CN108094519B - 一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂及其制备方法和应用，本发明人筛选到的具有保鲜作用的两种葡萄拮抗酵母菌，并与牛蒡低聚果糖、氢气复配成复合保鲜剂。每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×108‑10CFU假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×108‑10CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.3g‑0.8g牛蒡低聚果糖(BFO)和0.8mL‑1.0mL氢气。本发明首次将该两种葡萄拮抗酵母菌应用于水果保鲜，本发明是一种新型的葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，保鲜效果显著。且所用原料均为绿色成分，对人体无毒副作用，对环境无污染。本发明复合保鲜剂使用简单、易于推广。

Description

一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于果品保鲜技术领域，具体涉及一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂及其制备方法和应用。
背景技术
葡萄是一种古老的水果品种，原产于欧洲、西亚，我国已经有一千多年的葡萄种植历史。葡萄是一种味道鲜美，营养价值很高的水果，其葡萄糖含量高达10-30％。葡萄中还含有多种有助于消化的果酸，具有健脾胃的功效。所以葡萄也是消化能力较弱者的理想果品。此外，葡萄中矿物质及维生素含量也非常丰富，例如钙、钾、磷、铁、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素P等。我国的中医认为葡萄味甘、性平，具有补肝肾、益气血、开胃力、生津液和利小便的功效。常食葡萄可以缓解疲劳，减轻神经衰弱等症状。把葡萄制成葡萄干后，是孕妇、儿童和体弱贫血者的滋补佳品。
现代社会对新鲜葡萄的需求量日益增加，而新鲜葡萄采收后其细胞和组织继续进行呼吸和蒸腾作用，很容易产生皱缩、失重、萎蔫、变质等现象。且葡萄果实皮薄、果肉含糖酸量高，采后易破碎而遭受病菌感染，造成果实腐烂。因此，葡萄保鲜是葡萄生产、储藏和销售环节中一个非常重要的问题。如何防治采后病害和维持果实品质是葡萄贮藏保鲜领域面临的问题。
目前，所用的果蔬保鲜技术主要包括低温保鲜法、气调保鲜法、低气压保鲜法、塑料薄膜及化学保鲜贮藏法等。这些方法在一定程度上能够保持果蔬的新鲜，但都存在一定的缺陷，如低温保鲜和气调保鲜法投资大，不易推广应用；塑料薄膜能抑制果蔬失水，但容易造成腐烂和异味；化学保鲜法(例如亚硫酸盐葡萄保鲜剂)中大量的有机杀菌剂和防腐剂在果蔬表皮残留，对人体有毒害。因此开发绿色环保、无污染、对人体无毒副作用、且方法简单，成本低，易于推广应用的葡萄保鲜方法依然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，本发明提供一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂及其制备方法和应用，本发明采用葡萄拮抗酵母菌与牛蒡低聚果糖(BFO)、富氢水复配，能显著抑制葡萄霉变腐烂，延缓果实衰老变质，保持葡萄贮期和货架期品质。本发明方法绿色环保、无污染、对人体无毒副作用、且方法简单，成本低，易于推广应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：筛选到的具有保鲜作用的两种葡萄拮抗酵母菌，并与牛蒡低聚果糖、氢气复配成复合保鲜剂。
本发明一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×108-10CFU喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×108-10CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.3g-0.8g牛蒡低聚果糖(BFO)和0.8mL-1.0mL氢气。
本发明葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂的制备方法是：(1)发酵培养喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)和清酒假丝酵母菌(Candida sake)，浓缩发酵液。
(2)将牛蒡低聚果糖与浓缩发酵液一起冷冻干燥制成粉剂或片剂。
(3)制备氢气发生包。
所述步骤(1)发酵液浓缩至菌体干重≥200g/L。
使用时将氢气发生包溶于水中释放氢气，然后将制备的粉剂或片剂溶于其中(溶液中各成分终浓度如前所述)，喷洒在需要保鲜的葡萄上。
喷洒用量为每千克葡萄及其他水果喷洒8-10mL。
本发明还提供喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)和清酒假丝酵母菌(Candida sake)在葡萄及其他水果保鲜中的应用。
当然本发明复合保鲜剂不仅适用于葡萄，也适用于其他水果保鲜。
葡萄中含有丰富的营养物质，葡萄皮薄多汁，在储存过程中容易发生腐烂、干枝、褐变、脱粒等现象。采用拮抗微生物控制果蔬采后病害，是一项有潜力的新兴技术。由于酵母菌拮抗效果好，不产生毒素，且可以与化学杀菌剂协同使用，成为采后病害生物防治研究的热点菌种。有研究通过用草莓上分离筛选的季也蒙毕赤酵母和葡萄有孢汉逊酵母，处理葡萄，对葡萄储藏品质和抗氧化酶产生不同程度的影响。本发明喜橄榄假丝酵母菌和清酒假丝酵母菌是从葡萄表面筛选得到的，应用于葡萄保鲜未有相关报道。
牛蒡低聚果糖(BFO)是从牛蒡根中提出的水溶性菊糖型低聚糖，由呋喃型的果糖与呋喃型的葡萄糖构成。目前，对于BFO活性研究发现其具有广泛的生理活性，不仅可以作为免疫刺激剂，提高动物的免疫力，提高若干免疫因子的含量和抗肿瘤；还能诱导植物产生***性抗性，抵抗多种病害，增加果实产量。现有研究中，用BFO常温下处理果实，结果表明，BFO能够激活葡萄对灰霉病、苹果对青霉病、香蕉对炭疽病、猕猴桃对灰霉病、桔子对青霉病、草莓和巴梨对自然发病病原的抗病性。BFO对葡萄采后生理活性的影响，体现在提高CAT、SOD酶活性，降低MDA含量。BFO作为一种有效的诱导子，能够作为天然果蔬的保鲜剂应用于水果。
另据报道，日本大阪府立大学大学院生命环境科学院研究组发现：在富氢水中浸泡过的蔬菜、水果具有抗低温损伤的效果。该研究组将香蕉、茄子等冷藏保存时容易丢失水分和氧化的水果或蔬菜，在富氢水中浸泡10分钟，自然晾干1小时之后冷藏保存2周。结果与纯水浸泡物相比果肉的软化、变色、凹陷等品质的劣化程度降低。但单纯将富氢水喷洒到水果或蔬菜时没有同样的效果，所以推测浸泡后自然晾干过程起了效果。
本发明首次将筛选到的两种葡萄拮抗酵母菌与牛蒡低聚果糖和富氢水复配，获得了高效的复合生物保鲜剂。本发明葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂具有如下有益效果：
(1)本发明是一种新型的葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，所用原料均为绿色成分，对人体无毒副作用，对环境无污染。
(2)本发明复合保鲜剂用于葡萄保鲜有显著效果。可以显著保持葡萄贮期和货架期品质，延长了葡萄货架期。另外，由于葡萄在采摘及运输过程中，难免有损伤，而本发明的复合保鲜剂对有机械损伤的葡萄保鲜作用尤其显著。葡萄拮抗酵母菌及BFO等能够促进伤口愈合，可以抑制机械损伤诱发的快速劣变。因而相比较其他保鲜剂，本发明能更好的保持葡萄的品质。
(3)本发明复合保鲜剂使用简单、易于推广。尤其适用于农家水果、蔬菜的出货，物流及店铺中或家庭中的水果、蔬菜的保鲜。
附图说明
图1为实验一中筛选出的5种酵母菌生长曲线图。
图2为实验一用4种拮抗酵母菌处理刺伤葡萄贮藏10天后效果对比。
图3为实验一用4种拮抗酵母菌处理整串葡萄贮藏10天后效果对比。
图4为实验一用4种拮抗酵母菌对葡萄腐烂率和脱粒率的影响对比。
图5为实验二分别用本发明复配保鲜剂和牛蒡低聚果糖、富氢水对葡萄保鲜效果对比。
图6为实验三复合保鲜剂对抗坏血酸的含量的影响。
图7为实验三复合保鲜剂对CAT酶活性的影响。
图8为实验三复合保鲜剂对SOD酶活性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和试验、附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实验一、葡萄拮抗酵母菌的筛选、鉴定和抑菌效果研究
1.1葡萄拮抗酵母菌分离
本发明人从青岛莱西市南墅镇葡萄园采收克瑞森无核葡萄(Crimson seedless)，用于分离和筛选拮抗酵母菌。将葡萄表皮切成1cm×1cm的小片，加入到90ml PDB液体培养基的三角瓶中，滴入几滴0.1％的硫酸链霉素，置于恒温摇床震荡培养(25℃，180rpm)震荡30分钟，做梯度稀释(10-5，10-6，10-7)，各取100μL涂布在PDA平板上，25℃培养2-3d，初步选择形态相似菌落合并统计数量，镜检确认为酵母后，经纯化保存备用。
挑取培养特征各异的单菌落，通过观察法合并统计相似菌落，初步筛选了5种在果实表皮微生态环境中相对占优势的酵母菌菌种，通过测定酵母菌的吸光值，测定了编号为GY1、GY7、GY15、GY18、GY19的5中酵母菌在25℃的生长曲线(图1)，按照进入稳定期的时间看，生长速度最快的是GY15和GY7，其次为GY19，生长速度较慢的是GY1和GY18。由于GY18生长速度慢，且发酵后有异味，因此选取编号为GY1、GY7、GY15、GY19的四株酵母菌开展葡萄保鲜的拮抗实验研究。
1.2葡萄拮抗酵母菌菌种鉴定
在中国普通微生物菌种保藏管理中心，对GY1、GY7、GY15、GY19进行了菌种鉴定，菌种鉴定结果如表1所示，四种酵母菌均已经在CGMCC登记，但是在葡萄中的拮抗保鲜作用均属于首次研究。
表1酵母菌鉴定归类
Figure GDA0002980416610000051
1.3葡萄拮抗酵母菌抑菌效果研究
(1)拮抗酵母菌对刺伤葡萄的保鲜效果
克瑞森葡萄采摘后经过48h冷库预冷后，用无菌牙签刺伤果实赤道位置，每果伤口1个，伤口深度为3mm。用生理盐水悬浮的酵母菌液喷雾处理葡萄，所有试验用酵母菌浓度被稀释为1x108个/mL，对照组为生理盐水。喷雾处理后将葡萄置于湿度为85％的塑料筐包装袋内，放置在室温下(20℃)观察葡萄劣变情况。
如图2所示，经过处理后的葡萄室温下储藏10天，对照组葡萄由伤口处渗出大量组织液，使整筐葡萄的表面呈现湿粘的状态，果实开始出现腐烂。GY1和GY7处理的葡萄伤口的组织液渗出较多，整体看葡萄出现裂果现象，腐烂较CK更加严重。GY15和GY19处理的葡萄伤口及周围较为干燥，形成了愈合状的特征，整体葡萄表面较为清洁，没有湿粘的组织液，未发生腐烂现象。因此，针对机械损伤葡萄，GY15和GY19酵母菌对葡萄的保鲜效果显著，其主要机制可能与消耗伤口处营养成分，促进伤口愈合，抑制机械损伤诱发的快速劣变。
(2)拮抗酵母菌对整串葡萄的保鲜效果
克瑞森葡萄采摘后经过48h冷库预冷后，将重量相似的整串葡萄用于实验。用生理盐水悬浮的酵母菌液喷雾处理葡萄，所有试验用酵母菌浓度被稀释为1x108个/mL，对照组为生理盐水。喷雾处理后将葡萄置于湿度为85％的塑料筐包装袋内，放置在室温下(20℃)观察葡萄劣变情况。
如图3所示，经过处理后的葡萄室温下储藏10天，酵母菌对葡萄的保鲜作用非常显著。对照组果梗出现较严重褐变，褐变已经蔓延至葡萄连接处，葡萄果实出现严重的褐变和皱缩现象，脱粒较为显著。GY15和GY19处理的葡萄主果梗部分褐变，部分保持较好的翠绿色，连接葡萄的果柄新鲜度保持较好，葡萄果实褐变较少，饱满无皱缩现象，脱粒较少，保鲜效果显著。这可能与拮抗酵母菌对果梗、果柄和脱粒伤口的营养成分消耗，促进伤口愈合，抑制机械损伤诱发的快速劣变有关，从而从整体上表现出对整串葡萄的保鲜作用。
(3)拮抗酵母菌对葡萄腐烂率和脱粒率影响
如图4所示，经过处理后的葡萄室温下储藏10天，GY15、GY19、GY1和GY7都能够显著降低整串葡萄的脱果率，GY15和GY19显著降低刺伤果腐烂率，降幅为50％，GY1和GY7不仅不能降低刺伤果的腐烂率，反而增加了刺伤果的腐烂率。因此GY15和GY19酵母菌对抑制葡萄的腐烂和脱粒效果显著。
通过上述实验，可见GY15(Candida oleophila)和GY19(Candida sake)两种菌株对葡萄的保鲜效果显著，有效抑制抑制葡萄腐烂和脱粒。因此，本发明最终确定两种拮抗酵母菌：喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)和清酒假丝酵母菌(Candida sake)用于制备葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂。
实验二、本发明拮抗酵母菌复合保鲜剂对葡萄保鲜的协同效果研究
现有研究表明牛蒡低聚果糖、富氢水也具有一定保鲜的作用，但是效果还有待提高。因而本发明进一步研究将上述筛选得出的两种拮抗酵母菌与牛蒡低聚果糖、富氢水进行复配得到一种复合保鲜剂来用于葡萄保鲜，期望可以大大提高保鲜效果。实验中用葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂(简称复合保鲜剂)，每100mL中含有1×108CFU喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×108CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.3g牛蒡低聚果糖(BFO)和0.8mL氢气。
选取无病虫害、无霉烂果、无机械损伤，果粒饱满，穗形整齐紧凑的克瑞森葡萄，采摘后经过48h冷库预冷后，分别用复合保鲜剂(TR1)、1x108CFU/mL喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)和1x108CFU/mL清酒假丝酵母菌(Candida sake)(TR2)、50％饱和富氢水(TR3)、0.5％(0.5g/100ml)牛蒡低聚果糖BFO(TR4)喷雾处理葡萄，对照组为生理盐水(CK)。
喷雾处理后将葡萄置于湿度为85％的塑料筐包装袋内，放置在室温下(25℃)观察葡萄劣变情况。
2.1本发明复合保鲜剂对葡萄协同保鲜效果研究
结果：如图5所示，经过室温下10天的储藏，对照组(CK)葡萄果实开始出现霉变、软烂，失水腐烂较严重，而复合保鲜剂处理的(TR1)葡萄表面较为清洁，没有湿粘的组织液，几乎无腐烂。两种酵母菌处理TR2、50％饱和富氢水处理TR3和0.5％牛蒡低聚果糖BFO处理TR4的葡萄，均可以不同程度上抑制了葡萄腐烂，但是保鲜效果远不如复合保鲜剂TR1处理显著。
从表2中可以看出，经过处理室温下储藏10天后，复合保鲜剂处理的葡萄腐烂率仅为1.7％，而TR2、TR3、TR4的腐烂率分别为5.2％、6.3％和7.5％，而对照处理腐烂严重，高达47.2％。
表2拮抗酵母菌复合保鲜剂协同效果对葡萄腐烂率的影响
Figure GDA0002980416610000071
结论：本发明复合保鲜剂对室温下葡萄货架期保鲜效果显著。并且较其他成分单独使用，腐烂率更低，保鲜更好，说明本发明将两种酵母菌与富氢、牛蒡低聚果糖复配后起到了协同增效的作用。
2.2本发明复合保鲜剂对葡萄致病微生物的影响
参照GB 29921-2013食品安全国家标准《食品中致病菌限量》，对葡萄的采后致病菌进行了检测。结果如表3所示：对于刺伤的葡萄，不使用保鲜剂处理的，大肠埃希菌在第4天即超出国家安全标注，而金黄色葡萄球菌在第7天开始超出国家标准。使用本发明保鲜剂处理组第四天的大肠埃希菌和第7天的金黄色葡萄球菌都控制在国家标准以内。因此推测复合保鲜剂对刺伤葡萄的保护作用，腐烂的抑制作用可能与对细菌性微生物增殖的控制有关。
表3本发明复合保鲜剂对葡萄致病菌的影响
Figure GDA0002980416610000072
Figure GDA0002980416610000081
*参照GB 29921-2013食品安全国家标准《食品中致病菌限量》判断抑菌效应。
实验三、本发明复合保鲜剂用于葡萄保鲜的机制研究
3.1本发明复合保鲜剂对葡萄丙二醛含量的影响
为进一步研究本发明复合保鲜剂的保鲜机制，本发明人研究了与创伤程度直接相关的葡萄丙二醛含量和复合保鲜剂使用之间的关系。
如表4所示，结果表明，本发明复合保鲜剂(与实验二中的配方相同)对于刺伤的葡萄的MDA含量的增加有非常显著的抑制作用。表现在：在处理后的第四天，复合保鲜剂处理组的MDA含量是对照组的13倍，第三天是10倍。因此推测，复合保鲜剂对葡萄保鲜作用的靶点可能对伤口的控制。
表4本发明复合保鲜剂对葡萄MDA的影响
Figure GDA0002980416610000082
3.2本发明复合保鲜剂对葡萄抗氧化***的影响
上述3.1研究表明，本发明复合保鲜剂对葡萄对MDA的抑制作用可能与保护葡萄细胞的完整性有关。而抗坏血酸、CAT、SOD等组成的抗氧化体系，有助于清除自由基、保护细胞膜完整性，从而降低MDA含量，进而抑制伤口引起的局部坏死。
因此，本发明进一步研究了复合保鲜剂与抗坏血酸、CAT和SOD含量的关系。试验分为两组，一组为刺伤葡萄，对照组用生理盐水处理为CK1，试验组用本发明复合保鲜剂处理为TR1。一组为无机械损伤葡萄，对照组用生理盐水处理为CK2，试验组用本发明复合保鲜剂处理为TR2。
处理后将葡萄置于湿度为85％的塑料筐包装袋内，放置在室温下(20℃)，分别于0天、1天、4天、7天、10天检测抗坏血酸、CAT和SOD含量。结果如图6-图8所示。
图6显示，复合保鲜剂能够提高刺伤组和非刺伤组葡萄的抗坏血酸含量，在刺伤组提高的效果显著好于非刺伤组。推测抗坏血酸的提高一方面与氢分子的还原作用对抗坏血酸的保护有关，另一方面，BFO和酵母菌都可以作为诱导剂提高抗坏血酸的合成。刺伤水果的抗坏血酸含量高于非刺伤果，可能是由于刺伤果的酵母菌获得了更多的营养，酵母菌生长对刺伤水果的诱导作用更加显著有关。
如7和图8所示，本发明复合保鲜剂对刺伤果的CAT和SOD的酶活力下降有显著的抑制作用。这可能造成了复合保鲜剂对刺伤葡萄的MDA含量的抑制，以及对果实整体的保护作用。复合保鲜剂对非刺伤果的CAT和SOD的酶活力影响并不大，主要是因为非刺伤果对照组的CAT和SOD的酶活力并未在葡萄采后的前期发生显著变化有关。根据结果可以推测，本发明复合保鲜剂对刺伤葡萄的保护作用与CAT和SOD的酶活力的抑制下降有显著的关系。
实施例1.一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×108CFU喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×108CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.3g牛蒡低聚果糖(BFO)和0.8mL氢气。
制备方法是：(1)发酵培养喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)和清酒假丝酵母菌(Candida sake)，发酵方法为本领域常规方法即可。浓缩发酵液至菌体干重≥200g/L。
(2)将牛蒡低聚果糖与浓缩发酵液一起冷冻干燥，压片。
(3)制备氢气发生包。
实施例2.一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×1010CFU喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×1010CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.8g牛蒡低聚果糖(BFO)和1.0mL氢气。
制备方法同实施例1。
实施例3.一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×109CFU喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×109CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.5g牛蒡低聚果糖(BFO)和0.9mL氢气。
制备方法同实施例1。
实施例4.一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂，每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×108CFU喜橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、1×109CFU清酒假丝酵母菌(Candida sake)，0.4g牛蒡低聚果糖(BFO)和0.8mL氢气。
制备方法同实施例1。

Claims (2)

1.一种葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂在水果保鲜中的应用，其特征是，所述水果为葡萄；
每100mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂中含有1×108-10CFU喜橄榄假丝酵母菌、1×108 -10CFU清酒假丝酵母菌、0.3g-0.8g牛蒡低聚果糖和0.8mL-1.0mL氢气；所述喜橄榄假丝酵母菌的CGMCC编号为CGMCC 2.1734；所述清酒假丝酵母菌的CGMCC编号为CGMCC 2.2695；
所述葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂的制备方法，包括 如下步骤：(1)发酵培养喜橄榄假丝酵母菌和清酒假丝酵母菌，浓缩发酵液，发酵液浓缩至菌体干重≥200g/L；(2)将牛蒡低聚果糖与浓缩发酵液一起冷冻干燥制成粉剂或片剂；(3)制备氢气发生包。
2.权利要求1所述应用，其特征是，每千克水果喷洒8-10mL葡萄拮抗酵母复合生物保鲜剂。
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