with transglycosylation activity and its applications.AppliedBiochemistry and Biotechnology,2017,181(4):1283-1303)。

α-淀粉酶除应用在食品工业中，在饲料、医药、造纸、纺织和洗 涤剂等工业上有广泛的应用。目前，虽然已有几百种α-淀粉酶被发掘， 但在各个行业中应用的α-淀粉酶的性质需求不同，因此开发一些新 型、表达量高和具有特殊特性的α-淀粉酶仍具有重要的研究意义和实 际应用价值。

米黑根毛霉是一种嗜热真菌，最早应用于工业生产凝乳酶和脂肪 酶，这两种酶在国标GB2760-2014中被允许用作食品添加剂(中华 人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760-2014.食品安全国 家标准食品添加剂使用标准.北京:中国标准出版社,2015-05-24)。 目前，关于米黑根毛霉来源的α-淀粉酶还没有报道，因此可以从中提 取α-淀粉酶基因，将其进行外源表达，研究α-淀粉酶的性质和在食 品中的应用。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种米黑根 毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明提供的α-淀粉酶，GenBank编号为MG552704，英文名称 为RmAmyA，来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，该 菌已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，邮编100101)。保藏日期：2011年6月21日。保藏编 号为CGMCC No.4967。

1)序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列 组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

为了使1)或2)或3)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序 列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上 如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进 行生物表达得到。

上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或 几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标 签的编码序列得到。

本发明保护编码上述蛋白质的核酸分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA分子，如cDNA、基因组DNA 或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA分子，如mRNA或hnRNA 等。

所述DNA分子为以下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表序列1所示的DNA分子；

2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权 利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有75％以上的同一性 且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中， 在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗 膜一次。

本发明保护含有以上任一所述编码基因的重组载体(即重组质 粒)、表达盒、转基因细胞或重组菌。

所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点***序列表中序列 1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA。

所述重组载体具体可为用序列表中序列1所示的核苷酸序列替 换载体pPIC9K的EcoRI和NotI识别序列间的片段(载体pPIC9K被 限制性核酸内切酶EcoRI和NotI切成一个大片段和一个小片段，替 换该小片段)，得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA。

所述重组菌可通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到。

所述宿主微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母为巴斯 德毕赤酵母GS115。

将所述的重组载体导入巴斯德毕赤酵母中，得到重组巴斯德毕赤 酵母。

本发明的另一目的在于提供一种生产所述α-淀粉酶的方法。

所述方法是将所述重组菌进行发酵培养，得到所述的α-淀粉酶。

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在 30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基 BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速 600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，温度为 30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时 间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％ 甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％。

本发明保护上述方法生产α-淀粉酶的纯化方法。

所述纯化方法是发酵液经透析除盐后，经DE52弱阴离子柱层析， 用含有200mMNaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液洗脱收集得到纯的 蛋白。

本发明保护所述α-淀粉酶的应用。

上述α-淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用也属于本发明的 保护范围。

本发明提供了一种来源于米黑根毛霉的α-淀粉酶及其编码基因。 该蛋白氨基酸序列与Rhizomucor pusillus来源的α-淀粉酶的氨基酸序 列相似度最高，为70％。米黑根毛霉α-淀粉酶基因在毕赤酵母中成 功表达，毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，酶活力可达29794.2 U/mL，蛋白含量可达8.92mg/mL，实现了高效表达。所述α-淀粉酶 的分子量为51.0kDa；最适反应pH为6.0，在pH 4.5-8.0保温30min， 残余酶活力在80％以上；最适反应温度为75℃，在65℃下保持较好 的稳定性。本发明提供的α-淀粉酶添加到馒头中能够使馒头比容增大 7.7％，并能延缓馒头老化；可水解淀粉液化液生产麦芽糖浆，麦芽糖 含量可达到54.1％。本发明提供的α-淀粉酶在食品工业上具有很大应 用潜力。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为α-淀粉酶在5L发酵罐中高密度发酵的产酶历程图(A) 和SDS-PAGE电泳图(B)(■：酶活；●：蛋白浓度；▼：菌体湿重； M：标准蛋白；0-6：发酵时间(d))。

图2为α-淀粉酶的纯化电泳图(M：标准蛋白；1：粗酶液；2： 纯酶液；3：Endo H处理后的蛋白)。

图3为SDS-PAGE法(A)和凝胶过滤法(B)测α-淀粉酶分子 量(标准蛋白：●；重组蛋白：▲)。

图4为α-淀粉酶的最适pH(A)和pH稳定性(B)测定曲线图 (▲：sodium citrate；■：sodium acetate；◆：sodium phosphate；●： MPOS；○：Tris-HCl；△：glycinate)。

图5为α-淀粉酶的最适反应温度(A)、温度稳定性(B)和半衰 期(C)测定曲线图(◆：60℃；▲：65℃；■：70℃)。

图6为α-淀粉酶水解淀粉的历程图。

图7位α-淀粉酶水解麦芽寡糖的历程图。

图8为α-淀粉酶对馒头比容和高径比的影响曲线图。

图9为α-淀粉酶对馒头储藏期间硬度的影响曲线图。

图10为α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响曲线图。

图11为糖化温度对麦芽糖含量的影响曲线图。

图12为糖化时间对麦芽糖含量的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于 以下实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂如分子试剂、克隆表达载体、 菌株以及发酵用原料等，如无特殊说明均可从商业途径获得。

以下实施例中α-淀粉酶酶活力的测定方法及定义如下：

在试管中加900μL 1％(w/v)的可溶性淀粉，在75℃水浴中保 温2min，加100μL用50mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液稀释适当倍数 的酶液反应10min，加1mL DNS试剂终止反应，将试管移至沸水中 煮10min，用自来水冷却至室温，在540nm下测吸光值。淀粉酶酶 活力定义：在以上条件下，每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量， 以U表示。

实施例1.米黑根毛霉α-淀粉酶在重组巴斯德毕赤酵母中的表达

一、重组菌的构建

设计上游引物RmAmyAEcoRIF：

5’-CCGGAATTCAAGCCATTGCCACTCGCTAAG-3’(下划线示 EcoRⅠ酶切位点，下划线后序列与序列表序列1中的第58-78位相匹 配)；

设计下游引物RmAmyANotIR：

5’-GAATGCGGCCGCTTAAGCTCTCTGGAAAATAGCGGG-3’ (下划线示NotⅠ酶切位点，下划线后序列与序列表序列1中的第 1375-1398位相匹配)；

以米黑根毛霉α-淀粉酶的cDNA为模板，PCR扩增所述蛋白的 氨基酸的编码基因序列。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃ 变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，循环34次，72℃后延伸 10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。对PCR扩增产物 回收，以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将该双酶切后的产物与经相同双酶 切过的酵母表达载体pPIC9K的载体骨架片段以T4DNA连接酶进行 连接，连接后的质粒转入DH5α感受态中，涂于LB Amp⁺板上，挑取 单菌落进行菌落PCR，将条带正确的菌落进行测序，比对后得到阳性 克隆。将得到的重组载体命名为pPIC9K-RmAmyA。将得到的重组载 体pPIC9K-RmAmyA以限制性内切酶SalⅠ线性化后得到电转化巴斯 德毕赤酵母GS115，构成重组菌。

二、高拷贝筛选

将步骤一中得到的重组菌涂布MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％ 生物素，2％葡萄糖)，从MD平板得到的His⁺转化子经灭菌水刮取后 取100μL涂布于不同浓度的YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％ 胰蛋白胨，2％葡萄糖，G418浓度分别为1、2和4mg/mL)。30℃下 培养3-5d后，挑取转化子于BMGY培养基(1％酵母提取物，2％胰 蛋白胨，100mM pH 6.0的PB缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素， 1％甘油)摇瓶培养16-18h，3000rpm离心5min，收集菌体，用BMMY 培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的PB缓冲液， 1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)重悬菌体至OD₆₀₀为1.0左 右，诱导目标蛋白表达。以上培养条件为100mL三角瓶装量10mL 培养基，温度30℃，转速200rpm。

三、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵

将步骤二获得产酶水平高的重组巴斯德毕赤酵母菌株在5L发酵 罐中进行高密度发酵。发酵方法及培养基(种子培养基BMGY、发 酵基本培养基BSM、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基) 的配制参照Pichia Fermentation Process Guidelines(VersionB，053002， Invitrogen)。整个发酵过程采用种子液培养、基础培养、甘油流加培 养和100％甲醇诱导培养四个阶段。

1)种子液培养：选择摇瓶发酵中产酶水平较高的重组菌株，接 种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培 养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液。

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种到5L发酵罐中(装有 1.5L发酵基本培养基BSM)，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH 4.0，加 入PTM₁ 4.35mL/L起始发酵液，接种量10％，转速600rpm，温度 30℃。待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)，开始甘油流加培养阶段。

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，控制温 度为30℃，pH 5.0，始终监视溶氧，通过调整流加速度保持溶氧大于 20％。流加时间4-6h，菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油。

4)100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30min左右，流 加100％甲醇诱导，转速800rpm，监控溶氧大于20％，控制温度30℃， pH 6.0。

发酵过程中取样测菌体湿重、蛋白质含量和酶活力。发酵过程中 菌体湿重、蛋白含量和酶活力变化如图1A所示，发酵过程中蛋白的 SDS-PAGE电泳图如图1B所示。高密度发酵120h时酶活达到最高， 发酵上清液酶活为29794.2U/mL，蛋白浓度为8.92mg/mL。

实施例2.α-淀粉酶的纯化和酶学性质

一、α-淀粉酶的纯化

将发酵液于4℃、10000rpm离心10min，取上清置于20mM PB (pH 6.0)缓冲液中在4℃下透析过夜，透析后的酶液于4℃、10000 rpm离心10min。处理后的酶液进行DE52弱阴离子柱纯化。层析柱 预先用20mM PB(pH 6.0)缓冲液平衡，流速为0.5mL/min；将酶 液以0.5mL/min流速上样；用20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子 至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min；用含有100mM NaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min； 用含有200mM NaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min，收集洗脱后的溶液，并用SDS-PAGE 电泳检测蛋白纯度，结果如图2所示。α-淀粉酶的纯化结果见表2。 用SDS-PAGE法和凝胶S-100层析法测α-淀粉酶的分子量，结果如 图3所示。

表2α-淀粉酶的纯化表

由SDS-PAGE(图3A)和凝胶S-100(图3B)分析，变性状态 下去糖基化后的蛋白分子量为49.6kDa，活性状态下的蛋白分子量为 51.0kDa，与预测分子量50.2kDa接近。

二、α-淀粉酶的酶学性质

1)最适反应pH及pH稳定性

最适反应pH在50℃条件下测定，选择的pH范围及体系如下(50 mM)：柠檬酸钠缓冲液(3.0-6.0)，乙酸钠缓冲液(4.0-5.5)，MES 缓冲液(5.5-7.0)，PB缓冲液(6.0-8.0)，MOPS缓冲液(6.5-8.0)， Tris-HCl缓冲液(7.0-9.0)，甘氨酸-NaOH缓冲液(8.5-10.5)。用以 上缓冲液代替常规测酶活用的缓冲液，比较这些缓冲体系中酶活力差 异，以最高酶活为100％。

用上述缓冲液将纯酶稀释适当倍数，在50℃保温30min，冰水 浴冷却30min后，在最适pH条件下测酶活，以未作处理的酶液做对 照，计算残余酶活。

结果表明，α-淀粉酶的最适反应pH为6.0(图4A)，在pH 4.5-8.0 处理30min，残余酶活力在80％以上(图4B)。

2)最适反应温度、温度稳定性和半衰期

用50mM PB 6.0缓冲液将酶液稀释到适当倍数，分别测α-淀粉 酶在30-85℃的不同温度下的酶活，以最高酶活为100％。

用50mM PB 6.0缓冲液将酶液稀释到适当倍数，放入30-85℃的 不同温度下保温30min，放入冰水浴中冷却30min，以未做处理的酶 液做对照，计算酶的残余酶活力。

纯酶用50mM PB 6.0缓冲液稀释到适当倍数，分别置于60℃、 65℃、70℃不同温度下处理0-4h，不同时间间隔取样，以未经上述 处理的稀释后的酶液作为对照，测定α-淀粉酶酶活，计算残余酶活力 占对照酶活力的百分比，得到α-淀粉酶在不同温度下的衰减至50％ 的时间。

结果表明，α-淀粉酶的最适反应温度为75℃(图5A)，在65℃ 以下保持较好的稳定性(图5B)，α-淀粉酶在60℃、65℃、70℃时 半衰期分别为309.2min、57.3min、12.9min(图5C)。

3)底物特异性

分别以可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、α-环糊精、 β-环糊精和γ-环糊精为底物测其底物特异性，底物浓度均为10 mg/mL，反应条件中缓冲液为50mM PB(pH6.0)、75℃、反应10min。 以可溶性淀粉为底物时的酶活为100％，不同底物条件下的相对酶活 力结果如表3所示。

表3 RmAmyA的底物特异性

结果表明，以直链淀粉为底物时，该酶表现出相对较高的酶活力， 对支链淀粉和γ-环糊精表现的酶活力明显降低，对普鲁兰糖和β-环糊 精表现出较低的水解能力，该酶不能水解α-环糊精。

4)水解特性

对可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、麦芽糊精、β- 环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖进行 水解。水解条件：底物浓度均为10mg/mL，溶于50mM PB(pH 6.0) 缓冲液中，酶添加量为2.5U/mL，55℃水浴反应12h，定时取样。 TLC条件：硅胶板(60F 254，E.Merk，德国)在正丁醇-乙酸-水(2:1:1) 展层剂中展层2次，在其表面均匀喷洒5％硫酸甲醇溶液，吹干后在 130℃显色。以麦芽寡糖的混合物为标准品。该酶水解淀粉类底物的 历程结果如图6所示，水解麦芽寡糖的历程结果如图7所示。

该酶水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糊精、β-环糊 精和γ-环糊精时，水解产物主要为麦芽糖，有少量葡萄糖产生。该酶 能水解普鲁兰糖，但酶活较低，水解速度较为缓慢，水解产物主要是 麦芽糖和葡萄糖，无潘糖产生。该酶水解麦芽寡糖过程中有大于水解 物本身的麦芽寡糖产生，说明该酶具有一定的转糖苷活性。

实施例3.α-淀粉酶在馒头中的应用

一、馒头的制作方法

称取500g面粉放入和面机中，将4g酵母溶于235g水中，将 水倒入面粉中，低速搅拌使面粉成团，高速搅拌3min。将面团分割 成100g/个，将面团搓圆，放入38℃、80％相对湿度的醒发箱中醒发 45min，醒发完后放入蒸锅中蒸15min。RmAmyA添加量为0.25-1.25 ppm(mg/Kg面粉)。

二、馒头高径比和比容测定

比容：将蒸好的馒头放在室温下冷却1h后，用天平称量馒头的 质量，用菜籽排体积法测量馒头的体积，馒头的比容为体积与质量的 比值。

高径比：用游标卡尺测量馒头的直径和高度，馒头的高径比为馒 头的高度与直径的比值。

该酶对馒头比容和高径比的影响如图8所示。该酶添加量为1.0 ppm时，馒头的比容最大，比对照增大7.7％。该酶添加量为0.5ppm 时，馒头的高径比最大。

三、馒头老化测定

将馒头放在4℃条件下储藏，在储藏的不同时间点测馒头的硬度。

硬度测量：将馒头切成20mm的馒头片，采用FTC质构仪的圆 柱形探头，采用二次咀嚼模式测量馒头的质构，探头下降速度和上升 速度为1mm/s，形变量为30％。

该酶对馒头储藏期间硬度的影响如图9所示。随着储藏时间延 长，所有的馒头硬度都增加，在2d内硬度增加速度最快；同一储藏 时间，随该酶添加量增加，馒头的硬度逐渐减小，说明该酶对抑制馒 头老化有效果。

实施例4.α-淀粉酶在制备麦芽糖浆中的应用

一、α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响

在温度60℃、自然pH(pH 5.9)条件下，按照液化液质量分别 添加α-淀粉酶80、85、90、95、100、105和110U/g，水解8h，HPLC 检测麦芽糖的含量。HPLC检测条件为：氨基键合柱，柱温45℃；流 动相：乙腈:水＝60:40，流速1mL/min，进样体积10μL，糖化液过 0.22μm滤膜。液化液水解后的糖化液中的麦芽糖含量计算方法如下：

干物质质量测定：阿贝折光仪直接测定。

α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响如图10所示。加酶量为95 U/g时，麦芽糖含量达到最大，为52.3％，此时的水解率为63.1％。

二、糖化温度对麦芽糖含量的影响

在自然pH(pH 5.9)，加酶量为95U/g时，分别在温度55℃、 60℃、65℃、70℃和75℃条件下水解8h，HPLC检测麦芽糖含量， 检测和计算方法同步骤一。糖化温度对麦芽糖含量的影响如图11所 示。糖化温度为70℃时，糖化液中麦芽糖含量最高，为53.7％，此时 的水解率为67.6％。

三、糖化时间对麦芽糖含量的影响

在糖化温度70℃、自然pH(pH 5.9)、加酶量95U/g条件下， 分别糖化水解4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h和24h，HPLC 检测麦芽糖含量，检测和计算条件同步骤一。糖化时间对麦芽糖含量 的影响如图12所示。糖化水解时间为16h时，麦芽糖含量达到最大， 为54.1％，此时的水解率为73.3％。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知 的现有技术。

Claims (10)

1.一种α-淀粉酶，来源于米黑根毛霉CAU432，是以下1)或2)或3)的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

2.如权利要求1所述的α-淀粉酶，其特征在于：所述3)中的蛋白质为人工合成，或先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

3.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为DNA分子或RNA分子；所述DNA为cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述RNA为mRNA或hnRNA；

所述DNA分子为以下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表序列1所示的DNA分子；

2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

所述严格条件为在0.1×SSPE，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

4.含有权利要求3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌，其特征在于：

所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点***序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA；

所述重组菌通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到；

所述宿主微生物为酵母、细菌、藻类或真菌；所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

6.如权利要求1所述α-淀粉酶的生产方法，其特征在于：所述方法是将权利要求5所述重组菌进行发酵培养，得到所述的α-淀粉酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％。

8.如权利要求7所述方法生产α-淀粉酶的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法是发酵液经透析除盐后，经DE52弱阴离子柱层析，用含有200mM NaCl的20mM PB、pH 6.0缓冲液洗脱收集得到纯的蛋白。

9.如权利要求1所述α-淀粉酶的应用。

10.如权利要求9所述α-淀粉酶的应用，其特征在于：α-淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用。