CN102911965A - 一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物抗逆性基因研究领域，公开了一种抗螟虫和抗除草剂共价外源基因导入甘蔗的方法，具体包括S1、植物表达载体的构建步骤；S2、导入外源基因步骤；通过抗性筛选、PCR鉴定和无毒处理后获得阳性的甘蔗转基因植株的步骤。本发明改良了甘蔗遗传特性，一定程度上提高了甘蔗的抗螟虫和抗除草剂的能力。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗逆性基因研究领域，具体涉及一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法。
背景技术
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是世界上主要的糖料作物，蔗糖约占糖总产量的70％。而我国是世界甘蔗发源地之一，也是世界上主要的甘蔗糖生产国，目前蔗糖产量占据世界第三位。除了制糖以外甘蔗还用于造纸及燃料乙醇生产。同样，甘蔗糖业在国民经济中占有重要地位，是解决世界能源危机最重要的非粮生物质能源作物之一。近年来，螟虫是我国蔗区发生最普遍、危害最严重的甘蔗类害虫，具有全生长季、钻蛀性危害等的特点，苗期枯心率一般达10％～20％，严重的高达60％(HuangY K，LiW F.SugarCropsChina，2006(4)：34-35)，中后期危害造成蔗糖分显著降低，并引起风折等现象产生。目前，防治甘蔗螟虫危害已成为当前甘蔗生产上的一项非常重要的工作。而以综合及环保观点来治理螟虫，是当今甘蔗领域植保工作者面临的新任务(Reagan TE.LouisianaAgric，2001，44：16-18)。甘蔗转基因安全等级为I级，又是无性繁殖作物和工业原料作物，因此，转基因改良具有明显的优势。国外防治实践证明，种植抗虫甘蔗品种是防治甘蔗螟虫最安全、经济有效的方法，具有持久性和累积性的经济效益，因而是综合防治的首选措施(Smith C M.Wiley，New York.1989)。并且该措施不与其它防治措施相冲突(Kogan M.Wiley，New York.1994.73-128)。如果是大面积种植还可以降低整个区域的螟虫群体数量(Reay-JonesFPF，ShowlerAT，ReaganTE，et al.EnvironmentEntomology，2005，34：1558-1565)。自1999年Arencibia等(Arencibia A，Carmona E，Cornide M T，et a.l TransgenRes，1999，8(5)：349-360)最 早报道转cry1A基因改良甘蔗抗螟虫性状以来，先后又报道了3例转cry1Ab、gna和pinII基因改良抗茎螟或墨西哥稻螟的抗性研究。
目前危害甘蔗的杂草有100多种，亚热带地区高温、高湿气候和蔗地长期裸露特别适合杂草生长，需要大量人工进行除草，大大增加了甘蔗生产的投入，同时也给甘蔗生产带来严重损失(李松，廖江雄，谢廷林，等.糖料甘蔗生产杂草防除技术[J].中国糖料，2010(3)：49-51)。种植转基因的抗除草作物能够大大减少工作量，实现机械化作业，降低成本，目前抗除草剂的大豆已经在生产上广为应用。在经过15年的发展后，2010年转基因作物累计种植面积已逾10亿hm2，抗除草剂转基因作物面积也逐年增加甘蔗没有抗除草剂的基因资源，只能通过导入外源基因才能增强甘蔗的抗除草剂能力。甘蔗转基因研究主要集中在抗病虫、抗旱和抗除草剂等领域。在甘蔗抗除草剂转基因育种中，来自土壤吸水链霉菌并能够编码膦丝菌素乙酰转移酶的Bar基因能使草丁膦的有效成份PPT的自由氨基乙酰化，不能抑制GS的活性，从而使植株获得抗除草剂的能力(段发平，梁承邺，黎垣庆.Bar基因和转Bar基因作物的研究进展[J].广西植物，2001，21(2)：166-172.)。目前将Bar基因导入甘蔗已有成功报导，获得了具有抗草丁膦的甘蔗植株(Manickavasagam M，Ganapathi A，Anbazhagan V R，et al.Plant Cell Rep，2004，23：134-143)。
因此，针对以上提出的问题，有必要设计一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法。
为了解决以上提出的问题，本发明采用的技术方案为：
一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，包括以下步骤：
S1、植物表达载体的构建步骤，具体为，参考载体pCambia1300多克隆位点，分别设计抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和启动子引物组合，再分别用引物组合进行PCR扩增相对应的BT基因、Bar基因和启动子的质粒；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，分别回收，再经T-克隆、阳性筛选后，进行测序，依据pCambia1300多克隆位点(MCS)和引物两端酶切位点的特点，将测序正确的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和Ubi-1启动子片段***载体pCambia1300，从而获得甘蔗转基因植物表达载体pCambia1300-BT-bar；
S2、导入外源基因步骤，具体为，选取甘蔗植株受体，制作胚性愈伤组织；提取步骤S1中的植物表达载体pCambia1300-BT-bar的质粒DNA并纯化，对胚性愈伤组织进行基因枪轰击处理。
S3、在轰击处理后，通过抗性筛选、PCR鉴定和脱菌处理后获得阳性的甘蔗转基因植株的步骤。
优选的，所述步骤S1中，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳。
优选的，所述步骤S2中，制作胚性愈伤组织的具体步骤为：
从田间选取生长健壮且无病虫害的新台糖22号甘蔗植株，去掉梢部叶片，用75％的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，剥取生长点以上10cm内的心叶，将心叶切成厚度为2mm左右的圆片，接种于诱导培养基CM1上，在26℃-28℃黑暗下培养，诱导产生愈伤组织，然后在继代培养基CM2中继代1-2次，使其产生胚性愈伤组织。
优选的，所述步骤S2中，植物表达载体pCambia1300-BT-bar的质粒DNA并纯化后定量至1μgμL-1。
优选的，所述步骤S2中，对胚性愈伤组织进行基因枪轰击处理的具体步骤为：
在轰击前8h挑取生长旺盛的胚性愈伤组织(淡黄色，干爽，直径0.3-0.5cm)，接种于高渗透培养基(MS+2mgL-12，4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g L-1蔗糖+6gL-1琼脂粉，pH5.8)中，进行预处理；
在轰击前30min将渗透处理的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心(2.5cm)位置；
然后用基因枪对培养皿进行轰击处理。
优选的，所述基因枪的型号为PDS-1000/He型。
优选的，所述基因枪的轰击参数为：轰击距离6cm，气压1100psi，钨粉/DNA用量为600μgμL-1，沉淀剂用2.5mol/L的CaCl2和0.1mol/L的亚精胺。
本发明的有益效果在于：本发明公开的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗后的蛋白质，该共价基因的超量表达，在一定程度上提高了甘蔗的抗螟虫和抗除草剂两种抗性，能够增产和改善农业操作，降低生产投入，具有极大的商业生产价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明提供一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其具体实现的方法为：
(1)选择受体材料
用于甘蔗(Saccharum officinarum L.)遗传转化的受体材料为新台糖22号和桂糖03-1403甘蔗植株，本实施例中由广西农科院甘蔗研究所提供。
菌株及质粒：cry1Ac基因可以直接获得，植物表达载体质粒由澳大利亚Cambia公司引进，大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株在本实施例中由广西甘蔗遗传改良重点开放实验室提供。
培养基：诱导培养基CM1为MS+3mg L-12，4-D+30gL-1蔗糖+6gL-1琼脂粉，pH5.8；继代培养基CM2为MS+2mg L-12，4-D+30g L-1蔗糖+6gL-1琼脂 粉，pH5.8；分化培养基CM3为MS+2.0mg L-1BA+0.5mg L-1KT+0.2mgL-1NAA+30gL-1蔗糖+6g L-1琼脂粉，H5.8；生根培养基CM4：1/2MS+0.2mgL-16-BA+3mg L-1NAA+60gL-1蔗糖+6gL-1琼脂粉，pH5.8。
(2)植物表达载体的构建
参考载体pCambia1300多克隆位点，分别设计抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和启动子引物组合，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，测序全部由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物序列如下：
分别用引物组合进行PCR扩增相对应的BT基因、Bar基因和启动子的质粒，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，分别回收，T-克隆、阳性筛选，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，依据pCambia1300多克隆位点(MCS)和引物两端酶切位点的特点，将测序正确的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)基因和Ubi-1启动子片段***载体pCambia1300，获得甘蔗转基因植物表达载体pCambia1300-BT-bar。
(3)导入外源基因：
从田间选取生长健壮且无病虫害的新台糖22号甘蔗植株，去掉梢部叶片，用75％的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，剥取生长点以上10cm内的心叶，将心叶切成厚度为2mm左右的圆片，接种于诱导培养基CM1上，在26℃-28℃黑暗下培养，诱导产生愈伤组织，然后在继代培养基CM2中继代1-2次，使其产生胚性愈伤组织。
提取植物表达载体pCambia1300-BT-bar的质粒DNA并纯化，定量至1μgμL-1。在轰击前8h挑取生长旺盛的胚性愈伤组织(淡黄色，干爽，直径0.3-0.5cm)，接种于高渗透培养基(MS+2mgL-12，4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g L-1蔗糖+6gL-1琼脂粉，pH5.8)中，进行预处理。轰击前30min将渗透 处理的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心(2.5cm)位置。基因枪为Bio-Rad公司PDS-1000/He型，每皿轰击1次。采用优化的轰击参数：轰击距离6cm，气压1100psi。钨粉/DNA用量为600μgμL-1，沉淀剂用2.5mol/L的CaCl2和0.1mol/L的亚精胺(现配现用)，其具体步骤按照PDS-1000/He型基因枪操作说明书进行。
(4)转基因再生植株获得
通过抗性筛选、PCR鉴定和脱菌处理获得阳性甘蔗转基因植株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、植物表达载体的构建步骤，具体为：参考载体pCambia1300的多克隆位点，根据抗螟虫(BT)、抗除草剂(Bar)基因和启动子序列分别***合适的酶切位点，通过基因重组技术将抗螟虫(BT)、抗除草剂(Bar)基因和启动子***载体pCambia1300，获得甘蔗转基因植物表达载体pCambia1300-BT-bar。
S2、导入外源基因步骤，具体为：利用基因枪将包裹植物表达载体pCambia1300-BT-bar的微子弹轰击甘蔗胚性愈伤组织。
S3、轰击处理后，通过抗性筛选、PCR鉴定和脱菌处理后获得阳性的甘蔗转基因植株。
2.根据权利要求1所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于：所述步骤S1中，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳。
3.根据权利要求1所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于：所述步骤S2中，制作胚性愈伤组织的具体步骤为：
从田间选取生长健壮且无病虫害的新台糖22号甘蔗植株，去掉梢部叶片，用75％的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，剥取生长点以上10cm内的心叶，将心叶切成厚度为2mm左右的圆片，接种于诱导培养基CM1上，在26℃-28℃黑暗下培养，诱导产生愈伤组织，然后在继代培养基CM2中继代1-2次，使其产生胚性愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于：所述步骤S2中，植物表达载体pCambia1300-BT-bar的质粒DNA并纯化后定量至1μgμL-1。
5.根据权利要求1所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于：所述步骤S2中，对胚性愈伤组织进行基因枪轰击处理的具体步骤为：
在轰击前8h挑取生长旺盛的胚性愈伤组织(淡黄色，干爽，直径0.3-0.5cm)，接种于高渗透培养基(MS+2mgL-12，4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g L-1蔗糖+6gL-1琼脂粉，pH5.8)中，进行预处理；
在轰击前30min将渗透处理的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心(2.5cm)位置；
然后用基因枪对培养皿进行轰击处理。
6.根据权利要求5所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于：所述基因枪的型号为PDS-1000/He型。
7.根据权利要求5所述的抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基因导入甘蔗的方法，其特征在于：所述基因枪的轰击参数为：轰击距离6cm，气压1100psi，钨粉/DNA用量为600μgμL-1，沉淀剂用2.5mol/L的CaCl2和0.1mol/L的亚精胺。
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