CN115819374B - 一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于羧酸酯酶荧光探针技术领域,公开了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针及其制备方法和应用。本发明在硫代尼罗红母体上连接了具有羟甲基苯基二甲氨基甲酸酯基团的结构,合成了一种检测羧酸酯酶的小分子荧光探针。该荧光探针本身由于PET效应不发出荧光,当与羧酸酯酶反应后,氨基甲酸酯结构水解释放出羟基,进一步的氯代苯环结构发生自消除,荧光团部分重新恢复荧光,从而实现对羧酸酯酶的特异性检测。本发明的荧光探针为近红外荧光探针,避免了生物大分子的背景干扰,具有较高的灵敏度,可在微酸以及中性环境中检测羧酸酯酶,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及羧酸酯酶荧光探针技术领域,尤其涉及一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
羧酸酯酶(Carboxylesterases,CEs)是丝氨酸水解酶多基因家族的重要成员之一,参与体内多种内、外源性及药物的代谢过程,其主要对包含酯键、酰胺类、氨基甲酸酯和硫代酸酯类结构进行水解。以其氨基酸序列的同源性,CEs分为六个亚型(CEs1-6),其中人体内最常见为CEs1和CEs2。CEs在体内分布广泛,主要表达于肺、肝脏、肠、肾、皮肤等组织。CEs作用底物广泛,对维持机体正常生理功能具有重要作用。
肝细胞癌(HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,是一种高度侵袭性的肝脏恶性肿瘤,也是癌症相关死亡的主要原因,其发病率和死亡率呈逐渐升高的趋势。HCC的快速发展和早期转移往往导致预后不良。事实上,HCC的早期鉴别可以显著改善HCC患者的预后,特别是生存率。然而,到目前为止,肝癌高危人群的早期发现仍然是一个巨大的挑战。目前已使用放射技术,如超声(US),计算机断层扫描(CT)和磁共振成像对HCC进行诊断和筛查,但这些方法对于频繁的检测是不切实际的,并且涉及辐射暴露,因此仍迫切需要一种有效的方法来精确诊断。目前,生物标志物的检测常常作为反映异常情况的标志,用以早期癌症的检测。有研究表明,羧酸酯酶在肝脏中特异性表达,可以作为HCC潜在的血清标记物。因此构建一种检测羧酸酯酶的荧光探针有望成为指示HCC严重程度或是否存在的有效工具。
目前荧光探针技术已逐渐趋于成熟,利用其具有高灵敏度、高选择性、非侵入性和高时空分辨率等特点,已成为实现体内酶活性选择性成像的有力手段,且已经普遍应用于癌症的准确诊断和治疗。设计基于羧酸酯酶的荧光探针具有广阔的应用领域。虽然已有文献报道了一些可用于细胞内羧酸酯酶检测的荧光探针,但大多数的荧光探针存在选择性差、灵敏度低等问题。作为荧光探针中不可缺少的结构,识别部分与酶的相互作用对探针的选择性和敏感性起着极其重要的作用。然而,目前,除了丁酰胆碱酯酶(BChE)和乙酰胆碱酯酶(AChE)外,酯键(如乙酰基)仍是构建羧酸酯酶活性荧光探针的主要识别部分,这在一定程度上导致潜在的相互干扰。
因此,如何提供一种选择性高、灵敏度高的荧光探针对羧酸酯酶的检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针及其制备方法和应用,解决现有技术的荧光探针存在的上述问题。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针,其结构通式如下所示:
其中,R1为卤素;R2为氨基甲酸酯。
本发明还提供了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将化合物1、1,6-萘二酚、无水甲醇混合,回流反应一定时间后加入碳酸银,继续回流反应,得到化合物2;
(2)将化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷混合,室温反应,得到化合物4;
将化合物4、甲醇混合,于冰浴条件下加入硼氢化钠进行反应,得到有机相;将有机相和三溴化磷混合,室温反应,得到化合物5;
(3)将化合物2、四氢呋喃混合,于冰浴条件下加入氢化钠进行反应,然后加入化合物5,继续于冰浴条件下进行反应,得到近红外羧酸酯酶小分子荧光探针;
其中,化合物1为化合物2为/>化合物3为化合物4为/>化合物5为/>
步骤(1)和步骤(2)没有顺序限制。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(1)中化合物1、1,6-萘二酚、碳酸银、无水甲醇的摩尔体积比为1mmol:1~3mmol:1~2mmol:50~70mL。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(1)中将化合物1、1,6-萘二酚、无水甲醇混合后回流反应的时间为3~10min;加入碳酸银后回流反应的时间为3~5h。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(2)中化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷的摩尔体积比为10mmol:7~15mmol:10~20mmol:20~50mL。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(2)中化合物4、硼氢化钠、三溴化磷、甲醇的摩尔体积比为1~6mmol:10~20mmol:1~12mmol:10~30mL。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(2)中将化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷混合后室温反应的时间为2~6h;
加入硼氢化钠进行反应的时间为50~80min;
将有机相和三溴化磷混合后室温反应的时间为8~20h。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(3)中化合物2、化合物5、氢化钠、四氢呋喃的摩尔体积比为1~3mmol:1~5mmol:1~6mmol:5~20mL。
优选的,在上述一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法中,所述步骤(3)中加入氢化钠进行反应的时间为5~20min;加入化合物5进行反应的时间为1~3h。
本发明还提供了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明的荧光探针为近红外荧光探针,避免了生物大分子的背景干扰,具有较高的灵敏度,可在微酸以及中性环境中检测羧酸酯酶,具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为荧光探针YDZ-1检测CEs的反应原理图;
图2为荧光探针YDZ-1与不同浓度CEs反应的荧光光谱图;
其中,A为荧光光谱图;B为CEs浓度与荧光强度线性图;
图3为不同浓度荧光探针YDZ-1与CEs反应的荧光光谱图;
其中,A为荧光光谱图;B为反应速率与荧光探针YDZ-1浓度的Michaelis-Menten动力学图;
图4为荧光探针YDZ-1与CEs在不同反应时间的荧光光谱图;
其中,A为荧光光谱图;B为反应时间与荧光强度线性图;
图5为荧光探针YDZ-1与CEs在不同pH反应的荧光光谱图;
其中,A为荧光光谱图;B为不同pH与荧光强度线性图。
具体实施方式
本发明提供了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针,其结构通式如下所示:
其中,R1为卤素;R2为氨基甲酸酯。
在本发明中,所述R1优选为氟、氯、溴、碘中的一种,进一步优选为氯、溴、碘中的一种,更优选为氯。
本发明还提供了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将化合物1、1,6-萘二酚、无水甲醇混合,回流反应一定时间后加入碳酸银,继续回流反应,得到化合物2;
(2)将化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷混合,室温反应,得到化合物4;
将化合物4、甲醇混合,于冰浴条件下加入硼氢化钠进行反应,得到有机相;将有机相和三溴化磷混合,室温反应,得到化合物5;
(3)将化合物2、四氢呋喃混合,于冰浴条件下加入氢化钠进行反应,然后加入化合物5,继续于冰浴条件下进行反应,得到近红外羧酸酯酶小分子荧光探针;
其中,化合物1为化合物2为/>化合物3为化合物4为/>化合物5为/>
步骤(1)和步骤(2)没有顺序限制。
在本发明中,所述步骤(1)中化合物1、1,6-萘二酚、碳酸银、无水甲醇的摩尔体积比优选为1mmol:1~3mmol:1~2mmol:50~70mL,进一步优选为1mmol:1.1~2.7mmol:1.2~1.9mmol:58~67mL,更优选为1mmol:2.2mmol:1.7mmol:65mL。
在本发明中,所述步骤(1)中将化合物1、1,6-萘二酚、无水甲醇混合后回流反应的时间优选为3~10min,进一步优选为5~9min,更优选为7min;加入碳酸银后回流反应的时间优选为3~5h,进一步优选为3、3.5、4、4.5或5h,更优选为4.5h。
在本发明中,所述步骤(2)中化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷的摩尔体积比优选为10mmol:7~15mmol:10~20mmol:20~50mL,进一步优选为10mmol:7.5~14.1mmol:12~19mmol:27~42mL,更优选为10mmol:11.5mmol:16mmol:36mL。
在本发明中,所述步骤(2)中化合物4、硼氢化钠、三溴化磷、甲醇的摩尔体积比优选为1~6mmol:10~20mmol:1~12mmol:10~30mL,进一步优选为2~5mmol:13~19mmol:3~9mmol:12~26mL,更优选为3mmol:16mmol:8mmol:22mL。
在本发明中,所述步骤(2)中将化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷混合后室温反应的时间优选为2~6h,进一步优选为3~5h,更优选为4h。
在本发明中,所述步骤(2)中加入硼氢化钠进行反应的时间优选为50~80min,进一步优选为56~71min,更优选为63min。
在本发明中,所述步骤(2)中将有机相和三溴化磷混合后室温反应的时间优选为8~20h,进一步优选为11~18h,更优选为14h。
在本发明中,所述步骤(3)中化合物2、化合物5、氢化钠、四氢呋喃的摩尔体积比优选为1~3mmol:1~5mmol:1~6mmol:5~20mL,进一步优选为1.2~2.6mmol:1.9~4.4mmol:2~5mmol:8~16mL,更优选为1.8mmol:3.1mmol:4mmol:13mL。
在本发明中,所述步骤(3)中加入氢化钠进行反应的时间优选为5~20min,进一步优选为7~16min,更优选为14min;加入化合物5进行反应的时间优选为1~3h,进一步优选为1、1.5、2、2.5或3h,更优选为1.5h。
本发明还提供了一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针YDZ-1,其制备方法包括以下步骤:
(1)取100mL圆底烧瓶,依次将化合物1(1mmol)和1,6-萘二酚(1.5mol)加入圆底烧瓶中,加入无水甲醇50mL溶解,回流反应5min,再快速加入碳酸银(1.5mmol),溶液快速变成紫色,继续回流反应4h,TLC检测反应完全,过滤,减压蒸干滤液,得到蓝色油状物,柱层析纯化(流动相为体积比5:1的乙酸乙酯/石油醚),得到蓝黑色固体化合物2(156mg),收率为44%;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.38(s,1H),7.98(d,J=2H,1H z),7.92(d,J=8Hz,1H),7.60(d,J=8Hz,1H),7.05(dd,J=2Hz,J=4Hz,1H),6.86(s,1H),6.84(s,1H),6.83(br,1H),6.62(s,1H),3.46(q,J=8Hz,4H),1.23(t,J=8Hz,6H).
(2)将化合物3(10mmol)置于100mL圆底烧瓶中,用30mL二氯甲烷溶解,依次加入三乙胺(15mmol)和N,N-二甲胺基甲酰氯(11mmol),室温反应4h,TLC检测反应完全,用20mL饱和氯化铵洗涤有机相3次,再用20mL饱和食盐水洗涤有机相3次,然后无水硫酸钠干燥,柱层析纯化(流动相为体积比为50:1的二氯甲烷/甲醇),得到白色固体化合物4(1.85g),收率81%;1H-NMR(400MHz,DMSO)δ7.41(s,1H),7.24(br,1H),7.20(s,1H),3.04(s,3H),2.88(s.3H).
将化合物4(5mmol)置于100mL圆底烧瓶中,用20mL甲醇溶解,在冰浴条件下,分批次加入硼氢化钠(15mmol),室温反应1h,TLC检测反应完全,缓慢滴加去离子水淬灭反应,用20mL二氯甲烷萃取反应液3次,合并有机相,将有机相使用无水硫酸钠干燥后过滤,将三溴化磷(10mmol)加入到滤液中,室温反应12h,TLC检测反应完全,加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应,用20mL饱和食盐水洗涤有机相3次,无水硫酸钠干燥,过滤,减压蒸馏,得到无水油状物化合物5,化合物5不经纯化直接进行下一步;
(3)将化合物2(2mmol)加入50mL圆底烧瓶中,用10mL四氢呋喃溶解,冰浴条件下加入NaH(2.5mmol),反应10min,加入化合物5(2.2mmol),在冰浴条件下反应2h,TLC检测反应完全,室温下加入去离子水淬灭反应,用10mL二氯甲烷萃取反应液3次,合并有机相,用10mL饱和食盐水洗涤有机相3次,无水硫酸钠干燥,过滤,蒸干,柱层析纯化(流动相为体积比30:1的甲醇/二氯甲烷),得蓝黑色固体(650mg),收率58%,即为近红外羧酸酯酶小分子荧光探针,记为YDZ-1;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.27(d,J=4Hz,1H),8.21(d,J=8Hz,1H),7.71(d,J=8Hz,1H),7.59(d,J=4Hz,1H),7.38(dd,J=8Hz,J=4Hz,1H),7.26(s,1H),7.20(dd,J=8Hz,J=4Hz,1H),6.75(dd,J=8Hz,J=4Hz,1H),6.68(s,1H),6.50(d,J=4Hz,1H),5.20(s,2H),3.46(q,J=8Hz,4H),3.14(s,3H),3.02(s,3H),1.23(t,J=8Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ179.58,159.79,153.00,149.43,147.37,137.86,137.70,137.19,135.18,134.51,129.55,129.19,127.86,127.29,127.17,126.74,126.56,123.86,118.01,116.37,112.13,107.94,104.57,68.98,44.85,36.87,36.55,31.41,30.56,29.68.
YDZ-1检测CEs的原理如图1所示。由图1可知,荧光探针YDZ-1的本身由于PET效应不发出荧光,当与CEs反应后,氨基甲酸酯结构水解释放出羟基,进一步的氯代苯环结构发生自消除,荧光团部分重新恢复荧光,从而实现对CEs的特异性检测。
YDZ-1与不同浓度CEs反应的荧光光谱测定
将YDZ-1溶解于PBS溶液(pH=7,YDZ-1的浓度为5μM)中,分别与不同浓度CEs(0、1、2、3、4、5、6U/mL)于37℃反应5h,反应的荧光光谱图如图2所示。由图2可知,当不存在CEs时,YDZ-1无明显的荧光发射峰,随着CEs浓度的增加,YDZ-1与CEs反应后,荧光强度随之增加。且CEs浓度在0~6U/mL范围内,荧光强度值与CEs浓度值成线性关系,说明该荧光探针YDZ-1可用于CEs的检测。
不同浓度YDZ-1与CEs反应的荧光光谱测定
将YDZ-1溶解于PBS溶液(pH=7)中,配制成浓度分别为0、0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2μM的YDZ-1溶液,分别与1U/mL的CEs于37℃反应5h,反应的荧光光谱图如图3所示。由图3可知,随着YDZ-1浓度的增加,其与CEs反应后在650nm处荧光强度逐渐增加,当增至一定浓度时,荧光强度增强幅度变小。将反应速率与荧光探针浓度作图,符合酶动力学曲线,说明该荧光探针YDZ-1可用于羧酸酯酶的检测。
YDZ-1与CEs在不同反应时间反应的荧光光谱测定
将YDZ-1溶解于PBS溶液(pH=7,YDZ-1的浓度为5μM)中,与1U/mL的CEs于37℃分别反应0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h,在不同反应时间的荧光光谱图如图4所示。由图4可知,随着反应时间的延长,荧光强度随之增强,因此可选取5h作为反应时间来考察YDZ-1检测CEs。
YDZ-1与CEs在不同pH值反应的荧光光谱测定
将YDZ-1溶解于PBS溶液(pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11,YDZ-1的浓度为5μM)中,分别与1U/mL的CEs于37℃反应5h,在不同pH值反应的荧光光谱图如图5所示。由图5可知,YDZ-1在弱酸条件及中性条件下,具有较高的荧光强度,因此选择pH=7为最佳反应pH值,且说明该荧光探针YDZ-1在用于检测肿瘤细胞中的羧酸酯酶时,微酸环境对该探针无影响,可用于肿瘤细胞内羧酸酯酶的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针,其特征在于,其结构通式如下所示:
2.权利要求1所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将化合物1、1,6-萘二酚、无水甲醇混合,回流反应一定时间后加入碳酸银,继续回流反应,得到化合物2;
(2)将化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷混合,室温反应,得到化合物4;
将化合物4、甲醇混合,于冰浴条件下加入硼氢化钠进行反应,得到有机相;将有机相和三溴化磷混合,室温反应,得到化合物5;
(3)将化合物2、四氢呋喃混合,于冰浴条件下加入氢化钠进行反应,然后加入化合物5,继续于冰浴条件下进行反应,得到近红外羧酸酯酶小分子荧光探针;
其中,化合物1为化合物2为/>化合物3为化合物4为/>化合物5为/>
步骤(1)和步骤(2)没有顺序限制。
3.根据权利要求2所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中化合物1、1,6-萘二酚、碳酸银、无水甲醇的摩尔体积比为1mmol:1~3mmol:1~2mmol:50~70mL。
4.根据权利要求2或3所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中将化合物1、1,6-萘二酚、无水甲醇混合后回流反应的时间为3~10min;加入碳酸银后回流反应的时间为3~5h。
5.根据权利要求4所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷的摩尔体积比为10mmol:7~15mmol:10~20mmol:20~50mL。
6.根据权利要求3或5所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中化合物4、硼氢化钠、三溴化磷、甲醇的摩尔体积比为1~6mmol:10~20mmol:1~12mmol:10~30mL。
7.根据权利要求2或5所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中将化合物3、N,N-二甲胺基甲酰氯、三乙胺、二氯甲烷混合后室温反应的时间为2~6h;
加入硼氢化钠进行反应的时间为50~80min;
将有机相和三溴化磷混合后室温反应的时间为8~20h。
8.根据权利要求7所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中化合物2、化合物5、氢化钠、四氢呋喃的摩尔体积比为1~3mmol:1~5mmol:1~6mmol:5~20mL。
9.根据权利要求2或8所述的一种近红外羧酸酯酶小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中加入氢化钠进行反应的时间为5~20min;加入化合物5进行反应的时间为1~3h。
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