CN108102970B - 一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群及其制备和应用方法 - Google Patents

一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群及其制备和应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群及其制备和应用方法，属于微生物治理重金属污染土壤技术领域。本发明分别采用自养型和异养型微生物复配成一种可高效去除土壤中酸溶态和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群，既包括属于异养微生物的硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉，又包括属于自养微生物的嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌。本发明不但解决了复配的功能菌群在加入到污染土壤中适应性差，难定殖的问题，而且保证了污染土壤中酸溶态和可还原态镉有较高的去除率，显著降低了镉生物有效性和植物可利用性。本发明对微生物治理镉污染土壤的推广应用奠定了一定的基础。

Description

一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生 物功能菌群及其制备和应用方法
技术领域
本发明涉及一种用于去除镉污染土壤中酸溶态和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群及其制备和应用方法，属于微生物转化治理重金属污染土壤技术领域。
背景技术
目前我国重金属污染耕地面积约1.8～2.7亿亩，主要分布在我国南方湖南、江西、湖北、四川、广西、广东等省区，其中镉污染情况尤为严重。镉污染区域主要集中在采矿、金属冶炼企业周边、污水灌区、大中城市郊区和南方酸性水稻土区等。据调查，镉超标食品已经涉及粮食、水产品、经济作物、食用菌、动物内脏等，说明在污染地区镉污染情况已经比较普遍。土壤镉含量的不断累积会使土壤中固氮菌的多样性减少，影响作物根系对氮的固定和硝酸还原酶活性；镉含量的增加还会破坏植物体中的叶绿素，减少根系对水分和养分的吸收。镉元素通过食物链进入人体后，与人体内的功能蛋白质及特异性的酶发生反应使其失去活性，并在人体肾脏、肝脏等器官中积累造成慢性中毒，同时还干扰铜，钴，锌等微量元素在体内的正常代谢，诱发各种疾病，甚至死亡。
重金属生物有效性和植物可利用性是衡量土壤重金属元素迁移和生态影响的重要参数，同时在评价生态地球化学中有重要作用。重金属形态是指某一重金属元素在环境中以某种离子或分子存在的实际形式。重金属离子作为一种重要的污染物进入土壤中，会经过一系列的反应，包括吸附、络合、淋溶和还原反应等，使其实际存在形式与输入形态有所不同。通过这些行为，重金属最终以不同的方式与土壤的不同组分性结合形成不同形态的重金属。通过BCR提取法，可将重金属形态分为弱酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态，其中弱酸提取态和可还原态容易被植物吸收利用并对人类健康造成直接影响。因此，降低土壤重金属弱酸提取态和可还原态的含量对降低土壤重金属的污染程度、减少重金属对人类健康的危害以及生态***和人群健康的影响有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于去除镉污染土壤中酸溶态和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的制备方法。不但解决了复配的功能菌群在加入到污染土壤中适应性差，难定殖的问题，而且保证了污染土壤中酸溶态和可还原态镉有较高的去除率，显著降低了镉生物有效性和植物可利用性，对微生物治理镉污染土壤的推广应用奠定了一定的基础。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的制备方法：
所述的功能菌群由属于异养微生物的硫还原泥土杆菌(Geobactermetallireducens)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)、固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)、木霉(Streptophyta sp.)和属于自养微生物的嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)、喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸杆菌(Acidiphiliumcryptum)混合而成。
作为进一步的改进，先将属于异养微生物的硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉复配得到混合菌群a；属于自养微生物的嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌复配得到混合菌群b；然后将混合菌群a和b复配得到混合菌群c，最后再培养得到功能菌群。
作为进一步的改进，先将各种微生物单独培养，当达到对数生长期时收集微生物并计数，根据微生物数量比例混合获得两种营养类型的混合菌群，其中硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉按照1～1.2：1～1.2：1～1.2：1～1.2：1～1.2的比例混合得到混合菌群a；嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌按照1～1.2：1～1.5：1～1.2的比例混合得到混合菌群b；将得到的混合菌群a和b按照微生物数量比1:1混合。
作为进一步的改进，各微生物单独培养的培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；单独培养硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉时，培养基中还加入葡萄糖0.5～0.7g/L，酵母粉0.1～0.3g/L；单独培养嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌时，在培养基中加入硫粉0.5～1g/L。
作为进一步的改进，将得到的混合菌群a和b分别在含镉培养基中驯化培养；然后将混合菌群a和b混合得到混合菌群c，最后在含镉培养基中进行适应性培养得到功能菌群。
作为进一步的改进，将得到的混合菌群a和b分别在驯化培养基中进行驯化，驯化培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；培养混合菌群a时，在培养基中加入葡萄糖0.5～0.7g/L，酵母粉0.1～0.3g/L；培养混合菌群b时在培养基中加入硫粉0.5～1g/L；此外，在培养基中均加入氯化镉150～200mol/L；每次传代接种的微生物浓度为1.2～2×107个/mL，培养后微生物的浓度至少达到4×108～109个/mL；混合菌群a和b各自至少培养20代后，按照微生物数量等比例混合得到混合菌群c。
作为进一步的改进，混合菌群a和b的传代过程在2～3L的玻璃烧杯中进行，搅拌桨转速为400-500rpm，培养温度为25～30℃，初始pH值为3.0～4.5。
作为进一步的改进，所述的混合菌群c的适应性培养过程如下：基本培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；培养基还加入葡萄糖0.5～0.7g/L，酵母粉0.1～0.3g/L，硫粉0.5～1g/L，氯化镉150～200mol/L。
作为进一步的改进，对混合菌群c进行适应性培养，传代过程在2～3L的玻璃烧杯中进行，搅拌桨转速为400～500rpm，培养温度为25～30℃，初始pH值为3.0～4.5，每代培养时间为3～5天，当菌液pH值达到2.0以下，微生物菌体密度达到4×108～109个/mL时，进行传代培养，每次传代接种的微生物浓度为1.2～2×107个/mL。混合菌群c至少培养20代后得到兼养型微生物功能菌群。
本发明的另一目的是提供上述方法制备得到的能去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群。
本发明的第三个目的是提供能去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的应用方法：将所述的微生物功能菌群加入到镉污染土壤中反应除镉。具体如下：
在250～500mL锥形瓶中加入100～200mL基本培养基，培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L；Ca(NO3)2，0.001g/L；葡萄糖0.5～0.7g/L；酵母粉0.1～0.3g/L；硫粉0.5～1g/L；在此体系中加入40～60wt％的粒径小于20目镉含量为21mg/kg的镉污染土壤；将微生物功能菌群加入到锥形瓶中，初始加入的微生物浓度为1.2～2×107个/mL，转速为170～180rpm，温度为25～30℃，初始pH值为3.0～4.5，反应时间为3～5天。
本发明针对污染土壤中镉形态的微生物转化机理，采用不同营养类型的微生物复配成一种可高效治理镉污染土壤的功能菌群，不但解决了复配的功能菌群在加入到污染土壤中适应性差，难定殖的问题，而且保证了污染土壤中酸溶态和可还原态镉有较高的去除率，显著降低了镉生物有效性和植物可利用性。
附图说明
图1为不同混合菌群对土壤中酸溶态和酸溶态和可还原态镉去除率的影响。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
镉污染土壤中存在高浓度的有毒物质(重金属及其他有机污染物)和多种营养类型的本土微生物，要降低土壤中镉生物有效性和植物可利用性，单一菌株很难在重金属污染土壤修复领域达到工业化应用，因此，需要构建一种适应性强，营养结构合理且能够将不溶态镉高效转化为可溶态镉并去除的微生物功能菌群。
本发明首先筛选出对镉形态具有转化功能的多种微生物进行纯培养，再根据微生物的营养类型构建出异养和自养两种功能菌群；其中，在构建这两种菌群时，将同一营养类型的菌株进行不同组合混合成若干复合菌群，减少菌种之间的拮抗作用，发挥他们的协同作用，并在含镉培养基中对菌群进行驯化。然后将构建的若干个异养和自养微生物菌群进行镉污染土壤的修复实验，挑选出修复效果最好的异养和自养菌群进行等比例复配。其中构建的多个异养和自养微生物菌群及去除土壤中酸溶态和可还原态镉的效果如下：
1.异养微生物功能菌群：
菌群A：硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌、木霉等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为15.72％和6.18％。
菌群B：皱褶假丝酵母菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌、木霉等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为13.23％和5.11％。
菌群C：硫还原泥土杆菌、铜绿假单胞菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌、木霉等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为6.34％和7.69％。
菌群D：硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、粘红酵母菌、厌氧粘细菌、木霉等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为11.94％和6.16％。
菌群E：硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、橘青霉、木霉等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为14.34％和4.55％。2.自养微生物功能菌群：
菌群A：嗜酸氧化亚铁硫杆菌、喜温硫杆菌、嗜热嗜酸铁质菌和万座酸菌等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为14.27％和4.12％。
菌群B：嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌、嗜酸杆菌等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为22.28％和22.53％。
菌群C：嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌等比例混合，驯化20代后，修复试验表明土壤中酸溶态和可还原态镉的去除率分别为10.60％和13.16％。
根据以上结果选取异养菌群A和自养菌群B作为菌群a和b，并再次对这两个菌群在含镉培养基中进行适应性培养，最终得到能够高效去除土壤中酸溶态和和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群。
本实施例所用镉污染土样取自于湖南省湘潭县湘江入口4公里处，该地区土壤镉污染由工业废水的随意排放所致，污染时间长，污染程度严重，治理难度大。经测定，土样中镉含量为21mg/kg，其他重金属离子含量低于国家标准规定GB 15618－1995《土壤环境质量标准》。
本发明制备功能菌群的微生物均购自于各菌种保藏库，分别为属于异养微生物的硫还原泥土杆菌(Geobacter metallireducens ATCC 53774)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.CGMCC No.7038)、固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicusCGMCC No.5455)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.ATCC BAA258)、木霉(Streptophytasp.CGMCC No.8725)和属于自养微生物的嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans ATCC19377)、喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus CCTCC AB207044)、嗜酸杆菌(Acidiphilium cryptum CCTCC M208056)混合而成。
各微生物单独培养的培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；单独培养硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉时，培养基中加入葡萄糖0.7g/L，酵母粉0.3g/L；单独培养嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌时，在培养基中加入硫粉1g/L。各种微生物的培养温度为30℃，恒温培养箱转速为500rpm，初始pH值为4.5。
当各种微生物达到对数生长期时，收集微生物并计数，根据微生物数量比例混合获得两种营养类型的混合菌群，其中硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉按照1：1：1：1：1的比例混合得到混合菌群a；嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌按照1：1：1.2的比例混合得到混合菌群b。
将得到的混合菌群a和b分别在驯化培养基中进行驯化，驯化培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；培养混合菌群a时，在培养基中加入葡萄糖0.7g/L，酵母粉0.3g/L；培养混合菌群b时在培养基中加入硫粉1g/L；此外，在培养基中均加入氯化镉200mol/L；每次传代接种的微生物浓度为2×107个/mL，培养后微生物的浓度至少达到4×109个/mL；混合菌群a和b各自至少培养20代后，按照微生物数量等比例混合得到混合菌群c。
得到的混合菌群c进行的适应性培养过程在2L的玻璃烧杯中进行，基本培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；培养基还加入葡萄糖0.7g/L，酵母粉0.3g/L，硫粉1g/L，氯化镉200mol/L。搅拌桨转速为500rpm，初始pH值为4.5，每代培养时间为5天，当菌液pH值达到2.0以下，微生物菌体密度达到4×109个/mL时，进行传代培养25次，每次传代接种的微生物浓度为2×107个/mL。
在250mL锥形瓶中加入100mL基本培养基，成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L；Ca(NO3)2，0.001g/L；葡萄糖0.7g/L；酵母粉0.3g/L；硫粉1g/L；此外，在此体系中加入50wt％的粒径小于20目镉含量为21mg/kg的镉污染土壤；将传代培养20代后的混合菌群a和混合菌群b、未传代培养的混合菌群群落c(驯化后的复合群落a+b)以及本发明适应性培养(进行了驯化和适应性培养)得到的功能菌群分别加入到锥形瓶中，在初始加入的微生物浓度为2×107个/mL，恒温培养箱转速为175rpm，温度为30℃，初始pH值为4.5条件下进行比较试验，反应时间为5天。
如图1所示，本发明公开的功能菌群对污染土壤的酸溶态镉和可氧化态镉去除率达到87.17％和63.20％，而利用未进行适应性培养的混合菌群c(仅仅混合菌群a+b)、传代驯化培养后的混合菌群a和混合菌群b治理污染土壤的镉酸溶态和可氧化态镉去除率分别仅为38.05％和43.41％、15.72％和6.18％、22.28％和22.53％。

Claims (7)

1.一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的制备方法，其特征在于，所述的功能菌群由属于异养微生物的硫还原泥土杆菌(Geobacter metallireducens)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)、固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)、木霉和属于自养微生物的嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸杆菌（Acidiphilium cryptum）混合而成；
先将各种微生物单独培养，当达到对数生长期时收集微生物并计数，根据微生物数量比例混合获得两种营养类型的混合菌群，其中硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉按照1~1.2：1~1.2：1~1.2：1~1.2：1~1.2的比例混合得到混合菌群a；嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌按照1~1.2：1~1.5：1~1.2的比例混合得到混合菌群b；将得到的混合菌群a和b分别在含镉培养基中驯化培养；然后将混合菌群a和b按照微生物数量比1:1混合得到混合菌群c，最后在含镉培养基中进行适应性培养得到功能菌群。
2.根据权利要求1所述的一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的制备方法，其特征在于，各微生物单独培养的培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；单独培养硫还原泥土杆菌、脂环酸芽孢杆菌、固氮醋酸杆菌、厌氧粘细菌和木霉时，培养基中还加入葡萄糖0.5~0.7g/L，酵母粉0.1~0.3g/L；单独培养嗜酸氧化硫硫杆菌、喜温硫杆菌和嗜酸杆菌时，在培养基中加入硫粉0.5~1g/L。
3.根据权利要求1所述的一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的制备方法，其特征在于，将得到的混合菌群a和b分别在驯化培养基中进行驯化，驯化培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；培养混合菌群a时，在培养基中加入葡萄糖0.5~0.7g/L，酵母粉0.1~0.3g/L；培养混合菌群b时在培养基中加入硫粉0.5~1g/L；此外，在培养基中均加入氯化镉150~200mol/L；每次传代接种的微生物浓度为1.2~2×107个/mL，培养后微生物的浓度至少达到4×108~109个/mL；混合菌群a和b各自至少培养20代后，按照微生物数量等比例混合得到混合菌群c；
所述的混合菌群c的适应性培养过程如下：基本培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L和Ca(NO3)2，0.001g/L；培养基还加入葡萄糖0.5~0.7g/L，酵母粉0.1~0.3g/L，硫粉0.5~1g/L，氯化镉150~200mol/L；每代培养时间为3~5天，当菌液pH值达到2.0以下，微生物菌体密度达到4×108~109个/mL时，进行传代培养，每次传代接种的微生物浓度为1.2~2×107个/mL； 混合菌群c至少培养20代得到兼养型微生物功能菌群。
4.根据权利要求1所述的一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的制备方法，其特征在于，混合菌群a和b的传代过程在2~3L的玻璃烧杯中进行，搅拌桨转速为400-500rpm，培养温度为25~30℃，初始pH值为3.0~4.5；对混合菌群c进行适应性培养，传代过程在2~3L的玻璃烧杯中进行，搅拌桨转速为400~500rpm，培养温度为25~30℃，初始pH值为3.0~4.5。
5.一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群，其特征在于，是由权利要求1~4任一项所述的方法制备而成的微生物功能菌群。
6.权利要求5所述的去除镉污染土壤中酸溶态和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的应用方法，其特征在于，将所述的微生物功能菌群加入到镉污染土壤中反应除镉。
7.根据权利要求6所述的去除镉污染土壤中酸溶态和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群的应用方法：在250~500mL锥形瓶中加入100~200mL基本培养基，培养基成分为：(NH4)2SO4，0.3g/L；KCl，0.01g/L；K2HPO4，0.05g/L；MgSO4·7H2O，0.05g/L；Ca(NO3)2，0.001g/L；葡萄糖0.5~0.7g/L；酵母粉0.1~0.3g/L；硫粉0.5~1g/L；在此体系中加入40~60wt%的粒径小于20目镉含量为21mg/kg的镉污染土壤；将微生物功能菌群加入到锥形瓶中，初始加入的微生物浓度为1.2~2×107个/mL，转速为170~180rpm，温度为25~30℃，初始pH值为3.0~4.5，反应时间为3~5天。
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