CN108138232A - 用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法 - Google Patents

用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108138232A
CN108138232A CN201680053197.2A CN201680053197A CN108138232A CN 108138232 A CN108138232 A CN 108138232A CN 201680053197 A CN201680053197 A CN 201680053197A CN 108138232 A CN108138232 A CN 108138232A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
hsa
level
nash
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680053197.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108138232B (zh
Inventor
拉斐尔·达泰尔
热纳维耶夫·科多尼耶
约翰·布罗泽克
埃米莉·普拉萨
福阿德·本苏德理克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genfit SA
Original Assignee
Genfit SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genfit SA filed Critical Genfit SA
Publication of CN108138232A publication Critical patent/CN108138232A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108138232B publication Critical patent/CN108138232B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，用于确定NASH的活性、阶段或严重性或用于将受试者分类为NASH治疗的潜在接受者或非接受者的方法，所述方法使用循环miRNA和肝损伤的其他血液循环标志物如α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、miR‑34和miR‑200。本发明还涉及一种用于实施本发明的方法的试剂盒以及在治疗NASH的方法中使用的化合物，其中将待治疗的受试者根据本发明的方法进行鉴定、评估或分类。

Description

用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法
技术领域
本发明涉及一种用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，用于确定NASH的活性、阶段或严重性或用于将受试者分类为NASH治疗的潜在接受者或非接受者的方法。本发明还涉及一种用于实施本发明的方法的试剂盒以及在治疗NASH的方法中使用的化合物，其中将待治疗的受试者根据本发明的方法进行鉴定、评估或分类。
背景技术
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是组织学上由脂肪酸积累、肝细胞损伤和类似酒精性肝炎的炎症所表征的肝的进行性疾病。NASH是从肝脂肪变性到肝硬化和肝衰竭的过程中的关键阶段。建立这个诊断必不可少的是仔细确认没有大量酒精摄入史。NASH是提交给肝病学家进行评估的患者中转氨酶升高最常见的原因之一。肥胖和2型糖尿病与NASH有关。因为这些疾病的发病率正在提高，所以预期NASH的发病率也会提高，因此，这种疾病在美国和其它国家正成为一种新兴公共问题。
虽然已经数次尝试来提出用于诊断NASH和确定NASH的活性、阶段或严重性的非侵入方法，但是迄今为止对肝活组织检查进行组织学分析仍然是区分NASH与早期脂肪变性的最佳方法。脂肪变性、小叶和门静脉炎症、气球样变性和细胞凋亡形式的肝细胞损伤以及纤维化是从活组织检查中评估的NASH的特征。但是，肝活组织检查具有多种明显的缺陷。首先，肝活组织检查中收集的材料仅代表被诊断受试者肝脏的极小部分，因此引起人们对收集的样品是否代表受试者器官整体状态的怀疑。此外，肝活组织检查是一种非常有侵入性的程序，对患者而言其可能是麻烦、令人担忧和痛苦的，并且引起对发病和死亡的担忧。最后，鉴于上述情况，不能合理地建议肝活组织检查作为用于判定普通人群或甚至有NASH风险的患者中的人是否罹患NASH和/或用于确定所述人中NASH的活性、阶段或严重性的常规程序。
因此，非常需要提供用于诊断受试者的NASH和确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的准确、非侵入手段。
发明内容
本发明基于对从超过300个高质量样品测定的大量变量的非常精细和全面的分析，所述300个高质量样品在申请者进行的临床试验(研究GFT505-212-7-NCT01694849)期间从NASH患者获得，所述分析包括获自所述患者的肝活组织检查的组织学数据。这项研究发现了指示NASH以及其严重性或阶段或活性的关键循环因子(或生物标志物)。
因此，本发明的第一方面涉及一种用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或用于确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法包含测量NASH的至少一种血液、血清或血浆循环微RNA标志物和肝损伤的至少一种其它血液、血清或血浆循环标志物的水平。
优选地，本发明的这个第一方面涉及一种用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或用于确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法包含测量至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的水平的步骤：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
在第一方面的一个特定实施方式中，所述方法包含对所述受试者的血液、血清或血浆样品实施以下测量：
(i)测定α2巨球蛋白的水平；
(ii)测定至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)测定III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)测定至少一种选自hsa-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物的水平；以及
(v)测定hsa-miR-200的水平；
其中相对于对照样品，所述水平的增加指示NASH和/或指示NASH的活性、阶段或严重性。
在本发明第一方面的另一个实施方式中：
-测量(ii)包含测定至少HbA1c的水平；和/或
-测量(iv)包含测定至少hsa-miR-34的水平。
另一方面，第一方面的方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平。
在第一方面的另一个实施方式中，从测量(i)至(v)中测定的水平计算NASH评分，并且其中基于所述NASH评分来诊断NASH和/或确定NASH阶段或活性或严重性。
在第一方面的另一个实施方式中，根据以下逻辑函数计算NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
在这个实施方式的一个特定变化形式中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
在第一方面的另一个实施方式中，高于包含在0.102至0.6465之间的阈值的NASH评分指示严重NASH或指示中等或高的NASH活性。
在这个实施方式的一个变化形式中：
k等于25.13；
a等于0.60；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45；
并且其中所述阈值包含在0.102至0.462之间，并且更特别地等于0.23。
在这个实施方式的一个替代性变化形式中：
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39；
并且其中所述阈值包含在0.2319至0.6465之间，并且更特别地等于0.4343。
本发明的第二方面涉及一种用于将受试者分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者的方法，所述方法包含测量NASH的至少一种血液、血清或血浆循环微RNA标志物和肝损伤的至少一种其它血液、血清或血浆循环标志物的水平。
优选地，本发明的这个第二方面涉及一种用于将受试者分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者的方法，所述方法包含测量至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的水平的步骤：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
在本发明第二方面的一个特定实施方式中，所述方法包含对所述受试者的血液、血清或血浆样品实施以下测量：
(i)测定α2巨球蛋白的水平；
(ii)测定至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)测定III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)测定至少一种选自以下的标志物的水平：hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)；以及
(v)测定hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平；
其中从测量(i)至(v)中测定的水平计算NASH评分，并且其中基于所述评分将受试者分类为NASH治疗的接受者或非接受者。
在第二方面的另一个实施方式中：
-测量(ii)包含测定至少HbA1c的水平；和/或
-测量(iv)包含测定至少hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)的水平。
在第二方面的另一个实施方式中，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)和hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平。
在第二方面的又另一个实施方式中，根据以下逻辑函数计算NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
在这个实施方式的一个变化形式中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
在第二方面的又另一个实施方式中，如果S高于包含在0.102至0.6465之间的阈值，则将受试者分类为所述治疗的接受者。
在这个实施方式的一个变化形式中：
k等于25.13；
a等于0.6；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45；
并且其中阈值包含在0.102至0.462之间，并且更特别地等于0.23。
在这个实施方式的一个替代性变化形式中：
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39；
并且其中阈值包含在0.2319至0.6465之间，并且更特别地等于0.4343。
本发明的第三方面涉及一种用于计算指示受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或指示受试者的NASH的活性、阶段或严重性的NASH评分的方法，其中所述评分基于至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的测量：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
在第三方面的一个实施方式中，以下(i)至(v)测量从所述受试者的血液、血清或血浆样品测定：
(i)α2巨球蛋白的水平；
(ii)至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)至少一种选自以下的标志物的水平：hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)；以及
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平。
在第三方面的一个特定实施方式中，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)和hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平，其中NASH评分根据以下逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
在这个实施方式的一个特定变化形式中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
在这个实施方式的另一个特定变化形式中：
k等于25.13；
a等于0.6；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45。
在这个实施方式的又另一个特定变化形式中：
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39。
在第四方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包含用于测定以下物质的水平的工具：
(i)α2巨球蛋白；
(ii)至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物；
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽；
(iv)至少一种选自以下的标志物：has-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)；以及
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
在一个实施方式中，第四方面的试剂盒包含用于测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)和hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平的工具。
在本发明的第五方面中，本发明涉及一种用于治疗受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包含：
(a)根据上述方法诊断受试者的NASH或确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性；
(b)基于步骤(a)向所述受试者施用NASH治疗。
在第六方面中，本发明涉及一种用于治疗受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包含：
(a)根据上述方法将所述受试者分类；
(b)如果根据步骤(a)将所述受试者分类为治疗的接受者，则向所述受试者施用NASH治疗。
在第五和第六方面的一个实施方式中，治疗包含向受试者施用式(I)化合物
其中：
X1表示卤素、R1或G1-R1基团；
A表示CH＝CH或CH2-CH2基团；
X2表示G2-R2基团；
G1和G2相同或不同，表示氧或硫原子；
R1表示氢原子；未取代的烷基；芳基；或被一个或多个卤素原子、烷氧基或烷基硫基、环烷基、环烷基硫基或杂环基取代的烷基；
R2表示被至少一个-COOR3基团取代的烷基，其中R3表示氢原子，或被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基取代或未取代的烷基。
R4和R5相同或不同，表示被一个或多个卤素原子、环烷基、杂环基取代或未取代的烷基；
或其药学上可接受的盐。
在第五和第六方面的另一个特定实施方式中，所述化合物选自：1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸以及2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙酯；或其药学上可接受的盐。
在第五和第六方面的另一个特定实施方式中，所述化合物是1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在第五和第六方面的另一个特定实施方式中，所述治疗包含向受试者施用下示表1的化合物。
其它方面和实施方式将通过以下详细描述而变得显而易见。
附图说明
图1a至1g显示了根据本发明的方法源自靴带(Bootstrap)模型(图1a)的NASH评分与现有评分的比较。
具体实施方式
本发明涉及一种用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或用于确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的方法。本发明还涉及一种将受试者分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者的方法。该分类还可以作为进一步判定受试者是否应该通过本领域已知的方法如通过进行肝活组织检查来进行NASH的进一步证实的基础。
本发明源自循环标志物的指定组的鉴定，当综合考虑时，所述循环标志物指示对NASH和/或NASH的严重性或阶段或活性进行测试的受试者的NASH和/或指示该受试者的NASH的活性、阶段或严重性。本发明特别涉及一种用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或用于确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法将循环微RNA(miRNA)与肝损伤的其它循环标志物的水平的测定组合。
此外，根据两种不同的生物统计学方法处理本发明者收集的数据来确定指示所述疾病和/或其严重性或阶段或活性的评分，从而为医师提供强大、准确且具有高度预测性的工具来容易地判定受试者是否罹患NASH或确定疾病的阶段或活性或严重性。这个评分，在以下描述中被另外称为“NASH评分”，对于有需要的从业者和受试者来说都是非常宝贵的工具，因为其允许使用非侵入程序，即不依赖于肝活组织检查，诊断NASH或确定NASH的严重性或阶段或活性。
本发明的方法包含测量至少一种作为微RNA标志物的标志物和肝损伤的至少一种其它循环标志物。本发明的方法更特别包含测量至少一种选自以下组(i)、(ii)和(iii)的标志物和至少一种选自以下组(iv)或(v)的标志物的水平。
在一个特定实施方式中，本发明的方法包含测量如下物质的水平：
-至少一种选自组(i)、(ii)和(iii)的标志物和至少一种来自各组(iv)和(v)的标志物；
-至少一种选自各组(i)和(ii)或(ii)和(iii)或(i)和(iii)的标志物，和至少一种选自组(iv)和(v)的标志物；
-至少一种选自各组(i)、(ii)和(iii)的标志物和至少一种选自组(iv)和(v)的标志物；
-以下各标志物组(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的至少一种标志物，即：
-(i)中所列的标志物；和
-至少一种(ii)中所列的标志物；和
-(iii)中所列的标志物；和
-至少一种(iv)中所列的标志物；
-(v)中所列的标志物。
所述标志物组定义如下：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
根据本发明，“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”定义为存在肝脂肪变性、肝细胞气球样变性和肝发炎。对于该疾病的这个基本定义，NASH还可以包括肝纤维化。
根据本发明，受试者是哺乳动物，特别是人类受试者。由于本发明的非侵入性质，其可以在任何受试者上实施，诸如未知或怀疑易患NASH的受试者。然而，在一个特定实施方式中，受试者是具有患NASH或将来产生NASH的风险的受试者，诸如患有肥胖症、糖尿病，罹患代谢综合征或肝酶升高，或以前诊断患有非酒精性脂肪肝病(或肝脂肪变性)的受试者。受试者还可以是患有已经鉴定的NASH的受试者，因此本发明方法可以确定该疾病向肝癌或肝移植或心血管疾病演变的风险。
本发明中测量的标志物的水平从受试者的体液测定，所述体液特别地可以是血液，更特别地是血清或血浆样品。
本发明者鉴定的标志物水平可以根据生物标志物类型(诸如蛋白质、微RNA、葡萄糖水平……)而通过本领域中众所周知的常规方法来测定，所述常规方法诸如免疫分析(例如ELISA)，或分子和生物化学分析(定量PCR、比色分析)，或分析方法(诸如质谱法)。当测试的标志物是微RNA时，其测量可以根据本领域众所周知的多种方法进行，诸如下文实施例中提供的方法。简言之，对从血浆样品，特别是无细胞、无血小板血浆样品提取的总RNA进行测量。在RNA提取之前，可以向样品中添加适当的内部对照(诸如已知序列和数量的微RNA，例如秀丽隐杆线虫(C.elegans)miR-39)。使用定量PCR测定Cq值。市售试剂盒可用于进行这些分析。例如，可以根据制造商的说明书使用Taqman miRNA qRT-PCR分析：Taqman微RNA逆转录试剂盒、TaqMan微RNA分析20X和TaqMan通用主混合物II(Applied Biosystems)。可以使用容易获得的PCR***如 PCR***9700热循环仪(Applied Biosystems)，以适当的循环参数如16℃持续30分钟，接着42℃持续30分钟和85℃持续5分钟，然后保持在4℃下，进行逆转录。可以以多重形式实施所述逆转录。然后使用定量PCR***如CFX96TM实时***(C1000TouchTM热循环仪，BioRad)，进行定量PCT。循环条件可以如下：95℃持续10分钟，接着95℃持续15秒和60℃持续60秒，总共50个循环，以及30℃持续30秒。Cq测定模型可以是定量PCR***中的回归集。在一个特定实施方式中，根据本发明方法测定的Cq值是可使用上述特定参数和材料获得的Cq值。如果样品的Cq值高于每个miRNA的标准曲线的最大Cq，则可以从分析中排除所述值。可以使用标准曲线来评定反应效率。可以从最浓的cDNA样品开始进行8个点的连续稀释来确保标准曲线覆盖研究期间可能遇到的所有可能模板浓度。可以通过绘制模板起始数量的对数与获得的Cq值的图来构建标准曲线。
根据本发明，当在组(i)至(v)的每一个中选择和测量的所有标志物水平在与从对照(或参比)样品获得的参比值相比增加时，受试者被诊断为患有NASH，或被诊断为潜在地患有NASH或可能患NASH。所述参比样品可能对应于从未患NAFLD或NASH的一个或多个受试者(例如两个以上受试者)获得的体液样品，诸如血液、血清或血浆样品。
在本发明中，如上所述测量的生物标志物的水平还可以用于确定疾病评分，或称作NASH评分。可以将疾病评分与区分低、中等和高的NASH活性或中度和严重NASH的阈值比较。根据本发明，这个信息可以有利地用来判定受试者是否将接受NASH的治疗性处理。只有那些具有中等至高NASH活性或患有严重NASH的受试者才会进行治疗。因此，本发明涉及一种用于将受试者分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者的方法，所述方法包含测定如上文所定义的标志物的水平，计算NASH评分，和基于所述NASH评分将受试者分类为治疗的接受者或非接受者。此外，受试者的分类还可以用于确定受试者中的低NASH活性或中等NASH活性，并且基于这个分类向受试者提供饮食和生活方式建议以逆转NASH。
根据本发明，那些分类为中等至高NASH活性或分类为严重NASH患者的受试者被认为是NASH治疗的接受者或潜在接受者。在本发明的上下文中，中等至高NASH活性或严重NASH患者被定义为或等同于呈现以下源自肝活组织检查的等级的患者：
-脂肪变性等级≥1
-肝细胞气球样变性等级≥1
-小叶发炎等级≥1
-NAS(NAFLD活性评分)≥4(NAS被定义为脂肪变性等级、肝细胞气球样变性等级和小叶发炎等级的和)
-纤维化阶段≥2(诸如等于2、3或4，特别是2或3的纤维化)。
在一个特定实施方式中，从如上所提供进行测量的以下标记物水平计算本发明的NASH评分：
-α2巨球蛋白的水平(LVBP_A2M_GL)；和
-HbA1c的水平(LBBC_HBA1C_PERC)；和
-III型胶原蛋白的N端前肽的水平(LVB_P3NP)；和
-hsa-miR-34(特别是miR-34a，更特别是miR-34a-5p)的水平(LVMK_HSA_MIR34A_MULTI1_CQ)；和
-hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平(LVMK_HSA_MIR200A_MULTI1_CQ)。
在另一个特定实施方式中，将该评分定义为如下逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平(例如，如果测量的HbA1c百分比是10％，则B等于10)；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200(特别是c hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
在另一个特定实施方式中，根据上述逻辑函数计算该评分，其中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
因此NASH评分是具有中等至高NASH活性或患有严重NASH的概率。如果针对受试者测定的S大于或等于阈值，则将该受试者分类为将进行NASH治疗或潜在地将进行NASH治疗。如果S低于阈值，则将该受试者分类为不进行治疗，和/或将该受试者分类为用于管控其低NASH活性或中度NASH的饮食和生活方式建议的接受者或潜在接受者。
根据一个特定实施方式，其中如果S高于或等于包含在0.102至0.6465之间的阈值，则将该受试者分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在从如本申请实验部分所述的中值模型衍生的一个特定实施方式中：
k等于25.13；
a等于0.6；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45；
并且其中阈值包含在0.102至0.462之间，并且更特别地等于0.23。
在从如本申请实验部分所述的靴带模型衍生的一个特定实施方式中，
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39；
并且其中阈值包含在0.2319至0.6465之间，并且更特别地等于0.4343。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含用于测定如下物质的水平的工具：
(i)α2巨球蛋白；
(ii)至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物；
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽；
(iv)至少一种选自以下的标志物：hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)；以及
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
在本发明的一个特定实施方式中，所述试剂盒包含用于测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是miR-34a-5p)和hsa-miR-200a(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平的工具。
适用于实施上述方法的本发明的试剂盒还可以任选地包括用于实施所述方法的说明书。所述试剂盒可以包含适合于进行以上所鉴定的标志物的水平的测量的试剂和缓冲剂。特别地，所述试剂盒可以包含本领域中众所周知的特异于待定量蛋白质的抗体和/或适用于定量微RNA水平的引物。
本发明还涉及一种用于治疗受试者的NASH的方法，所述方法包含：
(a)根据上文所提供的方法诊断受试者的NASH或确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性；
(b)基于步骤(a)向所述受试者施用NASH治疗。
本发明还涉及一种用于治疗受试者的NASH的方法，所述方法包含：
(a)根据如上文所定义的分类方法将所述受试者分类；
(b)如果根据步骤(a)将受试者分类为治疗的接受者，则向所述受试者施用NASH治疗。
本发明还涉及一种用于管控受试者的低NASH活性或中度NASH的方法，所述方法包含：
(a)根据如上文所定义的分类方法将所述受试者分类；
(b)如果根据步骤(a)将受试者分类为治疗的非接受者，则向所述受试者提供饮食和生活方式建议。
根据本发明的用于治疗NASH的方法包含向有需要的受试者施用一种或多种化合物，诸如式(I)化合物：
其中：
X1表示卤素、R1或G1-R1基团；
A表示CH＝CH或CH2-CH2基团；
X2表示G2-R2基团；
G1和G2相同或不同，表示氧或硫原子；
R1表示氢原子；未取代的烷基；芳基；或被一个或多个卤素原子、烷氧基或烷基硫基、环烷基、环烷基硫基或杂环基取代的烷基；
R2表示被至少一个-COOR3基团取代的烷基，其中R3表示氢原子，或被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基取代或未被取代的烷基。
R4和R5相同或不同，表示被一个或多个卤素原子、环烷基、杂环基取代或未取代的烷基；
或其药学上可接受的盐。
在用于治疗NASH的这种方法的一个特定实施方式中，式(I)化合物选自：1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸和2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙酯；或其药学上可接受的盐。在本发明的另一个特定实施方式中，式(I)化合物是1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
可以用于本发明的用于治疗NASH的方法中的其它化合物可以包括(但不限于)选自以下类别的化合物和表1的特定化合物。
表1
实施例
样品收集和分析
临床研究
临床试验(NASH第2阶段GOLDEN-505试验(GFT505-212-7-NCT01694849)是一项多中心随机双盲安慰剂对照研究，其用于评估每天一次艾那菲布(Elafibranor)(1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的脂肪性肝炎的功效和安全性。
在适当排除其它病因的肝病后，进行肝活组织检查来证实NASH的诊断。在随机化前6个月内，通过肝活组织检查评估，NASH被诊断为脂肪性肝炎。脂肪性肝炎的确认基于肝活组织检查的中心读取进行。NASH患者被定义为NAS≥3，包括脂肪变性等级≥1，肝细胞气球样变性≥1并且小叶发炎≥1。
该研究经每个参与中心的适当监管机构批准，并且所有患者均已同意参与医学研究。
血液采样和实验室测试
根据中心实验室方案和手册Genfit-GFT505-212-7收集血液样品。
根据该研究方案，进行以下分析。
血液学包括血红蛋白、血细胞比容、RBC计数、白细胞、白细胞分类计数(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞-绝对值和％值)、血小板和网织红细胞。
生物化学组I包括血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)、肌酸酐、肌酸酐清除率，γ-谷氨酰转移酶(GGT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酸磷酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、促甲状腺激素(TSH)和HbA1c。
生物化学组II包括血浆葡萄糖、肌酸酐、肌酸酐清除率、总蛋白、白蛋白、钠、钾、氯化物、钙、尿酸、以血液尿素氮(BUN)表示的尿素、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶(CPK)、胆红素总量、结合的胆红素、C型反应蛋白(hsCRP)、AST/ALT比率和HbA1c。
尿分析包括：
-试纸分析(比重、pH值、RBC、白细胞、葡萄糖、蛋白质、酮、胆红素、***原和亚硝酸盐)
-显微术分析包括RBC、WBC、管型、晶体、细菌、上皮细胞和酵母菌。
-化学分析(白蛋白和肌酸酐)
血清学包括HIV ab I/II、HCV ab、HCV RNA(仅在收到HCV RNA诊疗样品后和在HCVAb的结果是‘反应’或‘不确定’的情况下测试)和HbsAg。
脂质组包括甘油三酯(TG)、总胆固醇、非HDL-C(计算)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)(计算)、计算的极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)(计算)、载脂蛋白AI(ApoAI)和载脂蛋白B(ApoB)。
尿化学包括α-1-微球蛋白、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(β-NAG)和嗜中性粒细胞-明胶酶相关脂质运载蛋白(N-Gal)
安全标志物包括高半胱氨酸、NT-ProBNP、肌钙蛋白T、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和β2-微球蛋白。
血糖和其它脂类参数包括瘦素、胰岛素、稳态模型评估(HOMA-IR)、血清葡萄糖(用于计算HOMA-IR)、果糖胺，C-肽和游离脂肪酸(FFA)。
发炎标志物包括触珠蛋白、纤维蛋白原、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)Ag(柠檬酸盐)。
肝标志物包括细胞角蛋白-18(CK18)(M65和M30)、脂联素、铁蛋白、α2巨球蛋白、FGF19和FGF21、透明质酸(Advia centaur，试剂购自Siemens Belgium并且在穿透过程中被载入Genfit)、III型胶原蛋白的N端前肽(PIIINP)(Advia centaur，试剂购自SiemensBelgium)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)(Advia centaur，试剂购自Siemens)。
样品收集和储存
这项生物标志物研究中使用的血液样品来自治疗期之前的505.212.7研究的患者。从每位患者获得收集、储存和使用额外的样品的书面知情同意书。
通过在收集15分钟内利用在1,500xg下离心15分钟将无细胞血浆与血细胞分离来处理收集在含柠檬酸盐的2.7mL管中的血液。将上清液血浆转移到新管中。将管保持在-70℃下。
为进行RNA提取，接着将血浆管在13,000xg下离心2分钟来沉淀并去除血小板。将上清液无血小板血浆转移到新管中，在液氮中冷冻并且储存在-80℃下。
总RNA提取和miRNA定量
根据制造商的说明，通过miRNeasy提取试剂盒(miRNeasy血清/血浆试剂盒(目录号217184))并且使用1:5的血浆/QIAzol比率从400μl无血小板血浆中提取具有保存的miRNA的总RNA。在RNA提取之前将合成的加标秀丽隐杆线虫miR-39添加到样品[3,125fmol]中，作为RNA提取过程的内部对照。在18μl洗脱缓冲液中进行洗脱。
根据制造商的说明书，使用Taqman miRNA qRT-PCR分析：TaqMan微RNA逆转录试剂盒(参考号：4366596，Applied Biosystems,Carlsbad,CA)、TaqMan微RNA分析20X(参考号：4440887，Applied Biosystems)和TaqMan通用主混合物II(参考号：4440040，AppliedBiosystems)，检测成熟miRNA的表达。
使用 PCR***9700热循环仪(参考号：200005，Applied Biosystems)进行逆转录，其循环条件为16℃持续30分钟，接着42℃持续30分钟和85℃持续5分钟，然后保持在4℃下。将逆转录用4种miRNA特异性反向引物多重化以便保存RNA样品。
使用CFX96TM实时***(C1000TouchTM热循环仪，BioRad)进行定量PCR，其循环条件为95℃持续10分钟，然后95℃持续15秒和60℃持续60秒，总共50个循环，以及30℃持续30秒。
根据下表2选择可能关注的miRNA的特异性引物的序列。
表2：测试的miRNA的序列
用于构建算法的数据呈Cq形式。Cq测定模型是回归模型。
统计分析
目的和定义
这些分析的目的是发现能够与待治疗的NASH患者的鉴定有关的生物标志物。将待治疗(TBT)患者定义为：
·纤维化阶段≥2，并且
·NAS≥4，并且
·小叶发炎等级≥1，并且
·脂肪变性等级≥1，并且
·气球样变性等级≥1。
将其它患者陈述为不进行治疗(NTBT)。为进行分析，在反应变量中将TBT患者分类为1并将NTBT分类为0。如上所示，解释变量涵盖血液(血液学、生物化学、凝血、肝标志物、循环miRNA)或尿(试纸、沉积物)样品中测量的大量生物标志物，只要人口统计学(年龄、性别、种族)、区域(研究中心、国家、洲)或医学(糖尿病)记录即可。
数据集管理
本研究中使用的数据集来自Golden-505试验，并且最初由274名患者和121个变量构成。该数据集管理包括以下步骤：
1.去除28个没有miRNA测量值的患者
2.去除9个具有超过10个缺失值的变量
3.去除7个具有极端值的患者和28个具有剩余缺失值的患者
从而产生具有211个患者和112个变量的数据集，用于测试解释变量之间的共线性。
共线性的测试
两个两个地计算定量变量之间的皮尔森相关性(Pearson correlation)。当两个变量呈现出高于0.7的相关性时，进行所述变量平均值之差与定义患者TBT的反应变量相关的单变量检验。所选的变量是更显著的。共线和所选的变量示于表2中。
去除35个独特的共线变量，并且分析中使用的最终数据集包括77个变量(患者id、反应变量、5个组织学等级和70个解释变量)和211个患者(95个TBT和116个NTBT)。
中值模型
将数据集在2/3训练集和1/3验证集中分配100万次，根据TBT和NTBT患者分布进行分层。在这些不同的可能分配中，27,477个在所有解释变量和组织学等级中的训练集与验证集之间没有呈现显著差异并且被用于分析。
在反应变量与70个解释变量之间进行逻辑回归，接着在27,477个训练集中使用Akaike信息准则(AIC)进行变量选择。从而对于70个变量产生27,477个不同系数。通过组合中值系数不等于零的变量产生中值模型(表4)。
表4.中值模型的结果(cor：共线变量)
LVBP_A2M_GL：α2巨球蛋白；LBBC_HBA1C_PERC：HbA1c；LVB_P3NP：III型胶原蛋白的N端前肽；lvmk_hsa_mir34a_multi1_cq：miR-34a；lvmk_hsa_mir200a_multi1_cq:miR-200a。
接着通过计算27,477个集中每一个的ROC曲线下面积(AUC)来验证该模型。AUC为0.82(95％CI：0.72-0.91)。使用中值AUC，定义3个阈值来用于预测患者为TBT或NTBT：
1.最接近1-特异性＝0％并且敏感性＝100％的点的阈值等于0.23。相应的列联表如表5a中所呈现，并且产生以下指标：
·总准确性：80.28％
·敏感性：81.25％
·特异性：79.49％
·PPV(阳性预测值)：76.47％
·NPV(阴性预测值)：83.78％
2.敏感性超过90％的阈值等于0.102。相应的列联表如表5b中所呈现，并且产生以下指标：
·总准确性：63.38％
·敏感性：90.63％
·特异性：41.03％
·PPV(阳性预测值)：55.77％
·NPV(阴性预测值)：84.21％
3.特异性超过90％的阈值等于0.462。相应的列联表如表5c中所呈现，并且产生以下指标：
·总准确性：70.42％
·敏感性：43.75％
·特异性：92.31％
·PPV(阳性预测值)：82.35％
·NPV(阴性预测值)：66.67％
表5a.通过中值模型和0.23的阈值观察和预测的TBT/NTBT患者的列联表。
表5b.通过中值模型和0.102的阈值观察和预测的TBT/NTBT患者的列联表。
表5c.通过中值模型和0.462的阈值观察和预测的TBT/NTBT患者的列联表。
靴带模型
使用全部211个患者使用所有70个解释变量将逻辑回归计算为完整模型，并且通过用AIC选择变量来获得最优模型(表6)。接着使用1000个靴带样品测试变量系数的显著性(表6)。
表6.靴带模型的结果(cor：共线变量)
最重要的是，非常满意地注意到用靴带模型鉴定的变量与用上述中值模型鉴定的变量相同。这个观察结果增强了这些变量作为NASH和其阶段或严重性的预测的统计相关性和置信度。
通过计算1000个靴带样品的AUC证实所述最优模型。AUC为0.82(95％CI：0.76-0.87)。使用最优模型的AUC，定义3个阈值来用于预测患者为TBT或NTBT：
1.最接近1-特异性＝0％并且敏感性＝100％的点的阈值等于0.4343。相应的列联表如表7a中所呈现，并且产生以下指标：
·总准确性：75.36％
·敏感性：74.74％
·特异性：75.86％
·PPV：71.72％
·NPV(阴性预测值)：78.57％
2.敏感性超过90％的阈值等于0.2319。相应的列联表如表7b中所呈现，并且产生以下指标：
·总准确性：65.88％
·敏感性：90.53％
·特异性：45.69％
·PPV(阳性预测值)：57.72％
·NPV(阴性预测值)：85.48％
3.特异性超过90％的阈值等于0.6465。相应的列联表如表7c中所呈现，并且产生以下指标：
·总准确性：73.46％
·敏感性：52.63％
·特异性：90.52％
·PPV(阳性预测值)：81.97％
·NPV(阴性预测值)：70.00％
表7a.通过靴带模型和0.4343的阈值观察和预测的TBT/NTBT患者的列联表。
表7b.通过靴带模型和0.2319的阈值观察和预测的TBT/NTBT患者的列联表。
表7c.通过靴带模型和0.6465的阈值观察和预测的TBT/NTBT患者的列联表。
与其它NASH评分方法比较
以前在文献中描述了建立NASH评分的方法：
-Angulo指数(Angulo等人,2007)
-ELF(Guha等人,2008)(还参见ELF说明表http://www.healthcare.siemens.com/clinical-specialities/liver-disease/elf-test-now-avail)
-纤维测试(Fibrotest)(Ratziu等人,2006)
-纤维计(Fibrometer)(Cales等人,2009)
-FLI(Bedogni等人,2006)
-脂肪变性等级或脂肪变性测试(Poynard等人,2005)
因此，本发明者评估了本发明的NASH评分与大量的这些现有方法。图1a至1g显示了源自靴带模型(图1a)根据本发明的方法的NASH评分与现有评分的比较。
本文提供的数据显示NASH患者或潜在的NASH患者的鉴定、NASH活性、阶段或严重性的确定的准确性显著改善。这个发现非常重要，并且将成为改善患者管控效率的宝贵工具。
本文公开的其它目的
本公开特别涉及以下目的：
1.一种用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或用于确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法包含测量NASH的至少一种血液、血清或血浆循环微RNA标志物和肝损伤的至少一种其它血液、血清或血浆循环标志物的水平。
2.根据目的1所述的方法，所述方法包含测量至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的水平的步骤：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
3.根据目的1或2所述的方法，所述方法包含对所述受试者的血液、血清或血浆样品实施如下测量：
(i)测定α2巨球蛋白的水平；
(ii)测定至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)测定III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)测定至少一种选自hsa-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物的水平；以及
(v)测定hsa-miR-200的水平；
其中相对于对照样品，所述水平的增加指示NASH和/或NASH的活性、阶段或严重性。
4.根据目的2至3所述的方法，其中：
-测量(ii)包含测定至少HbA1c的水平；和/或
-测量(iv)包含测定至少hsa-miR-34的水平。
5.根据目的1或4所述的方法，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平。
6.根据目的2至5中任一项所述的方法，其中从测量(i)至(v)中测定的水平计算NASH评分，并且其中基于所述NASH评分来诊断NASH和/或确定NASH阶段或活性或严重性。
7.根据目的6所述的方法，其中根据以下逻辑函数计算NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
8.根据目的7所述的方法，其中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
9.根据目的7或8所述的方法，其中高于包含在0.102至0.6465之间的阈值的NASH评分指示严重NASH或指示中等或高的NASH活性。
10.根据目的9所述的方法，其中：
k等于25.13；
a等于0.60；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45；
并且其中所述阈值包含在0.102至0.462之间，并且更特别地等于0.23。
11.根据目的9所述的方法，其中：
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39；
并且其中阈值包含在0.2319至0.6465之间，并且更特别地等于0.4343。
12.一种用于将受试者分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者的方法，所述方法包含测量NASH的至少一种血液、血清或血浆循环微RNA标志物和肝损伤的至少一种其它血液、血清或血浆循环标志物的水平。
13.根据目的12所述的方法，所述方法包含测量至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的水平的步骤：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
14.根据目的12或13所述的方法，所述方法包含对所述受试者的血液、血清或血浆样品实施如下测量：
(i)测定α2巨球蛋白的水平；
(ii)测定至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)测定III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)测定至少一种选自hsa-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物的水平；以及
(v)测定hsa-miR-200的水平；
其中从测量(i)至(v)中测定的水平计算NASH评分，并且其中基于所述评分将受试者分类为NASH治疗的接受者或非接受者。
15.根据目的13或14所述的方法，其中：
-测量(ii)包含测定至少HbA1c的水平；和/或
-测量(iv)包含测定至少hsa-miR-34的水平。
16.根据目的13至15中任一项所述的方法，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平。
17.根据目的16所述的方法，其中根据以下逻辑函数计算NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
18.根据目的17所述的方法，其中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
19.根据目的17或18中任一项所述的方法，其中如果S高于包含在0.102至0.6465之间的阈值，则将受试者分类为治疗的接受者。
20.根据目的19所述的方法，其中：
k等于25.13；
a等于0.6；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45；
并且其中所述阈值包含在0.102至0.462之间，并且更特别地等于0.23。
21.根据目的19所述的方法，其中：
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39；
并且其中所述阈值包含在0.2319至0.6465之间，并且更特别地等于0.4343。
22.一种用于计算指示受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或指示受试者的NASH的活性、阶段或严重性的NASH评分的方法，其中所述评分基于至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的测量：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
23.根据目的22所述的方法，其中以下(i)至(v)测量从所述受试者的血液、血清或血浆样品测定：
(i)α2巨球蛋白的水平；
(ii)至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)至少一种选自hsa-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物的水平；以及
(v)hsa-miR-200的水平。
24.根据目的23所述的方法，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平。
25.根据目的24所述的方法，其中根据以下逻辑函数计算NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
26.根据目的25所述的方法，其中：
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0.001至1.02之间的数字；
c是包含在0.001至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至-0.001之间的数字；
f是包含在-0.78至-0.04之间的数字。
27.根据目的25所述的方法，其中：
k等于25.13；
a等于0.6；
b等于0.48；
c等于0.1；
d等于-0.43；并且
f等于-0.45。
28.根据目的25所述的方法，其中：
k等于21.35；
a等于0.62；
b等于0.55；
c等于0.14；
d等于-0.38；并且
f等于-0.39。
29.一种试剂盒，其包含用于测定以下物质的水平的工具：
(i)α2巨球蛋白；
(ii)至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物；
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽；
(iv)至少一种选自has-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物；以及
(v)hsa-miR-200。
30.根据目的29所述的试剂盒，所述试剂盒包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平的工具。
31.一种用于治疗受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包含：
(a)根据目的1至11中任一项所述的方法诊断受试者的NASH或确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性；
(b)基于步骤(a)向所述受试者施用NASH治疗。
32.一种用于治疗受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包含：
(a)根据目的12至21中任一项所述的方法将所述受试者分类；
(b)如果根据步骤(a)将受试者分类为治疗接受者，则向所述受试者施用NASH治疗。
33.根据目的31或32所述的方法，其中所述治疗包含向受试者施用式(I)化合物：
其中：
X1表示卤素、R1或G1-R1基团；
A表示CH＝CH或CH2-CH2基团；
X2表示G2-R2基团；
G1和G2相同或不同，表示氧或硫原子；
R1表示氢原子；未取代的烷基；芳基；或被一个或多个卤素原子、烷氧基或烷基硫基、环烷基、环烷基硫基或杂环基取代的烷基；
R2表示被至少一个-COOR3基团取代的烷基，其中R3表示氢原子，或被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基取代或未取代的烷基。
R4和R5相同或不同，表示被一个或多个卤素原子、环烷基、杂环基取代或未取代的烷基；
或其药学上可接受的盐。
34.根据目的33所述的方法，其中所述化合物选自：1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸和2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙酯；或其药学上可接受的盐。
35.根据目的33或34所述的方法，其中所述化合物为1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
36.根据目的31或32所述的方法，其中所述治疗包含向所述受试者施用表1的化合物。
参考文献
Angulo P,Hui JM,Marchesini G,Bugianesi E,George J,Farrell GC,EndersF,Saksena S,Burt AD,Bida JP,Lindor K,Sanderson SO,Lenzi M,Adams LA,Kench J,Therneau TM,Day CP(2007)NAFLD纤维化分数：一种鉴别NAFLD患者的肝纤维化的非侵入***(The NAFLD fibrosis score:a noninvasive system that identifies liverfibrosis in patients with NAFLD).Hepatology45:846-854
Bedogni G,Bellentani S,Miglioli L,Masutti F,Passalacqua M,CastiglioneA,Tiribelli C(2006)脂肪肝指数：在一般人群中的肝脂肪变性的一种简单且准确的预示物(The Fatty Liver Index:a simple and accurate predictor of hepatic steatosisin the general population).BMC Gastroenterol6:33
Cales P,Laine F,Boursier J,Deugnier Y,Moal V,Oberti F,Hunault G,Rousselet MC,Hubert I,Laafi J,Ducluzeaux PH,Lunel F(2009)用于NAFLD特异性或非特异性肝纤维化的血液试验的比较(Comparison of blood tests for liver fibrosisspecific or not to NAFLD).J Hepatol50:165-173
Guha IN,Parkes J,Roderick P,Chattopadhyay D,Cross R,Harris S,Kaye P,Burt AD,Ryder SD,Aithal GP,Day CP,Rosenberg WM(2008)在非酒精性脂肪肝疾病中的纤维化的非侵入性标志物：确认欧洲肝纤维化组和探索简单标志物(Noninvasive markersof fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease:Validating the European LiverFibrosis Panel and exploring simple markers).Hepatology47:455-460
Poynard T,Ratziu V,Naveau S,Thabut D,Charlotte F,Messous D,Capron D,Abella A,Massard J,Ngo Y,Munteanu M,Mercadier A,Manns M,Albrecht J(2005)用于预测肝脂肪变性的生物标志物(SteatoTest)的诊断值(The diagnostic value ofbiomarkers(SteatoTest)for the prediction of liver steatosis).Comp Hepatol4:10
Ratziu V,Massard J,Charlotte F,Messous D,Imbert-Bismut F,Bonyhay L,Tahiri M,Munteanu M,Thabut D,Cadranel JF,Le Bail B,de Ledinghen V,Poynard T(2006)用于预测非酒精性脂肪肝疾病患者的肝纤维化的生物化学标志物(FibroTest-FibroSURE)的诊断值(Diagnostic value of biochemical markers(FibroTest-FibroSURE)for the prediction of liver fibrosis in patients with non-alcoholicfatty liver disease).BMC Gastroenterol6:6
序列表
<110> 基恩菲特公司
<120> 用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法
<130> B2093PC00
<160> 10
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）
<400> 1
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 2
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 3
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 4
uaacacuguc ugguaacgau gu 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 5
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 6
cugaccuaug aauugacagc c 21
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 7
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 8
agcagcauug uacagggcua uga 23
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 9
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 10
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 10
cccaguguuc agacuaccug uuc 23

Claims (16)

1.一种用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或用于确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法包含测量至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的水平的步骤：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包含对所述受试者的血液、血清或血浆样品实施如下测量：
(i)测定α2巨球蛋白的水平；
(ii)测定至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)测定III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)测定至少一种选自hsa-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物的水平；以及
(v)测定hsa-miR-200的水平；
其中相对于对照样品，所述水平的增加指示NASH和/或NASH的活性、阶段或严重性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中从测量(i)至(v)中测定的水平计算NASH评分，并且其中基于所述NASH评分来诊断NASH和/或确定NASH阶段或活性或严重性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中根据以下逻辑函数计算NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
6.根据权利要求5所述的方法，其中高于包含在0.102至0.6465之间的阈值的NASH评分指示严重NASH或指示中等或高的NASH活性。
7.一种用于将受试者分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者的方法，所述方法包含测量至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的水平的步骤：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法包含对所述受试者的血液、血清或血浆样品实施如下测量：
(i)测定α2巨球蛋白的水平；
(ii)测定至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物的水平；
(iii)测定III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
(iv)测定至少一种选自hsa-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物的水平；以及
(v)测定hsa-miR-200的水平；
其中从测量(i)至(v)中测定的水平计算NASH评分，并且其中基于所述评分将所述受试者分类为所述NASH治疗的接受者或非接受者。
9.根据权利要求7或8所述的方法，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平，其中根据以下逻辑函数计算所述NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
10.根据权利要求9所述的方法，其中如果S高于包含在0.102至0.6465之间的阈值，则将所述受试者分类为所述治疗的接受者。
11.一种用于计算指示受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或指示受试者的NASH的活性、阶段或严重性的NASH评分的方法，其中所述评分基于至少一种选自如下定义的组(i)、(ii)或(iii)的标志物和至少一种选自如下定义的组(iv)或(v)的标志物的测量：
(i)α2巨球蛋白
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽
(iv)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a，更特别是hsa-miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a，更特别是hsa-miR-200a-3p)。
12.根据权利要求11所述的方法，所述方法包含测定α2巨球蛋白、HbA1c、III型胶原蛋白的N端前肽、hsa-miR-34和hsa-miR-200的水平，其中根据以下逻辑函数计算所述NASH评分：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH评分；
A是以g/L表示的α2巨球蛋白的水平；
B是以百分比表示的HbA1c的水平；
C是以ng/mL表示的III型胶原蛋白的N端前肽的水平；
D是以Cq表示的hsa-miR-34的水平；
F是以Cq表示的hsa-miR-200的水平；
k是包含在5.26至36.76之间的数字；
a是包含在0.11至1.07之间的数字；
b是包含在0至1.02之间的数字；
c是包含在0至0.23之间的数字；
d是包含在-0.77至0之间的数字；
f是包含在-0.78至0之间的数字。
13.一种试剂盒，其包含用于测定以下物质的水平的工具：
(i)α2巨球蛋白；
(ii)至少一种选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的标志物；
(iii)III型胶原蛋白的N端前肽；
(iv)至少一种选自has-miR-34、hsa-miR-122和hsa-miR-192的标志物；以及
(v)hsa-miR-200。
14.一种用于治疗受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，所述方法包含：
(a)根据权利要求1至6中任一项的方法诊断受试者的NASH或确定受试者的NASH的活性、阶段或严重性，或根据权利要求7至12中任一项的方法将所述受试者分类；
(b)基于步骤(a)向所述受试者施用NASH治疗。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述治疗包含向所述受试者施用式(I)化合物：
其中：
X1表示卤素、R1或G1-R1基团；
A表示CH＝CH或CH2-CH2基团；
X2表示G2-R2基团；
G1和G2相同或不同，表示氧或硫原子；
R1表示氢原子；未取代的烷基；芳基；或被一个或多个卤素原子、烷氧基或烷基硫基、环烷基、环烷基硫基或杂环基取代的烷基；
R2表示被至少一个-COOR3基团取代的烷基，其中R3表示氢原子，或被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基取代或未取代的烷基。
R4和R5相同或不同，表示被一个或多个卤素原子、环烷基、杂环基取代或未取代的烷基；
或其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述化合物选自：1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲基硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸以及2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲基硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙酯；或其药学上可接受的盐。
CN201680053197.2A 2015-09-14 2016-09-14 用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法 Active CN108138232B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15306412 2015-09-14
EP15306412.6 2015-09-14
PCT/EP2016/071727 WO2017046181A1 (en) 2015-09-14 2016-09-14 Methods for diagnosing and evaluating non-alcoholic steatohepatitis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108138232A true CN108138232A (zh) 2018-06-08
CN108138232B CN108138232B (zh) 2023-07-18

Family

ID=54199140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680053197.2A Active CN108138232B (zh) 2015-09-14 2016-09-14 用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11371098B2 (zh)
EP (2) EP3350341B1 (zh)
JP (2) JP6947721B2 (zh)
KR (1) KR20180049098A (zh)
CN (1) CN108138232B (zh)
AU (1) AU2016323380B2 (zh)
CA (1) CA2997336A1 (zh)
DK (2) DK3712279T3 (zh)
EA (1) EA201890724A1 (zh)
ES (1) ES2891347T3 (zh)
FI (1) FI3712279T3 (zh)
HK (1) HK1255351A1 (zh)
HU (1) HUE056299T2 (zh)
IL (1) IL257680B2 (zh)
MX (1) MX2018003077A (zh)
PH (1) PH12018500513A1 (zh)
PT (2) PT3350341T (zh)
WO (1) WO2017046181A1 (zh)
ZA (1) ZA201801630B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072302A (zh) * 2016-03-30 2018-12-21 基恩菲特公司 非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断
CN110143890A (zh) * 2019-06-12 2019-08-20 天津科技大学 一种查尔酮衍生物和合成方法及其在制备抗非酒精性脂肪肝炎药物中的应用
CN110484605A (zh) * 2019-09-23 2019-11-22 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用
CN110578003A (zh) * 2019-10-22 2019-12-17 安徽医科大学第二附属医院 miR-200a在制备肝癌诊断治疗试剂盒及在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111065748A (zh) * 2017-09-18 2020-04-24 基恩菲特公司 非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和/或肝纤维化的非侵入性诊断

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104334742A (zh) 2012-01-27 2015-02-04 利兰斯坦福青年大学董事会 解析和定量无细胞rna的方法
AU2018320715A1 (en) * 2017-08-25 2020-02-13 Genfit Non-invasive diagnostic of non-alcoholic fatty liver diseases, non-alcoholic steatohepatitis and/or liver fibrosis
WO2019051073A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Bristol-Myers Squibb Company MODIFIED FIBROBLAST GROWTH FACTOR 21 (FGF-21) FOR USE IN NON-ALCOHOLIC STÉATOHÉPATITE (NASH) TREATMENT METHODS
WO2019053235A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Genfit NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF NON ALCOHOLIC LIVER DISEASES, NON ALCOHOLIC STHEATHEPATITIS AND / OR HEPATIC FIBROSIS
EP3546597A1 (en) 2018-03-28 2019-10-02 Sanofi Biomarker panel for nafld/nash
AU2020221278A1 (en) 2019-02-14 2021-08-05 Mirvie, Inc. Methods and systems for determining a pregnancy-related state of a subject
MX2021010475A (es) 2019-03-13 2021-10-01 Genfit Diagnostico de esteatohepatitis no alcoholica.
KR20210010100A (ko) 2019-07-19 2021-01-27 고려대학교 산학협력단 체질량지수와 자기공명영상을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단방법
KR102341336B1 (ko) * 2019-11-20 2021-12-21 숙명여자대학교산학협력단 만성간질환의 예후 예측용 바이오마커 조성물
JP2023548156A (ja) * 2020-10-30 2023-11-15 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 肝疾患の評価のためのキット、試薬、及び方法
CA3195833A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Suneil HOSMANE Methods of diagnostic of liver fibrosis
WO2024038901A1 (ja) * 2022-08-17 2024-02-22 公益財団法人東京都医学総合研究所 肝疾患非侵襲性バイオマーカー及びこれを用いた肝疾患の検出

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013068348A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Santaris Pharma A/S Lna oligomers for improvement in hepatic function
WO2014049131A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Université d'Angers Accurate blood test for the non-invasive diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis
KR20140147920A (ko) * 2013-06-19 2014-12-31 가톨릭대학교 산학협력단 비알코올성 지방간염 감별용 바이오마커 ｍｉＲ-34ａ
CN104293908A (zh) * 2014-06-18 2015-01-21 镇江市第三人民医院 用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110313276A1 (en) * 2008-11-18 2011-12-22 Centre Hospitalier Universitaire D'angers Non-invasive in vitro method for quantifying liver lesions
ES2441665T3 (es) * 2009-11-26 2014-02-05 Genfit Utilización de derivados de 1,3-difenilprop-2-en-1-ona para tratar trastornos hepáticos
CA2853328A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Stella Aps Prognostic method for checking efficacy of micro rna-122 inhibitors in hcv+ patients
EP2818549A4 (en) 2012-02-23 2015-09-02 Sumitomo Bakelite Co METHOD FOR CLASSIFYING BODY FLUID SAMPLE OF TEST
EP2684513A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-15 Universite D'angers Method for providing reliable non-invasive diagnostic tests

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013068348A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Santaris Pharma A/S Lna oligomers for improvement in hepatic function
WO2014049131A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Université d'Angers Accurate blood test for the non-invasive diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis
KR20140147920A (ko) * 2013-06-19 2014-12-31 가톨릭대학교 산학협력단 비알코올성 지방간염 감별용 바이오마커 ｍｉＲ-34ａ
CN104293908A (zh) * 2014-06-18 2015-01-21 镇江市第三人民医院 用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BART STAELS: "Hepatoprotective effects of the dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist,GFT505,in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis", 《HEPATOLOGY》 *
HIROYA YAMADA等: ""Associations between circulating microRNAs (miR-21, miR-34a, miR-122 and miR-451) and non-alcoholic fatty liver"", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
JOHN D. CLARKE等: ""Circulating microRNA 122 in the Methionine and Choline Deficient Mouse Model of Nonalcoholic Steatohepatitis"", 《J APPL TOXICOL》 *
VOLODYMYR P. TRYNDYAK等: ""Plasma microRNAs are sensitive indicators of inter-strain differences in the severity of liver injury induced in", 《TOXICOL APPL PHARMACOL》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072302A (zh) * 2016-03-30 2018-12-21 基恩菲特公司 非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断
CN109072302B (zh) * 2016-03-30 2024-01-16 基恩菲特公司 非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断
CN111065748A (zh) * 2017-09-18 2020-04-24 基恩菲特公司 非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和/或肝纤维化的非侵入性诊断
CN111065748B (zh) * 2017-09-18 2024-04-09 基恩菲特公司 非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和/或肝纤维化的非侵入性诊断
CN110143890A (zh) * 2019-06-12 2019-08-20 天津科技大学 一种查尔酮衍生物和合成方法及其在制备抗非酒精性脂肪肝炎药物中的应用
CN110484605A (zh) * 2019-09-23 2019-11-22 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用
CN110484605B (zh) * 2019-09-23 2020-07-28 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用
CN110578003A (zh) * 2019-10-22 2019-12-17 安徽医科大学第二附属医院 miR-200a在制备肝癌诊断治疗试剂盒及在制备抗肿瘤药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20220411874A1 (en) 2022-12-29
HUE056299T2 (hu) 2022-02-28
HK1255351A1 (zh) 2019-08-16
JP2021144048A (ja) 2021-09-24
ZA201801630B (en) 2019-01-30
PH12018500513A1 (en) 2018-09-24
DK3712279T3 (da) 2024-06-03
AU2016323380B2 (en) 2023-01-05
EP3712279A1 (en) 2020-09-23
DK3350341T3 (da) 2021-09-27
AU2016323380A1 (en) 2018-03-29
EA201890724A1 (ru) 2018-10-31
EP3350341B1 (en) 2021-08-11
US11371098B2 (en) 2022-06-28
IL257680B2 (en) 2023-03-01
JP6947721B2 (ja) 2021-10-13
CN108138232B (zh) 2023-07-18
MX2018003077A (es) 2018-05-28
JP2018534542A (ja) 2018-11-22
PT3712279T (pt) 2024-06-04
JP7274523B2 (ja) 2023-05-16
IL257680A (en) 2018-04-30
KR20180049098A (ko) 2018-05-10
ES2891347T3 (es) 2022-01-27
EP3350341A1 (en) 2018-07-25
IL257680B (en) 2022-11-01
EP3712279B1 (en) 2024-03-20
CA2997336A1 (en) 2017-03-23
US20180265924A1 (en) 2018-09-20
WO2017046181A1 (en) 2017-03-23
PT3350341T (pt) 2021-09-28
FI3712279T3 (fi) 2024-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108138232A (zh) 用于诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎的方法
AU2017242818B2 (en) Non-invasive diagnostic of non-alcoholic steatohepatitis
US7668661B2 (en) Liver disease-related methods and systems
Schlatzer et al. Novel urinary protein biomarkers predicting the development of microalbuminuria and renal function decline in type 1 diabetes
Banne et al. Reduced level of serum thiols in patients with a diagnosis of active disease
JP2008529030A (ja) 生化学マーカーを使用する肝臓脂肪症の診断方法
CN101563597A (zh) 用于诊断和治疗2型糖尿病的组合物和方法
CN105934671B (zh) 用于评估妊娠糖尿病的方法和试剂
CN111032884A (zh) 非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和/或肝纤维化的非侵入性诊断
Wang et al. Serum nitric oxide level serves as a potential prognostic biomarker in ACLF patients
EA044836B1 (ru) Неинвазивная диагностика неалкогольного стеатогепатита
EA043166B1 (ru) Способы диагностики и оценки неалкогольного стеатогепатита
JP2022143162A (ja) 急性脳梗塞の予後予測方法
TW201625945A (zh) 一種用以預斷肝硬化病患發生肝癌之風險的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant