CN108103063B - 一种saRNA及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种saRNA，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区‑3000至‑200位点区域互补的核苷酸序列；本发明还公开了所述的saRNA在制备用于***的药物中的用途。本发明的靶向PTPRO基因的SaRNA可使PD‑L1的Tyr123位点磷酸化水平降低，阻断PD‑1/PD‑L1通路，抑制肿瘤细胞生长，使T细胞恢复活性；同时，本发明的saRNA与PD‑L1抑制剂在肿瘤的治疗中起到协同增效作用，显著提高了PD‑L1抑制剂的治疗效果。因此，本发明saRNA可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种saRNA及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学技术领域，特别涉及肿瘤的免疫治疗技术，尤其是一种有效***的saRNA。

背景技术

肿瘤细胞治疗是通过调动机体的免疫***，增强抗肿瘤免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞治疗是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一。PD-1(programmeddeath-1)是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体，PD-1程序性死亡受体是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，是激活型T细胞的一种表面受体，PD-1有两个配体，分别是PD-L1

(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。机体内的肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，PD-L1与PD-1联接后，T细胞功能被抑制，不能向免疫***发出攻击肿瘤的信号。PD-1/PD-L1抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。目前，已经有多种PD-1/PD-L1抑制剂在动物模型中证明它们***的作用，pembrolizumab是一种高亲和力的结合PD-1的人源化IgG4-kappa抗体。美国食品药品管理局(FDA)已经批准pembrolizumab用于治疗晚期或无法手术切除的对其他药物无响应的黑色素瘤。nivolumab是一种抗PD-1的单克隆药物，仅作为二线或三线治疗药物被研发出来。nivolumab现已被FDA批准用于鳞状细胞肺癌的二线治疗。目前，其他PD-1/PD-L1抑制剂很多都处于Ⅰ/Ⅰ期临床试验阶段。PD-1/PDL1细胞疗法是当前备受瞩目的一类抗癌细胞疗法，旨在利用人体自身的免疫***抵御肿瘤，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路使肿瘤细胞死亡，适用于多种类型肿瘤。

基于目前有限的临床数据和随访资料，对PD-1/PD-L1抗体有效的患者，有一部分疾病最终还是会进展。那么，潜在的耐药机制是什么？如何克服免疫治疗导致的耐药？PD-1/PD-L1抑制剂联合治疗搭档选谁好？是当前癌症细胞疗法中面临的三大难题。目前的研究认为可能是因为其他免疫逃逸通路代偿性活跃起来了。但具体的机理和预测的准确性目前还不清楚。针对这些新通路的药物，还有很多基础研究和临床试验需要去做，因此还需要很长时间。

现研究发现，细胞中PD-L1蛋白的磷酸化水平对于PD-1/PD-L1信号通路的精准调控具有非常重要的意义。肿瘤的发生发展常常伴随着PD-L1蛋白磷酸化修饰发生异常。PD-L1氨基酸序列中磷酸化位点的磷酸化修饰是导致淋巴细胞凋亡，肿瘤发生免疫逃逸PD-1/PD-L1抑制剂抵抗的重要因素。从蛋白磷酸化修饰角度着手，找到PD-L1氨基酸序列中起到关键调控作用的磷酸化作用位点，找到在PD-1/PD-L1信号通路的磷酸化修饰中扮演重要角色的关键酶，将会为当前面临的癌症细胞疗法中的三大难题提供新的解决办法。

受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)是PTPs家族的成员之一，在一项筛选肾小球足细胞特异性蛋白的研究中首次被发现并克隆出来，因此也称作GLEPP1。PTPRO在人类、大鼠、小鼠等各物种间具有高度保守性。在人类基因组中，PTPRO基因位于染色体12p13.3-p13.2，包含6个已知的mRNA变构体，其中2个主要的表达产物分别由全长PTPRO(PTPRO-FL)cDNA和截短型PTPRO(PTPROt)cDNA编码。在肿瘤研究中，PTPRO基因的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关，现已发现，PTPRO在多种癌中有重要的抑癌作用，如：乳腺癌，***癌，食管癌，结肠癌，肝癌，肺癌等。该基因通过去磷酸化作用来调控促癌基因的活性，使这些促癌基因活性下调，从而影响其下游信号通路，对肿瘤的发生发展起到抑制作用。在体内如何安全高效激活该基因的表达对肿瘤的治疗具有重大意义。

近年的研究发现非编码RNA(ncRNA)分子能在多个水平参与基因表达的调控机制，其中小分子双链RNA(dsRNA)对相关蛋白表达的特异性抑制作用已经进行了广泛而深入的研究。最新研究发现dsRNA能特异地将某些沉默或低表达的基因激活的现象，并称之为“RNA激活(RNA activation，RNAa)”，将具有激活功能的小dsRNA称之为小激活RNA(saRNA)。与RNAi相比较，RNAa在***方面不用考虑某一肿瘤是否有特定的致癌基因作为靶基因，因而有其独特的优势，如可以利用RNAa激活肿瘤抑制基因、细胞周期抑制基因、细胞凋亡基因等来***。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可使PD-L1去磷酸化，从而阻断PD-1/PD-L1通路，使T细胞恢复活性，实现免疫***的saRNA。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种saRNA，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-3000至-200位点区域互补的核苷酸序列。由此，本发明中靶向PTPRO基因的SaRNA可使PD-L1的Tyr123位点磷酸化水平降低，阻断PD-1/PD-L1通路，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答；靶向PTPRO基因的SaRNA可作用于任何高表达PD-L1蛋白的细胞或组织，包括恶性肿瘤，肿瘤浸润性树突状细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、肿瘤浸润性巨噬细胞等。

优选地，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点区域的核苷酸序列。

优选地，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-658位点至-676位点区域的核苷酸序列。

优选地，所述saRNA由序列如SEQ ID NO:2所示的正义链和序列如SEQ ID NO:3所示的反义链组成，或者由序列如SEQ ID NO:8所示的正义链和序列如SEQ ID NO:9所示的反义链组成。

在另一方面，本发明还提供上述saRNA在制备用于***的药物中的用途。优选地，所述saRNA给药方式包括肿瘤内注射，腹腔注射，皮下注射以及全身静脉注射。

在另一方面，本发明还提供上述saRNA和PD-1/PD-L1抑制剂的联合使用在制备用于***的药物中的用途。

优选地，所述PD-1/PD-L1抑制剂为抗PD-1抗体或PD-L1抗体。

优选地，所述PD-1/PD-L1抑制剂为avelumab。本申请的发明人意外地发现，当同时使用本发明中的saRNA和avelumab时，其抑制肿瘤生长的效果显著优于单独使用本发明中的saRNA或avelumab，说明靶向PTPRO的saRNA和avelumab两者之间具有协同增效抑制肿瘤生长的作用。

优选地，其特征在于，所述肿瘤为NSCLC、黑色素瘤、肾细胞癌、***癌、乳腺癌、胶质瘤、食管癌、霍奇金淋巴瘤、恶性胸膜间皮瘤或头颈肿瘤。

综上所述，本发明的有益效果为：

现有的PD-L1抑制剂只能阻断PD-1/PD-L1通路，一旦PD-L1发生磷酸化之后，PD-L1抑制剂的效果将大大降低，而本发明的靶向PTPRO基因的SaRNA恰恰弥补了这一缺陷，其可使PD-L1的磷酸化水平降低，阻断PD-1/PD-L1通路，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答；同时，本发明的saRNA与PD-L1抑制剂在肿瘤的治疗中起到协同增效作用，显著提高了PD-L1抑制剂的治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中5对saRNA激活PTPRO基因表达的效果对比图；

图2Westen blot实验验证saPTPRO-220可提高PTPRO表达水平，同时降低PD-L1磷酸化水平；

图3为MTT实验检测三组处理组中食管癌细胞TE1对PD-L1单抗avelumab药物敏感性；

图4为ELISA法检测三组共培养上清中免疫抑制因子IL-10、TGF-β和免疫激活因子IL-12、IL-23的含量；

图5为不同处理措施时荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图，结果显示saRNA和Avelumab同时使用时，两者之间具有协同增效抗肿瘤作用。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当说明的是，本发明中涉及的化学品，细胞，耗材等，如无特别说明，均从市场购买获得。

实施例1saRNA分子的设计及其对PTPRO表达的影响

一、saRNA的设计

在网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得PTPRO启动子区序列。

根据按照RNA序列的设计原则，设计获得PTPRO的5对双链小RNA激活序列以及该5对序列对应PTPRO启动区位点。PTPRO启动子区位点-3000位点至-1位点的序列(SEQ ID NO:1)如下所示：

TGATTTGGAGTCTTGAAAATAGCATAATAAGATTTATCATACTTTGGAAGTATTGTATTGAAAAACCAGTCAATAGCTCAAAGAAACACAAAACATGCTCTATGAATTGAAAACCCCACACTGTGGATGACACAGCATTCACATTCTTTATGAGAATCTCTTCTAGGACACTGTTATGGTTTAAGTGCAATAAAAACAAATGAAAGTATTTTATCCAGCAATAGCAATGTAAAATACTTTTCTCTAGAGAGGAAATTTTCTGTGATTATAAAATAATACTTTCAGTCTTCAGCCCATCTAACCACAATGTTACTAATAAAATAACAACAATGCCAATTACTAATGCTTTACTACTTACTGTTTACTGTTATTGTTCCTCCAAAGTGGTCCACATAATATATATATATATATATATATATATACATATATATATATATGCACAAAGACAGAAAGAGCTGAACAAATTGTGATGTATGACTAAGAGAAAAACAGAAAGACGCAGCAGAATATGATTATTTAAAAGGGAGCCTCATTGTGAAAGTTCTTTTAGCATTTACAAGATTAATTTATGATCAGAACTGCTTTAAACGCCCTACGCACATCAGGCAAGGCTATATCCATGTATACACACAGACATATGCATACACACAAATGAATATCATCATACAGACCCATAATTCACAGACACATTTTAAAATTAAATGCTACTCCAAAGAGAAATTGTTGGCATCCTGTGAGTGTGATTGTTGCCCTTGGCCTATATATATCTTATGTTCTAGAGATTAGATCACTTTACAGCCACTTCTGAGGGCGAGTGGGAATAAAATGCTGCTTCAGGAGCGTCAAAATAAAAAGAAAACATATTAAACCAAAGTTCCTATAAGTGCAATCCCAAGGATTAAATGTTCAGATAGCCCGTAAGTCTAACCCAGAGGGAGGGAGGAGCAGTTAACATTTTCTCAAAAGAAAGAAAATGTCCAAACCAATGATGAGTGGACATGAGGGACCTGAAGAGAGCATGTGATGGGAATGTGAAAACAAAAGAAGCTTCTAAAAGAAGACACCAAGGATAATATTCTCACAAAAATTCAGACCATCATTCTATATTTTCATGCATATGAATTTTGGTACATATTTCATGCATATGAAATTTGGTACATATATACATATATGTACCATGCATATACATATGCGTACATATACATATACGTATGCATACACATATGTATCTATGTACACACATACACATATGTGTACACACATATGTACATGCACACACATATGTGTACACATATGTACATGCACACACATGTGTGTACACATATGTACATGTACACATATGTGTACATGTACACATGTGTATATATACATATTCACACTTATGTAAACATATTCAATCTAAAGCTTCCTTAAGACACATACAAACAACAACCAAATGATTAGTGTTTGGCCATTGCTCATGCAGCAAAAGCTGAGTAAACACAGCTCTGGATCCTTTTCTCAGGCCACCACTCCCTAGCTGTGTGACTGACAAAGTCTATGCCTGAACACCTACATTCATGACCAGGGTGGCCTTTCCTGTCTCCTGTTGCCCAAGCATGTCTCAGGTATAAATAAGTTCCAATACTGACAGGGCACAGCAAGGGTAATTTACATGACAATAAGAAATGATTTCTATCTGAACAGTGCATACCAGAGTTGATTTCGACAGACTTATCTTTAAAAAAATACACATAACAAAAAAGGAGACAAGTAGTAGATTGGGGACCCACAGCTTGAAAGTCGTTGCTTGTGATTCTAAAACATCCCAGTAAAATTATTCACAGATAATTGTTTAAAAATATAACTGTACATACCGTTGACACTTGGACAACACAGAGAATCACGTAGTTGAAAATCCACATATAACTTTGAACTCATCAAAACCTTAACTACTAATAGCCTACTCTTGACCGGAAACCTTACTGATAACATAATAAACAGTTGATTAACACACATTTTGTGTTGTATGTATTGTATACTGTATTCTTACAATAAAGTACGCTAGAGAACAGAAAATATTATTAAGAAAACCATAAAGAGGAGAAAATACATTTATATTCATTGAGTGGAAGTGAATTATCATAAAAGTCTTTAACGTCATCCTTTTCAGGCTGAGCAGGCAGAGGAGGAGGAAGAGGGTTTGGTCTTGCTGTCTCAAGGCTGGCAAAGGTGGAAGAAAATCTGCATATAACTGGACCCAACAGTTCAAACCCGTGTTGTTCAAGGGTCATACATGTAAAATACTGTGATTTTTCCCCCTTCTATATTCAGCTTCAGGTGACCCGACACACTTTGGTATCAAAAGAGAATCTGAAATGTACAAGAACTGCGGATTTCAAATGGAAAAGGTGCATAATTGTGCTATTTGTTCCTGGGTGAGTGTGGGACGGAGACGGTGAGAGTGTTGAAATGGGATGGAGATAATGGAAGCAGTGGGGAAGGAGAGAAAATACCCTTCCTATCACACACACTCACACACTCACACTACACACTATTTCTACAGTCACAACTACCCAACTGTTATTGATCCTTTATAACTGCAATTGAGTACAGATGTAGGAAGATTGAGAGGGAACTGGGATCTGGCGCCTGGATTGCTCAAGAGAGGTCAGGGAAACCCCTCAGAACTCCTGAGACCCAGAGATTGAGGGAGGGGTTGAGGCGGAGTCTGCAATGGGGGCTGTCCAGCAGTAGCAAGCAGCGGGCCGATCCTGGTGGAGGGTTGGGAGGCTGCTGTCATTTTATGGGTCGGCAGCCAGAGTGAGAGTGTCCCTGCTGCCAGAGGACTACGGCGGGCTGGGCGCGGGGTCCCCGCCTCTCGCTCACCACACAGACCCCGCGCCTCCTCTGGCAGCCGCGGTGGTGGCGGCGGCAGAGCCTCGCCCACTCCAATCCCCACCCTCTCCATCCTTAGTCATTAAAGAACAGCAGCGCCTGGCACGTTCTTGGAGGACCCCG。

saPTPRO-220：

正义链：5’-GGU UGG GAG GCU GCU GUC A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:2)

反义链：5’-UGA CAG CAG CCU CCC AAC C[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:3)

(PTPRO启动子区-220位点至-238位点)。

saPTPRO-398：

正义链：5’-AUU GAG UAC AGA UGU AGG A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:4)

反义链：5’-UCC UAC AUC UCU ACU CAA U[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:5)

(PTPRO启动子区-398位点至-416位点)。

saPTPRO-550：

正义链：5’-AGA CGG UGA GAG UGU UGA A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:6)

反义链：5’-UUC AAC ACU CUC ACC GUC U[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:7)

(PTPRO启动子区-550位点至-568位点)。

saPTPRO-658：

正义链：5’-CCG ACA CAC UUU GGU AUC A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:8)

反义链：5’-UGA UAC CAA AGU GUG UCG G[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:9)

(PTPRO启动子区-658位点至-676位点)。

saPTPRO-1026：

正义链：5’-AAA CCU UAC UGA UAA CAU A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:10)

反义链：5’-UAU GUU AUC AGU AAG GUU U[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:11)

(PTPRO启动子区-1026位点至-1044位点)。

二、上述saRNA对PTPRO表达的影响

乳腺癌细胞系SKBR3培养于含有10％胚牛血清的DMEM/F12完全培养基中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞按2×105个/ml接种于6孔培养板培养过夜。次日以上saRNAs和dscontrol以50nM的终浓度，转染细胞，转染5天后收获细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，并反转录为cDNA荧光定量PCR法分析靶基因的PTPROmRNA的差异表达。荧光定量PCR所使用的引物见下表1:

表1荧光定量PCR所使用的引物

结果如图1所示，saPTPRO-220、saPTPRO-658激活效果明显优于其他3对，且saPTPRO-220效果最优，其他三对saPTPRO-398，saPTPRO-550，saPTPRO-1026效果不明显。

实施例2westen blot实验验证SaPTPRO使PD-L1蛋白的磷酸化水平降低

将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，细胞培养箱继续培养，细胞丰度为50％-60&时转染saRNA。根据lipofectamine2000转染说明书进行转染，转染浓度为50nmol/L。48小时后提蛋白，BAC法测蛋白浓度，western blot检测PTPROp-PD-L1PD-L1蛋白的表达水平。

SDS-PAGE电泳：取一定量蛋白提取液(含蛋白5μg)和免疫共沉淀产物，加入适当的5×SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸10min使蛋白质变性，10000×g离心10min；SDS-PAGE电泳分离胶为10％，浓缩胶为5％；按预定顺序使用加样枪上样，在不用的样品孔中加等体积的5×SDS凝胶上样缓冲液；60V 20min电泳后改为100V约70min，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。

转膜：恒流300mA，时间为120min。

封闭：5％脱脂奶粉封闭，摇床37℃一小时。封闭完后用TBST缓冲液摇洗10min，重复3次。

一抗孵育：所用一抗分别为抗PTPRO、抗PD-L1、抗p-PD-L1(Y123)抗体，按1:2000比例稀释，水平缓慢摇匀，4℃过夜。

二抗孵育：次日37℃作用20min，弃一抗溶液，1×TBST洗膜10min，重复4次。将膜置于用1×TBST按1:2000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG的二抗稀释液中，摇床37℃，2h。

弃二抗溶液，1×TBST洗膜10min，重复3次。按照厂家说明使用ECL试剂盒显影，拍照记录。

结果如图2所示，结果显示，saRNA转染后，PTPRO蛋白表达水平升高，PD-L1磷酸化水平降低。

实施例3MTT检测三组处理对TE1细胞生长的影响以及ELISA检测三组肿瘤细胞与T细胞共培养上清中免疫抑制因子IL-10、TGF-β和免疫激活因子IL-12、IL-23的含量

步骤一：成熟DC细胞的制备

密度梯度离心法分离PBMC：

(1)无菌状态下取健康自愿者10m1肝素抗凝外周静脉血。

(2)将静脉血与等体积无菌生理盐水充分混匀，用5ml注射器沿管壁缓慢滴入Ficoll-Paque人淋巴细胞分离液液面上。2000rpm离心20min。

(3)离心后管内液体分为四层：上层为黄色血浆层，第二层为白色云雾状狭窄带，第三层为淋巴细胞分离液与无菌生理盐水，第四层为红细胞层

(4)用5ml注射器缓慢吸取白色云雾状狭窄带，置入新的15ml离心管中，加入5倍体积的生理盐水，1800rpm离心10min，弃上清，重复一遍后。收获PBMCs计数。

(6)种植培养皿中，培养基选用美国giblo公司RPMI—1640培养基(不加血清、双抗)。

(7)在7～10天时，细胞浓度l×10⁶个/ml，培养基中仅加入GM-CSF(800U/mL)、IL-4(1000U/mL)，促使未成熟的DC增殖。然后加入TNF-a以促使DC成熟，培养3-5天收获细胞。

步骤二：细胞毒性T细胞(CTL)的制备：

(1)收集食管癌TE1细胞，冲洗、重悬。

(2)并将细胞计数浓度调整至1×10⁷个/mL，迅速冷冻至液氮罐中数分钟，然后于37℃水浴解冻，反复冻融3次；

(3)1000r/min转低速离心20min，收集上清液过滤除菌，4℃保存；

(4)DC细胞培养至第7天时加入肿瘤裂解物，同时加入TNF-a(15ng/mL)；

(5)第7天时，将负载肿瘤冻融抗原的DC(1×10⁶个/mI)与T淋巴细胞按1：50比例混合共同孵育3天，收集所得细胞为肿瘤特异性CTL。

步骤三：肿瘤细胞增殖检测以及共培养上清中免疫抑制因子IL-10、TGF-β和免疫激活因子IL-12、IL-23的检测。

(1)实验分为三组：空白对照组、dscontrol组、dsPTPRO组，在治疗前，将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，细胞培养箱继续培养，细胞丰度为50％-60&时转染saRNA。根据lipofectamine2000转染说明书进行转染，转染浓度为50nmol/L。6h后观察细胞状态，更换培养液，每组细胞均加入等浓度的肿瘤特异性CTL与肿瘤细胞共培养。加入PD-1阻断剂处理72小时。每24h换一次培养基和药物。

(2)食管癌细胞TE1增值检测：建立食管癌细胞TE1与T细胞共培养体系，TE1细胞做三种处理，分为：空白对照组、dscontrol组、dsPTPRO组，在96孔板中配置100ul的细胞悬液。实验中每组均设3个复孔。将培养板放在培养箱预培养24小时，向培养板加入10u1抗PD-1单抗avelumab，浓度为0ug、0.01ug、0.1ug、1.0ug、10ug，将培养板在培养箱孵育时间为72小时，每孔加入l0ul CCK-8溶液，在培养箱内孵育2小时后在酶标仪测定吸光度(450nm)。

如图3所示，结果显示dsPTPRO可显著提高PD-L1单抗avelumab的药物敏感性。

(3)共培养上清中免疫抑制因子IL-10、TGF-β和免疫激活因子IL-12、IL-23的检测：以检测TGF-β为例：将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml一次加入试剂盒中ELISA板孔中，1孔只加样品稀释液作为零孔，1孔作为TMB空白显色孔；依次加入上清，100μl/孔；酶标板加盖，37℃反应90min；反应后将准备好的生物素抗人IFN-γ抗体工作液按100μl/孔依次加入，37℃反应60min；0.01MPBS洗涤3次，每次浸泡1分钟；将准备好的ABC工作液按100μl/孔依次加入，37℃反应30min；0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2min左右；按每孔90μl依次加入TMB显色液，37℃避光反应25min；按100μl/孔依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色；用酶标仪在450nm波长处测定A450值。以IFN-γ浓度为横坐标，A450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，计算检测标本中TGF-β的含量。

试验结果：如图4所示，结果显示dsPTPRO可显著提高免疫激活因子IL-12、IL-23的含量，降低免疫抑制因子IL-10、TGF-β的含量。

实施例4小鼠体内验证saPTPRO-220及其与PD-L1抑制剂联合应用对肿瘤生长的影响

选取6周龄，体重18-20g，健康状态相似，生长状态良好的裸鼠40只，随机分四组，于SPF级动物房饲养；

选取对数期生长TE1细胞，PBS重悬计数，制成2x10⁶个/200ul的细胞悬液，在小鼠腹股沟外侧皮下注射，每个注射部位注射量为200ul；取分离好的人外周血单核细胞PBMC,用1640细胞培养液重悬成细胞悬液，注射裸鼠体内。从注射PBMC后第一天起，分别给四组小鼠尾静脉注射PBS,avelumab,saRNA，saRNA+avelumab，其中saRNA注射剂量按体重计算50nmol/kg/kg体重，每7天注射一次。avelumab的注射剂量为10mg/kg体重，每7天注射一次。

实验进行至第五周时，处死小鼠，取瘤测量大小并称重。统计分析saPTPRO-220及其与PD-L1抑制剂联合应用对肿瘤生长的影响。绘制肿瘤生长曲线并运用统计学方法分析四组小鼠肿瘤生长的差异。

结果如图5所示，四组生长曲线差异表明saRNA(即saPTPRO-220)、avelumab以及saRNA+avelumab相对于PBS起到抑制肿瘤体积增长的作用，其中，单独使用saRNA、avelumab时，对肿瘤生长的抑制效果几乎相同，当同时使用saRNA+avelumab时，肿瘤体积增长速度显著降低，甚至，同时使用saRNA+avelumab约15天后，肿瘤体积开始减小，说明saRNA和avelumab同时使用时，两者之间具有协同增效抗肿瘤的作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110> 张灏

<120> 一种saRNA及其用途

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3000

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

tgatttggag tcttgaaaat agcataataa gatttatcat actttggaag tattgtattg 60

aaaaaccagt caatagctca aagaaacaca aaacatgctc tatgaattga aaaccccaca 120

ctgtggatga cacagcattc acattcttta tgagaatctc ttctaggaca ctgttatggt 180

ttaagtgcaa taaaaacaaa tgaaagtatt ttatccagca atagcaatgt aaaatacttt 240

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tacatatata tatatatgca caaagacaga aagagctgaa caaattgtga tgtatgacta 480

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gttcttttag catttacaag attaatttat gatcagaact gctttaaacg ccctacgcac 600

atcaggcaag gctatatcca tgtatacaca cagacatatg catacacaca aatgaatatc 660

atcatacaga cccataattc acagacacat tttaaaatta aatgctactc caaagagaaa 720

ttgttggcat cctgtgagtg tgattgttgc ccttggccta tatatatctt atgttctaga 780

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catatgtaca tgcacacaca tatgtgtaca catatgtaca tgcacacaca tgtgtgtaca 1320

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tagtgtttgg ccattgctca tgcagcaaaa gctgagtaaa cacagctctg gatccttttc 1500

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ccaatactga cagggcacag caagggtaat ttacatgaca ataagaaatg atttctatct 1680

gaacagtgca taccagagtt gatttcgaca gacttatctt taaaaaaata cacataacaa 1740

aaaaggagac aagtagtaga ttggggaccc acagcttgaa agtcgttgct tgtgattcta 1800

aaacatccca gtaaaattat tcacagataa ttgtttaaaa atataactgt acataccgtt 1860

gacacttgga caacacagag aatcacgtag ttgaaaatcc acatataact ttgaactcat 1920

caaaacctta actactaata gcctactctt gaccggaaac cttactgata acataataaa 1980

cagttgatta acacacattt tgtgttgtat gtattgtata ctgtattctt acaataaagt 2040

acgctagaga acagaaaata ttattaagaa aaccataaag aggagaaaat acatttatat 2100

tcattgagtg gaagtgaatt atcataaaag tctttaacgt catccttttc aggctgagca 2160

ggcagaggag gaggaagagg gtttggtctt gctgtctcaa ggctggcaaa ggtggaagaa 2220

aatctgcata taactggacc caacagttca aacccgtgtt gttcaagggt catacatgta 2280

aaatactgtg atttttcccc cttctatatt cagcttcagg tgacccgaca cactttggta 2340

tcaaaagaga atctgaaatg tacaagaact gcggatttca aatggaaaag gtgcataatt 2400

gtgctatttg ttcctgggtg agtgtgggac ggagacggtg agagtgttga aatgggatgg 2460

agataatgga agcagtgggg aaggagagaa aatacccttc ctatcacaca cactcacaca 2520

ctcacactac acactatttc tacagtcaca actacccaac tgttattgat cctttataac 2580

tgcaattgag tacagatgta ggaagattga gagggaactg ggatctggcg cctggattgc 2640

tcaagagagg tcagggaaac ccctcagaac tcctgagacc cagagattga gggaggggtt 2700

gaggcggagt ctgcaatggg ggctgtccag cagtagcaag cagcgggccg atcctggtgg 2760

agggttggga ggctgctgtc attttatggg tcggcagcca gagtgagagt gtccctgctg 2820

ccagaggact acggcgggct gggcgcgggg tccccgcctc tcgctcacca cacagacccc 2880

gcgcctcctc tggcagccgc ggtggtggcg gcggcagagc ctcgcccact ccaatcccca 2940

ccctctccat ccttagtcat taaagaacag cagcgcctgg cacgttcttg gaggaccccg 3000

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gguugggagg cugcugucat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ugacagcagc cucccaacct t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

auugaguaca gauguaggat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

uccuacaucu cuacucaaut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agacggugag aguguugaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucaacacuc ucaccgucut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgacacacu uugguaucat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ugauaccaaa gugugucggt t 21

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaaccuuacu gauaacauat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

uauguuauca guaagguuut t 21

Claims (2)

1.一种saRNA和PD-1/PD-L1抑制剂的联合使用在制备用于***的药物中的用途；其特征在于，所述saRNA由序列如SEQ ID NO:2所示的正义链和序列如SEQ ID NO:3所示的反义链组成；所述PD-1/PD-L1抑制剂为avelumab。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为NSCLC、黑色素瘤、肾细胞癌、***癌、乳腺癌、胶质瘤、食管癌、霍奇金淋巴瘤、恶性胸膜间皮瘤或头颈肿瘤。

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