CN108165540A - 一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种米黑根毛霉α‑淀粉酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质具有α‑淀粉酶活力,该蛋白质的基因在毕赤酵母中高效表达,经毕赤酵母高密度发酵后的最高酶活为29794.2U/mL,纯化后的比酶活为3502.1U/mg,最适反应pH为6.0,在pH 4.5‑8.0保持稳定;最适反应温度为75℃,在65℃以下保持较高酶活力,具有较好的耐热性。所述酶应用于馒头中,能使馒头比容增大7.7%,同时能延缓馒头老化;应用于麦芽糖生产中,麦芽糖含量能够达到54.1%。所述酶在食品行业中具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域,具体说是一种米黑根毛霉α-淀粉 酶及其编码基因与应用。
背景技术
α-淀粉酶[EC.3.2.1.1]属于糖苷水解酶类第13家族,是作用于淀 粉分子内部切开α-1,4-糖苷键生成糊精和还原糖的一种淀粉酶,其产 物的末端残基碳原子为α构型,故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶的来源广 泛,存在于动物、植物和微生物中。微生物易培养和大规模发酵,能 够大量生产淀粉酶,部分微生物菌株已经被用作工业生产菌株。
由于α-淀粉酶的需求量日益增大,分子生物学和生物化学的发展 使基因工程技术在酶制剂方面的应用越来越多。已有多种α-淀粉酶在 大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和黑曲霉等表达*** 中成功表达。如来源于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的α- 淀粉酶BlAmy-opt在毕赤酵母中表达后,在5L发酵罐中经高密度发酵,酶活和蛋白含量分别达到8100U/mL和8.3g/L;在50L发酵罐 中经高密度发酵,酶活和蛋白含量分别达到11000U/mL和12.2g/L (Wang J,Li Y,Liu N,et al.Codon optimizationsignificantly improves the expression level of α-amylase gene from Bacilluslicheniformis in Pichia pastoris.2015,2015:1~9)。
α-淀粉酶广泛应用于食品工业中。如Rhizopus oryzae FSIS4来源 的α-淀粉酶添加到面包中,比容和高径比分别比对照增加了0.72 mL/g和0.20(Ait A,Gagaoua M,Bourekoua H,et al.Improving bread quality with the application of a newlypurified thermostableα-amylase from Rhizopus oryzae FSIS4.Foods,2017,6(1):1)。来源于埃默森篮状 菌和棒曲霉的α-淀粉酶的最适pH分别为3.5和4.5,且在30-70℃范 围酶活力较高,在淀粉糖化过程中,这两种酶可以与葡糖淀粉酶组合 用于糖化反应,以消除在糖化过程中因必须对pH和温度重新调整而 实施分批过程的需求(丹尼斯科美国公司.使用来自埃默森篮状菌 (Talaromyces emersonii)的α-淀粉酶进行糖化的方法.中国专利,201380052438.8;丹尼斯科美国公司.使用来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α-淀粉酶进行糖化.中国专利,201380024428.3)。来源 于Streptomyces badius DB-1的α-淀粉酶可以水解生淀粉,将淀粉可 以不用预糊化而直接水解,从而降低淀粉加工过程中的生产能耗,在 淀粉加工业中具有一定的应用潜力(Shivlata L,Satyanarayana T.Characteristics of raw starch-digesting alpha-amylase of Streptomyces badiusDB-1with transglycosylation activity and its applications.AppliedBiochemistry and Biotechnology,2017,181(4):1283-1303)。
α-淀粉酶除应用在食品工业中,在饲料、医药、造纸、纺织和洗 涤剂等工业上有广泛的应用。目前,虽然已有几百种α-淀粉酶被发掘, 但在各个行业中应用的α-淀粉酶的性质需求不同,因此开发一些新 型、表达量高和具有特殊特性的α-淀粉酶仍具有重要的研究意义和实 际应用价值。
米黑根毛霉是一种嗜热真菌,最早应用于工业生产凝乳酶和脂肪 酶,这两种酶在国标GB2760-2014中被允许用作食品添加剂(中华 人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760-2014.食品安全国 家标准食品添加剂使用标准.北京:中国标准出版社,2015-05-24)。 目前,关于米黑根毛霉来源的α-淀粉酶还没有报道,因此可以从中提 取α-淀粉酶基因,将其进行外源表达,研究α-淀粉酶的性质和在食 品中的应用。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷,本发明的目的在于提供一种米黑根 毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用。
为达到以上目的,本发明采取的技术方案是:
本发明提供的α-淀粉酶,GenBank编号为MG552704,英文名称 为RmAmyA,来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432,该 菌已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微 生物研究所,邮编100101)。保藏日期:2011年6月21日。保藏编 号为CGMCC No.4967。
1)序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
2)序列表序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列 组成的蛋白质;
3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
为了使1)或2)或3)中的蛋白质便于纯化,可在序列表中序 列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上 如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 | 残基 | 序列 |
Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
FLAG | 8 | DYKDDDDK |
Strep-tagⅡ | 8 | WSHPQFEK |
c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述3)中的蛋白质可人工合成,也可先合成其编码基因,再进 行生物表达得到。
上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或 几个碱基对的错义突变,和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标 签的编码序列得到。
本发明保护编码上述蛋白质的核酸分子。
其中,所述核酸分子可以是DNA分子,如cDNA、基因组DNA 或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA分子,如mRNA或hnRNA 等。
所述DNA分子为以下1)或2)或3)或4)的DNA分子:
1)序列表序列1所示的DNA分子;
2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权 利要求1所述蛋白质的DNA分子;
4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有75%以上的同一性 且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1%SDS的溶液中, 在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗 膜一次。
本发明保护含有以上任一所述编码基因的重组载体(即重组质 粒)、表达盒、转基因细胞或重组菌。
所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点***序列表中序列 1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA。
所述重组载体具体可为用序列表中序列1所示的核苷酸序列替 换载体pPIC9K的EcoRI和NotI识别序列间的片段(载体pPIC9K被 限制性核酸内切酶EcoRI和NotI切成一个大片段和一个小片段,替 换该小片段),得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA。
所述重组菌可通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到。
所述宿主微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母为巴斯 德毕赤酵母GS115。
将所述的重组载体导入巴斯德毕赤酵母中,得到重组巴斯德毕赤 酵母。
本发明的另一目的在于提供一种生产所述α-淀粉酶的方法。
所述方法是将所述重组菌进行发酵培养,得到所述的α-淀粉酶。
所述发酵培养依次经过如下步骤:
1)种子液培养:将重组菌接种到150mL BMGY培养基中,在 30℃,200rpm条件下振荡过夜培养至OD600为2-6,得到种子液;
2)基础培养:将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基 BSM的5L发酵罐中培养,所述培养温度为30℃,pH为4.0,转速 600rpm,待甘油消耗完全,进行甘油流加培养;
3)甘油流加培养:流加质量浓度为50%(w/v)的甘油,温度为 30℃,pH为5.0,通过调整流加速度保持溶氧在20%-70%,流加时 间4-6h;待菌体湿重达到180-220g/L,停止流加甘油;
4)甲醇诱导培养:停止流加甘油后,饥饿半小时,流加100% 甲醇诱导,转速800rpm,培养温度为30℃,pH为6.0,溶氧20%-70%。
本发明保护上述方法生产α-淀粉酶的纯化方法。
所述纯化方法是发酵液经透析除盐后,经DE52弱阴离子柱层析, 用含有200mMNaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液洗脱收集得到纯的 蛋白。
本发明保护所述α-淀粉酶的应用。
上述α-淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用也属于本发明的 保护范围。
本发明提供了一种来源于米黑根毛霉的α-淀粉酶及其编码基因。 该蛋白氨基酸序列与Rhizomucor pusillus来源的α-淀粉酶的氨基酸序 列相似度最高,为70%。米黑根毛霉α-淀粉酶基因在毕赤酵母中成 功表达,毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵,酶活力可达29794.2 U/mL,蛋白含量可达8.92mg/mL,实现了高效表达。所述α-淀粉酶 的分子量为51.0kDa;最适反应pH为6.0,在pH 4.5-8.0保温30min, 残余酶活力在80%以上;最适反应温度为75℃,在65℃下保持较好 的稳定性。本发明提供的α-淀粉酶添加到馒头中能够使馒头比容增大 7.7%,并能延缓馒头老化;可水解淀粉液化液生产麦芽糖浆,麦芽糖 含量可达到54.1%。本发明提供的α-淀粉酶在食品工业上具有很大应 用潜力。
附图说明
本发明有如下附图:
图1为α-淀粉酶在5L发酵罐中高密度发酵的产酶历程图(A) 和SDS-PAGE电泳图(B)(■:酶活;●:蛋白浓度;▼:菌体湿重; M:标准蛋白;0-6:发酵时间(d))。
图2为α-淀粉酶的纯化电泳图(M:标准蛋白;1:粗酶液;2: 纯酶液;3:Endo H处理后的蛋白)。
图3为SDS-PAGE法(A)和凝胶过滤法(B)测α-淀粉酶分子 量(标准蛋白:●;重组蛋白:▲)。
图4为α-淀粉酶的最适pH(A)和pH稳定性(B)测定曲线图 (▲:sodium citrate;■:sodium acetate;◆:sodium phosphate;●: MPOS;○:Tris-HCl;△:glycinate)。
图5为α-淀粉酶的最适反应温度(A)、温度稳定性(B)和半衰 期(C)测定曲线图(◆:60℃;▲:65℃;■:70℃)。
图6为α-淀粉酶水解淀粉的历程图。
图7位α-淀粉酶水解麦芽寡糖的历程图。
图8为α-淀粉酶对馒头比容和高径比的影响曲线图。
图9为α-淀粉酶对馒头储藏期间硬度的影响曲线图。
图10为α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响曲线图。
图11为糖化温度对麦芽糖含量的影响曲线图。
图12为糖化时间对麦芽糖含量的影响曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于 以下实施例。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂如分子试剂、克隆表达载体、 菌株以及发酵用原料等,如无特殊说明均可从商业途径获得。
以下实施例中α-淀粉酶酶活力的测定方法及定义如下:
在试管中加900μL 1%(w/v)的可溶性淀粉,在75℃水浴中保 温2min,加100μL用50mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液稀释适当倍数 的酶液反应10min,加1mL DNS试剂终止反应,将试管移至沸水中 煮10min,用自来水冷却至室温,在540nm下测吸光值。淀粉酶酶 活力定义:在以上条件下,每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量, 以U表示。
实施例1.米黑根毛霉α-淀粉酶在重组巴斯德毕赤酵母中的表达
一、重组菌的构建
设计上游引物RmAmyAEcoRIF:
5’-CCGGAATTCAAGCCATTGCCACTCGCTAAG-3’(下划线示 EcoRⅠ酶切位点,下划线后序列与序列表序列1中的第58-78位相匹 配);
设计下游引物RmAmyANotIR:
5’-GAATGCGGCCGCTTAAGCTCTCTGGAAAATAGCGGG-3’ (下划线示NotⅠ酶切位点,下划线后序列与序列表序列1中的第 1375-1398位相匹配);
以米黑根毛霉α-淀粉酶的cDNA为模板,PCR扩增所述蛋白的 氨基酸的编码基因序列。PCR扩增条件为:95℃预变性3min,95℃ 变性30s,57℃退火30s,72℃延伸90s,循环34次,72℃后延伸 10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。对PCR扩增产物 回收,以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,将该双酶切后的产物与经相同双酶 切过的酵母表达载体pPIC9K的载体骨架片段以T4DNA连接酶进行 连接,连接后的质粒转入DH5α感受态中,涂于LB Amp+板上,挑取 单菌落进行菌落PCR,将条带正确的菌落进行测序,比对后得到阳性 克隆。将得到的重组载体命名为pPIC9K-RmAmyA。将得到的重组载 体pPIC9K-RmAmyA以限制性内切酶SalⅠ线性化后得到电转化巴斯 德毕赤酵母GS115,构成重组菌。
二、高拷贝筛选
将步骤一中得到的重组菌涂布MD平板(1.34%YNB,4×10-5% 生物素,2%葡萄糖),从MD平板得到的His+转化子经灭菌水刮取后 取100μL涂布于不同浓度的YPD-G418平板(1%酵母提取物,2% 胰蛋白胨,2%葡萄糖,G418浓度分别为1、2和4mg/mL)。30℃下 培养3-5d后,挑取转化子于BMGY培养基(1%酵母提取物,2%胰 蛋白胨,100mM pH 6.0的PB缓冲液,1.34%YNB,4×10-5%生物素, 1%甘油)摇瓶培养16-18h,3000rpm离心5min,收集菌体,用BMMY 培养基(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,100mM pH 6.0的PB缓冲液, 1.34%YNB,4×10-5%生物素,0.5%甲醇)重悬菌体至OD600为1.0左 右,诱导目标蛋白表达。以上培养条件为100mL三角瓶装量10mL 培养基,温度30℃,转速200rpm。
三、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵
将步骤二获得产酶水平高的重组巴斯德毕赤酵母菌株在5L发酵 罐中进行高密度发酵。发酵方法及培养基(种子培养基BMGY、发 酵基本培养基BSM、甘油分批补料培养基和100%甲醇诱导培养基) 的配制参照Pichia Fermentation Process Guidelines(VersionB,053002, Invitrogen)。整个发酵过程采用种子液培养、基础培养、甘油流加培 养和100%甲醇诱导培养四个阶段。
1)种子液培养:选择摇瓶发酵中产酶水平较高的重组菌株,接 种到150mL BMGY培养基中,在30℃,200rpm条件下振荡过夜培 养至OD600为2-6,得到种子液。
2)基础培养:将步骤1)的种子液接种到5L发酵罐中(装有 1.5L发酵基本培养基BSM),发酵罐灭菌,28%浓氨水调pH 4.0,加 入PTM1 4.35mL/L起始发酵液,接种量10%,转速600rpm,温度 30℃。待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升),开始甘油流加培养阶段。
3)甘油流加培养:流加质量浓度为50%(w/v)的甘油,控制温 度为30℃,pH 5.0,始终监视溶氧,通过调整流加速度保持溶氧大于 20%。流加时间4-6h,菌体湿重达到180-220g/L,停止流加甘油。
4)100%甲醇诱导培养:停止流加甘油后,饥饿30min左右,流 加100%甲醇诱导,转速800rpm,监控溶氧大于20%,控制温度30℃, pH 6.0。
发酵过程中取样测菌体湿重、蛋白质含量和酶活力。发酵过程中 菌体湿重、蛋白含量和酶活力变化如图1A所示,发酵过程中蛋白的 SDS-PAGE电泳图如图1B所示。高密度发酵120h时酶活达到最高, 发酵上清液酶活为29794.2U/mL,蛋白浓度为8.92mg/mL。
实施例2.α-淀粉酶的纯化和酶学性质
一、α-淀粉酶的纯化
将发酵液于4℃、10000rpm离心10min,取上清置于20mM PB (pH 6.0)缓冲液中在4℃下透析过夜,透析后的酶液于4℃、10000 rpm离心10min。处理后的酶液进行DE52弱阴离子柱纯化。层析柱 预先用20mM PB(pH 6.0)缓冲液平衡,流速为0.5mL/min;将酶 液以0.5mL/min流速上样;用20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子 至OD280小于0.1,流速为1.0mL/min;用含有100mM NaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD280小于0.1,流速为1.0mL/min; 用含有200mM NaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD280小于0.1,流速为1.0mL/min,收集洗脱后的溶液,并用SDS-PAGE 电泳检测蛋白纯度,结果如图2所示。α-淀粉酶的纯化结果见表2。 用SDS-PAGE法和凝胶S-100层析法测α-淀粉酶的分子量,结果如 图3所示。
表2α-淀粉酶的纯化表
由SDS-PAGE(图3A)和凝胶S-100(图3B)分析,变性状态 下去糖基化后的蛋白分子量为49.6kDa,活性状态下的蛋白分子量为 51.0kDa,与预测分子量50.2kDa接近。
二、α-淀粉酶的酶学性质
1)最适反应pH及pH稳定性
最适反应pH在50℃条件下测定,选择的pH范围及体系如下(50 mM):柠檬酸钠缓冲液(3.0-6.0),乙酸钠缓冲液(4.0-5.5),MES 缓冲液(5.5-7.0),PB缓冲液(6.0-8.0),MOPS缓冲液(6.5-8.0), Tris-HCl缓冲液(7.0-9.0),甘氨酸-NaOH缓冲液(8.5-10.5)。用以 上缓冲液代替常规测酶活用的缓冲液,比较这些缓冲体系中酶活力差 异,以最高酶活为100%。
用上述缓冲液将纯酶稀释适当倍数,在50℃保温30min,冰水 浴冷却30min后,在最适pH条件下测酶活,以未作处理的酶液做对 照,计算残余酶活。
结果表明,α-淀粉酶的最适反应pH为6.0(图4A),在pH 4.5-8.0 处理30min,残余酶活力在80%以上(图4B)。
2)最适反应温度、温度稳定性和半衰期
用50mM PB 6.0缓冲液将酶液稀释到适当倍数,分别测α-淀粉 酶在30-85℃的不同温度下的酶活,以最高酶活为100%。
用50mM PB 6.0缓冲液将酶液稀释到适当倍数,放入30-85℃的 不同温度下保温30min,放入冰水浴中冷却30min,以未做处理的酶 液做对照,计算酶的残余酶活力。
纯酶用50mM PB 6.0缓冲液稀释到适当倍数,分别置于60℃、 65℃、70℃不同温度下处理0-4h,不同时间间隔取样,以未经上述 处理的稀释后的酶液作为对照,测定α-淀粉酶酶活,计算残余酶活力 占对照酶活力的百分比,得到α-淀粉酶在不同温度下的衰减至50% 的时间。
结果表明,α-淀粉酶的最适反应温度为75℃(图5A),在65℃ 以下保持较好的稳定性(图5B),α-淀粉酶在60℃、65℃、70℃时 半衰期分别为309.2min、57.3min、12.9min(图5C)。
3)底物特异性
分别以可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、α-环糊精、 β-环糊精和γ-环糊精为底物测其底物特异性,底物浓度均为10 mg/mL,反应条件中缓冲液为50mM PB(pH6.0)、75℃、反应10min。 以可溶性淀粉为底物时的酶活为100%,不同底物条件下的相对酶活 力结果如表3所示。
表3 RmAmyA的底物特异性
结果表明,以直链淀粉为底物时,该酶表现出相对较高的酶活力, 对支链淀粉和γ-环糊精表现的酶活力明显降低,对普鲁兰糖和β-环糊 精表现出较低的水解能力,该酶不能水解α-环糊精。
4)水解特性
对可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、麦芽糊精、β- 环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖进行 水解。水解条件:底物浓度均为10mg/mL,溶于50mM PB(pH 6.0) 缓冲液中,酶添加量为2.5U/mL,55℃水浴反应12h,定时取样。 TLC条件:硅胶板(60F 254,E.Merk,德国)在正丁醇-乙酸-水(2:1:1) 展层剂中展层2次,在其表面均匀喷洒5%硫酸甲醇溶液,吹干后在 130℃显色。以麦芽寡糖的混合物为标准品。该酶水解淀粉类底物的 历程结果如图6所示,水解麦芽寡糖的历程结果如图7所示。
该酶水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糊精、β-环糊 精和γ-环糊精时,水解产物主要为麦芽糖,有少量葡萄糖产生。该酶 能水解普鲁兰糖,但酶活较低,水解速度较为缓慢,水解产物主要是 麦芽糖和葡萄糖,无潘糖产生。该酶水解麦芽寡糖过程中有大于水解 物本身的麦芽寡糖产生,说明该酶具有一定的转糖苷活性。
实施例3.α-淀粉酶在馒头中的应用
一、馒头的制作方法
称取500g面粉放入和面机中,将4g酵母溶于235g水中,将 水倒入面粉中,低速搅拌使面粉成团,高速搅拌3min。将面团分割 成100g/个,将面团搓圆,放入38℃、80%相对湿度的醒发箱中醒发 45min,醒发完后放入蒸锅中蒸15min。RmAmyA添加量为0.25-1.25 ppm(mg/Kg面粉)。
二、馒头高径比和比容测定
比容:将蒸好的馒头放在室温下冷却1h后,用天平称量馒头的 质量,用菜籽排体积法测量馒头的体积,馒头的比容为体积与质量的 比值。
高径比:用游标卡尺测量馒头的直径和高度,馒头的高径比为馒 头的高度与直径的比值。
该酶对馒头比容和高径比的影响如图8所示。该酶添加量为1.0 ppm时,馒头的比容最大,比对照增大7.7%。该酶添加量为0.5ppm 时,馒头的高径比最大。
三、馒头老化测定
将馒头放在4℃条件下储藏,在储藏的不同时间点测馒头的硬度。
硬度测量:将馒头切成20mm的馒头片,采用FTC质构仪的圆 柱形探头,采用二次咀嚼模式测量馒头的质构,探头下降速度和上升 速度为1mm/s,形变量为30%。
该酶对馒头储藏期间硬度的影响如图9所示。随着储藏时间延 长,所有的馒头硬度都增加,在2d内硬度增加速度最快;同一储藏 时间,随该酶添加量增加,馒头的硬度逐渐减小,说明该酶对抑制馒 头老化有效果。
实施例4.α-淀粉酶在制备麦芽糖浆中的应用
一、α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响
在温度60℃、自然pH(pH 5.9)条件下,按照液化液质量分别 添加α-淀粉酶80、85、90、95、100、105和110U/g,水解8h,HPLC 检测麦芽糖的含量。HPLC检测条件为:氨基键合柱,柱温45℃;流 动相:乙腈:水=60:40,流速1mL/min,进样体积10μL,糖化液过 0.22μm滤膜。液化液水解后的糖化液中的麦芽糖含量计算方法如下:
干物质质量测定:阿贝折光仪直接测定。
α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响如图10所示。加酶量为95 U/g时,麦芽糖含量达到最大,为52.3%,此时的水解率为63.1%。
二、糖化温度对麦芽糖含量的影响
在自然pH(pH 5.9),加酶量为95U/g时,分别在温度55℃、 60℃、65℃、70℃和75℃条件下水解8h,HPLC检测麦芽糖含量, 检测和计算方法同步骤一。糖化温度对麦芽糖含量的影响如图11所 示。糖化温度为70℃时,糖化液中麦芽糖含量最高,为53.7%,此时 的水解率为67.6%。
三、糖化时间对麦芽糖含量的影响
在糖化温度70℃、自然pH(pH 5.9)、加酶量95U/g条件下, 分别糖化水解4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h和24h,HPLC 检测麦芽糖含量,检测和计算条件同步骤一。糖化时间对麦芽糖含量 的影响如图12所示。糖化水解时间为16h时,麦芽糖含量达到最大, 为54.1%,此时的水解率为73.3%。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知 的现有技术。
Claims (10)
1.一种α-淀粉酶,来源于米黑根毛霉CAU432,是以下1)或2)或3)的蛋白质:
1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
2)序列表中序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
2.如权利要求1所述的α-淀粉酶,其特征在于:所述3)中的蛋白质为人工合成,或先合成其编码基因,再进行生物表达得到。
3.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子,其特征在于:所述核酸分子为DNA分子或RNA分子;所述DNA为cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述RNA为mRNA或hnRNA;
所述DNA分子为以下1)或2)或3)或4)的DNA分子:
1)序列表序列1所示的DNA分子;
2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子;
4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子;
所述严格条件为在0.1×SSPE,0.1%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
4.含有权利要求3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌,其特征在于:
所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点***序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA;
所述重组菌通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到;
所述宿主微生物为酵母、细菌、藻类或真菌;所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
6.如权利要求1所述α-淀粉酶的生产方法,其特征在于:所述方法是将权利要求5所述重组菌进行发酵培养,得到所述的α-淀粉酶。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于:所述发酵培养依次经过如下步骤:
1)种子液培养:将重组菌接种到150mL BMGY培养基中,在30℃,200rpm条件下振荡过夜培养至OD600为2-6,得到种子液;
2)基础培养:将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养,所述培养温度为30℃,pH为4.0,转速600rpm,待甘油消耗完全,进行甘油流加培养;
3)甘油流加培养:流加质量浓度为50%的甘油,温度为30℃,pH为5.0,通过调整流加速度保持溶氧在20%-70%,流加时间4-6h;待菌体湿重达到180-220g/L,停止流加甘油;
4)甲醇诱导培养:停止流加甘油后,饥饿半小时,流加100%甲醇诱导,转速800rpm,培养温度为30℃,pH为6.0,溶氧20%-70%。
8.如权利要求7所述方法生产α-淀粉酶的纯化方法,其特征在于:所述纯化方法是发酵液经透析除盐后,经DE52弱阴离子柱层析,用含有200mM NaCl的20mM PB、pH 6.0缓冲液洗脱收集得到纯的蛋白。
9.如权利要求1所述α-淀粉酶的应用。
10.如权利要求9所述α-淀粉酶的应用,其特征在于:α-淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用。
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