CN108164450B - 一种羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针是具有萘核双光子吸收单元和D‑π‑A结构的半花菁类化合物，具有双光子吸收和发射特性，能够应用于检测细胞内羧酸酯酶。实施例的实验结果表明，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针能够延长细胞和组织中检测羧酸酯酶的激发波长(800nm)，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度；同时，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针检测羧酸酯酶时稳定性强，响应时间短(为7min)，对pH不敏感，对细胞内羧酸酯酶成像具有特异性，能够在双光子激发条件下在活细胞中检测羧酸酯酶。

Description

一种羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物化学材料技术领域，尤其涉及一种羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
哺乳动物羧酸酯酶(Carboxylesterase，CaE，E.C.3.1.1.1)也叫脂族酯酶，广泛分布于哺乳动物组织和器官中，其活性中心含丝氨酸残基，能够有效的催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解。哺乳动物羧酸酯酶的主要功能可能是参与脂质运输和代谢，催化一些内源性化合物，如短链和长链酰基丙三醇、长链酰基肉毒碱和长链酰基CoA酯的水解；以及参与信号跨膜传导及保持生物膜完整性；催化药物(包括前体药物)生成相应的自由酸，参与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢。
人体内羧酸酯酶主要有hCE1和hCE2两种类型，hCE1主要存在于肝脏中，hCE2主要存在于肠道中。hCE1主要催化水解一大类外源性或内源性的底物，如脂肪酸、环境毒物和药物等，参与许多重要的生理过程，如脂质体内平衡、睾酮生成、视黄醇代谢、内质网中蛋白质的跟踪和保留等。人体内缺乏hCE1会导致多种疾病，如动脉粥样硬化、肝脂质沉着症、肥胖、高血脂以及肝癌等。另外近期研究发现，羧酸酯酶可以作为肝癌的血清标志物之一。基于羧酸酯酶的重要生理作用，检测羧酸酯酶及其活性对许多生理过程的研究及药物的疗效评价具有非常重要的科学意义和实际应用价值。
传统检测羧酸酯酶的方法有高效液相色谱法、气质联用、化学发光法及荧光法等，其中，荧光法由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。目前文献报道的检测羧酸酯酶的荧光探针中，大部分存在对pH较敏感、在细胞培养液中稳定性差、细胞穿透能力差、无法应用于活细胞或组织中成像等缺点。此外，已有可用于细胞成像的羧酸酯酶荧光探针在细胞成像中所需要的激发波长较短(<500nm)，短波长的激发光容易导致细胞光损伤，产生活性氧物质，并且组织穿透深度和成像深度较浅，限制了其在活细胞和活体成像中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供羧酸酯酶荧光探针及其制备方法和应用，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针能够在双光子激发条件下在活细胞中检测羧酸酯酶。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。
优选的，所述烷基、烷氧基和烷氨基中碳原子个数独立地为1～6。
优选的，所述芳基、芳氧基和芳氨基中芳基个数独立地为1～2。
优选的，所述羧酸酯酶荧光探针包括
本发明提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物；
(2)将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针；
式II和式III中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。
优选的，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂的混合是将乙酰氯加入到具有式II所示结构的化合物、碱性试剂和有机溶剂的混合溶液中。
优选的，所述乙酰氯的加入方式为滴加；所述滴加在-2～2℃的条件下进行。
优选的，所述步骤(2)中缩合反应的温度为75～85℃；缩合反应的时间为14～18h。
本发明提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。
优选的，所述羧酸酯酶为人***细胞内的羧酸酯酶。
本发明提供了一种具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针是具有萘核双光子吸收单元和D-π-A结构的半花菁类化合物，具有双光子吸收和发射特性，能够应用于检测细胞内羧酸酯酶。实施例的实验结果表明，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针能够延长细胞和组织中检测羧酸酯酶的激发波长(800nm)，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织穿透深度和成像深度；同时，本发明提供的羧酸酯酶荧光探针检测羧酸酯酶时稳定性强(在37℃时的PBS溶液中孵化60min荧光强度保持不变)，响应时间短(为7min)，对pH不敏感，对细胞内羧酸酯酶成像具有特异性，能够在双光子激发条件下在活细胞中检测羧酸酯酶。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为HCyNAc在PBS缓冲溶液中37℃下孵化不同时间后荧光强度的变化图；
图2为HCyNAc在不同pH值的PBS缓冲溶液中荧光强度的变化图；
图3为HCyNAc在不同浓度的羧酸酯酶存在条件下的PBS缓冲溶液中37℃下孵化不同时间后荧光强度的变化图；
图4为在10μM的HCyNAc溶液中加入不同浓度羧酸酯酶孵化后荧光发射光谱的变化图；
图5为10μM的HCyNAc溶液在567nm处荧光强度与羧酸酯酶浓度的关系及线性曲线图；
图6为在10μM的HCyNAc溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图和在10μM的HCyNAc溶液中分别加入不同竞争分子后再加入0.05U/mL的羧酸酯酶的荧光强度变化图；
图7为HCyNAc在抑制剂双(4-硝基苯基)磷酸酯存在条件下对羧酸酯酶的荧光响应情况图；
图8为羟基化合物HCyN在不同功率820nm双光子激发条件下的发射光谱图；
图9为HCyN荧光输出光谱积分面积与输入功率的对数关系图；
图10为HCyNAc与HeLa细胞37℃下孵化15min后的单光子或双光子激光共聚焦显微成像照片。
具体实施方式
本发明提供了一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。
在本发明中，所述烷基、烷氧基和烷氨基中碳原子个数优选独立地为1～6。
在本发明中，所述芳基、芳氧基和芳氨基中芳基个数优选独立地为1～2。
在本发明中，所述羧酸酯酶荧光探针优选包括
本发明提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物；
(2)将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针；
式II和式III中，R1、R2、R3和R4独立地为氢、氨基、烷基、烷氧基、烷氨基、芳基、芳氧基或芳氨基。
本发明将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物。在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物、乙酰氯和碱性试剂的摩尔比优选为1：(1.0～1.2)：(1～1.4)，更优选为1：1：1.2。本发明对于所述碱性试剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行乙酰化反应的碱性试剂即可，具体如三乙胺或吡啶。本发明对于所述有机溶剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行乙酰化反应的有机溶剂即可；具体如二氯甲烷或四氢呋喃。
在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂的混合优选是将乙酰氯加入到具有式II所示结构的化合物、碱性试剂和有机溶剂的混合溶液中。在本发明中，所述乙酰氯的加入方式优选为滴加；所述滴加优选在-2～2℃的条件下进行，更优选为0℃。本发明对于所述滴加的速率没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的滴加物料的速率即可；在本发明的实施例中，具体是以0.6mmol/min的速率进行滴加。
在本发明中，所述乙酰化反应的温度优选为20～40℃，更优选为25～35℃；在本发明的实施例中，具体是在室温下进行所述乙酰化反应，即不需要额外的加热或降温。本发明对于所述乙酰化反应的时间没有特殊的限定，通过TCL板监控具有式II所示结构的化合物完全消失即可。在本发明中，所述乙酰化反应优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。
所述乙酰化反应完成后，本发明优选将得到的乙酰化物料依次进行洗涤、干燥、浓缩和重结晶，得到具有式III所示结构的化合物。在本发明中，所述洗涤所采用的洗涤试剂优选为饱和食盐水；所述洗涤的次数优选为2～5次，更优选为3～4次。本发明优选将所述洗涤后所得有机相进行干燥；本发明对于所述干燥所采用的干燥剂没有特殊的限定，采用本领域技术熟知的干燥剂即可，具体如无水硫酸钠。本发明优选将所述干燥后所得有机物料进行浓缩；本发明对于所述浓缩没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩的技术方案即可；在本发明的实施例中，具体是通过旋转蒸发将干燥后所得干燥物料浓缩至固体。本发明优选将所述浓缩后所得浓缩物料进行重结晶；在本发明中，所述重结晶所采用的重结晶试剂优选为乙酸乙酯和石油醚的混合物；所述重结晶试剂中乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1：(35～45)，更优选为1：40。
得到具有式III所示结构的化合物后，本发明将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针(HCyNAc)。在本发明中，所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物的摩尔比优选为1：(1～1.2)。在本发明中，所述有机溶剂优选为乙腈、甲苯、乙酸或乙醇，更优选为乙醇。
在本发明中，所述缩合反应的温度优选为75～85℃，更优选为80℃；缩合反应的时间优选为14～18h，更优选为16h。本发明对于提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的保护气体即可，具体如氮气。
所述缩合反应完成后，本发明优选将得到的缩合物料与***混合，析出红色固体，得到固液混合物料；将所述固液混合物料进行固液分离，将所得红色固体物料依次进行洗涤和干燥，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针。在本发明中，所述缩合物料与***的体积比优选为1：(5～7)，更优选为1：(5.5～6.5)。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可；在本发明的实施例中，具体采用抽滤实现所述固液分离。在本发明中，所述洗涤所采用的洗涤试剂优选为***；所述洗涤的次数优选为2～5次，更优选为3～4次。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述真空干燥的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；所述真空干燥的时间为5～7h，更优选为6h。
本发明提供了上述技术方案所述羧酸酯酶荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。在本发明中，所述羧酸酯酶优选为人***细胞内的羧酸酯酶。在本发明中，所述羧酸酯酶荧光探针是具有萘核双光子吸收单元和D-π-A结构的半花菁类化合物，具有双光子吸收和发射特性：
在本发明中，以(HCyNAc)为例，所述羧酸酯酶荧光探针的检测机制如下：
在HCyNAc中有一个正电荷的盐，赋予了HCyNAc一定的水溶性，因此，HCyNAc可以用于水样或生物样本中的检测，简单实用。
在本发明的实施例中，以HCyNAc为例，具体是在2mLPBS缓冲溶液(pH值为7.4)中加入20μLHCyNAc的二甲基亚砜(DMSO)溶液(1mM)，得到10μM的HCyNAc溶液，然后分别加入不同浓度的羧酸酯酶的PBS溶液，在37℃下孵化7min后，测定加入不同浓度羧酸酯酶后所得溶液的荧光发射光谱(Ex＝443nm)，以567nm处的荧光强度为纵坐标、羧酸酯酶的浓度为横坐标建立HCyNAc对羧酸酯酶检测的线性曲线，如图5所示。所述线性曲线具体为y＝2.01+1.98x，567nm处的荧光强度对于羧酸酯酶的浓度的线性响应在0.02～0.07U/mL(R2＝99.9％)之间。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
按以下反应流程制备羧酸酯酶荧光探针：
(1)将化合物1(172.2mg,1mmol)、三乙胺(121.4mg,1.2mmol)和二氯甲烷(无水级)混合，将乙酰氯(94.2mg,1.2mmol)在0℃下2min内滴入所得混合溶液中，在室温下搅拌进行乙酰化反应，用TCL板监控反应进程直至化合物1完全消失；将所得乙酰化物料用饱和食盐水洗涤3次，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩至固体后用乙酸乙酯和石油醚的混合物(乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:40)进行重结晶，得到白色固体。
经计算产率为92％；
对所得白色固体进行表征，具体数据如下：
1HNMR(400MHz,DMSO)δ10.15(s,1H),8.61(s,1H),8.22(d,J＝8.9Hz,1H),8.06(d,J＝8.5Hz,1H),7.92(dd,J＝8.5,1.1Hz,1H),7.81(d,J＝1.9Hz,1H),7.47(dd,J＝8.8,2.2Hz,1H),2.35(s,3H)。
根据上述表征数据可知，所得白色固体为化合物2所示结构。
(2)将化合物2(214.2mg,1.0mmol)和1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物(301.2mg,1.0mmol)与乙醇混合，在氮气保护下80℃回流进行缩合反应16h；将所得缩合物料冷却后，加入***(30mL)进行重结晶，得到红色固体。
经计算产率为94％；
对所得红色固体进行表征，具体数据如下：
1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.77(s,1H),8.59(d,J＝16.4Hz,1H),8.39(d,J＝8.7Hz,1H),8.10(d,J＝8.8Hz,2H),7.94–7.87(m,2H),7.85–7.78(m,2H),7.68–7.61(m,2H),7.46(dd,J＝8.8,2.2Hz,1H),4.20(s,3H),2.36(s,3H),1.84(s,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ181.93,168.94,153.18,150.51,142.91,141.20,135.66,133.09,131.24,130.51,130.14,129.03,128.49,128.04,123.61,121.96,121.92,118.06,114.12,111.86,52.00,33.29,24.28,19.01.HRMS(MALDI-TOF)m/z:[M]+calcd for C25H24NO2 +,370.1802,found:370.1817.
根据上述表征数据可知，所得白色固体为HCyNAc。
实施例2
对实施例1制备的羧酸酯酶探针进行性能测试，具体如下：
羧酸酯酶探针的稳定性测定：在2mLPBS缓冲溶液(pH值为7.4)中加入20μL HCyNAc的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的HCyNAc溶液，所得溶液在37℃下孵化不同的时间(10、15、20、25、30、40、50、60min)，测定所述溶液的荧光强度随孵化时间的变化情况。图1为HCyNAc在PBS缓冲溶液中37℃下孵化不同时间后的荧光强度的变化图，从图1可知，荧光强度基本保持不变，说明羧酸酯酶探针的稳定性较好。
羧酸酯酶探对pH的敏感性测定：在2mL PBS缓冲溶液(pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)中加入20μLHCyNAc的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的HCyNAc溶液，然后加入0.05U/mL的羧酸酯酶，所得混合溶液在37℃下孵化7min后，测定所述混合溶液的荧光强度随PBS缓冲溶液pH值的变化情况。图2为HCyNAc在不同pH值的PBS缓冲溶液中荧光强度的变化图，由图2可知，羧酸酯酶对pH不敏感。
羧酸酯酶探针的响应时间测定：在2mL PBS缓冲溶液(pH值为7.4)中加入20μLHCyNAc的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的HCyNAc溶液，然后加入0.05U/mL的羧酸酯酶，所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、9、12、15、18、21min)，测定所述混合溶液的荧光强度随孵化时间的变化情况。图3为HCyNAc在不同浓度的羧酸酯酶存在条件下的PBS缓冲溶液中37℃下孵化不同时间后荧光强度的变化图，由图3可知，7min后，荧光强度基本达到饱和，这说明羧酸酯酶探针响应时间较短，仅为7min。
羧酸酯酶探针的荧光滴定测试：在2mLPBS缓冲溶液(pH值为7.4)中加入20μLHCyNAc的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的HCyNAc溶液，然后分别加入不同浓度的羧酸酯酶的PBS溶液，在37℃下孵化7min后，测定加入不同浓度羧酸酯酶后所得溶液的荧光发射光谱(Ex＝443nm)，以567nm处的荧光强度为纵坐标、羧酸酯酶的浓度为横坐标建立HCyNAc对羧酸酯酶检测的线性曲线。图4为在10μM的HCyNAc溶液中加入不同浓度羧酸酯酶孵化后荧光发射光谱的变化图；图5为10μM的HCyNAc溶液在567nm处荧光强度与羧酸酯酶浓度的关系及线性曲线图，所述线性曲线具体为y＝2.01+1.98x，荧光强度对于羧酸酯酶的浓度的线性响应在0.02～0.07U/mL(R2＝99.9％)之间。
羧酸酯酶探针的选择性测试：在2mL PBS缓冲溶液(pH值为7.4)中加入20μLHCyNAc的DMSO溶液(1mM)，得到10μM的HCyNAc溶液，分别加入100μM的NaCl、MgCl2、双氧水、过氧化叔丁醇(TBHP)、牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶，或者50μM的精氨酸、丝氨酸、Vc，或者12.8U/mL的谷胱甘肽还原酶，所得混合溶液分别在37℃下孵化7min，然后测定混合溶液的荧光发射光谱(Ex＝443nm)。图6为在10μM的HCyNAc溶液中分别加入不同竞争分子后的荧光强度变化图(黑色柱子)；在10μM的HCyNAc溶液中分别加入不同竞争分子后再加入0.05U/mL的羧酸酯酶的荧光强度变化图(白色柱子)；其中，1-羧酸酯酶、2-NaCl、3-MgCl2、4-双氧水、5-TBHP、6-葡萄糖、7-Vc、8-丝氨酸、9-精氨酸、10-BSA、11-溶菌酶、12-谷胱甘肽还原酶。由图6可知，除羧酸酯酶外的其它生物分子与HCyNAc反应前后的荧光强度均没有明显增强同时在上述干扰分子的存在条件下，再加入羧酸酯酶孵化7min过后分别测定HCyNAc反应前后的荧光强度，发现荧光均有明显增强，说明HCyNAc可以选择性识别羧酸酯酶，并且不受其它生物常见分子的干扰。图7为HCyNAc在抑制剂双(4-硝基苯基)磷酸酯(BNPP)存在条件下对羧酸酯酶的荧光响应情况图，其中，1-HCyNAc、2-HCyNAc+羧酸酯酶、3-HCyNAc+羧酸酯酶+0.5mM BNPP。由图7可知，不加入羧酸酯酶抑制剂BNPP时，HCyNAc与羧酸酯酶孵化7min后，荧光强度明显增强；但是加入羧酸酯酶抑制剂BNPP后，再加入HCyNAc和羧酸酯酶孵化7min过后，荧光强度不再增强，说明HCyNAc的荧光增强确实是因为与羧酸酯酶的特异性响应引起的。
实施例3
对实施例1制备的羧酸酯酶探针的双光子性质进行测定，HCyNAc被酶水解后生成HCyN，测定HCyN是否具有双光子吸收和发射性质是该羧酸酯酶探针能够用于双光子细胞成像的基础，具体如下：
(1)选择荧光素作为参比物，将其溶于氢氧化钠水溶液(pH＝11)中配制成0.05μmol/L的标准溶液；将HCyN配制成50μmol/L的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液；
(2)分别取3mL步骤(1)中所得两种溶液，在SP-5W掺钛蓝宝石飞秒脉冲激光器上固定激发功率为200mW，改变激发波长从740nm到880nm，分别测定两种溶液的双光子发射光谱；
(3)固定激发波长为820nm，改变激发功率从50mW到290mW，分别测定步骤(1)中所得两种溶液的发射光谱；
(4)按照如下公式计算双光子截面：
公式中δ为HCyN的双光子吸收截面，δref为荧光素的双光子吸收截面，Ф为HCyN的荧光量子产率，Фref为荧光素的荧光量子产率，c为HCyN的浓度，cref为荧光素的浓度，n为HCyN溶液的折光率，nref为荧光素溶液的折光率，F为HCyN的发射峰积分面积，Fref为荧光素的发射峰积分面积。
图8为羟基化合物HCyN在不同功率820nm双光子激发条件下的发射光谱图，图9为HCyN荧光输出光谱积分面积与输入功率的对数关系图；由图8和图9可知，HCyN具有双光子吸收和发射能力。
实施例4
对人***细胞(HeLa)内羧酸酯酶荧光成像情况进行测试，具体如下：
HeLa细胞经过复苏接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养，然后在18mm盖玻片上培养24h，待用。
将培养后的HeLa细胞浸入含5μM HCyNAc的培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养15min后，倒出培养基，用新鲜培养基清洗细胞3遍；分别在激光共聚焦荧光显微镜下观察，并分别用405nm作为单光子激发光源和800nm作为双光子激发光源，对其进行明场和暗场下拍照。图10为HCyNAc与HeLa细胞37℃下孵化15min后的单光子或双光子激光共聚焦显微成像照片，其中，(A)为HCyNAc与HeLa细胞在37℃下孵化15min后的明场照片，(B)为HCyNAc与HeLa细胞在37℃下孵化15min后的单光子荧光照片，(C)为HCyNAc与HeLa细胞在37℃下孵化15min后的双光子荧光照片，(D)为(A)、(B)与(C)的叠加图，(E)为抑制剂BNPP与HeLa细胞在37℃下孵化30min后再与HCyNAc孵化15min的明场照片，(F)为抑制剂BNPP与HeLa细胞在37℃下孵化30min后再与HCyNAc孵化15min的单光子荧光成像照片，(G)为抑制剂BNPP与HeLa细胞在37℃下孵化30min后再与HCyNAc孵化15min的双光子成像照片，(H)为(E)、(F)与(G)的叠加图。由图10可知，HCyNAc仅在HeLa细胞中呈现强的荧光信号，而同样条件下，在与抑制剂BNPP预先孵化30min的HeLa细胞中荧光较弱，说明HCyNAc对细胞内羧酸酯酶成像具有特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种羧酸酯酶荧光探针，具有式I所示结构：
式I中，R1、R2、R3和R4为氢。
2.权利要求1所述羧酸酯酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂混合进行乙酰化反应，得到具有式III所示结构的化合物；
(2)将所述具有式III所示结构的化合物与1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物、有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式I所示结构的羧酸酯酶荧光探针；
式II和式III中，R1、R2、R3和R4为氢。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中具有式II所示结构的化合物、乙酰氯、碱性试剂和有机溶剂的混合是将乙酰氯加入到具有式II所示结构的化合物、碱性试剂和有机溶剂的混合溶液中。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乙酰氯的加入方式为滴加；所述滴加在-2～2℃的条件下进行。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中缩合反应的温度为75～85℃；缩合反应的时间为14～18h。
6.权利要求1所述羧酸酯酶荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羧酸酯酶为人***细胞内的羧酸酯酶。
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