CN108148127A - 一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 - Google Patents
一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108148127A CN108148127A CN201611143853.6A CN201611143853A CN108148127A CN 108148127 A CN108148127 A CN 108148127A CN 201611143853 A CN201611143853 A CN 201611143853A CN 108148127 A CN108148127 A CN 108148127A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- map3k7ip2
- antibody
- people
- terminal
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种N端特异的人MAP3K7IP2多肽以及抗体的制备方法,属于以抗体为特征的体外实验用的生物制品。N端特异的人MAP3K7IP2多肽的氨基酸序列为:STRYLYGEGDLNFS。抗人MAP3K7IP2多肽抗体按以下方法制备:(1)人MAP3K7IP2抗原表位分析;(2)人MAP3K7IP2 N端多肽合成;(3)合成多肽与载体蛋白交联;(4)制备兔抗人MAP3K7IP2多肽抗体;(5)收集、分离得到含有抗体的血清,纯化抗体,即得到抗人MAP3K7IP2多肽抗体。本发明制备的N端特异的抗人MAP3K7IP2合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好,可与天然人MAP3K7IP2发生特异性结合反应;制备成本低;纯化后的抗体可以用于免疫印迹和免疫组化。该抗体为MAP3K7IP2蛋白的基础研究,比如对MAP3K7IP2的特性、功能、表达谱和含量的分析,及其相关疾病的研究提供了一个重要的工具。
Description
1.技术领域
本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法,这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。
2.背景技术
1)MAP3K7IP2功能:先天性心脏病(Congenital heart defects(CHDs))是胎儿期因心脏及大血管发育异常而致的先天畸形,其发病率在活产婴儿中为0.4-1.2%,具体发病原因目前仍不清楚。初步研究发现,病人在第6号染色体q25区上有一个约850kb大小的关键位点缺失,同时揭示这个区域是转化生长因子β激酶1/MAP3K7结合蛋白2(TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2gene(TAB2))的基因所在。MAP3K7IP2抗体是针对TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2蛋白的特异性抗体,此发明对了解该蛋白的含量,功能及在先天性心脏病发生、发展过程中的作用及预防有着及其重要的意义(Am J Hum Genet.2010Jun;11:86(6):839-49)。
2)MAP3K7IP2抗体产品信息:经检索,市场上有MAP3K7IP2蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位跟我公司的抗原表位不同。
3)MAP3K7IP2抗体的应用:初步研究发现,先天性心脏病病人转化生长因子β激酶1/MAP3K7结合蛋白2(TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2gene(TAB2))的基因缺失,可能是致病的原因之一。MAP3K7IP2抗体是针对TGF-beta-activatedkinase 1/MAP3K7binding protein 2蛋白的特异性抗体,此发明对研究该蛋白的含量,功能及在先天性心脏病发生、发展过程中的作用,以及今后的预防有着及其重要的意义。
3.发明内容
本发明提供了一种MAP3K7IP2多肽,其序列为:STRYLYGEGDLNFS。用此多肽制备的抗MAP3K7IP2抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然MAP3K7IP2蛋白。
抗MAP3K7IP2抗体是通过以下步骤获得的:
步骤一:多肽序列的分析和设计:利用DNAstar软件对MAP3K7IP2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析,主要评估亲水性,抗原性,表面可能性,柔性区等指数,再结合过去制备抗体的实际经验,最终确定MAP3K7IP2蛋白50-63位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列,序列为STRYLYGEGDLNFS。
步骤二:多肽合成和交联:采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽,并采用质谱进行鉴定;为增强多肽的抗原性,将MAP3K7IP2多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。
步骤三:多肽免疫和抗血清制备:将交联后的MAP3K7IP2-KLH与弗氏佐剂混合乳化,在新西兰兔背部进行皮内注射免疫,并反复加强免疫,至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。
步骤四:抗体纯化:实验兔抗体效价达到标准后,采用心脏取血,分离抗血清,采用Protein A纯化全抗体后,进一步采用肽亲和纯化,得到目标抗体。
抗MAP3K7IP2抗体是通过以下步骤鉴定的:
步骤一:免疫印迹:将所获得的MAP3K7IP2抗体作为一抗,采用标准的免疫印迹方法,确认该抗体能够与变性后的天然MAP3K7IP2蛋白相互作用,可用于免疫印迹试验。
步骤二:免疫组化:将所获得的MAP3K7IP2抗体作为一抗,采用标准的免疫组化方法,用于检测组织芯片(9种人肿瘤组织),确认该抗体能够与具有天然结构的MAP3K7IP2蛋白相互作用,可用于免疫组化试验。
4.附图说明
图1为免疫印迹图(Western blot)
图2为免疫组化(IHC)图
图3为免疫组化(IHC)图
5.具体实施方式
1.多肽序列的分析和设计
利用DNAstar软件对MAP3K7IP2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析,主要评估亲水性,抗原性,表面可能性,柔性区等指数,再结合过去制备抗体的实际经验,考虑氨基酸结构复杂程度,易氧化程度,合成难度,氨基酸类别和分布等,最终确定MAP3K7IP2蛋白50-63位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列,序列为STRYLYGEGDLNFS。同时,为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化,在N末端增加一个半胱氨酸C,最终待合成多肽序列为C-STRYLYGEGDLNFS。
2.多肽合成和交联
采用ACT396全自动多通道多肽合成仪,按照编制好的程序自动合成目的多肽,将合成后的多肽溶于50%乙腈,采用质谱仪进行鉴定,确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联:取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中;取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中,用3M NaOH调pH值7左右。在混匀情况下,把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中,室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB,pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中,收集浅灰色洗脱液,即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解待2mg交联多肽,把0.2体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中,调pH值到7.3,室温振摇4小时,-70℃冷冻后,用冻干机冻干24小时后备用。通过Ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率。
3.多肽免疫和抗血清制备
将交联好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中,加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月,体重1.75-2.25Kg的健康新西兰兔进行免疫,进行背部皮内注射免疫,至少要注射20点以上。首次免疫3周后,将300μg多肽溶于300μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中,与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫,作为第一次加强免疫,要求背部皮内注射免疫,至少要注射15点以上。第二次免疫3周后,进行第二次加强免疫,方法和要求同第一次加强免疫。1周后,采用耳缘静脉微量取血,用未交联的合成多肽包被酶标板,间接ELISA法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定,直至血清效价达到1∶60000以上,采用心脏取血,标准方法获得抗血清。
4.抗体亲和纯化
(1)、TIgG纯化:用移液器将50%的Protein-A Sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中,去掉顶盖和底帽,液体流出后的柱床体积即为5ml,然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml,与2ml PBS混合后加入30ml层析柱中,旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时,让血清样品流出。再用15ml纯化洗液洗层析柱3次,加入10ml洗脱液进行洗脱。
(2)、肽亲和纯化:在层析柱中加入1ml Sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶),待柱内液体流干,用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的MAP3K7IP2多肽,并加入层析柱,再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中,室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液冲洗层析柱,然后加入3ml封闭液,室温混匀1小时。冲洗层析柱3次,然后向层析柱内加入6mlIgG及3ml PBS,室温颠倒混匀1小时。用PBS冲洗层析柱3次,然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜,然后4000rpm×35min离心除沉淀,收集上清。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。
抗MAP3K7IP2抗体是通过以下步骤鉴定的:
1.免疫印迹分析
按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶,将5μl蛋白浓度为5mg/ml的细胞或者组织裂解液依次加样,恒压80V约30分钟,待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时,改换160V电压,电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳,采用电转膜方法恒压100V电转80分钟转膜至PVDF膜。将所获得的MAP3K7IP2抗体作为一抗,采用浓度为1μl/ml与上述转膜得到的抗原芯片在室温下杂交1小时,然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时,采用ECL显色法进行显色,在暗室中用X片进行显色和曝光,得到免疫印迹结果。
2.免疫组织化学分析
将4%甲醛溶液固定的人肿瘤组织切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的组织块,乙醇梯度脱水后二甲苯透明30分钟,62℃石蜡浸蜡2小时后,在组织包埋机上将9种人肿瘤组织按照3×3的排列方式用石蜡进行包埋。采用标准石蜡切片方法将切好的4-5μm厚的组织芯片蜡片贴附于APES处理过的载玻片上,在烤片机60℃烤片1小时,然后在烤箱中60℃烤片6小时。采用标准免疫组化方法,室温下用100μl 10%羊血清于湿盒中封闭切片30分钟,加入100μl浓度为2-4μg/ml的MAP3K7IP2抗体,湿盒中4℃过夜,PBS清洗后加入生物素标记羊抗兔IgG于湿盒中37℃孵育30分钟,然后PBS清洗后加入HRP标记的链霉卵白素浓缩液,湿盒中37℃孵育30分钟,洗片后1%DAB显色,苏木素复染,复蓝,脱水,透明,封片,镜检,检查结果并拍照。
Claims (6)
1.一种人MAP3K7IP2多肽,其特征在于多肽的氨基酸序列为:STRYLYGEGDLNFS。
2.一种抗人MAP3K7IP2多肽的抗体制备方法,其特征在于按权利要求1所述序列合成N端修饰肽,将合成的N端修饰肽与载体蛋白交联,用交联的肽免疫动物,取免疫动物的血制备抗血清,从血清中分离纯化IgG,其中所述的N端修饰为在氨基酸序列的N端增加一个半胱氨酸残基。
3.根据权利要求2所述的抗体制备方法,其特征在于载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。
4.根据权利要求2所述的抗体制备方法,其特征在于N端修饰肽通过交联剂将其巯基与载体蛋白氨基共价交联。
5.根据权利要求2所述的抗体制备方法,其特征在于交联肽与免疫佐剂混合乳化后,在兔背部通过多点皮下注射,并经二次以上加强免疫,血清的效价大于1∶10000。
6.根据权利要求2所述的抗体制备方法,其特征在于经过硫酸铵沉淀、蛋白A亲和纯化以及肽亲和纯化可以从抗血清中获得高纯度的IgG。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611143853.6A CN108148127A (zh) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | 一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611143853.6A CN108148127A (zh) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | 一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108148127A true CN108148127A (zh) | 2018-06-12 |
Family
ID=62467685
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611143853.6A Withdrawn CN108148127A (zh) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | 一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108148127A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113896769A (zh) * | 2021-11-16 | 2022-01-07 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白spag8特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN114133442A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-04 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白spaca3特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN114349846A (zh) * | 2022-01-07 | 2022-04-15 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白or1d2特异性多肽与抗体的制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105985422A (zh) * | 2015-01-30 | 2016-10-05 | 天津奥维亚生物技术有限公司 | 一种人sh3bgr多肽及其抗体制备方法 |
-
2016
- 2016-12-05 CN CN201611143853.6A patent/CN108148127A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105985422A (zh) * | 2015-01-30 | 2016-10-05 | 天津奥维亚生物技术有限公司 | 一种人sh3bgr多肽及其抗体制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANONYMOUS: "NP_055908.1", 《GENBANK》 * |
ANONYMOUS: "Product Protocols: MAP3K7IP2 antibody tested with human Hepg2 Cells (ARP32402_P050)", 《互联网文章》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113896769A (zh) * | 2021-11-16 | 2022-01-07 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白spag8特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN113896769B (zh) * | 2021-11-16 | 2023-12-15 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白spag8特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN114133442A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-04 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白spaca3特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN114133442B (zh) * | 2021-12-02 | 2024-02-02 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白spaca3特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN114349846A (zh) * | 2022-01-07 | 2022-04-15 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白or1d2特异性多肽与抗体的制备方法 |
CN114349846B (zh) * | 2022-01-07 | 2023-12-15 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种人***膜蛋白or1d2特异性多肽与抗体的制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Nilsson et al. | Towards a human proteome atlas: high‐throughput generation of mono‐specific antibodies for tissue profiling | |
CN111732664B (zh) | 一种新型冠状病毒重组蛋白、兔-人嵌合抗体、其制备方法及应用 | |
CN110272502B (zh) | 免疫原、分泌抗心肌肌钙蛋白i单克隆抗体的杂交瘤细胞及制备方法、单克隆抗体及应用 | |
CN103360468B (zh) | 一种scd1多肽及抗鹅scd1多肽多克隆抗体的制备方法 | |
CN103940986A (zh) | 肌钙蛋白i 特定位点抗体制备及其检测试剂盒 | |
CN108148127A (zh) | 一种人map3k7ip2多肽及其抗体制备方法 | |
CN105985422A (zh) | 一种人sh3bgr多肽及其抗体制备方法 | |
CN101880316B (zh) | 一种人rbpms多肽及其抗体制备方法 | |
CN109627306B (zh) | 水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位、其抗体及应用 | |
CN109374879B (zh) | 一种羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒及其检测方法 | |
CN110317270A (zh) | 抗毒蛇pla2蛋白抗体及其应用 | |
CN112661827B (zh) | 一种桥接整合因子1的抗原肽及其抗体与应用 | |
CN108148124A (zh) | 一种人hnrpa0多肽及其抗体制备方法 | |
CN101928332A (zh) | 一种人hnrpa0多肽及其抗体制备方法 | |
KR20090058327A (ko) | 마이코플라즈마 뉴모니아성 폐렴 진단을 위한 재조합단백질 및 이를 이용한 진단 키트 | |
CN101928334B (zh) | 一种鼠Ehf多肽及其抗体制备方法 | |
CN113832132B (zh) | 一种烙铁头svmp蛋白特异性短肽、抗烙铁头svmp蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒 | |
CN108148126A (zh) | 一种人c21orf13多肽及其抗体制备方法 | |
CN104072586B (zh) | 人肾损伤分子1的检测试剂及试剂盒 | |
CN108148125A (zh) | 一种人eif4h多肽及其抗体制备方法 | |
CN105985423A (zh) | 一种人c1qb多肽及其抗体制备方法 | |
CN101928333A (zh) | 一种人eif4h多肽及其抗体制备方法 | |
CN108117593A (zh) | 一种人znf295多肽及其抗体制备方法 | |
CN108117592A (zh) | 一种人znf294多肽及其抗体制备方法 | |
CN106167793A (zh) | 一种人gtpbp9多肽及其抗体制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180612 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |