CN108129439A - 一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法及其应用 Download PDF

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CN108129439A CN201810097397.9A CN201810097397A CN108129439A CN 108129439 A CN108129439 A CN 108129439A CN 201810097397 A CN201810097397 A CN 201810097397A CN 108129439 A CN108129439 A CN 108129439A
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孙彦君
冯卫生
高美玲
付露
弓建红
时博
张艳丽
陈辉
李晓坤
郝志友
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
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    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/60—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2
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Abstract

本发明涉及一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法及其应用，桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的新型双黄酮类化合物桃儿七双酮A和桃儿七双酮B制备方法包括以下步骤：制备粗提取物：硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：高效液相色谱法纯化：本发明方法稳定可靠、效率高、可快速从桃儿七中分离得到两个具有抗肿瘤活性的新型双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B，并经活性实验结果表明对人***细胞（HeLa）具有细胞毒活性，有效用于制备抗***的药物，开拓了桃儿七的药用价值和新用途，提高了桃儿七的商业价值，经济和社会效益巨大。

Description

一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。目前临床上广泛使用的合成抗肿瘤药物普遍存在着毒副作用强，选择性差等现象。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗肿瘤活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗肿瘤药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
桃儿七是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying.的干燥根及根茎。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。其根辛温，有毒。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、***、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。桃儿七中主要含有芳基萘内酯型木脂素类、四氢呋喃型木脂素类、简单的黄酮醇类、甾体类、酚类等，这些代谢产物中木脂素类化合物被认为是桃儿七药材发挥抗肿瘤作用的物质基础。经本发明的研究表明，来源于桃儿七药材中的双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B同样也具有抗肿瘤作用，对***细胞具有细胞毒活性。本发明采用硅胶柱色谱法结合凝胶柱色谱富集目标成分，再用高效液相色谱法进行分离纯化，建立了桃儿七中两个痕量的新型双黄酮类化合物(Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B)的快速制备方法。该方法重现性好，样品回收率高，得到的目标成分纯度高。本发明所涉及的双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B迄今在国内外尚未见相关文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现在技术缺陷，本发明之目的就是提供一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法及其应用，可有效解决从桃儿七中提取新的双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B，并用于制备抗***药物中的应用。
本发明解决的技术方案是，桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的新型双黄酮类化合物桃儿七双酮A(Sinodiflavonoid A)和桃儿七双酮B(Sinodiflavonoid B)的化学结构式为：
其制备方法包括以下步骤：
1)、制备粗提取物：将桃儿七药材粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七重量6-12倍的体积浓度为95％的乙醇回流提取3次，每次1–1.5h，提取温度为90-95℃，合并乙醇提取液，减压浓缩至呈无醇味的浓缩物，加浓缩物重量8-12倍的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的溶剂乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，流速为10-15mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为1-2mLmin-1，收集含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，45℃减压浓缩，得含有目标成分的总样；
3)、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45μm滤膜，制备高效液相色谱；分别用体积浓度为70％的甲醇-水作流动相进行梯度洗脱，流动相流速7.0-10.0mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长210nm或254nm，记录色谱图，根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，分别得到Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的单体化合物。
本发明方法稳定可靠、效率高、可快速从桃儿七中分离得到两个具有抗肿瘤活性的新型双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B，并经活性实验结果表明对人***细胞(HeLa)具有细胞毒活性，有效用于制备抗***的药物，开拓了桃儿七的药用价值和新用途，提高了桃儿七的商业价值，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明从桃儿七中提取的双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的化学结构式图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明。
实施例1：
本发明在具体实施中，所述的一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备粗提取物：将采集自四川康定县的桃儿七药材10.57kg，粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量8倍的体积浓度为95％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，提取温度为95℃，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味的浓缩物，加浓缩物重量8倍的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：取桃儿七粗提取物82.04g，加入120mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶164g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；取200-300目的硅胶1.23kg，加入石油醚5L，转移到100cm长×8cm内径的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；依次加入体积比为10:7、10:10、10:20石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5L，流速为10mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于10mL甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm、内径4cm，甲醇洗脱，流速为1mLmin-1，每5mL作为1个流份收集；将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，45℃减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3)、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱制备，高效液相色谱的条件如下：体积浓度为70％甲醇-水分别作流动相进行梯度洗脱，流动相流速10.0mLmin-1，反相ODS柱长度20cm，内径2cm，检测波长210nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，分别得到Sinodiflavonoid A(1)和Sinodiflavonoid B(2)的单体化合物。
实施例2：
本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出，所述的一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备粗提取物：将采集自青海大通县的桃儿七药材10.08kg粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量10倍的体积浓度为95％乙醇回流提取3次，每次1h，提取温度为90℃，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加浓缩物重量10倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：取桃儿七粗提取物80.13g，加入120mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶164g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；取200-300目的硅胶1.20kg，加入石油醚5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；再依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***，每个梯度5L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和100:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm，内径4cm，甲醇洗脱，流速为2mLmin-1，每5mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3)、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：分别用体积浓度为70％的甲醇-水作流动相进行梯度洗脱，流动相流速10.0mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长254nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，分别得到Sinodiflavonoid A(1)和Sinodiflavonoid B(2)的单体化合物。
实施例3：
本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出，所述的一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备粗提取物：将采集自甘肃永登县的桃儿七药材10.69kg粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量12倍的体积浓度为95％乙醇回流提取3次，每次1h，在90℃条件下，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味的浓缩液，加该浓缩液重量12倍的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物81.63g，加入120mL丙酮溶解，再加入过100-200目筛的硅胶162g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；将过200-300目筛的硅胶1.22kg，加入石油醚5L，转移到长100cm、内径8cm内径的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5L，流速为12mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm，内径4cm，甲醇洗脱，流速为1.5mLmin-1，每5mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3)、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：体积浓度70％甲醇-水为流动相进行等梯度洗脱，流动相流速10.0mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长254nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，得到Sinodiflavonoid A(1)和Sinodiflavonoid B(2)的单体化合物。
实施例4：
本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出，所述的一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备粗提取物：将取采集自西藏林芝县桃儿七药材10.62kg粉碎，过40目筛，成粗粉，粗粉用桃儿七药材重量8倍的体积浓度为95％乙醇回流提取3次，提取温度为90℃，每次1.5h，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加浓缩物重量9倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物80.12g，加入120mL丙酮溶解后，再加入过100-200目筛的硅胶160g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；将过200-300目筛的硅胶1.20kg，加入石油醚5L，转移到长100cm，内径8cm的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5L，流速为15mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm，内径4cm，甲醇洗脱，流速为1mLmin-1，每5mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3)、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：以体积浓度70％甲醇-水作流动相等梯度洗脱，流动相流速10.0mLmin-1，反相ODS柱长0cm，内径2cm，检测波长254nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，得到Sinodiflavonoid A(1)和Sinodiflavonoid B(2)的单体化合物。
实施例5：
本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出，所述的一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备粗提取物：将采集自云南德钦县桃儿七药材10.65kg粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量12倍量的体积浓度为95％乙醇回流提取3次，提取温度为95℃，每次1h，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加浓缩物重量10倍的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物80.05g，加入120mL丙酮溶解后，再加入过100-200目筛的硅胶160g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；取过200-300目筛的硅胶1.20kg，加入石油醚5L，转移到长100cm，内径8cm的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；再依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5L，流速为12mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm，内径4cm，甲醇洗脱，流速为2mLmin-1，每5mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3)、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45μm滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：用体积浓度70％甲醇-水作流动相进行等梯度洗脱，流动相流速10.0mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长254nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，得到Sinodiflavonoid A(1)和Sinodiflavonoid B(2)的单体化合物。
上述实施例1-5制备的两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物SinodiflavonoidA(1)和Sinodiflavonoid B(2)对***细胞(HeLa)具有细胞毒活性，有效用于制备抗***细胞(HeLa)的药物，实现双黄酮类化合物Sinodiflavonoid A(1)和Sinodiflavonoid B在制备抗***的药物中的应用，并经试验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
一、化合物的鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)、高分辨质谱(HR-ESI-MS)及CD光谱技术鉴定，其中：
化合物1，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 805.2862[M+H–H2O]+(calcd for C46H45O13,805.2860)，确定分子式为C46H46O14。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)显示1个与羰基缔合的羟基质子信号δ12.51(1H,s,5-OH)。四组芳环上质子偶合***信号：一组1,3,4-三取代苯环δ7.36(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz)，7.30(1H,d,J＝2.0Hz)和6.78(1H,dd,J＝8.4Hz)；一组1,2,3,5-四取代苯环δ5.93(2H,s)；一组1,2,3,4-四取代苯环δ7.13(1H,d,J＝8.4Hz)，7.08(1H,d,J＝8.4Hz)；一组五取代苯环δ6.32(1H,s)。三组异戊烯基氢信号δ3.22(2H,d,J＝6.9Hz)，5.01(1H,t,J＝6.9Hz)，1.44(3H,s)，1.53(3H,s)；3.14(2H,d,J＝7.4Hz)，4.89(1H,t,J＝7.4Hz)，1.32(3H,s)，1.20(3H,s)；3.40(2H,d,J＝7.3Hz)，5.16(1H,t,J＝7.3Hz)，1.55(3H,s)，1.67(3H,s)。一个甲氧基氢信号δ3.65(3H,s)。13C NMR(75MHz,DMSO-d6)谱中给出46个碳信号，除了一个甲氧基碳信号δ60.2，三组异戊烯基碳信号δ21.0、122.0、131.3、17.5、25.5；25.5、121.5、131.1、17.2、25.1；27.7、123.6、132.5、17.4、25.3，剩下30个碳信号中包括2个羰基碳信号δ178.3，187.4；24个芳香(4个苯环)碳信号；2个连氧烯碳信号δ139.0,156.3；2个二连氧脂肪碳季碳信号δ100.2、90.5，提示结构中存在黄酮醇母核和黄烷酮母核片段。由芳环质子δ7.13(1H,d,J＝8.4Hz,H-6′)与δ156.3(C-2)的HMBC相关，亚甲基质子δ3.22(2H,d,J＝6.9Hz)、3.14(2H,d,J＝7.4Hz)分别与δ106.0(C-8),δ129.8(C-2′)的HMBC相关，和甲氧基质子δ3.65(3H,s)与δ139.0(C-3)的HMBC相关，一个五取代苯环δ6.32(1H,s)，表明结构中存在8,2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚结构单元。由芳环质子δ7.30(1H,d,J＝2.0Hz,H-2″′)、7.36(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,6″′)与δ100.2(C-2″)的HMBC相关，异戊烯基亚甲基上的氢信号δ3.40(2H,d,J＝7.3Hz)与δ127.6(C-3″′)的远程相关，一个1,2,3,5-四取代苯环δ5.93(2H,s)，两个二连氧脂肪碳δ100.2,90.5，表明结构中的另一结构单元为3′-异戊烯基-2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮。将8,2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚结构单元中B环上的碳谱数据δ138.9(C-3′)、142.0(C-4′)、114.3(C-5′)与8,2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚的碳谱数据δ144.7(C-3′)、148.3(C-4′)、113.2(C-5′)对比发现，C-3′和C-4′的化学位移均向高场位移约6单位，C-5′化学位移向低场位移约2个单位，推测该化合物的另一取代单元3′-异戊烯基-2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮取代在8,2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚结构单元的C-4′位。化合物1的C-2″、C-3″、C-4″碳谱数据与podoverine C的相比，基本一致，提示8,2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚与3′-异戊烯基-2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮通过C-4′-O-C-3″醚键相连。化合物1的CD光谱在228和296nm呈现正Cotton效应，在262nm呈现负Cotton效应，这与具有C-2″S和C-3″R的podoverine B的CD光谱数据基本一致，因此化合物1的C-2″和C-3″的绝对构型分别确定为S和R。将该化合物的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表1和2)。根据以上光谱数据分析，确定化合物1的结构为8,2′-二异戊烯基-5,7,3′,4′-四羟基-3-甲氧基黄酮-[4′-O-3″]-3″′-异戊烯基-2″,3″,3″,5″,7″,4″′-六羟基黄烷酮，命名为桃儿七双酮B(Sinodiflavonoid B)。
表1.Sinodiflavonoid A的氢谱数据(300MHz,DMSO-d6)
表2.Sinodiflavonoid A的碳谱数据(75MHz,DMSO-d6)
化合物2，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 587.0825[M+H–H2O]+(calcd for C30H19O13,587.0826)，确定分子式为C30H20O14。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)显示1个与羰基缔合的羟基质子信号δ12.36(1H,s,5-OH)；四组芳环上质子偶合***信号：一组1,3,4-三取代苯环δ7.22(1H,d,J＝8.6Hz)，7.85(1H,dd,J＝8.6,2.0Hz)和7.81(1H,d,J＝2.0Hz)；一组1,4-二取代苯环δ7.48(2H,d,J＝8.6Hz)，6.75(2H,d,J＝8.6Hz)；两组1,2,3,5-四取代苯环δ6.46(1H,d,J＝2.0Hz)，6.20(1H,d,J＝2.0Hz)；δ5.99(1H,s)，5.97(1H,s)。由HSQC谱结合13C NMR(75MHz,DMSO-d6)谱发现，结构中含有30个碳信号，其中2个羰基碳信号δ176.2，187.4；24个芳香碳信号；2个连氧烯碳信号δ145.2，136.2；2个二连氧脂肪季碳信号δ100.5,90.6；提示结构中存在黄酮醇母核和黄烷酮母核片段。由黄酮醇母核B环上的一组1,3,4-三取代苯环δ7.22(1H,d,J＝8.6Hz)，7.85(1H,dd,J＝8.6,2.0Hz)，7.81(1H,d,J＝2.0Hz)和A环上的一组1,2,3,5-四取代苯环δ6.46(1H,d,J＝2.0Hz)，6.20(1H,d,J＝2.0Hz)，提示黄酮醇母核上存在5,7,3′,4′-四羟基取代，即结构中存在槲皮素结构单元。在HMBC谱中的芳香质子δ7.48(2H,d,J＝8.6Hz,H-2″′,6″′)与C-2″(δ100.5)的远程相关，一组1,2,3,5-四取代苯环δ5.99(1H,s)，5.97(1H,s)，提示另一结构单元为2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮。将槲皮素结构单元中B环上的碳谱数据δ140.5(C-3′)、145.3(C-4′)、117.3(C-5′)与槲皮素的碳谱数据δ145.5(C-3′)、148.1(C-4′)、115.5(C-5′)对比发现，C-3′和C-4′的化学位移分别向高场位移约5和3个单位，C-5′化学位移向低场位移约2个单位，推测该化合物的另一取代单元2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮取代在槲皮素结构单元的C-4′位。化合物2的C-2″、C-3″、C-4″碳谱数据与podoverine C的相比基本一致，提示槲皮素与2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮通过C-4′-O-C-3″醚键相连。将化合物2的氢谱和碳谱数据与化合物1相比后发现，少了一个甲氧基信号和三组异戊烯基信号。将该化合物的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表3和4)。根据以上光谱数据分析，确定化合物2的结构为3,5,7,3′,4′-五羟基黄酮-[4'-O-3”]-2″,3″,3″,5″,7″,4″′-六羟基黄烷酮，命名为桃儿七双酮(Sinodiflavonoid B).
表3.Sinodiflavonoid B的氢谱数据(300MHz,DMSO-d6)
表4.Sinodiflavonoid B的碳谱数据(75MHz,DMSO-d6)
No. δin ppm No. δin ppm
2 145.2(s) 2″ 100.5(s)
3 136.2(s) 3″ 90.6(s)
4 176.2(s) 4″ 187.4(s)
5 160.8(s) 5″ 163.1(s)
6 98.4(d) 6″ 97.3(d)
7 164.3(s) 7″ 168.2(s)
8 93.8(d) 8″ 96.3(d)
9 156.4(s) 9″ 159.0(s)
10 103.3(s) 10″ 99.8(s)
1′ 124.1(s) 1″′ 125.9(s)
2′ 116.7(d) 2″′ 129.4(d)
3′ 140.5(s) 3″′ 114.9(d)
4′ 145.3(s) 4″′ 158.8(s)
5′ 117.3(d) 5″′ 114.9(d)
6′ 122.5(s) 6″′ 129.4(d)
二、活性试验：
经对提取分离的Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B试验发现，对人***细胞株(HeLa)具有细胞毒活性，有关实验资料如下：
1.实验材料
人***细胞株(HeLa)由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
HeLa细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，每种细胞设4-5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/ml)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人***细胞(HeLa)对Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B进行细胞毒活性测试，结果见下表5。
表5.分离化合物对HeLa细胞的细胞毒活性
通过多次反复实验表明，本发明确定的桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的制备方法稳定可靠、效率高。同时发现Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对人***细胞(HeLa)具有细胞毒活性，具有制备临床上抗***药物的应用前景。本发明为桃儿七药材的深入开发和利用提供了技术支持，开拓了药材桃儿七的药用价值和商业价值，是治疗***药物上的创新，经济和社会效益巨大。

Claims (7)

1.一种桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的新型双黄酮类化合物桃儿七双酮A（Sinodiflavonoid A）和桃儿七双酮B （Sinodiflavonoid B）的化学结构式为：
Sinodiflavonoid A (1)
Sinodiflavonoid B (2)
其制备方法包括以下步骤：
1）、制备粗提取物：将桃儿七药材粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七重量6-12倍的体积浓度为95%的乙醇回流提取3次，每次1–1.5 h，提取温度为90-95℃，合并乙醇提取液，减压浓缩至呈无醇味的浓缩物，加浓缩物重量8-12倍的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的溶剂乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2）、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，流速为10-15mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，流速为1-2 mLmin-1，收集含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，45℃减压浓缩，得含有目标成分的总样；
3）、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45 μm 滤膜，制备高效液相色谱；分别用体积浓度为70%的甲醇-水作流动相进行梯度洗脱，流动相流速7.0-10.0 mLmin-1，反相ODS柱长20 cm，内径2 cm，检测波长210nm或254 nm，记录色谱图，根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，分别得到Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的单体化合物。
2.根据权利要求1所述的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、制备粗提取物：将采集自四川康定县的桃儿七药材10.57 kg，粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量8倍的体积浓度为95%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，提取温度为95℃，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味的浓缩物，加浓缩物重量8倍的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2）、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：取桃儿七粗提取物82.04 g，加入120 mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶164g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；取200-300目的硅胶1.23 kg，加入石油醚5L，转移到100cm长×8cm内径的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10 cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；依次加入体积比为10:7、10:10、10:20石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5 L，流速为10 mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于10 mL甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm、内径4cm，甲醇洗脱，流速为1mLmin-1，每5 mL作为1个流份收集；将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，45℃减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3）、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45 μm 滤膜，进行高效液相色谱制备，高效液相色谱的条件如下：体积浓度为70%甲醇-水分别作流动相进行梯度洗脱，流动相流速10.0 mLmin-1，反相ODS柱长度20cm，内径2cm，检测波长210 nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，分别得到Sinodiflavonoid A（1）和Sinodiflavonoid B（2）的单体化合物。
3.根据权利要求1所述的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、制备粗提取物：将采集自青海大通县的桃儿七药材10.08 kg粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量10倍的体积浓度为95%乙醇回流提取3次，每次1h，提取温度为90℃，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加浓缩物重量10倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2）、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：取桃儿七粗提取物80.13 g，加入120 mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶164g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；取200-300目的硅胶1.20 kg，加入石油醚5 L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10 cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；再依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***，每个梯度5 L，进行梯度洗脱，流速为15 mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和100:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm ，内径4cm，甲醇洗脱，流速为2 mLmin-1，每5 mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3）、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45 μm 滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：分别用体积浓度为70%的甲醇-水作流动相进行梯度洗脱，流动相流速10.0 mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长254 nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，分别得到Sinodiflavonoid A（1）和Sinodiflavonoid B（2）的单体化合物。
4.根据权利要求1所述的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、制备粗提取物：将采集自甘肃永登县的桃儿七药材10.69 kg粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量12倍的体积浓度为95%乙醇回流提取3次，每次1h，在90 ℃条件下，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味的浓缩液，加该浓缩液重量12倍的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2）、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物81.63 g，加入120 mL丙酮溶解，再加入过100-200目筛的硅胶162 g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；将过200-300目筛的硅胶1.22 kg，加入石油醚5 L，转移到长100cm 、内径8cm内径的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10 cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5 L，流速为12 mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm ，内径4cm，甲醇洗脱，流速为1.5 mLmin-1，每5 mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3）、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45 μm 滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：体积浓度70%甲醇-水为流动相进行等梯度洗脱，流动相流速10.0 mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长254 nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，得到Sinodiflavonoid A（1）和Sinodiflavonoid B（2）的单体化合物。
5.根据权利要求1所述的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、制备粗提取物：将取采集自西藏林芝县桃儿七药材10.62 kg粉碎，过40目筛，成粗粉，粗粉用桃儿七药材重量8倍的体积浓度为95%乙醇回流提取3次，提取温度为90 ℃，每次1.5h，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加浓缩物重量9倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2）、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物80.12 g，加入120 mL丙酮溶解后，再加入过100-200目筛的硅胶160 g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；将过200-300目筛的硅胶1.20 kg，加入石油醚5 L，转移到长100cm，内径8cm的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10 cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5 L，流速为15 mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10和10:20的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm，内径4cm，甲醇洗脱，流速为1 mLmin-1，每5mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3）、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45 μm 滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：以体积浓度70%甲醇-水作流动相等梯度洗脱，流动相流速10.0 mLmin-1，反相ODS柱长0cm，内径2cm，检测波长254 nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，得到Sinodiflavonoid A（1）和Sinodiflavonoid B（2）的单体化合物。
6.根据权利要求1所述的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、制备粗提取物：将采集自云南德钦县桃儿七药材10.65 kg粉碎，过40目筛，得粗粉，粗粉用桃儿七药材重量12倍量的体积浓度为95%乙醇回流提取3次，提取温度为95 ℃，每次1h，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加浓缩物重量10倍的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的乙酸乙酯萃取，45℃减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2）、硅胶柱色谱结合凝胶柱色谱初步分离：将桃儿七粗提取物80.05 g，加入120 mL丙酮溶解后，再加入过100-200目筛的硅胶160 g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶；取过200-300目筛的硅胶1.20kg，加入石油醚5 L，转移到长100cm，内径8cm的色谱柱中，待液面降至距硅胶面10 cm处，将伴样硅胶加入到色谱柱内；再依次加入体积比为10:7、10:10、10:20的石油醚-丙酮混合溶剂***进行梯度洗脱，每个梯度5 L，流速为12 mLmin-1，收集石油醚-丙酮10:10的洗脱流份，45℃减压浓缩，得到硅胶柱洗脱流份的浓缩物；将该浓缩物溶解于甲醇中，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱长120cm，内径4cm，甲醇洗脱，流速为2 mLmin-1，每5 mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样；所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比7:1的二氯甲烷-甲醇；
3）、高效液相色谱法纯化：将含有目标成分的总样，溶解于甲醇中，过0.45 μm 滤膜，进行高效液相色谱制备；高效液相色谱的条件如下：用体积浓度70%甲醇-水作流动相进行等梯度洗脱，流动相流速10.0 mLmin-1，反相ODS柱长20cm，内径2cm，检测波长254 nm，记录色谱图；根据色谱图色谱峰的保留时间，分别收集Sinodiflavonoid A和Sinodiflavonoid B对应的色谱峰，45℃减压回收溶剂至干，得到Sinodiflavonoid A（1）和Sinodiflavonoid B（2）的单体化合物。
7.权利要求1或2-6任一项所述方法制备的桃儿七中两个具有抗肿瘤活性的双黄酮类化合物在制备抗***药物中的应用。
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