CN108103031A - 一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水产养殖领域，公开了一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法，该噬菌体制剂由保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。制备方法：1）将大肠杆菌DH5α添加至培养基中发酵培养，得到宿主菌发酵液；2）将噬菌体和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，混匀后静置，增殖培养，得到发酵混合液；3）将发酵混合液经离心后，得到噬菌体制剂。本发明的宽谱噬菌体制剂对多种水产养殖病原菌均有裂解作用，可单独或与其他微生态制剂复配使用。且其宿主菌采用基因工程菌，制备方法简便，使用安全，无副作用，可推广应用于水产养殖的细菌性病害防治。

Description

一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，尤其涉及一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法。

背景技术

近年来我国水产养殖发展迅速，但病害也逐年严重。据不完全统计，目前水产养殖病害多达300余种，每年发生病害的养殖面积约占总养殖面积的1/10，年损失量占养殖总产量的15％～30％，年经济损失达数百亿元，严重威胁水产养殖业的可持续发展。

自1928年弗莱明发现青霉素以来，抗生素得到了广泛的使用和发展，此后人类进入了抗生素的高速发展期。广义上的抗生素是抑制或消除微生物生长的化学治疗剂。由于水产养殖具有细菌感染风险高的特点，出于预防和治疗目的，在养殖过程中使用抗生素成为水产行业的普遍做法。Amir Sapkota等人研究发现1990-2007年包括中国在内的等13个水产养殖国家中，使用过土霉素、氯霉素和奥索利酸的国家比例分别占到了92％、69％和69％。抗生素在过去60多年中被广泛使用，导致细菌耐药性基因加速扩散，耐药型细菌种类不断增加。此外，抗生素滥用还导致了水产品药物残留、破坏水体环境、危害有益微生物等一些列严重的后果。随着人们对抗生素及其残留对水产品安全和环境安全危害性的认识，以及贸易全球化趋势，我国对水产用抗生素种类及使用进行了严格的限制，水产养殖中滥用抗生素现象也已得到了较好的控制。但由于较长时间以来，抗生素在水产养殖中作为病害防治的重要手段，耐药菌株已普遍存在。据国家鲆鲽类产业技术体系的研究发现，我国鲆鲽类养殖中发现的90多种细菌性病原都存在不同程度的抗生素耐药性。因此，抗生素的限制使用与耐药菌株的大量出现，这一矛盾常导致生产上无药可用的现象发生。无抗生素水产养殖是今后产业发展的一个趋势。

噬菌体(phage，bacteriophage)是寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等中的一类病毒，亦称细菌病毒。其中烈性噬菌体可在敏感菌细胞内增殖并使之裂解，是细菌的“天然杀手”。因此，噬菌体也是细菌性病害的防治途径之一。与抗生素相比，噬菌体还具有特异性强、副作用小、增殖能力强、不易产生抗性、病原菌依赖性以及使用方便等特点，是一种绿色的生物防治措施。已有的文献报道发现噬菌体对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门菌(Salmonella)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)等细菌均有较好的抑制效果。

由于噬菌体对宿主菌杀菌作用具有特异性，大多数噬菌体对病原菌的防治有一定的局限性，即一种噬菌体只对1种或几种病原菌有杀菌作用。此外，其特异性也导致噬菌体制剂常以致病菌本身作为宿主菌进行制备，对后期的纯化要求较高，且给生产应用带来潜在的风险。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂及其制备方法。本发明的宽谱噬菌体制剂对多种水产养殖病原菌均有裂解作用，可以单独或与其他微生态制剂复配使用。且其宿主菌采用基因工程菌，制备方法简便，使用安全，无副作用，可推广应用于水产养殖的细菌性病害防治。

本发明的具体技术方案为：一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂，由保藏号为CGMCCNo.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。

本发明人在在先专利(201410506817.6，一株中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用)中发现了噬菌体毒株NTHP01后，进行了后续的研究，发现其不仅对气单胞菌具有裂解作用，而且还具有宽谱性。

此外，现有技术中，通常由于噬菌体的特异性导致噬菌体制剂常以有害的致病菌本身作为宿主菌进行制备，对后期的纯化要求较高，且给生产应用带来潜在的风险。而本发明采用基因工程用营养缺陷型大肠杆菌DH5α作为宿主菌，该宿主菌自身无害或者低毒害，因此后期纯化要求低，安全性高。并且本发明对宿主菌也具有良好的噬菌效果。

总之，本发明为后续规模化生产提供了安全性较高的宿主菌，简化了纯化分离工艺。本发明噬菌体制剂制备方法简便，使用安全，无副作用，制得的宽谱噬菌体制剂对多种水产养殖病原菌均有裂解作用，可以单独或与其他微生态制剂复配使用，可推广应用于水产养殖的细菌性病害防治。

上述水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至培养基中发酵培养，得到宿主菌发酵液。

2)将保藏号为CGMCC No.9623，保藏日期2014年8月28日的噬菌体毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，混匀后静置，然后进行增殖培养，得到发酵混合液；其中，增殖培养条件为：噬菌体毒株NTHP01添加时大肠杆菌DH5α的活化至OD₆₀₀为0.3-0.5，感染复数为10^-1-10^-2；温度30-37℃培养5h以上。

3)将发酵混合液经离心后，使噬菌体与宿主菌分离，得到宽谱噬菌体制剂。

本发明团队的在先专利(201410506817.6，一株中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用)公开了保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01，并公开了其能对中华鳖嗜水气单胞菌形成噬菌斑，对致病性气单胞菌具有裂解作用，可用于对气单胞菌所导致的疾病采用生物疗法治疗和预防，尤其对中华鳖烂脖子病和白点病等具有显著的治疗作用。在该专利技术方案中，只公开了噬菌体毒株NTHP01对气单胞菌具有裂解作用，并未公开其具有宽谱性：除了气单胞菌外对其他细菌(迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、格瓦斯细菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆菌等常见细菌)也具有裂解作用。因此本领域技术人员根据专利201410506817.6的记载并无法获知噬菌体毒株NTHP01具有宽谱性。

并且，在实际中除本发明团队外的其余本领域技术人员对该噬菌体的研究并不多，因此普通本领域技术人员也并不知晓噬菌体NTHP01的生理特征。为此，本发明通过长期大量探究宽谱噬菌体NTHP01的生理特征，如耐受温度，对不同pH条件的稳定性，增殖规律，感染复数，氯化镁(MgCl₂)添加浓度等确定增殖条件，并通过放大培养确定制备条件，制得可在4℃保存的产品。

该噬菌体对多种水产养殖常见病原菌有裂解作用；从电镜形态分析，属肌尾噬菌体科，命名为NTHP01，在pH4-10条件下都能存活。常温保存6个月活性稳定；添加30％甘油保护剂，4℃保存1年后活性稳定。

本发明的宽谱噬菌体制剂可在水产养殖细菌性病害防治中应用，该噬菌体制剂可用于抑制水产养殖常见病原菌(包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、格瓦斯细菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆菌等常见细菌)的生长。

作为优选，所述培养基为营养肉汤培养基；大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至培养基中于37℃发酵培养3-4h。

作为优选，步骤2)中，向所述培养基中添加MgCl₂母液使培养基中MgCl₂浓度为4-30mM，混匀后静置20-40min。

作为优选，步骤2)中，增殖培养条件为：感染复数为10^-2，MgCl₂终浓度为4mM，温度37℃，培养5h使OD₆₀₀为1.9。

作为优选，步骤3)中，在小规模生产中，离心条件为：5000-6000rpm/min，10-20min。

作为优选，步骤2)中，得到发酵混合液后，在进入步骤3)前，还经过二级串联发酵处理：

将发酵混合液和MgCl₂母液分别添加至大规模宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为4mM，，混匀后静置20-40min，进行二次发酵培养，得到二次发酵混合液；然后进入步骤3)；其中，二次发酵培养条件为：37℃，感染复数为10^-2，噬菌体添加时宿主菌活化至OD₆₀₀为0.3-0.5，培养5h。

本发明该提供了一种噬菌体制剂的规模化生产方法，首先在实验室摇瓶条件下优化培养时间、温度、感染复数等增殖条件，测定添加不同浓度离子对增殖的影响，最终确定噬菌体最佳增殖条件。在此基础上设计二级串联发酵方案，采用2吨发酵罐成功获得10⁹pfu/ml的噬菌体液。

作为优选，所述大规模宿主菌发酵液的制备方法如下：将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养20-24h；然后转移至45-55倍体积的培养基中于37℃继续发酵培养3-4h。

作为优选，步骤3)中，在大规模生产中，将二次发酵混合液通过蝶式离心机离心分离宿主菌，所得液体为宽谱噬菌体制剂。

本发明的水产养殖用宽谱噬菌体制剂在水产养殖细菌性病害防治中的应用，所述宽谱噬菌体制剂用于抑制水产养殖常见病原菌生长；所述病原菌包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、格瓦斯细菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆菌等常见细菌。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

本发明的宽谱噬菌体制剂对多种水产养殖病原菌均有裂解作用，可以单独或与其他微生态制剂复配使用。且其宿主菌采用基因工程菌，制备方法简便，使用安全，无副作用，可推广应用于水产养殖的细菌性病害防治。

本发明通过探究宽谱噬菌体NTHP01的生理特征，如耐受温度，对不同pH条件的稳定性，增殖规律，感染复数，氯化镁(MgCl₂)添加浓度等确定增殖条件，并通过放大培养确定制备条件，制备的产品可在4℃保存。

附图说明

图1为本发明规模化制备噬菌体制剂的发酵工艺流程图；

图2为电镜观察噬菌体NTHP01形态图(箭头所指的为噬菌体)；

图3为噬菌体NTHP01的一步生长曲线图；

图4为不同pH对噬菌体NTHP01的影响图；

图5为不同温度对噬菌体NTHP01的影响图；

图6为不同感染复数对噬菌体NTHP01增殖的影响图；

图7为不同氯化镁浓度对噬菌体NTHP01促感染的影响图；

图8为噬菌体NTHP01对部分常见水产养殖病原菌的抑菌作用图(A双层平板法裂解的嗜水气单胞菌，B和C分别为滴注法裂解的嗜水气单胞菌和副溶血弧菌，箭头所示为噬菌斑)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂，由保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。

所述水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养3.5h，得到宿主菌发酵液。

2)将保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为4mM，混匀后静置30min，然后进行增殖培养，得到发酵混合液；其中，增殖培养条件为：噬菌体毒株NTHP01添加时大肠杆菌DH5α的活化至OD₆₀₀为0.3，感染复数为10^-2；温度37℃培养5h使OD₆₀₀为1.9。

3)将发酵混合液经离心(5500rpm/min，15min)后，使噬菌体与宿主菌分离，取上清液，得到宽谱噬菌体制剂。

实施例2

一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂，由保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。

所述水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养3.5h，得到宿主菌发酵液。

2)将保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为4mM，混匀后静置30min，然后进行增殖培养，得到发酵混合液；其中，增殖培养条件为：噬菌体毒株NTHP01添加时大肠杆菌DH5α的活化至OD₆₀₀为0.3，感染复数为10^-2；温度37℃培养5h使OD₆₀₀为1.9。

在步骤1)和2)同时，制备大规模宿主菌发酵液：将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养22h；然后转移至50倍体积的培养基中于37℃继续发酵培养3.5h。

3)二级串联发酵处理：将发酵混合液和MgCl₂母液分别添加至大规模宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为4mM，混匀后静置30min，进行二次发酵培养，得到二次发酵混合液；其中，二次发酵培养条件为：37℃，感染复数为10^-2，噬菌体添加时宿主菌活化至OD₆₀₀为0.3，培养5h。

4)将二次发酵混合液通过蝶式离心机离心分离宿主菌，所得液体为宽谱噬菌体制剂。

实施例3

一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂，由保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。

所述水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养3h，得到宿主菌发酵液。

2)将保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为30mM，混匀后静置30min，然后进行增殖培养，得到发酵混合液；其中，增殖培养条件为：噬菌体毒株NTHP01添加时大肠杆菌DH5α的活化至OD₆₀₀为0.4，感染复数为10^-1；温度37℃培养5h使OD₆₀₀为1.9。

3)将发酵混合液经离心(5000rpm/min，20min)后，使噬菌体与宿主菌分离，取上清液，得到宽谱噬菌体制剂。

实施例4

一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂，由保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。

所述水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养4h，得到宿主菌发酵液。

2)将保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为15mM，混匀后静置30min，然后进行增殖培养，得到发酵混合液；其中，增殖培养条件为：噬菌体毒株NTHP01添加时大肠杆菌DH5α的活化至OD₆₀₀为0.5，感染复数为10^-2；温度37℃培养5h使OD₆₀₀为1.9。

在步骤1)和2)同时，制备大规模宿主菌发酵液：将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养24h；然后转移至50倍体积的培养基中于37℃继续发酵培养4h。

3)二级串联发酵处理：将发酵混合液和MgCl₂母液分别添加至大规模宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为15mM，混匀后静置30min，进行二次发酵培养，得到二次发酵混合液；其中，二次发酵培养条件为：37℃，感染复数为10^-2，噬菌体添加时宿主菌活化至OD₆₀₀为0.5，培养5h。

4)将二次发酵混合液通过蝶式离心机离心分离宿主菌，所得液体为宽谱噬菌体制剂。

研究过程实施例

一、噬菌体NTHP01的分离培养

分离纯化

1)噬菌体NTHP01的分离使用胰蛋白胨大豆琼脂培养基，以中华鳖养殖塘中分离出的嗜水气单胞菌为宿主菌，采用双层平板分离法分离裂解性噬菌体。双层平板的制备如下：首先配制2％胰蛋白大豆琼脂培养基和0.7％半固体胰蛋白大豆琼脂胨培养基。

2)将融化后的2％胰蛋白大豆琼脂培养基倾注培养皿底层，凝固后为底层培养基。

3)将0.7％半固体培养基融化后于46℃保温，将一定量的噬菌体与宿主菌混合，吸附20-30min后，再与半固体培养基混合，倾注在底层培养基上，28℃培养6-8h后，观察噬菌斑。噬菌体出斑后挑斑用液体胰酪胨大豆肉汤培养，重复以上过程直至纯化。

2、噬菌体NTHP01的扩增培养与收获

培养新鲜宿主菌菌液至OD₆₀₀为0.3加入MgCl₂使之终浓度达4mM，静置吸附20-30min，150rpm/min摇5个小时后收获。将培养液移入离心管中，以5，000g离心10分钟，以沉淀寄主细菌；将上清液移至新管中，以0.22μm孔径的细菌过滤器去除残余菌体，即得不含宿主菌之噬菌体原液。双层平板法测定其效价，4℃保存备用。

二、噬菌体NTHP01的电镜观察

将上述制备的噬菌体原液经30KD的超滤管浓缩后，用适量的PBS缓冲液洗涤后，采用磷钨酸负染后，滴铜网，透射电镜观察噬菌体形态。如图2所示，结果显示噬菌体头部呈廿面体，约为60-145nm，并伴有长短不一的尾巴(80-455nm)。结合《病毒分类-国际病毒分类委员会第9次报告》，NTHP01噬菌体为尾噬菌体目，肌尾噬菌体科噬菌体。

三、一步生长曲线测定

一步生长曲线可以通过计算得出噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量等信息。将噬菌体按最适MOI与宿主菌各3mL混合，28℃温育至大量吸附后，13000g离心1min，弃上清，沉淀用10mL 28℃预热的液体培养基重悬，至于28℃，120rpm/min振荡培养。前25分钟每隔5min取样，之后每隔15min取样，连续取样3.5h，每次取500μL，0.22μm滤膜过滤，采用双层琼脂培养法测定滤液中噬菌体效价。以培养时间为横坐标，噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线。如图3所示，结果表明，噬菌体NTHP01增殖的潜伏期和爆发期分别为150min，60min。

四、噬菌体NTHP01的pH稳定性

以培养液为介质，调节pH值为4、5、6、7、8、9、10、11。取滴度为1×10⁸PFU/mL的噬菌体原液100μL，加入到900μL不同pH值的TSB培养液中，28℃水浴2h后测定各管噬菌体的滴度，并计算噬菌体的pH耐受范围。如图4所示，结果显示，噬菌体NTHP01具有较宽的pH适应性。在pH7到pH10的条件下，滴度在10⁷PFU/mL与初始滴度基本一致，即噬菌体在此pH区间保持较高的生物活性。在pH7活性最高。pH小于7或大于10时，随着酸性或碱性增强，噬菌体活性逐渐下降，但总体都具有一定的活性。

五、噬菌体NTHP01的热稳定性

将上述制备的噬菌体原液稀释至1x10⁷PFU/mL并分装于4个5mL离心管中，每管各2mL，将离心管分别放置于30℃，40℃，50℃和60℃的恒温水浴锅中，每隔20min测定各管中噬菌体的滴度，直至第100min。待温度平衡后，测定其效价。如图5所示，结果显示，该噬菌体在30℃-40℃区间内，噬菌体滴度均在10⁶PFU/mL以上，相比较原始滴度10⁷PFU/mL并未明显降低，整体上存活率高。温度达到50℃及以上时，该噬菌体在20min内快速失活，20min时滴度只有10⁵PFU/mL，当时间在100min，50℃噬菌体滴度仅为10⁴PFU/mL，大部分死亡，表现出该噬菌体对50℃以上的温度高度敏感，活性较低。

六、噬菌体NTHP01的最适感染复数(MOI)

将宿主菌摇至1×10⁸CFU/mL，同时制备1×10⁸PFU/mL的噬菌体原液，两者分别进行10倍梯度稀释至1×10⁵PFU/mL，按表1以7个不同MOI(1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取100μL在1.5mL Eppendorf管中混合，并加入800μL新鲜液体培养基，28℃培养3.5h。取出后分别测定各管中噬菌体效价，3.5h滴度最高所对应的MOI即为最适感染复数。如图6所示，结果显示该噬菌体感染复数为1、10、100、1000和0.001时，对宿主菌感染效果最差，在0.1和0.01时对宿主菌有较好的感染效果，最适感染复数为0.01。

七、不同氯化镁浓度对噬菌体NTHP01增殖的影响

在6个装有10ml培养基已灭菌的50mL离心管中各加入100μL宿主菌1×10⁸CFU/mL，37℃摇床培养3h。各加入1×10⁸PFU/mL的噬菌体原液100μL，及不同终浓度氯化镁(0，2mM，4mM，8mM，16mM，32mM)，作用30min后置于37℃摇床培养4h，取出后分别测定各管中噬菌体效价。如图7所示，结果显示，添加氯化镁的噬菌体滴度明显高于未添加，且在氯化镁终浓度为4mM，促进对噬菌体的感染作用最佳。

八、多级串联发酵规模化制备噬菌体

在上述噬菌体增殖条件的实验结果基础上，设计多级串联发酵方案，如图1所示。具体实施如下：

1)30L噬菌体与宿主菌混合液制备。首先制备600ml新鲜宿主菌液，加入30L培养基(50L发酵罐)中，37℃培养3-4h，使菌液OD₆₀₀达0.3左右，再加入噬菌体原液600ml和MgCl₂母液300ml(终浓度为4mM)，混匀后静置30min，之后37℃培养5h，终止发酵，即得30L噬菌体与宿主菌混合液，用于后续发酵。

2)1.5吨噬菌体液的制备。600ml新鲜宿主菌液，加入30L培养基(50L发酵罐)中，37℃培养20-24h；之后加入1.5吨发酵培养基中(2吨发酵罐)，37℃培养3-4h，使菌液OD₆₀₀达0.3左右，加入上述制备的30L噬菌体与宿主菌混合液，同时加入MgCl₂母液1.5L(终浓度为4mM)，混匀后静置30min，之后37℃培养5h，终止发酵。将发酵产物采用碟式离心机离心，收集液体，分装。采用双层平板法测定噬菌体效价，其效价为2x10⁹pfu/ml。

九、噬菌体对不同病原菌的抑菌效果

采用双层平板法和滴注法观察噬菌体的对水产养殖常见病原菌的噬菌效果。所测试的病原菌有：分离自中华鳖的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌；分离自南美白对虾的嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、格瓦斯细菌；分离自罗氏沼虾的肠杆菌；分离自红螯螯虾的弗氏柠檬酸杆菌；分离自石斑鱼的嗜水气单胞菌以及鲈鱼的温和气单胞菌等。双层平板法是首先配制2％LB琼脂培养基和0.7％半固体LB培养基。将融化后的2％LB培养基倾注培养皿底层，凝固后为底层培养基。将0.7％半固体培养基融化后于46℃保温，将一定量的噬菌体分别与待测病原菌混合，吸附20-30min后，再与半固体培养基混合，倾注在底层培养基上，28℃培养6-8h后，观察噬菌斑。滴注法是首先用涂布法将宿主菌涂满这个平板，待平板表面风干3-5min后，再在平板上滴加5μL噬菌体液，28℃培养8-12h后，观察噬菌效果。如图8所示，结果表明，双层平板中可见明显的噬菌斑，滴注法测试上述病原菌，均可明显观察到噬菌效果，表明该噬菌体对上述水产养殖常见病原菌均有较好的裂解效果。

同时，采用基因工程用营养缺陷型大肠杆菌DH5α作为宿主菌，也具有良好的噬菌效果。为后续规模化生产提供了安全性较高的宿主菌，简化了纯化分离工艺。

表1.噬菌体对部分水产养殖常见细菌的噬菌作用

(注：+表示细菌对噬菌体敏感度较弱，++表示细菌对噬菌体的敏感度中等强，+++表示细菌对噬菌体的敏感度强)

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种水产养殖用宽谱噬菌体制剂，其特征在于：由保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备。

2.一种如权利要求1所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至培养基中发酵培养，得到宿主菌发酵液；

2）将保藏号为CGMCC No.9623的噬菌体毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌发酵液中，混匀后静置，然后进行增殖培养，得到发酵混合液；其中，增殖培养条件为：噬菌体毒株NTHP01添加时大肠杆菌DH5α的活化至OD₆₀₀为0.3-0.5，感染复数为10^-1-10^-2；温度30-37℃培养5h以上；

3）将发酵混合液经离心后，使噬菌体与宿主菌分离，得到宽谱噬菌体制剂。

3.如权利要求2所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，所述培养基为营养肉汤培养基；大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至培养基中于37℃发酵培养3-4h。

4.如权利要求2所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中，向所述培养基中添加MgCl₂母液使培养基中MgCl₂浓度为4-30mM，混匀后静置20-40min。

5.如权利要求2或4所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中，增殖培养条件为：感染复数为10^-2，MgCl₂终浓度为4mM，温度37℃，培养5h使OD₆₀₀为1.9。

6.如权利要求2所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤3）中，离心条件为：5000-6000rpm/min，10-20min。

7.如权利要求2所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中，得到发酵混合液后，在进入步骤3）前，还经过二级串联发酵处理：

将发酵混合液和MgCl₂母液分别添加至大规模宿主菌发酵液中，使MgCl₂终浓度为4mM，混匀后静置20-40min，进行二次发酵培养，得到二次发酵混合液；然后进入步骤3）；其中，二次发酵培养条件为：37℃，感染复数为10^-2，噬菌体添加时宿主菌活化至OD₆₀₀为0.3-0.5，培养5h。

8.如权利要求7所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，所述大规模宿主菌发酵液的制备方法如下：将大肠杆菌DH5α的新鲜菌液添加至营养肉汤培养基中于37℃发酵培养20-24h；然后转移至45-55倍体积的培养基中于37℃继续发酵培养3-4h。

9.如权利要求7或8所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤3）中，将二次发酵混合液通过蝶式离心机离心分离宿主菌，所得液体为宽谱噬菌体制剂。

10.如权利要求1所述的水产养殖用宽谱噬菌体制剂在水产养殖细菌性病害防治中的应用，其特征在于，所述宽谱噬菌体制剂用于抑制水产养殖病原菌生长；所述病原菌包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、格瓦斯细菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆菌。