CN108103236A - 玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记及其应用。本发明提供的分子标记由核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2或SEQ ID NO.3‑4所示的引物扩增得到。本发明的SSR分子标记与玉米无叶舌基因lg1紧密连锁，可用来跟踪玉米无叶舌基因，检测待测玉米是否具有无叶舌性状，在回交转育过程中用于进行分子标记辅助育种，筛选具有无叶舌基因的玉米材料，可以提高选择的准确性，并较现有技术节省近一半的转育选系时间。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与玉米无叶舌性状相关的分子标记，具体地，涉及玉米无叶舌基因lg1连锁的SSR分子标记、扩增其的引物对以及该分子标记的应用。
背景技术
近些年来，随着玉米耐密植、高光效育种目标的提出，株型紧凑、叶片上冲等成为玉米育种家关注的重要表型性状。无叶舌种质由于叶舌叶耳消失、叶鞘***、叶片直立上冲、光合面积大、光能利用率高，是开展耐密植杂交种选育的重要资源。目前已发现的玉米无叶舌性状有显性和隐性两种，其中lg1基因是隐性无叶舌基因，位于第二条染色体短臂的末端。
利用回交转育的方法，可以实现无叶舌性状lg1基因的定向改良。利用传统的育种方法把无叶舌性状lg1基因导入到轮回亲本选育自交系时，由于该性状是隐性单基因控制，需要对回交1代自交，在分离的自交后代中选择无叶舌植株继续回交，然后自交、回交、再自交，直至回交多代遗传背景与轮回亲本基本一致，再自交2代，才能获得性状稳定的无叶舌自交系。可见，利用常规回交转育方法，对于隐性单基因控制的性状来说，需要使用回交、自交交替的方法，才能将目标性状准确的选择出来，选系时间长、效率低。
分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)是一类广泛存在于基因组上的、由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于其在基因组上的大量分布，多态性高，且操作技术简单，费用低廉，在分子辅助育种中已被广泛使用。因此，筛选出与无叶舌基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记对玉米无叶舌基因进行选择，对玉米自交系选育有着独特的优势。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记。
本发明的第二个目的是提供用于扩增玉米无叶舌基因lg1连锁的SSR分子标记的特异性引物对。
本发明的第三个目的是提供上述SSR分子标记的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：基于以上目的，申请人利用玉米基因组数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)，选择与位于玉米第二条染色体短臂末端lg1基因遗传距离较近，上下游区间共计9个SSR分子标记。提取B73无叶舌突变体rla1(玉米EMS突变体库构建及突变体初步鉴定，安徽农业科学，2014，42(11):3162-3165)和自交系材料(京2416和京92)的基因组DNA，利用上述分子标记，进行PCR反应条件的优化和筛选，最终确定在B73无叶舌突变体rla1分别与京2416和京92间具有多态性，分辨率良好，且距离lg1基因遗传距离较近的两个SSR分子标记。
在北京基地(春播)，将受体自交系京2416和京92作为母本，分别与B73无叶舌突变体rla1进行杂交配制F1。在三亚基地(秋播)种植F1自交，收获2个相应的F2群体。利用rla1×京2416，rla1×京92的F2分离群体，分析标记与表型的连锁关系，以验证本发明筛选得到的2个SSR标记可用于无叶舌性状的分子标记辅助选择。
本发明首先提供了玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2或SEQ ID NO.3-4所示的引物对PCR扩增获得。
进一步地，本发明提供了玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记组合，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的引物对PCR扩增获得。
本发明提供了上述SSR分子标记或SSR分子标记组合在玉米分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或SSR分子标记组合在培育无叶舌性状玉米中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或SSR分子标记组合在鉴定玉米无叶舌性状中的应用。所述的玉米为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
本发明提供了用以扩增玉米无叶舌基因lg1的SSR分子标记的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对在玉米分子标记辅助育种中的应用。所述的玉米为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对在培育无叶舌性状玉米中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对在鉴定玉米无叶舌性状中的应用。所述的玉米为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对的试剂盒。
本发明还提供了一种鉴定玉米是否具有无叶舌基因lg1的方法，以待鉴定材料的DNA作为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对进行PCR扩增；PCR产物进行凝胶电泳分离，当特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2时，若扩增产物大小为230/230bp，则待测玉米具有lg1基因，并具有无叶舌性状，若扩增产物大小为193/230bp，则待测玉米具有lg1基因；
当特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示时，若扩增产物大小为157/157bp，则待测玉米具有lg1基因，并具有无叶舌性状，若扩增产物大小为153/157bp，则待测玉米具有lg1基因。
在本发明的实施例中所述的玉米为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
在本发明的实施例中，采用上述鉴定玉米是否具有无叶舌性状的方法的鉴定对象是B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
具体地，上述PCR扩增的扩增体系为：总体积20μL，其中DNA模板1μl，上下游混合后的引物1μl，MIX(含2×Buffer)10μl，ddH2O为8μL。
上述PCR扩增的程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，总共30个循环；72℃延伸7min。
优选地，本发明提供了一种鉴定玉米是否具有无叶舌性状的方法，以待鉴定玉米材料的DNA作为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对对待测材料的DNA进行PCR扩增，所述待鉴定玉米材料为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
待鉴定玉米材料的PCR扩增结果满足以下情况，即认定待测鉴定玉米材料具有无叶舌性状：特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2时，扩增产物大小为230/230bp；同时特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示时，扩增产物大小为157/157bp。
待鉴定玉米材料的PCR扩增结果满足以下情况，即认定待测鉴定玉米材料具有lg1基因：特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2时，扩增产物大小为193/230bp；同时特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示时，扩增产物大小为153/157bp。
在本发明的实施例中所述的玉米为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
本发明的有益效果在于：首次公开了玉米无叶舌基因lg1的分子标记isu488638和umc1542为共显性标记，与无叶舌基因lg1紧密连锁，可用于鉴定植株中是否含有基因lg1，检测方便、扩增稳定、简单易行。本发明公开的分子标记isu488638和umc1542与lg1之间的遗传距离短，连锁度高，能够作为遗传标记，利用分子标记辅助选择lg1的准确性高，提高无叶舌性状的鉴定效率，节约成本，用于筛选无叶舌性状的玉米，也可实现无叶舌性状lg1基因的定向改良；利用该分子标记，能够在回交转育过程中对无叶舌杂合基因型Lg1lg1进行鉴定筛选，免去对回交后代进行自交的步骤，与常规育种方法相比，既可以提高选择的准确性，又能够节省将近一半的选系时间。
附图说明
图1为isu488638连锁标记的扩增峰型图。由上到下依次为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
图2为umc1542连锁标记的扩增峰型图，由上到下依次为B73无叶舌突变体rla1、京2416和京92。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明实施例中所用的玉米种质资源来自北京市农林科学院玉米研究中心。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1玉米无叶舌lg1基因分子标记的筛选
1、利用玉米基因组数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)，选择与位于玉米第二条染色体短臂末端lg1基因遗传距离较近，上下游区间共计9个SSR分子标记。
表1无叶舌基因lg1上下游标记的位置与引物序列
| Primer名称 | 序列(5'to3') | 染色***置 |
| umc2245-L | GCCCTGTTATTGGAACAGTTTACG | 30.9 |
| umc2245-R | CGTCGTCTTCGACATGTACTTCAC | |
| isu308337-L | TTCTTGCTTGTCTCTAGCAGCTT | 35.6 |
| isu308337-R | TGTGGCGATGTCCATGATT | |
| isu488638-L | AGGCAACTCCTGTGTCTGTGT | 45.2 |
| isu488638-R | CATGATCGCCCACTCCTT | |
| umc1165-L | TATCTTCAGACCCAAACATCGTCC | 47.4 |
| umc1165-R | GTCGATTGATTTCCCGATGTTAAA | |
| phi098-L | GAGATCACCGGCTAGTTAGAGGA | 56.72 |
| phi098-R | GTATGGTTGGGTACCCGTCTTTCTA | |
| umc1542-L | TAAAGCTATGATGGCACTTGCAGA | 57.60 |
| umc1542-R | CATATTTGCCTTTGCCCTTTTGTA | |
| umc2536-L | CATACGTAATCCTACGCGACAACA | 58.99 |
| umc2536-R | TTGTGAAACAAAAAGAAAGCACGA | |
| bnlg1338-L | GTGCAGAATGCAGGCAATAG | 51.3 |
| bnlg1338-R | GCAAATGTTTTCACACACACG | |
| magi44170-L | TGTGGGATGTGGTCTCTAACG | 48.5 |
| magi44170-R | ACATCAGAGCACACCACTGC |
注：位置表示在MaizeGDB网站上的IBM2 2008Neighbors Frame 2中相对的遗传位置，其中lg1基因为50.9
提取B73无叶舌突变体rla1和自交系材料(京2416和京92)的基因组DNA，利用上述分子标记，进行PCR反应条件的优化和筛选，最终确定两个在无叶舌rla1和有叶舌京2416、京92间具有多态性，分辨率良好，且距离lg1基因遗传距离较近的SSR分子标记。这两个SSR分子标记为isu488638和umc1542，用于PCR扩增两个标记isu488638和umc1542的引物对序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。二者在B73无叶舌突变体rla1和自交系材料(京2416和京92)的PCR扩增片段大小分别见图1和图2。
2、两个SSR分子标记与玉米无叶舌lg1基因连锁关系分析
在北京基地(春播)，将自交系京2416和京92作为母本，分别与无叶舌的rla1进行杂交配制F1。在三亚基地(秋播)种植F1自交，收获相应的F2群体。利用rla1×京2416，rla1×京92的F2分离群体，分析与表型的连锁关系。
用自交系rla1、京2416和京92，以及2个F2分离群体，检测分子标记isu488638和umc1542与表型的连锁关系。
rla1×京2416的F2分离群体79株，其中26株田间表型为无叶舌，53株为有叶舌，rla1×京92的F2分离群体81株，其中25株田间表型为无叶舌，56株为有叶舌。提取基因组DNA，利用isu488638和umc1542进行检测。结果显示，这两个标记与lg1基因紧密连锁，用isu488638进行PCR检测时，在160株分离群体(rla1×京2416的F2分离群体79株和rla1×京92的F2分离群体81株)中有7株基因型与表型不符；用umc1542进行检测时，在160株分离群体中有3株基因型与表型不符(详见表2)；当用isu488638和umc1542两个标记同时进行辅助选择时，基因型与表型完全吻合，即isu488638基因型为230/230、且umc1542基因型为157/157的株数为45株，田间表现均为无叶舌；isu488638基因型为193/230或193/193、且umc1542基因型为153/157或153/153的株数为105株，田间表现均为有叶舌，说明isu488638和umc1542可用于京2416、京92等系列自交系回交转育无叶舌性状的分子标记辅助选择。
表2isu488638和umc1542基因型和有无叶舌表型的对比
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记及其应用
<130> KHP171113166.7
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcaactcc tgtgtctgtg t 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgatcgcc cactcctt 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taaagctatg atggcacttg caga 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catatttgcc tttgcccttt tgta 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccctgttat tggaacagtt tacg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtcgtcttc gacatgtact tcac 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcttgcttg tctctagcag ctt 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtggcgatg tccatgatt 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatcttcaga cccaaacatc gtcc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcgattgat ttcccgatgt taaa 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagatcaccg gctagttaga gga 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtatggttgg gtacccgtct ttcta 25
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catacgtaat cctacgcgac aaca 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgtgaaaca aaaagaaagc acga 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acatcagagc acaccactgc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtgggatgt ggtctctaac g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcaaatgttt tcacacacac g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgcagaatg caggcaatag 20
Claims (10)
1.玉米无叶舌基因lg1紧密连锁的SSR分子标记，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2或SEQID NO.3-4所示的引物对PCR扩增获得。
2.权利要求1所述的SSR分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
3.权利要求1所述的SSR分子标记在培育无叶舌性状玉米中的应用。
4.权利要求1所述的SSR分子标记在鉴定玉米无叶舌性状中的应用。
5.用以扩增玉米无叶舌基因lg1的SSR分子标记的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQID NO.1-2或SEQ ID NO.3-4所示。
6.权利要求5所述的特异性引物对在玉米分子标记辅助育种中的应用。
7.权利要求5所述的特异性引物对在培育无叶舌性状玉米中的应用。
8.权利要求5所述的特异性引物对在鉴定玉米无叶舌性状中的应用。
9.含有的试剂盒，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ IDNO.3-4所示。
10.一种鉴定玉米是否具有无叶舌基因lg1的方法，其特征在于，以待鉴定材料的DNA作为模板，用特异性引物对进行PCR扩增；PCR产物进行凝胶电泳分离；所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示；
当特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2时，若扩增产物大小为230/230bp，则待测玉米具有lg1基因，并具有无叶舌性状，若扩增产物大小为193/230bp，则待测玉米具有lg1基因；
当特异性引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示时，若扩增产物大小为157/157bp，则待测玉米具有lg1基因，并具有无叶舌性状，若扩增产物大小为153/157bp，则待测玉米具有lg1基因。
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|---|
| 郭莹: "利用不同F2群体定位玉米株型性状的QTL", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108588270A (zh) * | 2018-07-10 | 2018-09-28 | 北京市农林科学院 | 玉米无叶舌性状相关snp分子标记开发及其应用 |
| CN108588270B (zh) * | 2018-07-10 | 2021-06-29 | 北京市农林科学院 | 玉米无叶舌性状相关snp分子标记开发及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108103236B (zh) | 2021-04-27 |
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