CN108137656A - α-溶血素变体 - Google Patents
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Abstract
本文描述了具有突变的寡聚化结构域的、经工程改造的α‑溶血素亚基,其用于在脂质双层中组装成七聚体纳米孔。
Description
技术领域
公开了与金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)α-溶血素变体和αHL突变变体相关的组合物和方法。所述α-溶血素(α-HL)变体可用作例如用于测定聚合物序列信息的装置中的纳米孔(nanopore)。所述αHL突变变体可用于操作亚基的化学计量学以提供有功能的七聚体αHL孔。本文所述的纳米孔、方法和***采用具有改进的特征的基于纳米孔的单分子技术提供单链核酸如DNA、RNA等的定量检测。
背景
溶血素是由多种生物体生产的蛋白毒素家族的成员。一些溶血素(例如α溶血素)可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜(例如,宿主细胞膜)的完整性。由成孔蛋白在膜中形成的孔或通道可以用于将某些聚合物(例如,多肽或多核苷酸)从膜的一侧运输到另一侧。
α-溶血素(α-HL、a-HL、αHL、aHL或α-HL)是在宿主细胞膜中形成水性通道的自组装毒素。α-HL已成为纳米孔测序界的主要组分。它具有许多有利的性质,包括高稳定性、自组装和足够宽以容纳单链DNA、但不容纳双链DNA的孔径(Kasianowicz等人, 1996)。
以前关于a-HL孔中DNA检测的工作已经集中在分析随着DNA通过孔转移的离子电流特征(Kasianowicz等人, 1996, Akeson等人, 1999, Meller等人, 2001),这在给定转移速率(在100 mV为~1 nt/ μs)和离子电流信号中的固有噪声的情况下是一项非常困难的任务。通过掺入永久束缚到孔内部的探针分子,已经在基于纳米孔的传感器中实现了更高的特异性(Howorka等人, 2001a和Howorka等人, 2001b; Movileanu等人, 2000)。
野生型a-HL导致显著数目的缺失错误,即没有测量到碱基。因此,需要具有改进的性能的α-HL纳米孔。
发明概述
本发明表征了含有氨基酸变异的突变葡萄球菌α溶血素(αHL)多肽,其增强穿入时间(time to thread,TTT),例如减少捕获目标分子的时间,例如,相对于亲本或野生型αHL的TTT。
本文公开的变体减少目标分子(例如,各种带标记的核苷酸或要测序的核苷酸)的穿入时间(time thread)。
本文中公开了α-溶血素(αHL)变体。所述α-溶血素(αHL)变体源自亲本α-HL多肽,例如,SEQ ID NO: 3,且包含相对于亲本α-HL多肽的一个或多个突变。在某些实施方案中,所述变体包括在与SEQ ID NO: 3 (成熟的a-HL)的位置12或17对应的位置处的置换。在某些实施方案中,所述变体还包含置换H144A。在某些实施方案中,所述置换包含一个或多个正电荷。在某些实施方案中,所述变体包含在与残基T12和/或N17中的一个或多个对应的位置处的置换。在某些实施方案中,所述变体包含选自T12K、T12R、N17K、N17R和它们的组合的置换。在某些实施方案中,所述变体具有相对于亲本α-溶血素改变的穿入时间(TTT)。在某些实施方案中,所述TTT减少。在某些实施方案中,所述变体包含在与来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素(αHL) (SEQ ID NO: 1和3)中选自T12R或T12K和/或N17R或N17K的残基对应的位置处的置换。在某些实施方案中,所述置换是T12K。在某些实施方案中,所述置换是T12R。在某些实施方案中,所述置换是N17K。在某些实施方案中,所述置换是N17R。在某些实施方案中,与亲本α-溶血素相比具有改变的特征的变体a-HL (例如,AAA26598)包含H144A和至少一个选自以下的另外突变
a. T12K/R;
b. N17K/R;
或其组合。
在某些实施方案中,所述氨基酸置换允许添加异源分子,例如PEG。在某些实施方案中,所述a-HL变体具有翻译后修饰。
在某些实施方案中,所述置换是在pH约5至约8.5为碱性或带正电荷的非天然氨基酸。
在一个方面,提供了包含至少一种如本文所述的α-溶血素(αHL)变体的七聚体孔组件(例如,纳米孔组件)。在一个实施方案中,本发明提供了含有突变αHL多肽(M)的异聚体孔组件,例如,含有野生型(WT)葡萄球菌αHL多肽和突变αHL多肽的孔组件,其中所述突变αHL多肽的氨基酸变体(如本文所提供的)占据孔结构的跨膜通道中的位置。例如,WT和变体αHL多肽的比率由式WT7-nMn表示,其中n为1、2、3、4、5、6或7;优选地,异七聚体中的αHL多肽的比率是WT7-nMn;最优选地,所述比率是WT6M1。本发明也包括这样的同聚体孔:其中七聚体的每个亚基是突变的αHL多肽(即,其中n=7)。可以从与至少两个连接的单体的多联体亚基组合的至少两个连接的单体的多联体亚基组装七聚体孔。可替换地,可以从至少两个连接的单体的多联体亚基和各个单体的组合组装七聚体孔。因而,在多联体或多联体和单体的混合物的七聚体中WT与变体亚基的比率将取决于多联体的大小和数目。
在某些情况下,聚合酶与纳米孔结合(例如,共价地连接至纳米孔),且聚合酶执行核苷酸掺入事件,即,保留酶活性。
在一个方面,提供了编码如本文所述的a-HL变体的核酸。
在一个方面,提供了一种载体,其包含编码如本文所述的α-溶血素变体的核酸。
在一个方面,提供了用载体转化的宿主细胞,所述载体包含编码如本文所述的α-溶血素变体的核酸。
在一个方面,提供了一种生产α-溶血素变体的方法,所述方法包括下述步骤: (a)在合适的培养基中在合适的条件下培养包含编码如本文所述的α-溶血素变体的核酸的宿主细胞以生产α-溶血素变体;和(b)获得所述生产的α-溶血素变体。
在一个方面,提供了一种用于检测靶分子的方法,所述方法包括:(a)提供芯片,其包含处于配置为与传感电极邻近或接近的膜中的如本文所述的纳米孔;(b)引导核酸分子穿入所述纳米孔,其中所述核酸分子与报告分子结合,其中所述核酸分子包含寻址区和探针区,其中所述报告分子与所述核酸分子在所述探针区结合,并且其中所述报告分子与靶分子偶联;(c)在所述核酸分子被引导穿入所述纳米孔时测序所述寻址区,以确定所述寻址区的核酸序列;和(d)借助于计算机处理器,基于在(c)中确定的所述寻址区的核酸序列鉴定所述靶分子。
在一个方面,提供了一种包含至少一个在前寡聚化亚基和至少一个在后寡聚化亚基的异寡聚体α-溶血素(αHL)七聚体,每个寡聚化亚基包含至少一个αHL单体和/或至少一个αHL单体的多联体,所述寡聚化亚基具有在第一寡聚化结构域中的一个或多个突变和/或在第二寡聚化结构域中的一个或多个突变;其中所述第一结构域和/或第二结构域上的所述突变中的至少一个是中断突变,其阻止所述至少一个在前寡聚化亚基和所述至少一个在后寡聚化亚基的自寡聚化。
在另一个方面,本文描述的异寡聚体αHL七聚体可以进一步包含在所述至少一个在前寡聚化亚基中的第一寡聚化结构域上的至少一个同源和/或挽救突变和/或在至少一个在后寡聚化亚基中的第二寡聚化结构域上的至少一个同源和/或挽救突变,其中所述至少一个同源和/或挽救突变决定所述至少一个在前寡聚化亚基和所述至少一个在后寡聚化亚基之间的亚基间接触以指定所述异寡聚体αHL七聚体中的寡聚化亚基的序列。在实现亚基的寡聚化的在前亚基和在后亚基的寡聚化结构域中可以做出的同源突变的一个例子是突变H35I和Y101H的对。
在某些方面,所述αHL七聚体可以由至少一个在前寡聚化亚基(其为αHL单体的多联体)和至少一个在后亚基(其为至少一个αHL单体)形成。
在其它方面,所述αHL七聚体可以由至少一个在前寡聚化亚基和至少一个在后寡聚化亚基形成,每个亚基是αHL单体的多联体。
在其它方面,所述αHL七聚体可以由为αHL单体的在前寡聚化亚基和在后寡聚化亚基形成。
在另一个方面,所述αHL七聚体可以由至少一个在前寡聚化亚基(其为αHL单体的多联体)和至少一个在后亚基(其为αHL单体)形成。
在另一个方面,所述αHL七聚体可以由至少一个在前寡聚化亚基(其为αHL单体)和至少一个在后亚基(其为αHL单体的多联体)形成。
在某些情况下,所述αHL七聚体的单体和/或单体的多联体包含一个或多个SEQ IDNO: 3的多肽。
在一个方面,可以在与SEQ ID NO: 3的氨基酸2-28、35-42和43-61对应的位置处做出αHL七聚体的第一寡聚化结构域中的突变。在所述第一寡聚化结构域中可以做出的突变的例子包括与SEQ ID NO: 3的H35D、H35E、H35I、H35L、D24A、V26D、K37S和D24A+V26D+K37S对应的氨基酸置换。可以在与SEQ ID NO: 3的氨基酸95-104、158-164和228-236对应的位置处做出在第二寡聚化结构域中的突变。在所述第二寡聚化结构域中可以做出的突变的例子包括与SEQ ID NO: 3的T233R、S99K、Y101D、Y101H和T233R+S99K对应的氨基酸置换。
在所有方面,所述αHL七聚体保留在脂质双层中形成孔的能力。
在某些情况下,所述αHL七聚体可以进一步包含聚合酶,其连接至在前和/或在后寡聚化亚基中的一个或多个。
在另一个方面,除了在第一寡聚化结构域和/或第二寡聚化结构域中的突变以外,所述αHL七聚体可以进一步包含这样的αHL多肽:其包含在与SEQ ID NO: 3的位置12或17对应的位置处的氨基酸置换,其中所述置换包含一个或多个正电荷。在位置12或17处的置换可以选自T12K、T12R、N17K、N17R和它们的组合。包含具有在位置12或17处的置换的αHL多肽的αHL七聚体可以具有相对于亲本α-溶血素的改变的穿入时间(TTT)。例如,可以减少TTT。
在另一个方面,提供了多个多核苷酸,其编码本文描述的异寡聚体αHL七聚体的至少一个在前和一个在后寡聚化亚基。
在另一个方面,提供了用表达载体转化或转染的宿主细胞,所述表达载体编码每种多核苷酸之一,所述多核苷酸编码异寡聚体αHL七聚体的寡聚化亚基。
在另一个方面,提供了制备αHL七聚体的至少一个在前寡聚化亚基和至少一个在后寡聚化亚基的方法,所述方法包括培养用编码异寡聚体αHL七聚体的寡聚化亚基的多核苷酸转染或转化的宿主细胞。所述方法可以进一步包含从宿主细胞培养物分离所述αHL七聚体的至少一个在前寡聚化亚基和至少一个在后寡聚化亚基。
在另一个方面,提供了包含如本文所述的异寡聚体αHL七聚体的七聚体孔组件。
从下面的详细描述会明白本发明的其它目的、特征和优点。但是,应当理解,尽管详细描述和具体实施例指示本发明的优选实施方案,但是它们仅以示例的方式给出,因为在本发明的范围和精神内的各种改变和修改将从该详细描述变得对于本领域技术人员而言显而易见。
附图说明
图1-5各自包含两个图,例如图1A和1B。每个图的A图是捕获事件的数目的直方图,所述捕获事件具有等于在x-轴上显示的时间箱(time bin)的“穿入时间”。每个图的B图是相应图A的原始数据的一部分。
图1A和1B显示了野生型α-溶血素纳米孔的结果。图1A(上图)显示了“穿入时间”数据。该数据从许多正在捕获带标签的核苷酸的孔合并得来,表明所述孔具有聚合酶和模板DNA分子。野生型αHL的平均值和中位值以及标准差分别为20.7ms、16.1ms和1.5ms,且用于计算的方波的总数为41910。
图1B(下图)显示了一些原始数据,显示了五个连续的方波。实线之间的数据点表示开放通道(其中没有带标签的核苷酸穿入孔中),并且虚线之间的数据表示当带标签的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子穿入通道移动时。电极在正和负100mV之间循环,并且在施加负电压时,在我们的***中没有记录数据点。因此,所有的数据点都从正向施加的电位收集,且没有数据点的时间(例如1716.9-1717秒之间)是当电极具有对其施加的负电压时。在该实施例中,“穿入时间”测量由具有可观察的穿入水平的方波计算,并且先前的方波在正电压结束时具有穿入水平(指示所述标签穿入孔中且被聚合酶结合)。
图2A和B显示了包含T12K突变的α-溶血素纳米孔的结果。图2A(上图)是从许多正在捕获带标签的核苷酸的孔合并得来的数据,表明所述孔具有聚合酶和模板DNA分子。T12KαHL的平均值和中位值以及标准差分别为19.7ms、14.5ms和1.5ms,且用于计算的方波的总数为4311。
图2B(下图)显示了一些原始数据,显示了五个连续的方波。实线之间的数据点表示开放通道(其中没有带标签的核苷酸穿入孔中),并且虚线之间的数据表示当带标签的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子穿入通道移动时。电极在正和负100mV之间循环,并且在施加负电压时,在我们的***中没有记录数据点。因此,所有的数据点都从正向施加的电位收集,且没有数据点的时间(例如1600.4-1601.2秒之间)是当电极具有对其施加的负电压时。在该实施例中,“穿入时间”测量由具有可观察的穿入水平的方波计算,并且先前的方波在正电压结束时具有穿入水平(指示所述标签穿入孔中且被聚合酶结合)。
图3A和B显示了包含T12R突变的α-溶血素纳米孔的结果。图3A是从许多正在捕获带标签的核苷酸的孔合并得来的数据,表明所述孔具有聚合酶和模板DNA分子。T12RαHL的平均值和中位值以及标准差分别为16.9ms、10.5ms和1.5ms,且用于计算的方波总数为4138。
图3B(下图)显示了一些原始数据,显示了五个连续的方波。实线之间的数据点表示开放通道(其中没有带标签的核苷酸穿入孔中),并且虚线之间的数据表示当带标签的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子穿入通道移动时。电极在正和负100mV之间循环,并且在施加负电压时,在我们的***中没有记录数据点。因此,所有的数据点都从正向施加的电位收集,且没有数据点的时间(例如267.2 - 268.2秒之间)是当电极具有对其施加的负电压时。在该实施例中,“穿入时间”测量由具有可观察的穿入水平的方波计算,并且先前的方波在正电压结束时具有穿入水平(指示所述标签穿入孔中且被聚合酶结合)。
图4A和4B显示了包含N17R突变的α-溶血素纳米孔的结果。图4A(上图)是从许多正在捕获带标签的核苷酸的孔合并得来的数据,表明所述孔具有聚合酶和模板DNA分子。N17RαHL的平均值和中位值以及标准差分别为17.5ms、10.5ms和1.7ms,且用于计算的方波总数为3877。
图4B(下图)显示了一些原始数据,显示了五个连续的方波。实线之间的数据点表示开放通道(其中没有带标签的核苷酸穿入孔中),并且虚线之间的数据表示当带标签的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子穿入通道移动时。电极在正和负100mV之间循环,并且在施加负电压时,在我们的***中没有记录数据点。因此,所有的数据点都从正向施加的电位收集,且没有数据点的时间(例如344 - 344.9秒之间)是当电极具有对其施加的负电压时。在该实施例中,“穿入时间”测量由具有可观察的穿入水平的方波计算,并且先前的方波在正电压结束时具有穿入水平(指示所述标签穿入孔中且被聚合酶结合)。
图5A和5B显示了包含N17K突变的α-溶血素纳米孔的结果。图5A(上图)显示从许多正在捕获带标签的核苷酸的孔合并得来的数据,表明所述孔具有聚合酶和模板DNA分子。N17KαHL的平均值和中位值以及标准差分别为5.7ms、2.4ms和0.7ms,且用于计算的方波总数为2424。
图5B(下图)显示了一些原始数据,显示了五个连续的方波。实线之上的数据点表示开放通道(其中没有带标签的核苷酸穿入孔中),并且虚线之间的数据表示当带标签的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子穿入通道移动时。电极在正和负100mV之间循环,并且在施加负电压时,在我们的***中没有记录数据点。因此,所有的数据点都从正向施加的电位收集,且没有数据点的时间(例如79.5 - 80.5秒之间)是当电极具有对其施加的负电压时。在该实施例中,“穿入时间”测量由具有可观察的穿入水平的方波计算,并且先前的方波在正电压结束时具有穿入水平(指示所述标签穿入孔中且被聚合酶结合)。
图6A显示了αHL亚基(600)的简图,所述αHL亚基具有在所述亚基的第一区域中的第一(601)寡聚化结构域(☐)和在所述亚基的第二区域中的第二(602)寡聚化结构域(★)。显示的寡聚化亚基是单体亚基。
图6B显示了7个不同的寡聚化亚基的异寡聚体αHL七聚体的简图,其在该情况下是单体i、ii、iii、iv、v、vi和vii。描绘了在前亚基上的第一寡聚化结构域(☐)和在后亚基上的第二寡聚化结构域(★)之间的相互作用(←→)。
图6C显示了亚基的简图,所述亚基包含实现亚基间相互作用的突变(显示为实心双箭头线)和抑制亚基间相互作用的突变(显示为带叉的虚线双箭头线)。具有中断突变1(BM1)的亚基不会与野生型亚基(WT)或具有中断突变2 (BM2)的亚基相互作用。具有挽救突变(RM)和同源突变(CM)的亚基可以与具有中断突变(例如,中断突变1)的亚基相互作用。具有挽救突变(RM)的亚基还可以与野生型(WT)亚基相互作用。
图6D显示了两个单体的αHL多联体亚基的简图。所述多联体亚基的第一寡聚化结构域(☐)存在于第一亚基(这里显示为vii)上,且所述多联体亚基的第二寡聚化结构域(★)存在于第二亚基(这里显示为i)上。
图7A-7F显示了通过接头(---)连接的2个(7A)、3个(7B、7C)和4个(7D、7E、7F)αHL单体的多联体的简图,例如,(GS)5 (SEQ ID NO: 9)。组分1和2 (C1, C2)可以是纯化组分,例如,His6 (SEQ ID NO: 10),FLAG表位,或连接组分,例如,SpyTag。
图8A和8B显示了SDS-PAGE凝胶,其证实在寡聚化结构域处具有如指示的中断突变的变体单体(N17K)的寡聚化缺失。参考实施例6。图8A和8B将“His6-GSGG”公开为SEQ IDNO: 11。
图9显示了具有如指示的中断突变的αHL单体的凝胶,并证实野生型αHL单体(HemoM)不会实现突变单体的寡聚化。参考实施例6。
图10A-10C显示了两个αHL单体的亚基多联体的SEC纯化的色谱图(10A)和通过(GS)5连接的两个单体的αHL多联体的SDS-PAGE凝胶(10B) (SEQ ID NO: 9),其在N-端处用His6-SpyTag标记(“His6”公开为SEQ ID NO: 10),且与信号序列pelB一起表达(10C)。参考实施例7。
图11显示的SDS-PAGE凝胶图像证实,在图11中所示的两个单体的多联体可以寡聚化,如视作泳道5中的高分子量带。参考实施例7。
图12显示的SDS-PAGE凝胶图像证实,可以表达和纯化3和4个连接的单体的浓缩亚基。参考实施例8。
图13显示的SDS-PAGE凝胶图像证实了具有同源突变H35I和Y101H的αHL亚基的寡聚化,其能实现突变的亚基的寡聚化。参考实施例10。
图14显示的SDS-PAGE凝胶图像证实具有H35G突变的单体的温度依赖性寡聚化。参考实施例11。
发明详述
现在将使用下述定义和实施例仅通过参考来详细描述本发明。在本文中参考的所有专利和出版物(包括在这样的专利和出版物中公开的所有序列)都明确地通过引用并入。
除非在本文中另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般词典。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用在本发明的实践或测试中,但是描述了优选的方法和材料。关于本领域的定义和术语,将从业人员特别引向Sambrook等人,1989,和Ausubel FM等人, 1993。应当理解,本发明不限于所描述的具体方法、规程和试剂,因为这些可能变化。
数字范围包括限定所述范围的数字。术语“约”在本文中用于表示值的加或减百分之十(10%)。例如,“约100”表示在90和110之间的任何数字。
除非另有说明,否则核酸以5'至3'取向从左到右书写;氨基酸序列分别以从氨基到羧基取向从左到右书写。
本文提供的标题不是本发明的各个方面或实施方案的限制,其可以通过参考整个说明书来获得。因此,在下面紧接着定义的术语通过参考整个说明书更完整地定义。
定义
α-溶血素: 本文中使用的“α-溶血素”、“α-溶血素”、“aHL”、“αHL”、“a-HL”和“α-HL”可互换使用,且表示从单体、单体的多联体、或单体和单体的多联体的组合自组装成七聚体充水跨膜通道(即纳米孔)的蛋白。
氨基酸:本文中使用的术语“氨基酸”在其最宽的含义表示可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在某些实施方案中,氨基酸具有一般结构H2N—C(H)(R)—COOH。在某些实施方案中,氨基酸是天然存在的氨基酸。在某些实施方案中,氨基酸是合成的氨基酸;在某些实施方案中,氨基酸是D-氨基酸;在某些实施方案中,氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”表示通常在天然存在的肽中发现的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”表示除了标准氨基酸以外的任何氨基酸,无论它是合成制备的还是从天然来源获得的。本文中使用的“合成的氨基酸”或“非天然的氨基酸”包括化学修饰的氨基酸,包括、但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代物。氨基酸(包括在肽中的羧基端和/或氨基端氨基酸)可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它化学物质或化学基团取代进行修饰,不会不利地影响它们的活性。氨基酸可以参与二硫键。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用,并且可以表示游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文显而易见,无论它表示游离氨基酸还是肽的残基。应当指出,所有氨基酸残基序列在本文中都用这样的式表示:其左右取向为氨基端到羧基端的常规方向。
碱基对(bp):本文中使用的碱基对表示在双链DNA分子中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)、或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的配偶关系。
互补:本文中使用的术语“互补”表示通过碱基配对在两个多核苷酸链的区域之间或在两个核苷酸之间的序列互补性的广义概念。已知腺嘌呤核苷酸能够与胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸形成特异性氢键(“碱基配对”)。类似地,已知胞嘧啶核苷酸能够与鸟嘌呤核苷酸碱基配对。
表达盒:“表达盒”或“表达载体”是重组地或合成地产生的核酸构建体,其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定的核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常,表达载体的重组表达盒部分除其它序列外还包括要转录的核酸序列和启动子。
异源的:“异源的”核酸构建体或序列具有这样的序列的一部分:所述序列对于它在其中表达的细胞而言不是天然的。关于控制序列异源的表示这样的控制序列(即,启动子或增强子),它在自然界中不起作用以调节它目前调节其表达的相同基因。通常,异源核酸序列对于它们存在于其中的细胞或部分基因组而言不是内源性的,并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等加入到细胞中。“异源”核酸构建体可以含有与在天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
宿主细胞:术语“宿主细胞”是指含有载体并支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译(表达)的细胞。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E. coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus),或真核细胞诸如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。一般而言,宿主细胞是原核的,例如大肠杆菌。
分离的:“分离的”分子是这样的核酸分子,其与至少一种通常伴随它(例如,在它的天然环境中)的其它分子分离。分离的核酸分子包括被包含在通常表达所述核酸分子的细胞中的核酸分子,但是所述核酸分子在染色体外存在或位于不同于其天然染色***置的染色***置。
修饰的α-溶血素:本文中使用的术语“修饰的α-溶血素”表示起源于另一种(即亲本)α-溶血素的α-溶血素,并且与亲本α-溶血素相比含有一个或多个氨基酸改变(例如,氨基酸置换、缺失和/或***)。在某些实施方案中,本发明的修饰的α-溶血素源自天然存在的或野生型α-溶血素或由其修饰而来。在某些实施方案中,本发明的修饰的α-溶血素源自重组的或工程改造的α-溶血素或由其修饰而来,包括、但不限于嵌合α-溶血素、融合α-溶血素或另一种修饰的α-溶血素。通常,与亲本α-溶血素相比,修饰的α-溶血素具有至少一个改变的表型。
突变:本文中使用的术语“突变”表示引入亲本序列中的改变,包括、但不限于置换、***、缺失(包括截短)。突变的后果包括、但不限于在由亲本序列编码的蛋白中未发现的新特性、性质、功能、表型或特质的建立。
纳米孔:本文中使用的术语“纳米孔”或“孔”通常表示在膜中形成或以其它方式提供的通道或通路。膜可以是有机膜,诸如脂质双层,或合成的膜,诸如由聚合材料形成的膜。膜可以是聚合材料。可以将纳米孔配置为邻近或接近传感电路或与传感电路偶联的电极,例如,互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在某些实施例中,纳米孔具有在0.1纳米(nm)至约1000nm的量级的特征宽度或直径。一些纳米孔是蛋白。α-溶血素是蛋白纳米孔的一个例子。
核酸分子:术语“核酸分子”或“核酸”或“多核苷酸”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解,作为遗传密码的简并性的结果,可以生产许多编码给定蛋白诸如α-溶血素和/或其变体的核苷酸序列。本发明预见到编码变体α-溶血素的每种可能的变体核苷酸序列,所有这些在给定遗传密码的简并性的情况下都是可能的。
启动子:本文中使用的术语“启动子”表示起作用以指导下游基因的转录的核酸序列。启动子通常将适合于靶基因正在其中表达的宿主细胞。启动子与其它转录和翻译调节核酸序列(也称为“控制序列”)一起是表达给定基因所必需的。一般而言,转录和翻译调节序列包括、但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活蛋白序列。
纯化的:本文中使用的“纯化的”是指,分子以含有它的样品的至少95重量%、至少98%、至少99%或至少99.5重量%的浓度存在于样品中。
纯化:本文中使用的术语“纯化”通常表示对含有转基因核酸或蛋白的细胞或其提取物进行生物化学纯化和/或柱色谱法。
标签:本文中使用的术语“标签”表示可检测的部分,其可以是原子或分子或原子或分子的集合。标签可以提供特征(signature),例如,光学、电化学、磁学或静电(例如,感应的、电容的)特征,该特征可以借助于纳米孔来检测。通常,当核苷酸附接到标签时,它称为“带标签的核苷酸”。标签可以附接到核苷酸,例如,通过磷酸酯部分。
穿入时间:术语“穿入时间”或“TTT”是指聚合酶-标签复合物将所述标签穿入纳米孔的筒体所需的时间。
变体:本文中使用的术语“变体”表示与亲本蛋白相比表现出改变的特征的修饰的蛋白,例如改变的离子电导、改变的穿入时间等。
变体溶血素:术语“变体溶血素基因”或“变体溶血素”分别是指,通过除去、添加和/或操作编码序列已经改变了来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素基因的核酸序列,或表达的蛋白的氨基酸序列已经根据本文所述的发明进行了修饰。
载体:本文中使用的术语“载体”表示被设计成在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”表示能够在外来细胞中掺入并表达异源DNA片段的载体。许多原核和真核表达载体是商购可得的。合适的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内。
野生型:本文中使用的术语“野生型”表示这样的基因或基因产物:其当从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物的序列和/或特征。
同源性百分比:术语“%同源性”在本文中与术语“%同一性”可互换使用,并且表示当使用序列比对程序进行比对时,编码本发明多肽的任何一个的核酸序列或本发明多肽的氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
例如,本文中使用的80%同源性是指,与通过明确的算法确定的80%序列同一性相同的事物,且因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80%序列同一性。序列同一性的示例性水平包括、但不限于与给定序列(例如,本文所述的本发明多肽的任何一种的编码序列)的80%、85%、90%、95%、98%或更高序列同一性。
可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括、但不限于在因特网上可公开获得的BLAST程序,例如,BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN。也参见,Altschul, 等人, 1990和Altschul, 等人, 1997。
在相对于GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列评价给定的核酸序列时,通常使用BLASTN程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于对GenBank蛋白序列和其它公共数据库中的氨基酸序列检索已经在所有读码框中翻译的核酸序列。BLASTN和BLASTX使用11.0的开放缺口罚分(open gap penalty)和1.0的延伸缺口罚分(extended gap penalty)的默认参数运行,并利用BLOSUM-62矩阵(参见,例如,Altschul, S. F., 等人, NucleicAcids Res. 25:3389-3402, 1997)。
使用例如MacVector 13.0.7版中的CLUSTAL-W程序来执行所选择的序列的优选比对以确定两个或更多个序列之间的“%同一性”,其用默认参数运行,包括10.0的开放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分和BLOSUM 30相似度矩阵。
“寡聚体蛋白”:术语“寡聚体蛋白”在本文中表示这样的蛋白:其可以由多个相同亚基、多个不同亚基、或相同和不同亚基的混合物组成。具有相同亚基的蛋白被称作“同寡聚体”。含有两个或更多个不同多肽亚基的蛋白被称作“异寡聚体”。
“异七聚体蛋白”:术语“异七聚体蛋白”在本文中表示含有两个或更多个不同亚基多肽的蛋白,其中每个多肽包含一个或多个αHL单体,它们形成7个单体的蛋白。
“寡聚化亚基”:术语“寡聚化亚基”或“亚基”在本文中表示包含至少一个αHL单体或至少一个2、3、4、5、6或7个单体(它们通过接头彼此连接且各自由单个多核苷酸编码)的αHL多联体的氨基酸序列的多肽。
“寡聚化结构域”:术语“寡聚化结构域”在本文中表示一个亚基区域中的氨基酸,其可以与另一个亚基区域中的氨基酸相互作用以实现所述亚基的寡聚化。每个单体亚基或单体的每个多联体亚基具有第一和第二寡聚化结构域。
“中断突变”:术语“中断突变”在本文中表示αHL亚基中的突变,其不允许与野生型αHL亚基的亚基间相互作用,由此抑制寡聚化。
“挽救突变”:术语“挽救突变”在本文中表示不是中断突变的突变,其当存在于第一亚基的寡聚化结构域上时可以与第二亚基的寡聚化结构域中的中断突变接口以实现亚基间相互作用,由此允许所述亚基的寡聚化。挽救突变还可以实现与野生型亚基的寡聚化。“挽救突变”还可以被称作“补偿突变”。
“同源突变”:术语“同源突变”在本文中表示在第一亚基的寡聚化结构域上的中断突变,其可以与第二亚基的寡聚化结构域中的中断突变接口以实现亚基间相互作用,由此允许所述亚基的寡聚化。
“自挽救突变”:术语“自挽救突变”在本文中表示这样的突变:其在第一温度(例如,室温)为中断突变,且在第二温度(例如,37℃)转化为同源突变。应当理解,所述第一温度可以高于或低于第二温度。
“突变变体”:术语“突变变体”在本文中表示变体αHL亚基,例如,单体,其已经被进一步修饰以在αHL亚基的一个或两个寡聚化结构域中引入一个或多个突变,例如,置换。
“寡聚化突变体”:术语“寡聚化突变体”在本文中表示在一个或两个寡聚化结构域中具有一个或多个突变αHL亚基。
命名法
在本说明书和权利要求书中,使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。
为了易于提及,使用以下命名法来描述本申请的变体:
原始氨基酸:位置:置换的氨基酸。根据这个命名法,例如,在位置17精氨酸对苏氨酸的置换显示为:
Thr17Arg或T17R
多个突变被加号分开,即:
Thr17Arg+Glu34Ser或T17R+E34S
代表在位置17和34中的突变,分别用精氨酸和丝氨酸置换苏氨酸和谷氨酸。
当一个或多个替代性氨基酸残基可以***给定位置时,其表示为:T17R/K或T17R或T17K。
α-溶血素的定点诱变
在本文中提供了金黄色葡萄球菌α溶血素野生型序列(SEQ ID NO: 1, 核酸编码区;SEQ ID NO: 3, 蛋白编码区),且可在其它地方获得(国家生物信息学中心(NationalCenter for Bioinformatics)或GenBank登录号M90536和AAA26598)。
使用QuikChange Lightning 2试剂盒(Stategene/Agilent)遵循生产商的说明书可以引入点突变。
引物可以从商业公司例如IDT DNA订购。
纳米孔组装和***
本文描述的方法可以使用具有与纳米孔附接的聚合酶的纳米孔。在某些情况下,合乎需要的是,每个纳米孔具有一个且仅一个聚合酶(例如,使得在每个纳米孔处仅将一个核酸分子测序)。但是,许多纳米孔(包括α-溶血素(αHL))可以是具有多个亚基的多聚体蛋白(例如,对于αHL而言7个亚基)。亚基可以是相同多肽的相同拷贝。本文提供了具有修饰的亚基(例如a-HL变体)与未修饰的亚基(例如a-HL)的确定比率的多聚体蛋白(例如纳米孔)。本文还提供了用于生产具有修饰的亚基与未修饰的亚基的确定比率的多聚体蛋白(例如纳米孔)的方法。
参考WO2014/074727的图27,用于组装具有多个亚基的蛋白的方法包含提供多个第一亚基2705并提供多个第二亚基2710,其中当与第一亚基比较时第二亚基被修饰。在某些情况下,第一亚基是野生型(例如,从天然来源纯化或重组生产)。可以以任何合适的方式修饰第二亚基。在某些情况下,第二亚基具有附接(例如,作为融合蛋白)的蛋白(例如,聚合酶)。
修饰的亚基可以包含化学反应性部分(例如,适于形成键的叠氮化物或炔烃基)。在某些情况下,该方法还包含进行反应(例如,点击化学环加成)以将实体(例如聚合酶)附接到化学反应性部分。
所述方法可以进一步包含以第一比率使第一亚基与第二亚基接触2715以形成多个具有第一亚基和第二亚基的蛋白2720。例如,一份修饰的具有适合于附接聚合酶的反应性基团的αHL亚基可以与六份野生型αHL亚基混合(即第一比率为1:6)。多个蛋白可以具有多个第一亚基与第二亚基的比率。例如,混合的亚基可以形成几个具有修饰的亚基与未修饰的亚基的化学计量分布的纳米孔(例如1:6、2:5、3:4)。
在某些情况下,通过简单混合亚基形成蛋白。例如,在αHL纳米孔的情况下,去污剂(例如,脱氧胆酸)可以触发αHL单体呈现孔构象。纳米孔也可以使用脂质(例如,1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)或1,2-二-O-植烷基-s/n-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC))和适度的温度(例如,小于约100℃)形成。在某些情况下,将DPhPC与缓冲溶液混合产生大的多层囊泡(LMV),并且向该溶液中加入αHL亚基并将混合物在40℃温育30分钟导致孔形成。
如果使用两种不同类型的亚基(例如,天然野生型蛋白和可以含有单个点突变的第二αHL单体),则所得蛋白可以具有混合的化学计量(例如,野生型和突变蛋白的)。这些蛋白的化学计量可以遵循取决于在成孔反应中使用的两种蛋白的浓度的比率的公式。这个公式如下:
100 Pm= 100[n!/m!(n-m)!]·fmut m·fwt n~m,其中
Pm=具有m个突变亚基的孔的概率
n=亚基总数(例如,对于αHL为7)
m=“突变”亚基的数目
fmut=混合在一起的突变亚基的分数或比率
fwt=混合在一起的野生型亚基的分数或比率。
该方法可以进一步包含分级分离多个蛋白以富集具有第一亚基与第二亚基的第二比率的蛋白2725。例如,可以分离具有一个且仅一个修饰的亚基的纳米孔蛋白(例如,1:6的第二比率)。但是,任何第二比率是合适的。第二比率的分布也可以被分级分离,诸如富集具有一个或两个修饰的亚基的蛋白。形成蛋白的亚基的总数不总是7(例如,可以使用不同的纳米孔,或者可以形成具有六个亚基的α-溶血素纳米孔),如在WO2014/074727的图27所示。在某些情况下,仅具有一个修饰的亚基的蛋白被富集。在这种情况下,第二比率是每(n-1)个第一亚基1个第二亚基,其中n是构成蛋白的亚基的数目。
第一比率可以与第二比率相同,但是这不是必需的。在某些情况下,具有突变的单体的蛋白可以以比不具有突变的亚基的蛋白更低的效率形成。如果是这种情况,那么第一比率可以大于第二比率(例如,如果在纳米孔中需要1个突变的亚基与6个非突变的亚基的第二比率,则形成适当数目的1:6蛋白可能需要以大于1:6的比率混合所述亚基)。相反,如果突变的单体能够更有效地寡聚化,那么第一比率可以小于第二比率(例如,如果在纳米孔中需要1个突变的亚基与6个非突变的亚基的第二比率,则形成适当数目的1:6蛋白可能需要以小于1:6的比率混合所述亚基)。
具有亚基的不同第二比率的蛋白在分离中可以不同地表现(例如,具有不同的保留时间)。在某些情况下,使用色谱法(诸如离子交换色谱法或亲和色谱法)分级分离蛋白。由于除了修饰之外,第一亚基和第二亚基可以是相同的,所以蛋白上的修饰的数目可以充当分离的基础。在某些情况下,第一或第二亚基具有纯化标签(例如,在修饰之外)以允许或提高分级分离的效率。在某些情况下,使用多组氨酸标签(His-标签)、抗生蛋白链菌素标签(Strep-标签)或其它肽标签。在某些情况下,第一亚基和第二亚基各自包含不同的标签,且分级分离步骤基于每个标签进行分级分离。在His-标签的情况下,在低pH在标签上产生电荷(组氨酸残基在侧链的pKa以下变得带正电荷)。利用与其它αHL分子相比αHL分子之一上的电荷的显著差异,可以使用离子交换色谱法来分离具有0、1、2、3、4、5、6或7个“电荷-标记的”αHL亚基的寡聚体。原则上,该电荷标签可以是携带电荷(例如,均匀电荷)的任何氨基酸的串。WO2014/074727的图28和图29显示了基于His-标签的纳米孔的分级分离的实施例。图28显示在280纳米的紫外吸光度、在260纳米的紫外吸光度和电导率的图。峰对应于具有修饰的亚基和未修饰的亚基的不同比率的纳米孔。WO2014/074727的图29显示了使用His-标签和Strep-标签的αHL纳米孔和其突变体的分级分离。
在某些情况下,实体(例如,聚合酶)在分级分离后附接到蛋白。所述蛋白可以是纳米孔,且实体可以是聚合酶。在某些情况下,该方法还包含将具有第二比率亚基的蛋白***双层。
在某些情况下,纳米孔可以包含多个亚基。聚合酶可以附接到亚基之一,并且至少一个且少于所有的亚基包含第一纯化标签。在某些实施例中,纳米孔是α-溶血素或其变体。在某些情况下,所有亚基都包含第一纯化标签或第二纯化标签。第一纯化标签可以是多组氨酸标签(例如,在具有附接的聚合酶的亚基上)。
附接到纳米孔的聚合酶
在某些情况下,聚合酶(例如,DNA聚合酶)附接到纳米孔和/或位于纳米孔附近。在将纳米孔掺入膜之前或之后,可以将聚合酶附接到纳米孔。在某些情况下,纳米孔和聚合酶是融合蛋白(即,单个多肽链)。
聚合酶可以以任何合适的方式附接到纳米孔。在某些情况下,聚合酶附接到纳米孔(例如,溶血素)蛋白单体,并且然后组装完整的纳米孔七聚体(例如,以1个具有附接的聚合酶的单体与6个没有附接的聚合酶的纳米孔(例如,溶血素)单体的比率)。然后可以将纳米孔七聚体***膜中。
将聚合酶附接到纳米孔的另一种方法包括将接头分子附接到溶血素单体或使溶血素单体突变以具有附接位点,并然后组装完整的纳米孔七聚体(例如,以1个具有接头和/或附接位点的单体与6个没有接头和/或附接位点的溶血素单体的比率)。还可以将聚合酶附接到αHL单体的多联体。例如,图7A-7F表明,两个或更多个αHL单体的多联体可以包含酶(例如,聚合酶)可与其连接的连接组分。因此,可以将聚合酶连接至两个或多个单体的多联体,其可以与其它多联体和/或单体寡聚化以提供包含聚合酶的纳米孔,例如,七聚体αHL纳米孔。还可以将第二聚合酶连接至单体或单体的多联体。然后可以将聚合酶附接到附接位点或附接接头(例如,在***膜内之前,整批)。还可以在膜中形成(例如,七聚体)纳米孔之后将聚合酶附接到附接位点或附接接头。在某些情况下,将多个纳米孔-聚合酶对***生物芯片的多个膜(例如,配置在孔和/或电极上)中。在某些情况下,聚合酶与纳米孔复合物的附接发生在每个电极上面的生物芯片上。
可以用任何合适的化学法(例如,共价键和/或接头)将聚合酶附接到纳米孔。在某些情况下,用分子钉(molecular staple)将聚合酶附接到纳米孔。在某些情况下,分子钉包含三个氨基酸序列(表示为接头A、B和C)。接头A可以从溶血素单体伸出,接头B可以从聚合酶伸出,然后接头C可以结合接头A和B(例如,通过缠绕在接头A和B周围),且从而将聚合酶附接到纳米孔。还可以将接头C构造为接头A或接头B的部分,从而减少接头分子的数目。
在某些情况下,使用SolulinkTM化学法将聚合酶连接至纳米孔。SolulinkTM可以是HyNic(6-肼基烟酸,一种芳族肼)和4FB(4-甲酰基苯甲酸酯,一种芳族醛)之间的反应。在某些情况下,使用点击化学(例如可从Life Technologies获得)将聚合酶连接至纳米孔。在某些情况下,将锌指突变引入溶血素分子中,并然后使用分子(例如,DNA中间分子)将聚合酶连接至溶血素上的锌指位点。
化学计量学和将αHL亚基布置进七聚体孔中
在另一个方面,提供了异寡聚体αHL七聚体和用于制备七聚体的方法。通过调节化学计量学和它们的亚基组分的连续布置,可以形成异寡聚体七聚体。通过亚基的寡聚化结构域中的突变的相互作用来确定连续布置。
通过7个野生型单体亚基的自组装而形成七聚体野生型αHL孔。每个单体亚基包含第一和第二寡聚化结构域,其中一个亚基的第一寡聚化结构域与另一个亚基的第二寡聚化结构域相互作用以实现单体亚基向七聚体αHL孔的自组装。第一寡聚化结构域区域(即,每个单体亚基的位点1)包含与SEQ ID NO: 3的αHL的氨基酸位置20-28、35-42和53-61对应的氨基酸。第二接口区域(即,每个αHL单体的位点2)包含与SEQ ID NO: 3的αHL亚基的氨基酸位置158-164、95-104、43-48和228-236对应的氨基酸。图6A解释了单体亚基的第一(601)和第二(602)寡聚化结构域各自的定位。在图6B中示意地显示了7个编号为i、ii、iii、iv、v、vi和vii的单体亚基的寡聚化结构域的相互作用的定位(随着它们寡聚化成七聚体αHL孔)。
但是,经工程改造的单体的组装可以产生具有不希望的化学计量学的寡聚体。例如,经工程改造的亚基的组装可以产生由4个二聚体亚基组成的八聚体,或由3个二聚体亚基组成的六聚体(Hammerstein等人, 2011)。因此,有利的是,控制αHL亚基的组装以提供七聚体形式,其为实现αHL孔的感知能力的化学计量学。
在一个实施方案中,通过在界面(即,寡聚化结构域)处在每个亚基上引入突变以破坏亚基-亚基相互作用,可以得到αHL亚基向七聚体孔的寡聚化。如上所述,和在图6A和6B中描绘的,在每个亚基上存在2个寡聚化结构域,并且可以将一个或多个突变引入每个亚基的第一寡聚化结构域和/或第二寡聚化结构域以抑制亚基间接触并由此阻止亚基寡聚化成具有不希望的亚基化学计量学的αHL多聚体。抑制亚基间相互作用的突变在本文中被称作中断突变。可以将每个亚基的每个寡聚化结构域修饰成包含一个或多个中断突变。在某些实施方案中,可以将第一寡聚化结构域中的一个或多个氨基酸突变以提供一个或多个中断突变。类似地,可以将第二寡聚化结构域中的一个或多个氨基酸突变以提供一个或多个中断突变。在其它实施方案中,可以将每个亚基的第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域中的一个或多个氨基酸突变以提供一个或多个中断突变。
在寡聚化结构域处可以做出的突变包括置换、缺失和***。这些结构域中的氨基酸的优选突变是氨基酸置换。
在某些实施方案中,将与SEQ ID NO: 3的αHL亚基的第一寡聚化结构域的位置20-28、35-42和53-61对应的氨基酸中的一个或多个突变以将一个或多个中断突变引入αHL亚基的第一寡聚化结构域中。在某些实施方案中,在第一寡聚化结构域处的中断突变包括SEQID NO: 3的D24A、V26D、K37S、H35I、H35D、H35E、H35L和D24A+V26D+K37S。
在其它实施方案中,将与SEQ ID NO: 3的αHL亚基的位置158-164、95-104、43-48和228-236对应的氨基酸中的一个或多个突变以将一个或多个中断突变引入αHL亚基的第二寡聚化结构域中。在某些实施方案中,在第二寡聚化结构域处的中断突变包括SEQ IDNO: 3的T233R、S99K、Y101D、Y101H和T233R+S99K。图8A和8B表明,在有脂质存在下,不可将具有在第一寡聚化结构域和/或第二寡聚化结构域处的中断突变的突变的单体重构进寡聚体蛋白中。
为了实现包含中断突变的亚基的受控寡聚化,将挽救突变和/或同源突变引入亚基的一个或两个寡聚化结构域中以逆转中断突变的影响并允许寡聚化所必需的必要亚基间相互作用和七聚体纳米孔的形成。图6C显示了在αHL亚基的寡聚化结构域上在允许或抑制寡聚化的突变之间的相互作用的类型。中断突变1和2 (BM1, BM2)通过它们所在的结构域抑制亚基的寡聚化。类似地,中断突变(例如,BM1)抑制与野生型亚基的寡聚化。通过带叉的断裂箭头线表示寡聚化的抑制。中断突变(例如,BM1)的中断效应的逆转由同源突变(CM)和/或挽救突变(RM)实现。用实箭头线描绘寡聚化的实现。
同源突变(CM)(其本身为中断突变)当存在于第一亚基的寡聚化结构域上时可以与另一个亚基的寡聚化结构域上的中断突变(例如,BM1)相互作用以恢复两个亚基寡聚化的能力。中断突变和同源突变的配对也规定哪两个亚基可以在该过程中相互作用。在某些实施方案中,在一个亚基(即,在先亚基)的第一寡聚化结构域上的中断突变允许通过第二亚基(即,在后亚基)的第二寡聚化结构域上的同源突变实现第二亚基的相互作用,因为所述同源突变会逆转中断突变的影响以允许通过第一结构域和第二结构域实现的亚基间相互作用。
挽救突变(RM)(其不是中断突变)当存在于第一亚基的寡聚化结构域上时可以与另一个亚基的寡聚化结构域上的中断突变(例如,BM1)相互作用以恢复两个亚基寡聚化的能力。中断突变和挽救突变的配对也规定哪两个亚基可以在该过程中相互作用。在某些实施方案中,在一个亚基(即,在先亚基)的第一寡聚化结构域上的中断突变允许通过第二亚基(即,在后亚基)的第二寡聚化结构域上的挽救突变实现第二亚基的相互作用,因为所述挽救突变会逆转中断突变的影响以允许通过第一结构域和第二结构域实现的亚基间相互作用。
因而,在某些实施方案中,与SEQ ID NO: 3的αHL亚基的第一寡聚化结构域的位置20-28、35-42和53-61对应的一个或多个氨基酸的至少一个突变是中断突变,和/或与SEQID NO: 3的αHL亚基的第二寡聚化结构域的位置158-164、95-104、43-48和228-236对应的一个或多个氨基酸的至少一个突变是挽救突变和/或同源突变,其实现分别与在后亚基或在前亚基的对应第二寡聚化结构域和第一寡聚化结构域的亚基间相互作用。可替换地,与SEQ ID NO: 3的第二寡聚化结构域的位置158-164、95-104、43-48和228-236对应的一个或多个氨基酸的至少一个突变是中断突变,和/或与SEQ ID NO: 3的αHL亚基的第一寡聚化结构域的位置20-28、35-42和53-61对应的一个或多个氨基酸的至少一个突变是同源突变和/或挽救突变。应当理解,在一个亚基的一个结构域中的中断突变可以与另一个亚基的一个结构域的挽救突变和/或同源突变相互作用以实现亚基的寡聚化。当与未突变的αHL亚基的寡聚化对比时,所述一个或多个中断突变使亚基的寡聚化抑制了至少约10%、20%、30%40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多。在一个亚基上的一个或多个挽救突变和/或同源突变会实现与另一个亚基上的中断突变的亚基间相互作用,以得到当与未突变的αHL亚基的寡聚化对比时,或者当与不含挽救突变和/或同源突变的亚基和包含中断突变的亚基的寡聚化对比时,至少约10%、20%、30%40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多的亚基寡聚化。
在另一个实施方案中,可以在在先亚基上的第一寡聚化结构域中的中断突变和在后亚基的第二结构域中的挽救突变和/或同源突变之间建立亚基间相互作用。因此,可以在在先亚基的每个第一寡聚化结构域中做出至少一个中断突变,并且可以在在后亚基的每个第二寡聚化结构域中做出至少一个中断突变。在某些实施方案中,在后亚基的第二寡聚化结构域中的至少一个中断突变是同源突变,其当与在先亚基上的中断突变配对时允许亚基间相互作用,由此实现所述亚基的寡聚化。在其它实施方案中,在后亚基的第二寡聚化结构域中的突变是挽救突变,其当与在先亚基的第一寡聚化结构域上的中断突变配对时允许亚基间相互作用,由此实现所述亚基的寡聚化。
在某些实施方案中,寡聚化亚基可以包含至少一个可将它自身转化成同源突变的中断突变,即,所述中断突变可以是自挽救突变。申请人发现存在这样的中断突变:其在低于30℃的温度抑制单体的寡聚化,但是当所述过程在大于30℃的温度进行时,其实现寡聚化。例如,且参考实施例11和图14,具有SEQ ID NO: 3的中断突变H35G的单体在25℃不能寡聚化。但是,当重构相同单体(即,具有相同H35G突变的单体)时,所述单体能够在37℃寡聚化。因此,在某些实施方案中,七聚体可以包含在第一寡聚化结构域和/或第二寡聚化结构域中的至少一个为自挽救突变的中断突变,其实现亚基的寡聚化。在某些实施方案中,中断突变向自挽救突变的转化发生在30℃和50℃之间、35℃和45℃之间、或37℃和43℃之间的温度。在某些实施方案中,中断突变向自挽救突变的转化发生在约30℃、35℃、40℃、45℃或50℃中的任一个。应当理解,缺乏变性、中断突变向自挽救突变的转化可以发生在大于50℃的温度。在某些实施方案中,所述自挽救突变是与SEQ ID NO: 3中的H35G对应的氨基酸置换。
自挽救突变是特别有用的,因为有利的是在较高的温度将孔亚基(例如,单体)寡聚化。包含自挽救突变的变体在较低温度的蛋白表达允许准确确定单体浓度(由于寡聚化的抑制/阻断)。相反,野生型单体可以寡聚化并作为单体和寡聚体的混合物存在。WT寡聚化会导致单体浓度的不准确测量。溶液中的单体的真实浓度的知识在得到制备期望的七聚体孔所需的亚基类型的正确比率中是关键性的。因此,自挽救突变(其在较低温度作为中断突变起作用)会阻止寡聚化并由此允许准确确定单体浓度。随后,可以在较高温度得到期望的七聚体孔,在该温度相同的中断突变转化成自挽救突变以允许期望的寡聚化。
寡聚化亚基可以是单体,或它们可以是2个连接的单体(二聚体多联体)、3个连接的单体(三聚体多联体)、4个连接的单体(四聚体多联体)、5个连接的单体(五多联体)、6个连接的单体(六多联体)和7个连接的单体(七多联体)的多联体。多联体亚基的第一寡聚化结构域是多联体的第一个单体(N-端)的第一寡聚化结构域;且多联体亚基的第二寡聚化结构域是多联体的最后一个(C-端)单体的第二寡聚化结构域。所述单体亚基可以通过接头多肽连接,所述接头多肽将在先单体的C-端末端连接至在后单体的N-端末端。图6D显示了一种寡聚化亚基,其为通过接头(--------)连接的两个αHL单体vii和i的多联体。在该多联体亚基中,第一寡聚化结构域(☐)是第一亚基vii的第一寡聚化结构域,且多联体亚基的第二寡聚化结构域(★)是多联体中的第二αHL单体(i)的第二寡聚化结构域。所述接头可以是通过共价力连接第一区域和第二区域的分子的任何形式。具体地,所述接头可以是将在本发明的背景下起作用的任何长度的肽或多肽,包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或更多个氨基酸中的任一种,或将为了本发明的目的起作用的任意数目或范围的氨基酸。所述氨基酸接头可以包括合成的或天然存在的氨基酸残基。本领域普通技术人员将能够确定和测试任何数目的接头的类型和长度。所述接头可以是在在先亚基的C-端和在后亚基的N-端之间。在某些实施方案中,所述接头是至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个或至多30个氨基酸的柔性接头。在某些实施方案中,所述接头具有约10个氨基酸。在其它实施方案中,所述接头具有约5个氨基酸。
在某些实施方案中,可以在多联体多肽的一个或两个C-端和N-端处提供连接组分和/或纯化组分。纯化组分包括、但不限于His6 (SEQ ID NO: 10)和FLAG表位。连接组分包括、但不限于SpyTag/SpyCatcher肽***(Zakeri等人. PNAS109:E690-E697 [2012])、天然化学连接(Thapa等人, Molecules 19:14461-14483 [2014])、分选酶***(Wu和Guo, JCarbohydr Chem 31:48-66 [2012]; Heck等人, Appl Microbiol Biotechnol 97:461-475 [2013]))、转谷氨酰胺酶***(Dennler等人, Bioconjug Chem 25:569-578 [2014])、甲酰基甘氨酸连接(Rashidian等人, Bioconjug Chem 24:1277-1294 [2013])或本领域已知的其它化学连接技术。连接组分可以用于将酶(例如,聚合酶)附接至αHL亚基。可以附接至αHL孔的酶包括聚合酶,例如,DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。在某些实施方案中,可以将聚合酶通过两个不同αHL亚基上的连接组分附接至αHL七聚体孔内的两个不同αHL亚基。在其它实施方案中,可以将聚合酶通过三个不同αHL亚基上的连接组分附接至αHL七聚体孔内的三个不同αHL亚基。在其它实施方案中,可以将两个或多个酶附接至任意数目的αHL亚基。图7A - 7F也显示了2、3和4个单体的多联体亚基的实施例以及附接组分和/或纯化组分的定位。
所述包含在第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域中的一个或多个突变的突变单体或单体多联体可以进一步包含在多肽单体或单体多联体的第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域以外的区域中的一个或多个突变。例如,包含在与SEQ ID NO: 3的位置12或17对应的位置处的氨基酸置换(与亲本αHL的TTT相比,其改变αHL的TTT)的变体αHL单体多肽可以进一步突变成包含突变,例如,在第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域处的氨基酸置换,以赋予所述亚基形成七聚体αHL孔的能力。
其它实施方案涉及编码单体和单体多联体的突变αHL寡聚化亚基的核酸。在某些实施方案中,这些核酸编码在第一寡聚化结构域处和/或在第二寡聚化结构域处具有一个或多个突变的寡聚化亚基,如本文别处所述。在某些实施方案中,将与多联体亚基中的在先单体的C-端连接的单体的起始ATG除去以避免晚起始产物。
所述多核苷酸可以进一步包含信号序列。
在某些实施方案中,所述多核苷酸还包含编码接头的序列,所述接头连接单体多联体中的单体单元,如本文别处所述。
在其它实施方案中,所述多核苷酸包含编码纯化组分和/或连接组分的序列。
在某些实施方案中,所述多核苷酸包含编码纯化组分和/或连接组分的序列(图7A-7F)。所述纯化组分和/或连接组分可以位于寡聚化亚基的N-端和/或C-端。纯化组分和/或连接组分还可以附接在多肽的任何区域,即,在C-端和N-端之间的区域。在某些实施方案中,所述纯化组分和连接组分可以位于寡聚化亚基的N-端或C-端。在某些实施方案中,至少一个纯化组分可以位于N-端,且连接组分可以位于寡聚化亚基的C-端。在其它实施方案中,至少一个纯化组分可以位于C-端,且连接组分可以位于寡聚化亚基的N-端。在某些实施方案中,至少一个连接组分可以位于多肽内,且纯化组分可以位于C-端。在某些实施方案中,至少一个连接组分可以位于多肽内,且纯化组分可以位于N-端。
在本发明的某些方面,所述核酸是可表达的以产生多肽。所述多肽可以在原核细胞或真核细胞中表达,或在无细胞***中表达。用于表达的优选细胞包括、但不限于细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
本发明的另一个方面包含载体,其包含编码本发明的多肽的全部或部分的核酸。所述载体可以例如是克隆载体或表达载体。本发明的克隆载体可以被包含在任意合适的重组宿主细胞中,如本文别处所述或本领域技术人员已知的。
还提供了用于制备异寡聚体αHL七聚体蛋白的方法。在宿主细胞中表达编码突变αHL亚基的多核苷酸。在不同的宿主细胞中分别表达编码不同的突变αHL亚基的不同多核苷酸。任选地,将每种表达的亚基多肽纯化,并随后混合以允许寡聚化成异寡聚体αHL七聚体。在某些实施方案中,所述方法可以包含:提供第一多核苷酸,其编码在第一寡聚化结构域中和/或在第二寡聚化结构域中具有一个或多个中断突变的第一突变αHL亚基,培养用编码第一突变αHL亚基的第一多核苷酸的表达载体转化或转染的宿主细胞;提供第二多核苷酸,其编码在第一寡聚化结构域和/或第二寡聚化结构域中具有至少一个挽救突变和/或同源突变的第二突变αHL亚基,培养用编码第二αHL亚基的第二多核苷酸的表达载体转化或转染的第二宿主细胞,其中所述第一和第二突变αHL亚基寡聚化以形成至少一个αHL二聚体、至少一个αHL三聚体、至少一个αHL四聚体、至少一个αHL五聚体、至少一个αHL六聚体或至少一个αHL七聚体。所述方法可以进一步包含纯化第一突变αHL亚基和第二突变αHL亚基。纯化的αHL亚基可以在有脂质存在下寡聚化以形成七聚体αHL孔。应当理解,七聚体αHL孔可以如下形成:通过单个单体亚基(例如,7个αHL单体亚基)的寡聚化,通过多联体亚基(例如,3个αHL单体的多联体和4个αHL单体的多联体)的寡聚化,或通过αHL单体亚基和αHL多联体亚基(例如,3个αHL单体亚基和4个αHL单体的多联体亚基)的混合物的寡聚化。所述αHL孔保留随着核苷酸被附接至αHL孔的聚合酶掺入新多核苷酸链鉴定核苷酸标签的能力。
设备设置
纳米孔可以形成在或以其它方式嵌入配置在与传感电路(诸如集成电路)的传感电极邻近的膜中。集成电路可以是专用集成电路(ASIC)。在某些实施例中,集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)。传感电路可以位于具有纳米孔的芯片或其它装置中,或者位于芯片或装置外,例如处于芯片外(off-chip)构型。半导体可以是任何半导体,包括、但不限于IV族(例如硅)和III-V族半导体(例如砷化镓)。关于用于感知核苷酸或标签的设备和装置设置,参见,例如,WO 2013/123450。
基于孔的传感器(例如,生物芯片)可以用于单分子的电询问(electro-interrogation)。基于孔的传感器可以包括形成于膜中的本公开内容的纳米孔,所述膜被配置为邻近或接近传感电极。传感器可以包括对应电极。膜包括反侧(即,面向传感电极的一侧)和顺侧(即,面向对应电极的一侧)。
在下面的实验公开内容中,应用以下缩写:eq(当量);M(摩尔); μ Μ(微摩尔);N(标准的);mole(摩尔);mmol(毫摩尔); μmol(微摩尔);nmol(纳摩尔);g(克);mg(毫克);kg(千克); μg(微克);L(升);ml(毫升); μl(微升);cm(厘米);mm(毫米); μm(微米);nm(纳米);℃(摄氏度);h(小时);min(分钟);sec(秒);msec(毫秒)。
实施例
在以下实施例中更详细地描述本发明,以下实施例不以任何方式意图限制所要求保护的本发明的范围。附图意图被视作本发明的说明书和描述的组成部分。引用的所有参考文献对于其中描述的所有内容都通过引用特别并入本文中。提供下述实施例来解释、而不是限制要求保护的发明。
实施例1
表达和回收
该实施例解释了来自细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)的蛋白的表达和回收。
编码野生型a-HL的DNA购自商业来源。通过测序验证序列。
质粒构建. 将编码野生型或变体α-溶血素的基因***pPR-IBA2质粒(IBA LifeSciences, 德国)中在T7启动子的控制下。
转化. 使用本领域众所周知的技术,将大肠杆菌BL21 DE3(来自LifeTechnologies)细胞用包含编码野生型或变体α-溶血素的DNA的表达载体转化。简言之,将细胞在冰上解冻(如果冷冻的话)。接着,将期望的DNA(在合适的载体/质粒中)直接加入到感受态细胞中(不应超过感受态细胞的5%),并通过轻弹管来混合。将管置于冰上20分钟。接着,将细胞置于42℃水浴中45秒而不混合,然后将管置于冰上2分钟。然后将细胞转移到含有0.9 ml SOC培养基的15 ml灭菌的培养管(在室温预热)中,并在振荡器中于37℃培养1小时。最后,将细胞的等分试样涂布在含有适当抗生素的LB琼脂平板上,并将平板在37℃温育过夜。
蛋白表达. 转化后,挑取菌落,并在37℃振荡下接种到小体积(例如,3 ml)的含有合适抗生素的生长培养基(例如,LB液体培养基)中过夜。
次日早晨,将1 ml过夜培养物转移到新的100 ml自诱导培养基,例如,含有适当抗生素的Magic Media(Life Technologies),以选择表达质粒。在25℃振荡下使培养物生长大约16小时,但这取决于表达质粒。通过在4℃在3,000g离心20 min收获细胞,并在使用前在-80℃储存。
纯化. 通过超声处理裂解细胞。通过亲和柱色谱法将α-溶血素纯化至均匀。
实施例2
T12和/或N17变体
以下实施例详述了突变在所期望的残基处的引入。
突变. 使用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)进行定点诱变以制备SEQ ID NO: 3的T12和/或N17变体。
如在实施例1中表达和纯化变体。
实施例3
纳米孔的组装
该实施例描述了包含六个a-HL变体亚基和一个野生型亚基的纳米孔的组装。
将野生型a-HL如实施例1所述与SpyTag和HisTag一起表达,并使用钴洗脱缓冲液(200mM NaCl, 300mM咪唑, 50mM Tris, pH 8)在钴亲和柱上纯化。将期望的a-HL变体如在实施例1中所述与StrepTag一起表达,并使用洗脱缓冲液(50mM tris, 5mM脱硫生物素,200mM NaCl, pH 8)在快速蛋白液相色谱法(FPLC)上使用Streptactin亲和柱进行纯化。如果在5天内使用,则将蛋白在4℃储存,否则加入8%海藻糖并将蛋白在-80℃储存。
使用大约20mg总蛋白,将野生型a-HL和期望的a-HL变体溶液以1:6的比率混合在一起。将二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质溶解于50mM Tris、200mM NaCl(pH 8)或150mMKCl、30mM HEPES(pH 7.5)中至50mg/ml的终浓度,并加入到a-HL单体的混合物中至5mg/ml的终浓度。将a-HL单体的混合物在40℃温育至少10min。将脂质溶血素混合物应用于尺寸排阻色谱柱以从寡聚化的蛋白分离脂质。
实施例4
聚合酶的附接
该实施例提供聚合酶向纳米孔的附接。
可以通过任何合适的方式将聚合酶与纳米孔偶联。参见,例如PCT/US2013/068967(公开为WO2014/074727;Genia Technologies),PCT/US2005/009702(公开为WO2006/028508)和PCT/US2011/065640(公开为WO2012/083249;Columbia Univ)。
将聚合酶(例如,phi29 DNA聚合酶)通过接头分子与蛋白纳米孔(例如,α-溶血素)偶联。具体地,使用SpyTag和SpyCatcher***,其在生理条件下自发地形成共价的异肽键。参见,例如,Li等人, J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309-17。
将粘性phi29 SpyCatcher HisTag根据实施例1表达,并使用钴亲和柱进行纯化。将SpyCatcher聚合酶和SpyTag寡聚化蛋白在4℃在3mM SrCl2中温育过夜。然后使用尺寸排阻色谱法纯化1:6-聚合酶-模板复合物。
实施例5
变体的活性
该实施例显示了由实施例3和4提供的纳米孔(具有附接的聚合酶的纳米孔)的活性。
测定野生型和变体纳米孔以确定在一个或多个位置的突变的影响。将该测定设计为使用交变电压(即,方波)测量通过附接到纳米孔的DNA聚合酶捕获带标签的分子所花费的时间。
如于2014年10月23日提交的PCT/US14/61853中所述的,形成双层并***孔。用于检测分子(和/或对核酸测序)的纳米孔装置(或传感器)如WO2013/123450中所述设置。
为了测量在我们的测序复合物中DNA聚合酶捕获带标签的核苷酸所花费的时间,我们已经设计了一种使用交变的正电压和负电压(方波)来确定所花费的时间量的测定。我们的测序复合物包含附接到单个DNA聚合酶的蛋白纳米孔(αHL)(参见实施例4)。带标签的核苷酸是带负电荷的,且因此当施加的电压在性质上为正时被吸引到纳米孔,并且当施加到纳米孔测序复合物的电压为负时被排斥。我们因此可以通过循环正电位和负电位之间的电压来测量标签穿入孔所花费的时间,并确定与当标签穿入时(减小的电流通量)相比纳米孔的电流有多少时间是无阻塞的(开放通道)。
为了进行该“穿入时间”测定,将Genia测序装置与Genia测序芯片(GeniaSequencing Chip)一起使用。如在PCT/US2013/026514中所解释的,调节电极并且在芯片上建立磷脂双层。将Genia的测序复合物按照PCT/US2013/026514(公开为WO2013/123450)中描述的方案***双层。
使用包含20mM HEPES pH 7.5、300mM KCl、3uM带标签的核苷酸、3mM Ca2+的缓冲***收集在该实施例中显示的穿入时间数据,其中施加±100mV的电压,占空比为5Hz。在收集数据之后,针对特定方波分析它,所述特定方波显示持续到方波的正部分结束且随后为在随后方波上的另一个标签捕获的带标签的核苷酸的捕获(穿入水平)。通过确定第二个方波报告多长时间的无阻塞的开放通道电流来测量穿入时间。作为一个例子,如果10个连续方波显示持续到方波的正部分结束的带标签的核苷酸捕获,则将从方波2-10计算穿入时间参数(因为在先前方波中聚合酶不具有与其结合的标签,所以第一个方波不计入计算)。然后收集实验中所有孔的这些穿入时间数值,并从它们提取统计参数(诸如平均值、中位数、标准差等)。
结果显示在图1A-1B、2A-2B、3A-3B、4A-4B和5A-5B中。
实施例6
寡聚化缺陷亚基中的中断突变
该实施例表明,中断突变会阻止或减少αHL单体亚基的自寡聚化。
使用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)进行定点诱变以在包含实施例2所述的N17K突变的α-溶血素变体的第一(位点1)和第二(位点2)寡聚化结构域中的每一个处引入单个氨基酸突变。
编码溶血素变体N17K单体的DNA多核苷酸还包含在N17K变体的第一或第二寡聚化结构域中的以下突变之一:H35D、D24A+V26D+K37S、H35E、H35L、H35I、T233R+S99K、Y101D、Y101H、H35N和T233R+S99K+D24A+V26D+K37S,将其克隆进pPR-IBA2质粒中,在大肠杆菌中表达,并随后如在实施例1中所述纯化。
将纯化的突变的N17K变体单体在有脂质存在下重构以确定每个突变在抑制单体自寡聚化中的能力。将5mg/mL DoPhPC脂质在1mg/ml的浓度加给蛋白,并将混合物在30℃温育30分钟。用5%β-OG溶解脂质体。通过对重构的突变变体进行SDS-PAGE凝胶电泳,确定每种突变变体的单体和寡聚体的存在或不存在。结果显示在图8A和8B的凝胶以及图13所示的凝胶的泳带4-7中。
为了测试中断突变是否可以被野生型αHL单体(Hemo M)挽救,将Hemo M以1:1比率加给具有突变D24A+V26D+K37S和T233R+S99K的单体。在图9中所示的结果证实,这些中断突变不可被野生型单体挽救,即,在野生型单体的第一或第二寡聚化结构域上的未突变氨基酸不会挽救具有所示突变的单体的相互作用。
另外,确定了具有突变D24A+V26D+K37S、T233R+S99K、H35E、H35D、H35N和H35L的突变变体单体/寡聚体的相对迁移率(Rf)。
Rf值的结果显示在下面表1中。确定未突变的N17K变体单体保留自寡聚化的能力,其中66.3%的单体作为寡聚体存在。
总之,数据表明在溶血素变体单体的一个或两个寡聚化结构域(位点1和2)处做出的中断突变会阻止或实质上减小所述单体的自寡聚化能力。
表1
突变的N17K变体单体的自寡聚化
突变体 | 自寡聚体 | %自寡聚体 |
D24A + V26D + K37S | - | 0 |
T233R + S99K | - | 0 |
H35E | - | 0 |
H35D | - | 0 |
H35N | - | 0 |
H35L | + | 2.8 |
实施例7
寡聚化的二聚体多联体的纯化重构
该实施例证实了由包含两种野生型αHL单体的多联体的亚基的寡聚化引起的寡聚体形成。
将编码包含信号序列、(pelB)、第一αHL单体、(Hemo 1)、接头(GS)5 (SEQ ID NO:9)、第二αHL单体(Hemo 2)和纯化标签-附接标签(His6-SpyTag) (“His6”公开为SEQ IDNO: 10)的αHL蛋白的DNA多核苷酸克隆进pPR-IBA2质粒,在大肠杆菌中表达,并随后如在实施例1中所述纯化。
将纯化的多联体二聚体纯化为通过SEC得到的单个峰(图10A和10B)。
通过将蛋白与DoPhPC脂质一起在37℃温育10分钟,将纯化的多联体在有脂质存在下重构。将脂质体溶解,并进行电泳,如在实施例6中所述。
图11表明,两个单体的αHL多联体具有自寡聚化的能力。
预见到,引入中断突变,例如如关于实施例6中的单体所述的那些,将消除二聚体多联体的自寡聚化能力,且可以随后用于管理化学计量学和αHL亚基向功能性七聚体孔的排列。
实施例8
寡聚化的三聚体和四聚体多联体的表达和纯化
该实施例显示了三个和四个αHL单体的多联体的表达和纯化。
如关于实施例7中的二聚体多联体所述,表达和纯化αHL单体的三聚体和四聚体多联体亚基。编码三聚体多联体的多核苷酸表达下述寡聚化亚基:
(pelB)、第一αHL单体、(Hemo 1)、接头(GS)5 (SEQ ID NO: 9)、第二αHL单体(Hemo 2)、接头(GS)5 (SEQ ID NO: 9)、第三αHL单体(Hemo 3)和StrepII标签。
编码四聚体多联体的多核苷酸表达下述寡聚化亚基:
信号序列(pelB)、第一αHL单体、(Hemo 1)、接头(GS)5 (SEQ ID NO: 9)、第二αHL单体(Hemo 2)、接头(GS)5 (SEQ ID NO: 9)、第三αHL单体(Hemo 3)、接头(GS)5 (SEQ ID NO:9)、第四αHL单体(Hemo 4)和His-SpyTag。
将所述多联体在大肠杆菌中表达并如在实施例1中所述纯化,然后进行电泳。
图12表明,可以表达和纯化3和4个连接的单体的浓缩亚基。在凝胶上看到的二聚体和单体是在纯化过程中发生的降解的结果,并且可以如下最小化:在多联体的N-端处引入亲和标签,并与使用N-端亲和标签的纯化步骤组合。
实施例9
功能性异寡聚体α-溶血素七聚体纳米孔
为了确定亚基多联体的形成功能性αHL孔的能力,在有脂质存在下将三个单体的第一αHL多联体亚基与四个单体的第二αHL多联体亚基组合以提供七聚体aHL孔。
将中断突变(即,氨基酸置换)引入在三聚体和四聚体多联体亚基的每个第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域中。另外,将同源突变和/或挽救突变引入作为三聚体和四聚体多联体的第一寡聚化结构域中的氨基酸置换。使用如在实施例2中所述的定点诱变产生突变。使用在实施例4中描述的方法,将聚合酶附接至每个多联体亚基。
如在实施例5中所述,测量纳米孔的活性。
两个多联体亚基的异寡聚体α-溶血素七聚体保留在脂质双层中形成七聚体纳米孔的能力。
实施例10
同源突变实现亚基的寡聚化
为了证实αHL亚基的第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域中的突变能力,分别在变体N17KαHL单体的第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域中做出氨基酸置换H35I和Y101H。
将突变变体单体在细菌中表达并如在实施例6中所述纯化。
接着,将纯化的突变的N17K变体单体在有脂质存在下重构以确定寡聚化结构域中的突变在抑制或实现突变变体单体的寡聚化中的能力。将5mg/mL DoPhPC脂质以1mg/ml的浓度加给单体蛋白,并将混合物在30℃温育30分钟。用5%β-OG溶解脂质体。通过对重构的突变变体进行SDS-PAGE凝胶电泳,确定突变变体的单体和寡聚体的存在或不存在。结果显示在图13中。
泳道5表明,单独的突变H35I会抑制突变变体单体的寡聚化。类似地,泳道7表明,单独的突变Y101H也会抑制寡聚化,即,H35I和Y101H被证实为中断突变。但是,当在变体单体上做出突变H35I和Y101H时(泳道9),突变变体αHL单体的能力被恢复,即,当配对时,H35I和Y101H是允许亚基间相互作用和实现αHL单体的寡聚化的同源突变。
这些数据表明,通过在亚基的第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域中做出的突变的配对,可以控制αHL亚基(例如,单体)的亚基相互作用和寡聚化。
实施例11
中断突变的温度依赖性转化
执行实验以鉴定中断突变和能够实现亚基的寡聚化的对应挽救突变和/或同源突变,申请人意外地发现了在较高温度可以转化成它们自身的同源突变的中断突变。
在25℃和在37℃在脂质中重构具有在第一寡聚化结构域中的H35G突变的αHL单体。如在实施例10中所述执行重构。
结果显示在图14中。泳道2表明,在有脂质存在下,具有H35G突变的单体在25℃没有寡聚化。因此,泳道2表明,H35G突变是抑制亚基间相互作用和突变亚基的寡聚化的中断突变。但是,如在泳道4中所示,当在37℃在脂质中重构相同的突变单体时,观察到亚基的寡聚化。
这些数据证实,在较高的温度,例如,37℃相对于25℃,具有H35G中断突变的亚基可以寡聚化。
因此,除了将中断突变与同源突变和/或挽救突变配对以实现亚基的寡聚化以外,中断突变可以转化成它们自身的同源突变并实现寡聚化。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1 (WTαHL DNA)
SEQ ID NO: 2 (WTαHL氨基酸) [在大肠杆菌中表达]
SEQ ID NO: 3 (用于编号的成熟WTαHL序列)
SEQ ID NO: 4 (N17KαHL氨基酸)
SEQ ID NO: 5 (N17RαHL氨基酸)
SEQ ID NO: 6 (T12KαHL氨基酸)
SEQ ID NO: 7 (T12RαHL氨基酸)
SEQ ID NO: 8 (成熟的WT aHL; AAA26598)
引文列表
专利文献
[1] 标题为“Methods for Creating Bilayers for Use with Nanopore Sensors”的PCT/US2013/026514 (公开为WO2013/123450)
[2] 标题为“Nucleic Acid Sequencing Using Tags”的PCT/US2013/068967 (公开为WO 2014/074727)
[3] 2014年10月23日提交的标题为“Methods for Forming Lipid Bilayers onBiochips”的PCT/US14/61853
非专利文献
[4] Aksimentiev和Schulten, Imaging a-Hemolysin with Molecular Dynamics: Ionic Conductance, Osmotic Permeability, and the Electrostatic Potential Map, Biophysical Journal (2005) 88: 3745-3761.
[5] Butler等人, Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore , PNAS (2008) 105(52): 20647-20652.
[6] Korchev等人, Low Conductance States of a Single Ion Channel are not ' Closed', J. Membrane Biol. (1995) 147:233-239.
[7] Krasilnikov和Sabirov, Ion Transport Through Channels Formed in Lipid Bilayers by Staphylococcus aureus Alpha-Toxin, Gen. Physiol. Biophys. (1989)8:213-222.
[8] Nakane等人, A Nanosensor for Transmembrane Capture and Identification of Single Nucleic Acid Molecules, Biophys. J. (2004) 87:615-621.
[9] Rhee和Burns, Nanopore sequencing technology: nanopore preparations,TRENDS in Biotech. (2007) 25(4):174-181.
[10] Song等人, Structure of Staphylococcalα-HemoIysin, a Heptameric Transmembrane Pore, Science (1996) 274:1859-1866.
[11] Kasianowicz等人, Nanometer-scale pores: potential applications for analyte detection and DNA characterization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996)93:13770-13773.
[12] Akeson等人, Microsecond timescale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules, Biophys. J. (1999) 77:3227-3233.
[13] Meller等人, Voltage-driven DNA translocations through a nanopore,Phys. Rev. Lett., 86 (2001), 第3435-3438页.
[14] Howorka等人, Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores, Nat. Biotechnol., 19 (2001a), 第636-639页.
[15] Howorka等人, Kinetics of duplex formation for individual DNA strands within a single protein nanopore, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (2001b), 第12996-13001页.
[16] Movileanu等人, Detecting protein analytes that modulate transmembrane movement of a polymer chain within a single protein pore, Nat.Biotechnol., 18 (2000), 第1091-1095页.
[17] Hammerstein等人, Subunit dimers ofα-Hemolysin Expand the EngineeringToolbox for Protein nanopores, J. Biol. Chem. (2011) 286:14324-14334.
[18] Zakeri等人. Peptide tag forming a covalent bond to a protein,through engineering a bacterial adhesion, PNAS109:E690-E697 (2012).
[19] Dennler等人, Transglutaminase-based chemo-enzymatic conjugationapproach yields homogenous antibody-drug conjugates, Bioconjug Chem 25:569-578 (2014).
[20] Thapa等人, Native Chemical Ligation: A boon to peptide chemistry,Molecules 19:14461-14483 [2014].
[21] Wu和Guo, Sortase-mediated transpeptidation for site-specificmodification of peptides, glycopeptides, and proteins, J Carbohydr Chem 31:48-66 [2012].
[22] Heck等人, Enzyme-catalyzed protein crosslinking, Appl MicrobiolBiotechnol 97:461-475 [2013].
[23] Rashidian等人, Chemoenzymatic labeling of proteins: techniques andapproaches, Bioconjug Chem 24:1277-1294 [2013]。
本文引用的每篇专利、专利申请、出版物、文件、GENBANK序列、网站和其它出版的材料的整个内容特此通过引用并入,包括所有表、图和数字。所有专利和出版物通过引用并入本文,其程度如同具体地地且单独地指出各自通过引用并入。上述专利、专利申请、出版物和文件的引用不是承认上述的任一项是相关的现有技术,也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。本文提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的普通技术人员的技能水平。
Claims (15)
1.一种异寡聚体α-溶血素(αHL)七聚体,其包含至少一个在前寡聚化亚基和至少一个在后寡聚化亚基,每个寡聚化亚基包含至少一个αHL单体和/或至少一个αHL单体的多联体,所述寡聚化亚基具有在第一寡聚化结构域中的一个或多个突变,和在第二寡聚化结构域中的一个或多个突变;其中所述第一结构域和/或第二结构域上的所述突变中的至少一个是中断突变,其阻止所述至少一个在前寡聚化亚基和所述至少一个在后寡聚化亚基的自寡聚化。
2.权利要求1的异寡聚体αHL七聚体,进一步包含在所述至少一个在前寡聚化亚基的所述第一寡聚化结构域上的至少一个同源和/或挽救突变,和/或在所述至少一个在后寡聚化亚基的所述第二寡聚化结构域上的至少一个同源和/或挽救突变,其中所述至少一个同源和/或挽救突变决定所述至少一个在前寡聚化亚基和所述至少一个在后寡聚化亚基之间的亚基间接触以规定所述异寡聚体αHL七聚体中的寡聚化亚基的序列。
3.权利要求1或2的异寡聚体αHL七聚体,其中所述αHL七聚体由至少一个为αHL单体的多联体的在前寡聚化亚基形成,且至少一个在后亚基是至少一个αHL单体。
4.权利要求1或2的异寡聚体αHL七聚体,其中所述αHL七聚体由至少一个在前寡聚化亚基和至少一个在后寡聚化亚基形成,所述亚基各自为αHL单体的多联体。
5.权利要求1或2的异寡聚体αHL七聚体,其中所述至少一个在前寡聚化亚基和所述至少一个在后寡聚化亚基是αHL单体中的每一个。
6.权利要求1-5中的任一项的异寡聚体αHL七聚体,其中所述αHL单体和/或所述αHL单体的多联体包含一个或多个SEQ ID NO: 3的多肽。
7.权利要求1-6中的任一项的异寡聚体αHL七聚体,其中所述异寡聚体αHL七聚体保留在脂质双层中形成孔的能力。
8.权利要求1-7中的任一项的异寡聚体αHL七聚体,还包含聚合酶,所述聚合酶附接至所述至少一个在前或在后寡聚化亚基中的一个或多个。
9.权利要求1-8中的任一项的异寡聚体αHL七聚体,其中所述αHL单体和/或所述αHL单体的多联体包含一个或多个SEQ ID NO: 3的多肽,其中至少一个SEQ ID NO: 3的多肽是变体,所述变体还包含在与SEQ ID NO: 3的位置12或17对应的位置处的置换,其中所述置换包含一个或多个正电荷。
10.多个多核苷酸,其编码权利要求1-9中的任一项的异寡聚体αHL七聚体的所述至少一个在前寡聚化亚基和所述至少一个在后寡聚化亚基。
11.多个宿主细胞,其各自用表达载体转化或转染,所述表达载体编码权利要求10的所述多个多核苷酸中的每一个之一。
12.一种七聚体孔组件,其包含根据权利要求1-9中的任一项的异寡聚体αHL七聚体。
13.一种用于检测靶分子的方法,所述方法包括:
(a)提供包含纳米孔的芯片,所述纳米孔包含处于配置为与传感电极邻近或接近的膜中的根据权利要求12的七聚体孔组件;
(b)引导核酸分子穿入所述纳米孔,其中所述核酸分子与报告分子结合,其中所述核酸分子包含寻址区和探针区,其中所述报告分子与所述核酸分子在所述探针区结合,并且其中所述报告分子与靶分子偶联;
(c)在所述核酸分子被引导穿入所述纳米孔时测序所述寻址区,以确定所述寻址区的核酸序列;和
(d)借助于计算机处理器,基于在(c)中确定的所述寻址区的核酸序列鉴定所述靶分子。
14.权利要求2的异寡聚体αHL七聚体,其中所述第一寡聚化结构域中的所述至少一个同源突变对应于SEQ ID NO: 3的H35I,且所述第二寡聚化结构域中的所述至少一个同源突变对应于SEQ ID NO: 3的Y101H。
15.权利要求1的异寡聚体αHL七聚体,其中所述一个或多个突变包含在与SEQ ID NO:3的H144对应的位置处的置换。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021208936A1 (zh) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 成都今是科技有限公司 | 纳米孔制备和检测方法及其检测装置 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3000561C (en) * | 2015-09-24 | 2022-03-22 | F. Hoffman-La Roche Ag | Alpha-hemolysin variants |
EP3436602A1 (en) * | 2016-03-31 | 2019-02-06 | Genia Technologies, Inc. | Nanopore protein conjugates and uses thereof |
CN109563140B (zh) * | 2016-04-21 | 2022-10-28 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | α-溶血素变体及其用途 |
WO2017202917A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tagged multi-nucleotides useful for nucleic acid sequencing |
US10669580B2 (en) | 2016-08-26 | 2020-06-02 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Tagged nucleotides useful for nanopore detection |
EP3759116A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-06 | F. Hoffmann-La Roche AG | Tagged nucleoside compounds useful for nanopore detection |
US20210142866A1 (en) * | 2018-05-23 | 2021-05-13 | William Marsh Rice University | Hybridization-based dna information storage to allow rapid and permanent erasure |
JP2023513128A (ja) | 2020-02-06 | 2023-03-30 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | ナノポアへの鋳型の貫通を低減する組成物 |
EP4196608A1 (en) | 2020-08-11 | 2023-06-21 | F. Hoffmann-La Roche AG | Nucleoside-5'-oligophosphates tagged with positively-charged polymers, nanopores incorporating negative charges, and methods and systems using the same |
EP4355912A1 (en) | 2021-06-17 | 2024-04-24 | F. Hoffmann-La Roche AG | Engineered nanopore with a negatively charged polymer threaded through the channel |
CN117999346A (zh) | 2021-07-21 | 2024-05-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 形成窄通道孔的α-溶血素变体及其用途 |
WO2023213766A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods that reduce prussian blue formation during nanopore sequencing |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999005167A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | University Of Massachusetts | Designed protein pores as components for biosensors |
CN102245760A (zh) * | 2008-07-07 | 2011-11-16 | 牛津纳米孔技术有限公司 | 酶-孔构建体 |
WO2014074727A1 (en) * | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Genia Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using tags |
CN104254619A (zh) * | 2012-02-16 | 2014-12-31 | 吉尼亚科技公司 | 产生用于纳米孔传感器的双层的方法 |
WO2015055981A2 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Modified enzymes |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006028508A2 (en) | 2004-03-23 | 2006-03-16 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and apparatus for characterizing polynucleotides |
GB0523282D0 (en) * | 2005-11-15 | 2005-12-21 | Isis Innovation | Methods using pores |
JP5658564B2 (ja) * | 2007-08-31 | 2015-01-28 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴThe University Of Chicago | ブドウ球菌肺疾患および状態に対する免疫に関連した方法および組成物 |
AU2009269792A1 (en) * | 2008-07-07 | 2010-01-14 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Base-detecting pore |
NZ612315A (en) * | 2009-04-14 | 2014-10-31 | Novartis Ag | Compositions for immunising against staphylococcus aureus |
CA2805247C (en) * | 2010-07-14 | 2021-08-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Nanopore-facilitated single molecule detection of nucleic acids |
US10443096B2 (en) | 2010-12-17 | 2019-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection |
CA2826566C (en) * | 2011-02-08 | 2022-09-13 | Medimmune, Llc | Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use |
WO2012178093A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Electronic Biosciences Inc. | High contrast signal to noise ratio device components |
AU2012360244B2 (en) | 2011-12-29 | 2018-08-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme method |
US20130244340A1 (en) * | 2012-01-20 | 2013-09-19 | Genia Technologies, Inc. | Nanopore Based Molecular Detection and Sequencing |
WO2014100481A2 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Electornic Biosciences Inc. | Modified alpha hemolysin polypeptides and methods of use |
WO2015016125A1 (ja) * | 2013-07-30 | 2015-02-05 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 改良型α-ヘモリシンおよびそれを用いたナノポアシーケンサ |
US9567630B2 (en) | 2013-10-23 | 2017-02-14 | Genia Technologies, Inc. | Methods for forming lipid bilayers on biochips |
US10301361B2 (en) * | 2014-10-31 | 2019-05-28 | Genia Technologies, Inc. | α-hemolysin variants with altered characteristics |
CA3000561C (en) * | 2015-09-24 | 2022-03-22 | F. Hoffman-La Roche Ag | Alpha-hemolysin variants |
-
2016
- 2016-09-20 CA CA3000561A patent/CA3000561C/en active Active
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-
2019
- 2019-01-03 US US16/238,874 patent/US10752948B2/en active Active
-
2020
- 2020-06-30 US US16/917,435 patent/US11261488B2/en active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999005167A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | University Of Massachusetts | Designed protein pores as components for biosensors |
CN102245760A (zh) * | 2008-07-07 | 2011-11-16 | 牛津纳米孔技术有限公司 | 酶-孔构建体 |
CN104254619A (zh) * | 2012-02-16 | 2014-12-31 | 吉尼亚科技公司 | 产生用于纳米孔传感器的双层的方法 |
WO2014074727A1 (en) * | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Genia Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using tags |
WO2015055981A2 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Modified enzymes |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021208936A1 (zh) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 成都今是科技有限公司 | 纳米孔制备和检测方法及其检测装置 |
CN115398008A (zh) * | 2020-04-14 | 2022-11-25 | 成都今是科技有限公司 | 纳米孔制备和检测方法及其检测装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10752948B2 (en) | 2020-08-25 |
EP3766987B1 (en) | 2023-08-02 |
US11261488B2 (en) | 2022-03-01 |
EP3353317A1 (en) | 2018-08-01 |
CA3000561A1 (en) | 2017-03-30 |
US10227645B2 (en) | 2019-03-12 |
JP2018529342A (ja) | 2018-10-11 |
US20170088890A1 (en) | 2017-03-30 |
US20200325534A1 (en) | 2020-10-15 |
US20190119745A1 (en) | 2019-04-25 |
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