CN108070029A

CN108070029A - 针对胆固醇代谢相关疾病的药物靶点及治疗药物

Info

Publication number: CN108070029A
Application number: CN201611012407.1A
Authority: CN
Inventors: 余鹰; 颜帅
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明涉及针对胆固醇代谢相关疾病的药物靶点及治疗药物。本发明揭示了EP3/PKA/HNF4α信号通路对胆固醇代谢的影响及其分子机制；本发明人还揭示一种可以明显抑制PKA对HNF4α的磷酸化，从而降低全身的胆固醇水平的小肽，该小肽可以作为治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化等疾病的新药物。

Description

针对胆固醇代谢相关疾病的药物靶点及治疗药物

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及针对胆固醇代谢相关疾病的药物靶点及治疗药物。

背景技术

胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，细胞膜包围在人体每一细胞外，胆固醇为它的基本组成成分，占质膜脂类的20％以上。胆汁的功能是将大颗粒的脂肪变成小颗粒，使其易于与小肠中的酶作用，在代谢过程中胆汁会随粪便***，肝脏需产生新的胆酸来弥补这5％～15％的损失，此时就需要胆固醇。胆固醇还参与合成激素。人体的肾上腺皮质和性腺所释放的各种激素，如皮质醇、醛固酮、***、***以及维生素D都属于类固醇激素，其前体物质就是胆固醇。

虽然胆固醇是人体代谢所必不可少的物质，但是胆固醇过量时便会导致高胆固醇血症，对机体产生不利的影响。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症与高胆固醇血症有密切的相关性。

因此，本领域有必要研究一些新的降低体内胆固醇水平的新的靶点，以及开发新的治疗药物。

***素E₂(PGE₂)通过与靶细胞质膜上特定受体结合产生广泛的生理学和药理学效应。PGE₂受体分为四种亚型：EP1、EP2、EP3和EP4。PGE₂的四种受体属于G蛋白偶连超家族受体，不同的亚型受体分别与相应G蛋白偶连进行信号传导。EP3受体是EP中较特殊的“成员”，它能与多种G蛋白偶连转导复杂的信号入细胞内。

肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor-4α，HNF4α)是核激素受体超家族的一种保守性的配体依赖性转录因子，在肝脏高表达，参与维护肝细胞分化、脂肪代谢、药物解毒、白蛋白合成、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能。近年来，随着对HNF4α研究的深入，人们发现它也是调控上皮细胞表型的重要基因，可阻断肝纤维化、肝硬化等肝脏慢性疾病的进程，同时，HNF4α与乙肝病毒的转录和复制有关，但是上述机制尚不完全清楚。

蛋白激酶A(protein kinase A or cAMP-dependent protein kinase，PKA)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞信号转导方面扮演重要的角色。PKA全酶(R_2C_2)由调节亚基(R)与催化亚基(C)组成，被第二信使3’，5’-环腺苷酸(cAMP)激活，释放出具有活性的催化亚基。PKA的催化亚基作为激酶中代表性的结构，是这十几年研究的热点。PKA对生长、分化、特定基因的表达以及糖原分解起调节作用，其活性异常与许多疾病相关，是药物设计的潜在靶点。

上述蛋白是否发生相互作用以及如何发生相互作用，对疾病产生怎样的影响，均是本领域目前没有揭示过的。

发明内容

本发明的目的在于提供针对胆固醇代谢相关疾病的药物靶点及治疗药物。

在本发明的第一方面，提供一种分离的小肽，该小肽是肝细胞核因子4α的片段，包括蛋白激酶(PKA)在肝细胞核因子4α的磷酸化结合域。

在一个优选例中，所述的小肽不是全长的肝细胞核因子4α。

在另一优选例中，所述的小肽不包括肝细胞核因子4α的DNA转录结构域。

在另一优选例中，该小肽包含肝细胞核因子4α的第121～170位的氨基酸序列；或该小肽包含肝细胞核因子4α的第(121-131)～(150-170)位的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码所述的小肽。

在本发明的另一方面，提供一种融合肽，所述的融合肽包括：穿膜肽；以及所述的小肽。

在另一优选例中，所述的穿膜肽包括但不限于：所述的穿膜肽是反式激活蛋白，Penetratin，polyarginine，MAP，Transportan。

在另一优选例中，所述的穿膜肽是反式激活蛋白；更佳地，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1中第1～9位(RKKRRQRRR)所示。

在另一优选例中，所述的穿膜肽位于融合肽的N端。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码所述的融合肽。

在本发明的另一方面，提供所述的小肽或所述的融合肽的用途，用于制备预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物或药盒。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢(相关)疾病是与肝细胞核因子4α的143位丝氨酸磷酸化异常相关的疾病，或所述的胆固醇代谢疾病是与胆酸缺乏相关的疾病，或所述的胆固醇代谢疾病是胆固醇代谢(特别是高胆固醇)相关疾病。

在另一优选例中，所述的胆固醇代谢疾病包括(但不限于)：高胆固醇血症，动脉粥样硬化，静脉血栓，黄色瘤，角膜弓。

在另一优选例中，所述的小肽或融合肽通过竞争性的结合蛋白激酶A(PKA)、抑制蛋白激酶A对肝细胞核因子4α的第143位丝氨酸磷酸化、增加肝细胞核因子4α对CYP7A1启动子的结合，促进CYP7A1的转录、翻译，从而促进胆酸合成，降低胆固醇。

在本发明的另一方面，提供一种用于预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物，所述的组合物含有所述的小肽；以及食品学或药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物，所述的组合物含有所述的融合肽；以及食品学或药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药盒，所述的药盒含有所述的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物(或潜在药物)的方法，所述方法包括：

(1)将候选物质加入到存在(或表达)蛋白激酶A和肝细胞核因子4α的体系；和

(2)检测所述体系中蛋白激酶A与肝细胞核因子4α的相互作用；

其中，若所述候选物质能抑制蛋白激酶A对肝细胞核因子4α的143位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在(或表达)蛋白激酶A和肝细胞核因子4α的体系中；

步骤(2)包括：检测测试组的体系中肝细胞核因子4α的第143位丝氨酸的磷酸化情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的存在(或表达)蛋白激酶A和肝细胞核因子4α的体系；

其中，若所述候选物质能抑制(较佳地是统计学上抑制；如降低20％以上，较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)蛋白激酶A对肝细胞核因子4α的磷酸化，则表明该候选物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的物质。

(a)将候选物质加入到存在(或表达)***素E2受体亚型3(EP3)和肝细胞核因子4α的体系；和

(b)检测所述体系中***素E2受体亚型3与肝细胞核因子4α的相互作用；

其中，若所述候选物质能促进***素E2受体亚型3活性，进而抑制肝细胞核因子4α的第143位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的物质。

在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在(或表达)***素E2受体亚型3和肝细胞核因子4α的体系中；

步骤(2)包括：检测测试组的体系中***素E2受体亚型3与肝细胞核因子4α的相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的存在(或表达)***素E2受体亚型3和肝细胞核因子4α的体系；

其中，若所述候选物质能促进(较佳地是统计学上促进；如促进20％以上，较佳地促进50％以上，更佳地促进80％以上)***素E2受体亚型3活性，进而抑制(较佳地是统计学上抑制；如降低20％以上，较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)肝细胞核因子4α的第143位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对***素E2亚型3、蛋白激酶A、肝细胞核因子4α或它们上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(细胞培养物体系)(如肝脏细胞或肝癌细胞)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A，高脂饮食喂养后，肝脏中***素受体表达；

图1B，肝脏特异性敲除EP3小鼠肝脏和血液中，胆固醇和甘油三酯水平；

图1C，EP3肝脏敲除小鼠和低密度脂蛋白受体LDLR双敲除小鼠，全身胆固醇水平；

图1D，快速蛋白液相色谱分析血液中胆固醇在三种脂蛋白中的分布；

图1E和F，小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块面积统计。

图2A，梯度删减CYP7A1基因启动子序列；

图2B，梯度删减CYP7A1基因启动子的荧光报告实验；

图2C，人和小鼠CYP7A1基因启动子DR-1序列同源性分析；

图2D，突变CYP7A1基因启动子DR-1序列荧光报告实验；

图2E和F，敲降HNF4α的荧光报告实验。

图3A，PKA活性检测；

图3B，不同物种HNF4α蛋白序列中PKA结合域保守性分析；

图3C，体外PKA激酶磷酸化实验；

图3D，Forskolin和PKA抑制剂H89对HNF4α磷酸化影响；

图3E，PKA抑制剂H89对胆酸合成酶表达和胆固醇水平的影响；

图3F，EP3缺失对HNF4α结合靶基因CYP7A1启动子的影响。

图4，体外培养肝细胞系中，EP3拮抗剂L798106处理明显增加HNF4α的磷酸化，P121-170小肽处理抑制PKA对HNF4α的磷酸化。

图5A，染色质免疫共沉淀技术分析P121-170对HNF4α结合CYP7A1基因启动子的影响；

图5B，P121-170小肽处理小鼠对胆酸合成相关基因表达的影响；

图5C，P121-170小肽处理小鼠对胆酸水平的影响；

图5D，P121-170小肽处理小鼠对胆固醇水平的影响；

图5E，P121-170小肽处理小鼠对胆固醇在血液脂蛋白中的分布的影响；

图5F，P121-170小肽作用分子机制示意图。

具体实施方式

本发明首次研究及揭示了EP3/PKA/HNF4α信号通路对胆固醇代谢的影响及其分子机制。本发明人在肝脏中特异性地敲除EP3基因，发现动物的全身(包括血液、肝脏和粪便)的胆固醇水平明显升高；肝脏缺失EP3的动物的动脉粥样硬化斑块的面积明显高于对照组小鼠；EP3缺失明显增加PKA引起的肝细胞核因子4(HNF4α)143位丝氨酸的磷酸化，抑制HNF4α对靶基因CYP7A1启动子的结合，从而抑制CYP7A1的转录。本发明人还制备了一种小肽，使用该小肽可以明显抑制PKA对HNF4α的磷酸化，增加HNF4α对CYP7A1启动子的结合，促进CYP7A1的转录和翻译；CYP7A1的增加明显促进肝脏中胆酸的合成，从而降低全身的胆固醇水平。因此，该小肽可以作为治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化等疾病的一种新的物质。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“包括蛋白激酶(PKA)在肝细胞核因子4α的磷酸化结合域”是指来源于肝细胞核因子4α的全长序列上的片段，较佳地，其含有肝细胞核因子4α的第(121-131)～(150-170)位的氨基酸序列。

如本文所用，所述的“肝细胞核因子4α的第(121-131)～(150-170)位的氨基酸序列”是指一段氨基酸序列片段，其起始于全长肝细胞核因子4α氨基酸序列的第121-131位的任一位的氨基酸，终止于全长肝细胞核因子4α氨基酸序列的第150-170位的任一位的氨基酸。例如，该序列片段可以是全长肝细胞核因子4α氨基酸序列的第121-170位，或可以是全长肝细胞核因子4α氨基酸序列的第131-150位；较佳地，其是全长肝细胞核因子4α氨基酸序列的第121-170位。

本发明提供了一种小肽，该小肽是肝细胞核因子4α的片段，包括蛋白激酶A(PKA)在肝细胞核因子4α的磷酸化结构域的第(121-131)～(150-170)位的氨基酸序列。

所述的小肽不是全长的肝细胞核因子4α。全长的肝细胞核因子4α，由于含有例如DNA转录结构域，导致其并不能达到本发明的小肽同样的功能。因此，较佳地，所述的小肽不包括肝细胞核因子4α的DNA转录结构域。最优选地，所述的小肽是氨基酸序列是肝细胞核因子4α的第121～170位的氨基酸序列。

在所述的小肽基础上，经过一个或多个(一般1-5个，如2、3、4个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的小肽变体也包括在本发明中。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

在所述的小肽基础上，经修饰或改良的小肽变体也包括在本发明中，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的小肽变体。所述经过修饰或改良的小肽变体可包含被取代的或人工的氨基酸。也就是说，任何不影响所述小肽的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

本发明还提供了一种融合肽，所述的融合肽包括：穿膜肽，以及所述的小肽。所述的穿膜肽是引导所述的小肽进入到细胞内的肽，穿膜肽可以采用本领域已知的可引导多肽或其编码基因进入到细胞内的任何分子，或采用提高多肽穿透细胞能力的任何分子。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(protein derived CPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(model peptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类：①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。所述的穿膜肽可以与小肽直接连接，或者可以通过连接肽连接。

一旦获得了所述小肽或融合肽的序列，就可以用重组法来大批量地获得该小肽或融合肽。例如可以将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列的融合蛋白。对于本发明的小肽或融合肽而言，优选的是采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的多肽。

本发明还提供了编码所小肽或融合肽的核酸。所述的核酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。所述的重组法通常是将所述核酸克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明还提供了所述的小肽或融合肽的应用，用于制备预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物或药盒。所述的小肽或融合肽通过结合蛋白激酶A(PKA)、抑制蛋白激酶A对肝细胞核因子4α磷酸化、增加肝细胞核因子4α对CYP7A1启动子的结合，促进CYP7A1的转录、翻译，从而促进胆酸合成，降低胆固醇。

本发明中所述的胆固醇代谢疾病特别是指高胆固醇相关疾病；或者，所述的胆固醇代谢疾病特别是指肝细胞核因子4α多度磷酸化相关的疾病；或者，所述的胆固醇代谢疾病特别是指与胆酸缺乏相关的疾病。一些具体的疾病例如；高胆固醇血症，动脉粥样硬化，静脉血栓，胆石症。广义而言，这些疾病的并发症也被包含在本发明的小肽或融合肽可以治疗的疾病范围内。

本发明还提供了一种组合物，可以是食品组合物、保健品组合物或药物组合物，该组合物包括有效量的本发明所述的小肽或融合肽，以及食品学或药学上可接受的载体。

合适的食品学上或药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的多肽或融合肽、或编码它们的核酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的多肽或融合肽，或含有所述的多肽或融合肽的组合物。

为了便于临床应用，本发明的组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

筛选方法

在得知了EP3/PKA/HNF4α信号通路对胆固醇代谢的影响及其分子机制以后，可基于该新发现来筛选通过调节该信号通路，预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物或潜在药物。

因此，本发明提供了一种预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物或潜在药物的方法，所述方法包括：以蛋白激酶A和肝细胞核因子4α作为筛选的靶点，选出特异性抑制蛋白激酶A对肝细胞核因子4α的磷酸化的物质，所述的物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物或潜在药物。

本发明还提供了一种预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物或潜在药物的方法，所述方法包括：以***素E2亚型3和肝细胞核因子4α作为筛选的靶点，选出特异性调控***素E2亚型3、从而抑制肝细胞核因子4α的磷酸化的物质，所述的物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物或潜在药物。

以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱或检测蛋白的磷酸化情况可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交***或免疫共沉淀技术等。

经过大规模的药物筛选，可以获得一类特异性作用于EP3/PKA/HNF4α信号通路、对胆固醇代谢有调控作用的潜在物质。这些初步筛选出的潜在物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以在进一步验证的基础上，从中筛选出真正有用的、副作用低的药物。

在本发明的具体实施例中，采用染色质免疫共沉淀技术、重组质粒构建技术、siRNA knockdown技术、Real-time PCR技术、腺病毒包装和注射技术、免疫印迹技术以及快速蛋白液相色谱***等先进的生物学技术手段，以野生型以及EP3肝脏特异性敲除的小鼠为对象，研究EP3/PKA/HNF4α信号通路对胆固醇代谢的影响及其分子机制。研究结果表明：在小鼠肝脏中特异性的敲除EP3基因，相较于野生型对照小鼠，全身(血液、肝脏和粪便)的胆固醇水平明显升高；肝脏缺失EP3小鼠其动脉粥样硬化斑块的面积明显高于对照组小鼠；EP3缺失明显增加PKA引起的肝细胞核因子4(HNF4α)143位丝氨酸的磷酸化，抑制HNF4α对靶基因CYP7A1启动子的结合，从而抑制CYP7A1的转录；使用小肽可以明显抑制PKA对HNF4α的磷酸化，增加HNF4α对CYP7A1启动子的结合，促进CYP7A1的转录和翻译；CYP7A1的增加明显促进肝脏中胆酸的合成，从而降低小鼠全身的胆固醇水平。由本发明可知，本发明的小肽可以作为治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化等疾病的一种新的手段。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

实验动物与饮食

雄性C57BL/6小鼠购于上海斯莱克实验动物中心。8-10周龄小鼠养于SPF级动物房，饲养温度为22℃，昼夜12小时循环，实验开始之前给予符合国际标准的食物及饮水饲养。对于高脂诱导的高胆固醇血症模型，小鼠饲喂高脂高胆固醇粮食(货号：D12079B,Research Diets,)12周，Chow diet为小鼠正常生长饲料，购于斯莱克实验动物中心。

肝脏特异性敲除EP3小鼠的建立

肝脏特异性敲除EP3小鼠的构建，通过EP3^flox/flox小鼠(本实验室自有)与肝脏特异性Cre转基因小鼠(Alb Cre小鼠，购置Jackson lab)杂交，获得肝脏特异性敲除EP3的小鼠EP3^hep-/-(EP3^flox/flox:Alb-Cre)。

低密度脂蛋白受体LDLR单敲除小鼠的建立

低密度脂蛋白受体LDLR敲除小鼠Ldlr^-/-购自Jackson lab。

EP3肝脏敲除小鼠和低密度脂蛋白受体LDLR双敲除小鼠的建立

肝脏特异性敲除小鼠EP3^hep-/-与低密度脂蛋白受体LDLR敲除小鼠Ldlr^-/-杂交，获得双敲除小鼠EP3^hep-/-Ldlr^-/-。

染色质免疫沉淀

培养在15cm培养皿中的小鼠肝脏原代细胞(大概1.5×10⁷)，提前使用10μM PKA抑制剂H89(购自sigma)处理12小时，接着使用25-羟基(OH)胆固醇(1μg/ml)处理24小时。处理后的细胞使用浓度为1％的甲醛室温固定10分钟，接着使用0.125M的甘氨酸终止交联反应。终止后使用预冷的PBS缓冲液洗两遍细胞，使用SDS裂解液裂解细胞。小鼠肝脏组织样本的处理，大约200mg小鼠的肝脏组织在液氮中将组织磨成粉末，并转移至离线管中。同样使用1％的甲醛室温固定十分钟，并用预冷的PBS缓冲液洗涤组织沉淀两次，加入SDS裂解液并匀浆。肝细胞或肝脏组织经过裂解后，使用超声仪将基因组DNA打断成为200-500bp所有的片段。为了减少非特异性的结合，使用蛋白G琼脂糖珠子加入打断后的染色质4℃孵育1小时，接着上清中加入3μg HNF4α的抗体，对照组样品加入3μg小鼠IgG抗体。接着使用G蛋白琼脂珠子将抗原抗体和DNA的复合物进行富集。免疫沉淀下来得到的物质分别使用低盐免疫洗涤缓冲液、高盐免疫洗涤缓冲液、氯化锂免疫洗涤缓冲液、TE和洗脱液进行洗涤。实验组和对照组的样品经0.2M氯化钠65℃过夜处理，接着使用蛋白酶45℃消化2小时。洗脱下来的DNA经DNA纯化试剂盒进一步纯化。

进行PCR的引物如下：

正向，5’-TAATGACATGGACAGCCAGTATTA-3’(SEQ ID NO:2)；

反向，5’-TTGAACTTGGGTGACCAGAGC-3’(SEQ ID NO:3)。

双荧光报告实验

人和小鼠CYP7A1基因的启动子(请提供最长片段的序列)分别使用小鼠肝脏原代细胞基因组DNA和HepG2细胞系基因组DNA为模板，经过PCR扩增获得。

人CYP7A1基因的启动子最长片段的序列(1000bp)：

TCAGATCTCAAATGTCACAATTTCAGAGAGCCCATCTCTGATCATCATATCTAAAGTTGTCCTCATTCCCCCATAGCTTTCTATACCATGTTTTATTTTTTTCATAACATGTATTTTATTACTCCTTTCTCCATTGGAATAGAATCTCCATTAGATTAGGAAATCTGCCTATCTTATTAATGCCTGCAACTGGAATACTTTTGAAGAGTTCTTGGCACGTAATAAATACTCAACTAATATTTTTGTGTACACAGAAATAAAGTTTGGAAGAACAGATGCCAAATTGTTACTAGTGGTTACTTCTGAGTAAAGGAGTAGCATGGTAGGTAAATTATTAATAGATGTTCACTTTCCACCAAGATATGTTTTAGTTAGTCTTAACTTACTTGAAATGAAATTTATTACTTTAATAATTAGAAACATTGATAAACATTTTAGTCACAAGAATGATAGATAAAATTTTGATGCTTCCAATAAGTTATATTTATCTAGAGGATGCACTTATGTAGAATACTCTCTTGAGGATGTTAGGTGAGTAACATGTTACTATATGTAGTAAAATATCTATGATTTTATAAAAGCACTGAAACATGAAGCAGCAGAAATGTTTTTCCCAGTTCTCTTTCCTCTGAACTTGATCACCGTCTCTCTGGCAAAGCACCTAAATTAATTCTTCTTTAAAAGTTAACAAGACCAAATTATAAGCTTGATGAATAACTCATTCTTATCTTTCTTTAAATGATTATAGTTTATGTATTTATTAGCTATGCCCATCTTAAACAGGTTTATTTGTTCTTTTTACACATACCAAACTCTTAATATTAGCTGTTGTCCCCAGGTCCGAATGTTAAGTCAACATATATTTGAGAGACCTTCAACTTATCAAGTATTGCAGGTCTCTGATTGCTTTGGAACCACTTCTGATACCTGTGGACTTAGTTCAAGGCCAGTTACTACCACTTTTTTTTTTCTAATAGAATGAACAAATGGCTAATTGTTT(SEQ ID NO:4)

小鼠CYP7A1基因的启动子最长片段的序列(1000bp)：

ATATTTGCTGTCTCCCCATCAAAATACAATCTTCAGTAGAGAAACTCCCTGTCTTGTTAGTACCTGAAACCAGAATATCTTCAAAGAGTTCCTGGAACATAAAAATGCTCAATTAATATTTATGTTAAGTAGGGAGCTGGGGTGTAAATCAGCGGTAGAGTGCTTGCCTTGGAGGAGTGGGGCCATTGGTTCAATCTTCAGCACAAAATGAAAGATTATGCTGAGTAAAGTTGGGAAAGTTGTATACCAGTTTATGAGTAGTATAAGAGGTAAATTATGAATTCATATTTACTTTGACAAGAAGTGTTGTAGTCTTTATTTGAAATAAAAGTACATCTTAATTACAAATAAAAATTGGTAAAGAGTGAATTCTCAAGCTATGGCTGCCTAGAAGATGAGTGCTGGGAGGTTTTCTATTTCGACGATAGTAGATAGACTACATGAAGCACCTGTGGCTTTATAAACACACTGAACAATCAAGCAAAAACAAACAAACAAAGAAACAAACAAAACAAACTGTTCCACACCGTTCACATCCTTTAGGATCGGTTGCTGTATACTTCTGGAAATTAATTTAAATAATTTTCCCCAAAGGTTAATGACATGGACAGCCAGTATTAAAGCCAGGATGGAAAGCTTCTGCCTGTTTTGCTTTACAACACACTCCACATCTTTGGTAGGTGAGCTCTTCTGTAGTGTGTTTACTTCTTTTTCTACACACAGAAGCACAGTGTTAGCTGTTGTCCCCAGCTTTGAATGTTATGTCAGCACATGAGGGACAGACCTTCGGCTTATCGACTATTGCAGCTCTCTGCTTGTTCTGGAGCCTCTTCTGAGAAGATGGACTTAGTTCAAGGCCAGATAATGCTATTTTTTTCTTTTTTCTTTTTTCTTTTTTTTAGGAGGACAAATAGTTAGTGTTTGCTCTGGTCACCCAAGTTCAAGTTATTGGATCATGGTCCTGTGCATATATAAAGCCTAGTTAGAGCCACAGTTTCTG(SEQ ID NO:5)

使用了XhoI和KpnI将PCR获得的片段连入pGL3-Basic载体。

截短的人和小鼠CYP7A1基因启动子的质粒，分别使用相应的引物进行PCR，经过酶切和连接，再装入pGL3-Basic载体。

以上PCR所使用的引物，请见表1和表2。所构建的质粒，全部经过测序验证其序列的正确性。

表1、不同长度人CYP7A1基因启动子PCR引物序列

表2、不同长度小鼠CYP7A1基因启动子PCR引物序列

含有不同长度的人和小鼠CYP7A1基因启动子的质粒，分别转染人肝癌细胞株HepG2和小鼠肝癌细胞株Hep1-6细胞，对照组则转染pGL3-Basic空载体。转染后24小时使用1μM的EP3拮抗剂L798106(购自Cayman chemical)处理细胞。使用表达海参荧光的pRL-TK质粒进行共转染，作为一个内部对照。双荧光报告实验采用了普洛麦格公司双荧光报告实验试剂盒。

HNF4α的敲降实验采用SiRNA，其序列如下：

小鼠：5’-GGUGCCAACCUCAAUUCAUTT-3’(SEQ ID NO:20)；

人：5’-GUGGUGGACAAAGACAAGATT-3’(SEQ ID NO:21)。

敲降实验方法：(1)转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％，使用无抗生素的培养基。(2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液(24孔板，每孔使用1μl的lipo2000和终浓度为20nM的SiRNA)：a.稀释转染试剂lipo2000：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)稀释，轻轻混和，室温孵育5min；b.稀释siRNA：用Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释siRNA，轻轻混和；c.稀释好的lipo2000经过5min的孵育后的孵育后，与上述(b)稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000混和物。(3)将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和；(4)将培养板置于37℃的CO₂培养箱中培养48小时进行后续试验。

PKA激酶体外磷酸化实验

PKA体外磷酸化实验采用的反应体系如下：0.4μl ATP(10mM)，0.2μl cAMP-dependent Protein Kinase(PKA)，催化亚基(P6000S；New England BioLabs)(Ipswitch，MA，USA)，2μl 10×NEB buffer，16.4μl短肽(1mg/ml)，1μl[γ-P³²]ATP(3,000Ci/mmol)(PerkinElmer，Hopkinton，MA)在30℃反应30min。加入20μl 2X SDS-PAGE loading终止反应。使用Tricine SDS-PAGE胶分离短肽，胶经过固定、风干，使用X光片记性显影。

全长肝细胞核因子4α氨基酸序列如下(SEQ ID NO:22)：

短肽序列如下：

WT：QNERDRISTR RSSYEDSSLP(SEQ ID NO:23，该小肽序列只包括PKA和HNF4a结合的序列)；

S142A：QNERDRISTR RASYEDSSLP(SEQ ID NO:24)；

S143A：QNERDRISTR RSAYEDSSLP(SEQ ID NO:25)。

小鼠原代肝细胞的分离和培养

实验开始前用3％双氧水(原浓度约30％)清洗灌流器半小时，再用水冲一下。小鼠麻醉(12％浓度的水合氯醛腹腔注射麻醉，20g左右小鼠注射约200μl)后，四肢固定，剪开腹腔。首先将线穿过下腔静脉，留置针***下腔静脉(留置针三角面朝上，***血管位置尽量靠下，因为若第一次没插好可再更上位置重插一次)，然后用线将血管和塑料针结扎，接着拔出钢针，留下灌流针的外套塑料针，连接输液器，再剪开肝门静脉，最后打开灌流器开关开始灌流(速度大致为15ml/min，本实验室仪器调至1/40标志)：首先是用perfusionbuffer灌大约120-150ml，之后换为enzyme buffer(始终置于37℃水浴涡中)大致为100ml(能明显看到肝组织被消化呈松散状)。小心剪下整个肝组织，用无菌的PBS或培养基洗一下，再放入60mm dish(之前剩余的enzyme buffer可倒入dish中)。进入细胞房。以下步骤在冰上操作。用的1ml枪头要剪平。加入不含血清的培养基(DMEM，1640等均可)少许，将肝组织表面的膜撕开，并挑出膜，留下已被消化成个体的细胞。再加入少许无血清的DMEM，洗残留的细胞。将含有细胞的培养基转移到新的50ml管子(或用2个15ml管子)中。离心50g 1min，弃上清。细胞中加入约8ml培养基(15ml管子即为每管加约4ml)，轻轻吹散，过100um滤网。离心50g 1min，弃上清，加入培养基至总体积5ml(15ml管子即为每管加至2.5ml)。0.48ml10xPBS+4.32ml percoll(P1644，sigma)混匀。与第九步的5ml细胞液混匀(15ml管子即为每管与2.5ml PBS-percoll混匀)。离心50g(700rpm)10min(可以不带刹车)弃上清及表面悬浮物，下层沉淀即为活着的原代肝实质细胞。加入10％FBS DMEM，细胞计数，使培养密度为5x10 ⁵个细胞每35mm皿(或6孔板1个孔)。4小时后换新鲜的培养基10％FBS DMEM。第二天即可开始实验。

免疫印迹实验

使用适量RIPA裂解液(提前加入蛋白酶抑制剂PMSF)在冰上裂解30分钟后收取细胞蛋白。组织样品加入蛋白裂解液中后，使用组织研磨仪进行研磨。而后4℃，14000g离心15分钟取上清转移到新的EP管中，取适量蛋白样品加入一定体积的5×SDS上样缓冲液混匀，100℃煮沸5分钟，以备上样。免疫印迹实验时根据目标蛋白质分子量不同，选用8％-12％浓度的变性SDS-PAGE胶进行电泳。当蛋白质在压缩胶内时，以80V电压进行电泳，蛋白质进入分离胶后以120V电压进行电泳，直到目标蛋白质到达合适的位置时停止，进行转膜。转膜前将硝酸纤维素膜(PVDF膜，Millipore公司)和胶一起置于转膜缓冲液中平衡，而后按着阳极-海绵-滤纸-NC膜-胶-滤纸-海绵-阴极的排序置放正确，放入转膜槽中。350mA转膜1.5小时，结束后取出NC膜，根据靶标蛋白质的表观分子量大小裁剪相应的条带。将裁剪出的条带用5％脱脂牛奶或者5％BSA(均用TBST溶解)在室温孵育2小时封闭，而后倒去上述封闭液，加入稀释好的一抗(溶于含5％BSA的TBST)，4℃摇匀过夜。第二天将与抗体孵育后的膜用TBST洗三遍，每遍10分钟，之后加入适合的二抗溶液(溶于含5％BSA的TBST)，室温孵育1-2小时。弃二抗，加入适量TBST洗膜，每次10分钟。ECL发光底物显色，暗房压片冲片。检测结果利用Image J 1.44p进行统计。

使用抗体的种类和货号如下：

anti-CYP7A1(catalogue No.ab65596，diluted 1:1,000)；

anti-CYP27A1(ab126785，1:1,000)；

anti-CYP8B1(ab191910，1:500)；

anti-HNF4α(for ChIP assay，ab41898，1:1,000)；

anti-CYP7B1(24889-1-AP，1:1,000)；

anti-GAPDH(10494-1-AP，1:1,000)，获自Proteintech(Chicago，IL，USA)；

anti-β-actin(A5441，1:5,000)，获自Sigma(St.Louis，MO，USA)；

anti-FXR(sc-13068，1:200)，获自Santa Cruz(Santa Cruz，CA，USA)；

anti-phospho-PKA substrate(RRXS*/T*)(9624S，1:1,000)，获自CellSignaling Technology(Beverly，MA，USA)；

anti-HNF4α(for western blot，A2085，1:1000)，获自ABclonal Technology(Shanghai，China)；

HNF4α 143位磷酸化的抗体：使用序列为DRISTRRS(p-S)YEDSSLPSC的肽免疫兔子，收集兔子的血清，经过纯化获得磷酸化的抗体。

HNF4α小肽注射

HNF4α小肽(来自HNF4α的第121-170位，称为P121-170)序列(SEQ ID NO:1)如下：

RKKRRQRRRFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLPSINALLQAEVLSQQITSPIS。(前面9个氨基酸为穿膜肽)

对照肽序列如下(称为P Con)：

RKKRRQRRR(SEQ ID NO:26)。

小肽溶解在PBS配置的05％的BSA中，腹腔注射对照小肽或者实验小肽P121-170(500μg/kg/day)14天，接着进行后续的试验。

血浆胆固醇和胆汁酸检测

血浆中的胆固醇和胆汁酸的检测使用商业化的试剂盒。

胆固醇的检测使用日本和光纯药工业株式会社(Wako)生产的试剂盒。

总胆汁酸的检测使用Diazyme生产的试剂盒。

RNA的提取、反转和荧光定量试验

向待裂解的细胞或组织中加入1ml Trizol(购自Invitrogen公司)，细胞样品室温放置5min，转移到1.5ml RNase-free的EP管中。组织样品使用研磨仪打碎，加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀15秒，4℃12000g离心15分钟。吸取上清至新的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后，室温放置15分钟以上，4℃12000g离心15分钟，这时可见白色的RNA沉淀。吸净并弃去上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，吸净并晾干，加入适量的DEPC水，充分溶解后，测定RNA浓度。取上述1μg RNA、适量gDNA Eraser和5X gDNA Eraser，42℃，2min。反转录酶(购自Takara公司)，按照生产商建议反转录反应体系，先在37℃加热15分钟置，后于85℃反应5秒，获得cDNA模板原液，最后用双蒸水1:10稀释作为PCR反应模板。RT-PCR使用Syber Green(购自Takara公司)相应体系进行。检测剪接靶点引物设计原则为：跨越可变剪接区域设计引物，使相同条件下扩增出长短不同的2种或2种以上在大小上可区分的PCR产物。其中使用的引物序列如表3。

表3

实施例1、肝脏中特异性敲除EP3明显增加小鼠胆固醇水平和饮食诱导的动脉粥样硬化

本发明人利用C57BL/6小鼠制作了高脂诱导的肥胖动物模型(High fat diet组，即图1中Westem diet)，以正常生长饲料喂食的小鼠作为对照，比较两种处理方式的小鼠。

检测肝脏中***素受体表达情况，发现高脂饮食明显上调肝脏中EP3的表达，如图1A。

测定肝脏特异性敲除EP3小鼠(EP3^hep+/+)肝脏和血液中，胆固醇(Chol)和甘油三酯(TG)水平，以EP3^hep-/-小鼠为对照(其是EP3^flox/flox小鼠，肝脏Alb Cre阴性小鼠)。结果如图1B，肝脏中特异性敲除EP3可以明显增加小鼠全身的胆固醇水平；血液和肝脏中均有上升，其中以血液中胆固醇的增加更为显著。

本发明人还构建了EP3肝脏敲除小鼠和低密度脂蛋白受体LDLR双敲除小鼠。正常的小鼠很难形成动脉粥样硬化，即使是饲喂了高脂高胆固醇的粮食。因此一般采用与LDLR敲除或者是ApoE敲除的小鼠杂交，这样可以更好的观察动脉粥样硬化的形成和发展。观察其血液、肝脏、***物中胆固醇的含量；以LDLR单敲除小鼠为对照。结果如图1C，可见，肝脏中特异性敲除EP3明显增加小鼠全身的胆固醇水平。本发明人还利用快速蛋白液相色谱分析法，测定血液中胆固醇在三种脂蛋白(VLDL，LDL，HDL)中的分布，结果如图1D。

观测LDLR单敲除小鼠、EP3及LDLR双敲除小鼠分别在饲喂高脂高胆固醇粮食第12周和第24周时的主动脉动脉粥样硬化斑块。结果如图1E和F，EP3及LDLR双敲除小鼠的主动脉动脉粥样硬化斑块面积显著增加。

综上说明，高脂饮食明显上调肝脏中EP3的表达，肝脏中特异性敲除EP3明显增加小鼠全身的胆固醇水平，增加主动脉动脉粥样硬化斑块的面积。

实施例2、HNF4α可以调控CYP7A1的转录

本发明人研究了EP3/PKA/HNF4α信号通路中HNF4α的功能及作用机制。

本发明人获得了不同长度的CYP7A1基因启动子序列，制备含有不同长度的人和小鼠CYP7A1基因启动子序列片段(ATG上游1000、500、250、200、100、50bp；如图2A)的质粒分别转染人肝癌细胞株HepG2和小鼠肝癌细胞株Hep1-6细胞，对照组则转染pGL3-Basic空载体。转染后24小时使用1μM的EP3拮抗剂L798106(购自Cayman Chemical)处理细胞。结果如图2B-F，可见使用EP3的拮抗剂L798106处理人肝癌细胞株HepG2和小鼠肝癌细胞株Hep1-6，可以明显抑制CYP7A1基因的转录活性(图2B)。在人肝癌细胞株HepG2中，CYP7A1启动子序列删除到-50后，EP3拮抗剂L798106对CYP7A1基因转录活性的抑制作用消失；在小鼠肝癌细胞株Hep1-6中，CYP7A1启动子序列删除到-100后，EP3拮抗剂对CYP7A1基因转录活性的抑制作用消失(图2B)。通过序列分析，本发明人发现在人和小鼠CYP7A1基因启动子-50到-100区域，含有核受体HNF4α结合DNA的DR-1序列(图2C)。在人肝癌细胞株HepG2和小鼠肝癌细胞株Hep1-6中，将DR-1序列突变，EP3拮抗剂L798106对CYP7A1基因转录的抑制作用消失(图2D)，证明了EP3的缺失抑制CYP7A1基因表达，主要是通过核受体HNF4α来实现。为了进一步验证我们的结论，在人肝癌细胞株HepG2和小鼠肝癌细胞株Hep1-6中敲降HNF4α(图E)，可以消除EP3缺失对CYP7A1基因转录的抑制作用(图F)。

因此，核受体HNF4α通过结合CYP7A1基因启动子上DR-1序列，调控CYP7A1的转录。

实施例3、EP3缺失增加PKA对HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化

本发明人研究了EP3/PKA/HNF4α信号通路中PKA的功能及作用机制。

获取肝脏特异性敲除EP3小鼠(EP3^hep+/+)，以EP3^hep-/-小鼠为对照(EP3^flox/flox小鼠，肝脏Alb Cre阴性小鼠)，取小鼠的肝脏原代细胞，检测原代肝脏细胞中PKA的活性。通过图3A所示，上部条带属于磷酸化的条带，下部为非磷酸化的条带；肝细胞中敲除EP3明显增加PKA的活性，增加的活性可以被PKA特异性的抑制剂H89抑制。不同物种HNF4α蛋白序列中PKA结合域保守性分析如图3B，表明该结构域高度保守。取合成的小肽作为待测样品，本发明人进行了PKA激酶体外磷酸化实验，结果如图3C，可见PKA可以磷酸化野生型WT小肽的磷酸化，将142位的丝氨酸突变成丙氨酸并不影响PKA对该小肽的磷酸化。但是，将143位的丝氨酸突变成丙氨酸，PKA则不能磷酸化该小肽。结果表明，PKA磷酸化HNF4α是在143位的丝氨酸。

为了进一步的研究PKA对HNF4α的磷酸化，制作了特异性识别HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化抗体。如图3D所示，PKA的激动剂forskolin可以明显上调HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化，这种上调作用可以被PKA的抑制剂H89彻底的抑制；表明了磷酸化抗体的特异性和PKA对HNF4α的磷酸化。研究PKA抑制剂H89对胆酸合成酶表达和胆固醇水平的影响，使用两种小鼠肝脏原代细胞，使用了PKA的抑制剂H89进行处理。结果如图3E(左图)，在小鼠肝脏原代细胞中敲除EP3明显上调HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化，抑制胆汁酸合成酶的表达；使用PKA的抑制剂H89抑制EP3敲除引起的HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化，增加胆汁酸基因的表达。如图3E(右图)，EP3缺失明显增加肝脏原代细胞中胆固醇的水平，PKA的抑制剂可以明显抑制胆固醇的升高。以上结果表明EP3调节胆固醇的水平，是通过PKA磷酸化HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化来实现的。

研究P3缺失对HNF4α结合靶基因CYP7A1启动子的影响。利用了染色质免疫共沉淀技术，在小鼠的肝脏原代细胞中，结果如图3F，敲除EP3明显增加HNF4α对CYP7A1基因启动子的结合，PKA的抑制剂H89可以明显抑制这种结合。

因此，EP3缺失明显增加PKA对HNF4α 143位丝氨酸的磷酸化，磷酸化的HNF4α丧失对目的基因CYP7A1启动子的结合，进而抑制CYP7A1及下游胆酸合成相关酶的表达，从而增加胆固醇的水平。

实施例4、P121-170小肽抑制PKA和HNF4α的相互作用

体外培养肝细胞HepG2和Hep1-6，比较EP3拮抗剂L798106处理、P121-170小肽处理对于PKA对HNF4α的磷酸化的影响。结果如图4，在HepG2和Hep1-6细胞系中，使用EP3的拮抗剂L798106可以明显增加HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化；使用小肽P121-170处理两种细胞系，P121-170可以竞争性结合PKA，进而抑制PKA对HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化,同时可以消除EP3拮抗剂L798106处理对HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化的影响。结果表明，EP3拮抗剂L798106处理明显增加HNF4α的磷酸化，P121-170小肽处理抑制PKA对HNF4α的磷酸化。

实施例5、P121-170小肽降低高脂饮食诱导高胆固醇血症小鼠的胆固醇水平

针对LDLR单敲除小鼠、EP3及LDLR双敲除小鼠，利用染色质免疫共沉淀技术，本发明人分析了P121-170对HNF4α结合CYP7A1基因启动子的影响；通过染色质免疫共沉淀技术，分析了对照肽和P121-170小肽处理后，小鼠肝脏中HNF4α对基因CYP7A1的结合。结果如图5A，EP3敲除明显增加HNF4α对其靶基因CYP7A1启动子的结合，这种结合作用可以被小肽P121-170消除。

针对LDLR单敲除小鼠、EP3及LDLR双敲除小鼠，本发明人还检测了P121-170小肽处理小鼠对肝脏胆酸合成相关基因表达的影响；结果如图5B，敲除EP3明显抑制肝脏组织中胆酸合成相关基因的表达，P121-170小肽处理可以明显降低两组小鼠肝脏组织中胆酸合成相关基因的表达，并可以消除小鼠EP3缺失对胆酸合成基因的上调。

针对LDLR单敲除小鼠、EP3及LDLR双敲除小鼠的血液、肝脏、粪便，本发明人还检测了P121-170小肽处理小鼠对胆酸水平的影响；结果如图5C，敲除EP3明显抑制肝脏以及各组织中胆酸的水平，P121-170小肽处理可以明显增加两组小鼠肝脏及各组织中胆酸的水平，并可以消除小鼠EP3缺失对胆酸水平的抑制作用。

针对LDLR单敲除小鼠、EP3及LDLR双敲除小鼠的血液、肝脏、粪便，本发明人还检测了P121-170小肽处理小鼠对胆固醇水平的影响；结果如图5D，可见敲除EP3明显上调肝脏以及各组织中胆固醇的水平，P121-170小肽处理可以明显抑制两组小鼠肝脏及各组织中胆固醇的水平，并可以消除小鼠EP3缺失对胆固醇的上调作用。本发明人还检测了P121-170小肽处理小鼠对胆固醇在血液脂蛋白中的分布的影响；结果如图5E，可见EP3缺失血液中的胆固醇在三种脂蛋白中均有明显的上调，P121-170小肽处理可以明显降低两组小鼠血液中胆固醇在三种脂蛋白中的分布，同时P121-170小肽处理可以消除EP3缺失对血液中三种脂蛋白胆固醇的上调作用。

因此，使用P121-170小肽注射小鼠，明显增强HNF4α对靶基因CYP7A1启动子的结合，促进CYP7A1的转录，增加CYP7A1及胆酸合成其他相关基因的表达，促进胆酸的合成，降低胆固醇水平。

根据前述研究，本发明人得出P121-170小肽作用分子机制，如图5F，肝细胞中EP3的缺失会上调肝细胞中cAMP水平，进而增加PKA活性，增加PKA对核受体HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化，磷酸化的HNF4α结构发生变化，减少对靶基因CYP7A1启动子的结合，抑制CYP7A1基因的转录，进而抑制胆酸的合成，造成血液和各组织中胆固醇水平的升高。通过使用小肽P121-170抑制PKA对核受体HNF4α的结合，可以抑制PKA对HNF4α的第143位丝氨酸的磷酸化，促进CYP7A1基因的表达，增加胆酸的合成，进而降低血液和各组织中的胆固醇水平。

实施例6、药物筛选

第一步：准备表达EP3/PKA/HNF4α信号通路的细胞：小鼠肝脏原代细胞，其内源表达EP3/PKA/HNF4α信号通路中的蛋白。将该种细胞作为用于筛选治疗胆固醇代谢疾病的物质的药物的细胞模型。

第二步：药物筛选：

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定所述细胞的肝细胞核因子4α的第143位丝氨酸的磷酸化情况。如果与对照组相比，测试组中的肝细胞核因子4α的磷酸化下降20％以上，则说明该候选物质是潜在的治疗胆固醇代谢疾病的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 针对胆固醇代谢相关疾病的药物靶点及治疗药物

<130> 168436

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 融合肽

<400> 1

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Phe Arg Ala Gly Met Lys Lys

1 5 10 15

Glu Ala Val Gln Asn Glu Arg Asp Arg Ile Ser Thr Arg Arg Ser Ser

20 25 30

Tyr Glu Asp Ser Ser Leu Pro Ser Ile Asn Ala Leu Leu Gln Ala Glu

35 40 45

Val Leu Ser Gln Gln Ile Thr Ser Pro Ile Ser

50 55

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

taatgacatg gacagccagt atta 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ttgaacttgg gtgaccagag c 21

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

tcagatctca aatgtcacaa tttcagagag cccatctctg atcatcatat ctaaagttgt 60

cctcattccc ccatagcttt ctataccatg ttttattttt ttcataacat gtattttatt 120

actcctttct ccattggaat agaatctcca ttagattagg aaatctgcct atcttattaa 180

tgcctgcaac tggaatactt ttgaagagtt cttggcacgt aataaatact caactaatat 240

ttttgtgtac acagaaataa agtttggaag aacagatgcc aaattgttac tagtggttac 300

ttctgagtaa aggagtagca tggtaggtaa attattaata gatgttcact ttccaccaag 360

atatgtttta gttagtctta acttacttga aatgaaattt attactttaa taattagaaa 420

cattgataaa cattttagtc acaagaatga tagataaaat tttgatgctt ccaataagtt 480

atatttatct agaggatgca cttatgtaga atactctctt gaggatgtta ggtgagtaac 540

atgttactat atgtagtaaa atatctatga ttttataaaa gcactgaaac atgaagcagc 600

agaaatgttt ttcccagttc tctttcctct gaacttgatc accgtctctc tggcaaagca 660

cctaaattaa ttcttcttta aaagttaaca agaccaaatt ataagcttga tgaataactc 720

attcttatct ttctttaaat gattatagtt tatgtattta ttagctatgc ccatcttaaa 780

caggtttatt tgttcttttt acacatacca aactcttaat attagctgtt gtccccaggt 840

ccgaatgtta agtcaacata tatttgagag accttcaact tatcaagtat tgcaggtctc 900

tgattgcttt ggaaccactt ctgatacctg tggacttagt tcaaggccag ttactaccac 960

tttttttttt ctaatagaat gaacaaatgg ctaattgttt 1000

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 5

atatttgctg tctccccatc aaaatacaat cttcagtaga gaaactccct gtcttgttag 60

tacctgaaac cagaatatct tcaaagagtt cctggaacat aaaaatgctc aattaatatt 120

tatgttaagt agggagctgg ggtgtaaatc agcggtagag tgcttgcctt ggaggagtgg 180

ggccattggt tcaatcttca gcacaaaatg aaagattatg ctgagtaaag ttgggaaagt 240

tgtataccag tttatgagta gtataagagg taaattatga attcatattt actttgacaa 300

gaagtgttgt agtctttatt tgaaataaaa gtacatctta attacaaata aaaattggta 360

aagagtgaat tctcaagcta tggctgccta gaagatgagt gctgggaggt tttctatttc 420

gacgatagta gatagactac atgaagcacc tgtggcttta taaacacact gaacaatcaa 480

gcaaaaacaa acaaacaaag aaacaaacaa aacaaactgt tccacaccgt tcacatcctt 540

taggatcggt tgctgtatac ttctggaaat taatttaaat aattttcccc aaaggttaat 600

gacatggaca gccagtatta aagccaggat ggaaagcttc tgcctgtttt gctttacaac 660

acactccaca tctttggtag gtgagctctt ctgtagtgtg tttacttctt tttctacaca 720

cagaagcaca gtgttagctg ttgtccccag ctttgaatgt tatgtcagca catgagggac 780

agaccttcgg cttatcgact attgcagctc tctgcttgtt ctggagcctc ttctgagaag 840

atggacttag ttcaaggcca gataatgcta tttttttctt ttttcttttt tctttttttt 900

aggaggacaa atagttagtg tttgctctgg tcacccaagt tcaagttatt ggatcatggt 960

cctgtgcata tataaagcct agttagagcc acagtttctg 1000

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

tcaaggccag ttactaccac 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

cttatgtaga atactctctt ga 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 8

tatgtattta ttagctatgc cca 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 9

acacatacca aactcttaat att 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 10

tgattgcttt ggaaccactt c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 11

ttactaccac tttttttttt 20

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 12

tttgcaaatc taggccaaaa tctctg 26

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 13

atatttgctg tctccccatc aa 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 14

aaacaaacaa aacaaactgt 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 15

ctttgaatgt tatgtcagca ca 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 16

attgcagctc tctgcttgtt 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 17

aggaggacaa atagttagtg t 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 18

ggatcatggt cctgtgcata tata 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 19

tttgcaaaag caggaaaacg tcc 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> siRNA

<400> 20

ggugccaacc ucaauucaut t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> siRNA

<400> 21

gugguggaca aagacaagat t 21

<210> 22

<211> 474

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Met Arg Leu Ser Lys Thr Leu Ala Gly Met Asp Met Ala Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Ala Leu Asp Pro Ala Tyr Thr Thr Leu Glu Phe Glu Asn Val Gln

20 25 30

Val Leu Thr Met Gly Asn Asp Thr Ser Pro Ser Glu Gly Ala Asn Leu

35 40 45

Asn Ser Ser Asn Ser Leu Gly Val Ser Ala Leu Cys Ala Ile Cys Gly

50 55 60

Asp Arg Ala Thr Gly Lys His Tyr Gly Ala Ser Ser Cys Asp Gly Cys

65 70 75 80

Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val Arg Lys Asn His Met Tyr Ser Cys

85 90 95

Arg Phe Ser Arg Gln Cys Val Val Asp Lys Asp Lys Arg Asn Gln Cys

100 105 110

Arg Tyr Cys Arg Leu Lys Lys Cys Phe Arg Ala Gly Met Lys Lys Glu

115 120 125

Ala Val Gln Asn Glu Arg Asp Arg Ile Ser Thr Arg Arg Ser Ser Tyr

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Leu Pro Ser Ile Asn Ala Leu Leu Gln Ala Glu Val

145 150 155 160

Leu Ser Gln Gln Ile Thr Ser Pro Ile Ser Gly Ile Asn Gly Asp Ile

165 170 175

Arg Ala Lys Lys Ile Ala Asn Ile Thr Asp Val Cys Glu Ser Met Lys

180 185 190

Glu Gln Leu Leu Val Leu Val Glu Trp Ala Lys Tyr Ile Pro Ala Phe

195 200 205

Cys Glu Leu Leu Leu Asp Asp Gln Val Ala Leu Leu Arg Ala His Ala

210 215 220

Gly Glu His Leu Leu Leu Gly Ala Thr Lys Arg Ser Met Val Phe Lys

225 230 235 240

Asp Val Leu Leu Leu Gly Asn Asp Tyr Ile Val Pro Arg His Cys Pro

245 250 255

Glu Leu Ala Glu Met Ser Arg Val Ser Ile Arg Ile Leu Asp Glu Leu

260 265 270

Val Leu Pro Phe Gln Glu Leu Gln Ile Asp Asp Asn Glu Tyr Ala Cys

275 280 285

Leu Lys Ala Ile Ile Phe Phe Asp Pro Asp Ala Lys Gly Leu Ser Asp

290 295 300

Pro Gly Lys Ile Lys Arg Leu Arg Ser Gln Val Gln Val Ser Leu Glu

305 310 315 320

Asp Tyr Ile Asn Asp Arg Gln Tyr Asp Ser Arg Gly Arg Phe Gly Glu

325 330 335

Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr Leu Gln Ser Ile Thr Trp Gln Met Ile

340 345 350

Glu Gln Ile Gln Phe Ile Lys Leu Phe Gly Met Ala Lys Ile Asp Asn

355 360 365

Leu Leu Gln Glu Met Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ala Pro His

370 375 380

Thr His His Pro Leu His Pro His Leu Met Gln Glu His Met Gly Thr

385 390 395 400

Asn Val Ile Val Ala Asn Thr Met Pro Ser His Leu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Met Cys Glu Trp Pro Arg Pro Arg Gly Gln Ala Ala Thr Pro Glu Thr

420 425 430

Pro Gln Pro Ser Pro Pro Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Tyr Lys Leu

435 440 445

Leu Pro Gly Ala Ile Thr Thr Ile Val Lys Pro Pro Ser Ala Ile Pro

450 455 460

Gln Pro Thr Ile Thr Lys Gln Glu Ala Ile

465 470

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Gln Asn Glu Arg Asp Arg Ile Ser Thr Arg Arg Ser Ser Tyr Glu Asp

1 5 10 15

Ser Ser Leu Pro

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 短肽

<400> 24

Gln Asn Glu Arg Asp Arg Ile Ser Thr Arg Arg Ala Ser Tyr Glu Asp

1 5 10 15

Ser Ser Leu Pro

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 短肽

<400> 25

Gln Asn Glu Arg Asp Arg Ile Ser Thr Arg Arg Ser Ala Tyr Glu Asp

1 5 10 15

Ser Ser Leu Pro

20

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 短肽

<400> 26

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 27

gcagagcctc cttgatgatg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gaagcaatga aagcagcctc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 29

ttatcaaggg tggttcacga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 30

tcctaggcct tctctttgcc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 31

gataggggaa gagagccacc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 32

tcctcagggt ggtacaggag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 33

gggcactagc cagattcaca 20

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 34

ctatgtgctg cacttgccc 19

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 35

tattggcaac gagcggttcc 20

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 36

ggcatagagg tctttacgga tgt 23

Claims

1.一种分离的小肽，其特征在于，该小肽是肝细胞核因子4α的片段，包括蛋白激酶在肝细胞核因子4α的磷酸化结合域。

2.如权利要求1所述的小肽，其特征在于，该小肽包含肝细胞核因子4α的第121～170位的氨基酸序列；或

该小肽包含肝细胞核因子4α的第(121-131)～(150-170)位的氨基酸序列。

3.分离的多核苷酸，其特征在于，该分离的多核苷酸编码权利要求1或2所述的小肽。

4.一种融合肽，其特征在于，所述的融合肽包括：

穿膜肽；以及

权利要求1或2所述的小肽。

5.如权利要求4所述的融合肽，其特征在于，所述的穿膜肽包括：所述的穿膜肽是反式激活蛋白，Penetratin，polyarginine，MAP，Transportan。

6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述的穿膜肽是反式激活蛋白；更佳地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第1～9位所示。

7.分离的多核苷酸，其特征在于，该分离的多核苷酸编码权利要求4-6任一所述的融合肽。

8.权利要求1或2所述的小肽或权利要求4-6任一所述的融合肽的用途，用于制备预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物或药盒。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的胆固醇代谢疾病是与肝细胞核因子4α的143位丝氨酸磷酸化异常相关的疾病，或所述的胆固醇代谢疾病是与胆酸缺乏相关的疾病，或所述的胆固醇代谢疾病是高胆固醇相关疾病。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的胆固醇代谢疾病包括：高胆固醇血症，动脉粥样硬化，静脉血栓，黄色瘤，角膜弓。

11.一种用于预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1-2任一所述的小肽；以及食品学或药学上可接受的载体。

12.一种用于预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求4-6任一所述的融合肽；以及食品学或药学上可接受的载体。

13.一种预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药盒，其特征在于，所述的药盒含有权利要求11或12所述的组合物。

14.一种筛选预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将候选物质加入到存在蛋白激酶A和肝细胞核因子4α的体系；和

(2)检测所述体系中蛋白激酶A与肝细胞核因子4α的相互作用；

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在蛋白激酶A和肝细胞核因子4α的体系中；

步骤(2)包括：检测测试组的体系中肝细胞核因子4α的第143位丝氨酸的磷酸化情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的存在蛋白激酶A和肝细胞核因子4α的体系；

其中，若所述候选物质能抑制蛋白激酶A对肝细胞核因子4α的磷酸化，则表明该候选物质是预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的物质。

16.一种筛选预防、改善或治疗胆固醇代谢疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将候选物质加入到存在***素E2受体亚型3和肝细胞核因子4α的体系；和

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在***素E2受体亚型3和肝细胞核因子4α的体系中；

步骤(2)包括：检测测试组的体系中***素E2受体亚型3与肝细胞核因子4α的相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的存在***素E2受体亚型3和肝细胞核因子4α的体系；