CN105483054A - 一种解淀粉芽孢杆菌ws-8及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌亚种WS-8及其应用，公开了一种解淀粉芽孢杆菌亚种，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC？No.11787，保藏日期为2015年12月4日。本发明还公开了解淀粉芽孢杆菌亚种在防治作物叶面气传真菌病害及土传真菌病害中的应用，发酵液稀释50倍间隔7-15天喷施一次，对番茄叶霉病的防效可达72%，对其他气传及土传真菌病害也有良好防治效果；同时该菌株还可提高作物品质，有效改善植株的叶色，提高叶绿素的含量，提高植株的抗病性，降低农药残留，提高品质。该菌株人工培养方便，繁殖速度快，便于规模化生产，具有开发成防治蔬菜种植及采后应用的生物农药的潜力。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌WS-8及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌WS-8及其应用，属于农业微生物及生物技术领域，具有改善叶色、提高叶片叶绿素含量、提高植株***抗病性、防治作物叶面气传真菌病害、提高品质的功效。

背景技术

叶霉病的病原菌为Fulviafulva（Cooke）Cif.，属半知菌亚门褐孢霉属，异名为黄枝孢菌CladosporiumfulvumCooke，是设施番茄栽培中常见的病害，该病传播快、危害重，一般造成减产20-30%，严重时可达50%以上。目前主要采用化学药剂进行防治，但由于它的致病性分化繁杂而且复杂，存在许多生理小种；导致化学农药的防治效果越来越差，药剂的用量越来越大，造成蔬菜的农药残留超标，种植环境被严重污染，阻碍了农业的可持续发展。生物农药凭借其低残留、对环境无污染的优势，及对农业的可持续发展、农业生态环境的保护、食品安全的保障具有重要的作用，而受到越来越广泛的关注与厚爱。

芽孢杆菌Bacillusspp.是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌。芽孢杆菌产生的芽孢，有较强的抵抗干燥、热和紫外线辐射等外界环境压力的能力，同时芽孢杆菌种群中有许多具有特殊功能的菌株，可产生许多种活性物质，如多肽、环肽、氨基酸、蛋白酶及香豆素等，所以在工业、农业、医学和食品加工等领域中有广泛的应用价值。由于生防芽孢杆菌具有抑制多种植物病原菌的能力，并且是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，对环境友好，因此，备受国内外植物保护和环境保护专家的青睐。目前，生防芽孢杆菌广泛应用于植物根部、枝干、叶片以及果蔬采后病害的防治上。

美国已有3株枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis和1株解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens获得环保局（EPA）商品化生产应用许可，进入大面积推广应用。其中解淀粉芽孢杆菌FZB42和枯草芽孢杆菌GB122混用制成的杀菌剂商品名为BioYield，由Gustafson公司研发，应用于防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等病害。国内杀菌剂截止到2014年12月，只有1种解淀粉芽孢杆菌的可湿性粉剂进行登记，用于防治稻瘟病。

据预测，2014-2020年间全球农药生物农药在消费量和市值需求上将获得10%以上的快速增长，而亚太地区有望获得最快速的增长。随着“十三五”规划的制定，国家更加重视绿色农业的发展、更注重生态环境的保护，蔬菜种植的生物农药使用比例会越来越大，为生物农药的发展提供了更为广阔的空间。目前已经授权及公开的专利，多为解淀粉芽孢杆菌防治土传真菌病害、防治水果采后病害，防治蔬菜叶面真菌病害的相关研究较少，利用解淀粉芽孢杆菌防治番茄叶霉病未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及其用途，该菌株适宜于露地及棚室条件，可提高植株***抗病性，可控制植株叶面气传真菌病害及土传真菌病害，尤其能防治番茄叶霉病。

本发明采用如下技术方案：

本发明所述的菌株WS-8为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，保藏号为CGMCCNo.11787，保藏日期为2015年12月4日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明的解淀粉芽孢杆菌培养条件简单，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落呈白色，圆形、中间凹陷、表面光滑、不透明，电镜下观察菌体大小约为0.7μm～0.8μm×1.8μm～3μm，芽胞中生，椭圆形；革兰氏阳性、兼性厌氧菌；生理生化指标结合16SrDNA的分析，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。

本发明所述解淀粉芽孢杆菌WS-8的最佳发酵培养基配方为：淀粉0.7%，豆饼粉1.6%，蔗糖0.2%，酵母膏0.08%，蛋白胨0.05%，硫酸铵0.15%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.03%，硫酸锰0.01%，氯化钠0.02%，碳酸钙0.1%，pH7.3-7.5，以上均为质量百分比。

本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌WS-8在防治作物叶面气传真菌病害及土传真菌病害中的应用，具体地，所述作物叶面气传真菌病害为：梨轮纹病、梨黑斑病、黄瓜灰霉病、番茄叶霉病、番茄灰霉病、番茄早疫病或番茄煤污病，所述土传真菌病害为立枯病、枯萎病、黄萎病或蔓枯病。

优选地，用于防治作物叶面气传真菌病害，将所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液10-100倍稀释后喷施于叶面，优选50倍稀释（孢子数为1亿/ml），7-15天喷施一次。用于防治土传真菌病害时，将所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液10-100倍稀释后灌根，优选10倍稀释（孢子数为5亿/ml）。

本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌WS-8在提高作物生理生化指标及品质中的应用，具体为用于提高作物叶片中叶绿素含量、可溶性蛋白含量及作物抗坏血酸含量。优选将所述解淀粉芽孢杆菌WS-8的发酵液10-100倍稀释后喷施于作物，优选50倍稀释（孢子数为1亿/ml），间隔10天喷施一次。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌WS-8发酵液稀释50倍叶面喷施，对番茄叶霉病的防效可达72%；同时可有效改善叶色，提高叶片中叶绿素的含量；提高叶片的光合能力，促进光合产物可溶性蛋白的合成；提高番茄中抗坏血酸的含量，改善番茄品质。叶面喷施对棚室内气传真菌病害番茄灰霉病、番茄早疫病、黄瓜灰霉病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病的防效分别达70.2%、71%、70.8%、72%、71.1%；对采后梨的轮纹病和黑斑病的防效达64%、69%；灌根对棚室内番茄枯萎病和黄萎病土传真菌病害的防效分别达61.8%和62%，对食源性的金黄色葡萄球菌也有很好的抑制作用。可见该菌株的高效应用可有效降低真菌病害的发病率，减少产品的农药残留，保护了环境的生态安全，其潜在市场应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌WS-8的***发育树。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的说明，以便本领域内的技术人员了解。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌WS-8的分离及鉴定

于石家庄鹿泉大河镇番茄、黄瓜种植棚室采集染病和健康蔬菜叶片，在本实验室依照下列条件培养，即可获得本发明的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌WS-8：

菌株WS-8的分离和纯化：将健康样品和去除腐烂及霉菌后染病叶片，采用梯度稀释的方法，将10克叶片放入磷酸缓冲液中，室温200r/min震荡30min，超声处理5min，制得菌悬液涂布平板，挑取单菌落采用划线的方法进行纯化。

拮抗菌株WS-8筛选：将纯化出的单菌落，以番茄叶霉病、早疫病为目的病原菌株进行抗病菌株的初筛及复筛；获得拮抗效果好的菌株WS-8菌株。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌WS-8依据其菌落形态和个体形态学特征、生理生化特征及16SrDNA基因序列的***进化分析进行鉴定。

该菌株的个体形态与菌落特征如下：电镜下观察菌体大小约为0.7μm～0.8μm×1.8μm～3μm，芽胞中生，椭圆形。培养条件简单，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落呈白色，圆形、中间凹陷、表面光滑、不透明、边缘不整齐。

该菌株的部分生理生化鉴定结果如下表：

表1菌株WS-8的生理生化鉴定结果

。

该菌的16SrDNA基因序列长度为1431bp，利用该序列构建***发育树（图1所示），确定了该菌株的种属分类地位，该菌株WS-8为解淀粉芽孢杆菌亚种。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌WS-8的抑菌谱测定

本发明所述菌株，以气传真菌病害：梨轮纹病、梨黑斑病、黄瓜灰霉病、番茄叶霉病、番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄煤污病；土传真菌病害：立枯病、枯萎病、黄萎病、蔓枯病；食源性细菌：金黄色葡萄球菌，多种病原菌株进行抑菌谱的测定，结果见表2。

表2解淀粉芽孢杆菌亚种WS-8的抑菌谱

注：拮抗作用强弱以“+’’表示。“+”：弱，抑菌带宽度小于1.5cm；“++’’：中等强度，抑菌带宽度在1.5cm和3.0cm之间；“+++”：很强，抑菌带宽度大于3.0cm。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌WS-8的培养及发酵条件

纯化出抑菌效果强的菌株，采用牛肉膏蛋白胨培养基，保存在固体斜面上；从斜面培养上挑取一环，接种到牛肉膏蛋白胨的液体培养基中37℃过夜培养，作为菌种种子瓶待用。

发酵培养条件：发酵培养基：淀粉0.7%，豆饼粉1.6%，蔗糖0.2%，酵母膏0.08%，蛋白胨0.05%，硫酸铵0.15%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.03%，硫酸锰0.01%，氯化钠0.02%，碳酸钙0.1%，pH7.3-7.5，以上均为质量百分比。121℃灭菌20分钟，冷却后，将种子液以接种量1.5-2%加入发酵培养液中，600mL/3L三角瓶，转速180转/min，温度30℃，培养48个小时，得到发酵液。

实施例4：解淀粉芽孢杆菌WS-8防治番茄叶霉病的应用效果

于实验室内采用盆栽实验，设置5个处理：空白对照（清水处理）、发酵液10倍稀释、发酵液20倍稀释、发酵液50倍稀释和发酵液100倍稀释；于番茄第三片真叶全展后，5个处理分别喷施清水及不同稀释倍数的发酵液（喷施量以叶片正反两面均全部喷湿喷匀为准），喷后48h接种番茄叶霉病原菌，每个处理24盆，设置三个重复。发病后统计番茄叶霉病的病情指数及防病效果（见表3），综合应用成本和防治效果，发酵液最佳应用浓度为50倍稀释。

番茄叶霉病病害分级标准如下：

1级，叶片无病斑；

2级，叶缘和叶尖有病斑，病斑稀少，病斑直径D＜0.6cm；

3级，病斑多，但病斑直径为0.6≤D＜1.2cm；4级，病斑多并连片，病斑直径为1.2cm≤D＜2.0cm；5级，病斑连片，病斑直径D≥2.0cm。

病情指数计算公式：病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查叶片总数×最高级代表值）。

表3不同稀释浓度处理番茄的病情指数和防治效果

。

实施例5：解淀粉芽孢杆菌亚种WS-8防治番茄叶霉病的田间应用效果

于番茄棚室中进行连续4茬防治番茄叶霉病的应用实验，实验设置4个处理：空白对照、发酵液50倍稀释、百菌清、多抗菌素，不同处理间采用塑料薄膜隔开，以避免不同处理间的相互影响，便于实验结果统计。空白对照不做任何处理；发酵液喷施处理于番茄现蕾期开始间隔10天喷施一次（喷施量以叶面正反两面均全部喷湿喷匀为准）；百菌清、多抗菌素依照当地菜农的应用经验，在番茄叶霉病出现发病迹象的时候开始喷施，之后根据病情间隔7-10天喷施一次。待空白对照病情指数达到50%以上时，统计其他处理番茄叶霉病的病情指数及防病效果（见表4）。

表4发酵液与农药处理番茄的病情指数和防病效果

。

实施例6：解淀粉芽孢杆菌WS-8对其他气传及土传真菌病害的应用效果

分别进行解淀粉芽孢杆菌WS-8对其他气传及土传真菌病害的防治效果试验，其中对于气传真菌病害采用50倍稀释发酵液喷施，对于土传真菌病害采用10倍稀释发酵液灌根施入，每株灌施10ml，施用48h后接种各病原菌，待发病后统计防治效果，见表5。

表5解淀粉芽孢杆菌WS-8对其他气传及土传真菌病害的防治效果

。

实施例7：解淀粉芽孢杆菌WS-8对番茄叶片生理指标及品质的影响

于番茄棚室中进行发酵液及化学药剂的对比应用实验，设置发酵液50倍稀释、百菌清、多抗菌素三个处理，发酵液喷施处理于番茄现蕾期开始间隔10天喷施一次；百菌清、多抗菌素依照当地菜农的应用经验，在番茄叶霉病出现发病迹象的时候开始喷施，之后根据病情间隔7-10天喷施一次，直至病情得到控制。于发酵液喷施2次后，间隔10天取一次第二叶位（从生长点开始往下数第二个叶片位置）的叶片测定叶绿素及可溶性蛋白含量；于番茄成熟后，取不同处理相同果穗位的番茄测定抗坏血酸含量；番茄叶片及果实测定5次的平均结果见表6，发酵液喷施处理的番茄经河北省质量监督部门检测，品质达绿色蔬菜的标准。

表6不同处理番茄叶片生理指标及蔬菜品质

。

SEQUENCELISTING

<110>河北省科学院生物研究所

<120>一种解淀粉芽孢杆菌WS-8及其应用

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1431

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌WS-8

<400>1

TGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA60

CACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGA120

TGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATG180

GACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGC240

CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG300

GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG360

ATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAG420

GGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG480

GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGT540

TTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGA600

ACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT660

GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAG720

CGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA780

GTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGG840

AGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC900

ATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAAT960

CCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG1020

CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGC1080

CAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT1140

GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAAC1200

AAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCG1260

CAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGC1320

GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACAC1380

CCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGTGACAAGAT1431

Claims (8)

1.一种解淀粉芽孢杆菌WS-8，其于2015年12月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.11787。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于其培养基组成为：淀粉0.7%，豆饼粉1.6%，蔗糖0.2%，酵母膏0.08%，蛋白胨0.05%，硫酸铵0.15%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.03%，硫酸锰0.01%，氯化钠0.02%，碳酸钙0.1%，pH7.3-7.5，以上均为质量百分比。

3.权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌在防治作物叶面气传真菌病害及土传真菌病害中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述作物叶面气传真菌病害为：梨轮纹病、梨黑斑病、黄瓜灰霉病、番茄叶霉病、番茄灰霉病、番茄早疫病或番茄煤污病，所述土传真菌病害为立枯病、枯萎病、黄萎病或蔓枯病。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液10-100倍稀释后喷施于叶面或灌根。

6.权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌在提高作物品质中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌用于提高作物叶片中叶绿素含量、可溶性蛋白含量及作物中的抗坏血酸含量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液10-100倍稀释后喷施于作物，优选50倍稀释。