CN108064305B - 可编程的溶瘤病毒疫苗***及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种表达***，***包括：有细胞特异性启动子的第一核酸分子；编码转录激活因子的第二核酸分子；有所述转录激活因子的第一识别序列的第三核酸分子；有第一启动子和第一调控元件的第四核酸分子；编码第一调控蛋白的第五核酸分子；有所述转录激活因子的第二识别序列的第六核酸分子；有第二启动子和第二调控元件的第七核酸分子；编码第二调控蛋白的第八核酸分子；以及：被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达的第九核酸分子；被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达第十核酸分子，其中，第一调控元件适于通过结合第二调控蛋白抑制第一启动子的功能，第二调控元件适于通过结合第一调控蛋白抑制第二启动子的功能。

Description

可编程的溶瘤病毒疫苗***及其应用
优先权信息
本申请请求2017年03月24日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为201710184736.2的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及表达***及其应用，更具体地，本发明涉及表达***、重组病毒、重组细胞以及表达***、重组病毒、重组细胞在制备药物中的用途，进一步地，本发明还涉及利用表达***表达目的蛋白的方法。
背景技术
溶瘤病毒是指一类具有复制与包装能力实现肿瘤杀伤作用的病毒。目前，多数研究通过改造一些自然界存在的致病力较弱的毒种，使其特异的在肿瘤细胞中表达包装继而实现溶瘤作用。利用溶瘤病毒识别肿瘤细胞的原理主要有两种：第一，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞；第二，选择利用肿瘤特异性的启动子调控病毒关键基因的表达使溶瘤病毒在肿瘤细胞内大量复制并表达毒性蛋白摧毁肿瘤细胞，并/或同时分泌细胞因子刺激自身免疫***攻击肿瘤细胞。相应的溶瘤病毒无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，因此溶瘤病毒具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了巨大进展。目前腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)、新城疫病毒等相继被改造成溶瘤病毒。2006年，溶瘤腺病毒产品(Gendicine和oncorine)在中国已经用于临床治疗，主要用于治疗头颈部肿瘤、鼻窦癌等。Gendicine和oncorine的原理类似，将人5型腺病毒E1B-55kD区删除，使该病毒可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用。但是，临床数据显示这两种基于单一p53基因突变的溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。美国生物治疗公司Jennerex的JX-594是一种经过修改的牛痘病毒。在2013年完成的二期临床试验中，发现原发性肝癌患者在注射了高剂量的病毒后，其生命延长时间的中间值可达到14.1个月，而接受低剂量注射的患者只有6.7个月的生命延长期。生物技术公司BioVex研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEX GM-CSF已于2015年10月通过了FDA的批准成为美国和欧洲首个上市的溶瘤病毒产品。OncoVex可选择性地杀灭肿瘤细胞同时表达分泌GM-CSF启动机体产生***的免疫反应杀伤剩余肿瘤细胞及其转移位点。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示50名患者中有26％对治疗有反应，有8名患者完全恢复健康。该公司于2011年被Agmen以10亿美元的价格收购，用于推进三期临床试验。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的治疗数据，临床证明它能成功地让晚期患者的肿瘤缩小，并在超过400名试验患者的III期研究中，Amgen的该药物要比同类其他药物表现得更加出色。
综合以上的研究成果可以发现，溶瘤病毒确实是***的利器，但依然存在着很多的问题。
目前已知的人体腺病毒有52种，分别命名为Adl～Ad52，研究中最常用的是Ad2。腺病毒的转录模式具有十分鲜明的特点：已知的腺病毒基因组的转录单位至少有5个：E1区位于病毒基因组左侧，可再分成E1A和E1B，与细胞转化有关；E2区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；E3区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；E4区位于Ad2基因组右端，受E2区编码的DNA结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成Ad2蛋白质Ⅳ。腺病毒基因组进入细胞核后，细胞转录因子首先与E1A区上游的增强子结合，表达E1A蛋白，该蛋白的作用是调节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制。E1A蛋白还可以激活其他早期基因(E1B、E2A、E2B、E3和E4)的启动子，其中E2B驱动另外三个与病毒复制有关的早期基因转录单位末端蛋白前体(pTP,precursor terminal protein)、单链DNA结合蛋白(ssDBP,single-stranded DNA binding proteins)以及DNA聚合酶(DNA pol,DNA polymerase)的表达，这三个基因的表达产物紧密地结合成一个复合物，与至少三种细胞蛋白相互作用，启动病毒基因组的复制。通过对腺病毒基因组和转录模式的分析，可以做出以下的改造策略：通过调控E1A的表达来调控腺病毒在靶向细胞中的表复制包装；去除一些病毒包装非必要的基因减少病毒对非靶标细胞的毒性，同时提高病毒的包装容量，如E3，E4等；替换腺病毒的外壳蛋白，改变病毒对特定细胞和组织的靶向性。
而现有的溶瘤腺病毒的研究结果显示现有的调控方式存在过于单一，特异性差，安全性低等缺陷，同时腺病毒的改造技术方法比较繁琐。所以如何设计更加严谨安全的调控***以及如何快速高效的实现溶瘤腺病毒的拼装是设计构建溶瘤腺病毒急需解决的重要问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。
基于发明人实验室的研究基础，发明人设计并构建了一个适用于腺病毒调控的可以响应不同微环境的基因线路。在此基因线路中，发明人利用了多水平的生物标志物。具体地，第一，利用特异性启动子作为调控基因线路的总开关，即利用特异性启动子调控总激活子的表达，进一步调控腺病毒E1A基因的表达。第二，利用microRNA的靶标序列来响应不同微环境的microRNA的表达特征作为调控基因线路的二级开关。第三，利用闭合基因线路搭建开关***，闭合的双向抑制型开关可以更高效的响应微环境的变化，同时有效的避免泄露。第四，移除了E1B基因，利用E1B识别P53基因的互补缺失原理进一步提高腺病毒区分肿瘤细胞和正常细胞的能力。第五，移除了E3基因，降低了溶瘤腺病毒对正常细胞的毒害作用同时提高了腺病毒载体的包装容量。
同时，2型和5型人腺病毒的基因组长度为36K，如果利用传统单一的质粒构建方式(如酶切连接等)改造腺病毒的难度很大，耗时很长。为了解决这一问题，发明人设计了针对本发明涉及的基因线路搭建的腺病毒快速构建方法：第一步构建一级元件库，将所需的元件构建到相应的质粒上。一级元件库包括三个库：抑制元件A库主要表达基因线路一侧的抑制元件，腺病毒的E1A基因和与腺病毒共表达的效应因子基因(如免疫因子或杀伤基因)；抑制元件B库主要表达基因线路另一侧的抑制基因，用于调控基因线路的有效翻转，增强开关的安全性；特异性启动子库，通过组织或肿瘤特异性的启动子调控下游基因线路的总开关。第二步，确定生物标志物和表达的效应因子，从一级元件库中挑选相应的质粒，通过GoldenGate的方法快速搭建基因线路。第三步通过Gateway的方式将基因线路整合入已经改造好的腺病毒载体上(去除E1基因，便于实现对腺病毒的人工控制；去除部分E3序列，以扩大包装容量)。
溶瘤腺病毒的另一个显著特点就是可以携带并同时表达多个基因，在本发明中，发明人同时表达了单个或多个细胞免疫相关基因：如IL-2、GM-CSF,、anti-PD-1scFv、anti-PD-L1scFv以及这些因子之间的融合蛋白等。由于携带免疫相关基因，溶瘤病毒在攻击肿瘤细胞的同时会引起***性的免疫反应，但也存在引起免疫过激反应的风险和隐患。所以携带何种免疫反应基因，以及相应的给予多大剂量的病毒治疗，以及病毒治疗的给药方式等都强烈影响溶瘤病毒的治疗效果。在本发明中,发明人尝试利用生物信息学的方法对溶瘤腺病毒感染靶向细胞的过程进行建模，研究溶瘤腺病毒杀伤肿瘤细胞的特性，尽量地提高了溶瘤腺病毒的治疗效果。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种表达***。根据本发明的实施例，所述表达***包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子含有细胞特异性启动子；第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子；第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列；第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件；第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白；第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件；第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白；以及选自下列的至少之一：第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达；第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，其中，所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能。利用根据本申请实施例的表达***，能够实现目的基因在特定细胞环境中的特异性表达，对目的基因的特异性表达实现了双向调控，调控力度大而有效，且特异性强。
根据本发明的实施例，所述表达***还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述细胞特异性启动子为肿瘤细胞特异性启动子，所述肿瘤细胞特异性启动子为选自甲胎蛋白特异性启动子，Survivin基因启动子,人端粒酶逆转录酶基因启动子,胆囊收缩素A受体基因启动子，癌胚抗原启动子，原癌基因人类表皮生长因子受体2启动子，***素内氧化酶还原酶2启动子，趋化因子受体-4，E2F-1基因启动子，黏蛋白启动子，***特异抗原，人酪氨酸酶相关蛋白1，酪氨酸酶启动子至少之一。在上述肿瘤细胞特异性启动子的调控下，本申请实施例的表达***能够在特异肿瘤细胞的微环境中启动，表达***对基因表达调控的特异性进一步增强。
根据本发明的实施例，所述转录激活因子为选自Gal4VP16、Gal4VP64、Gal4esn、dCas9-VP16、dCas9-VP64、dCas9-VPR、dCas9-VTR以及rtTA至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一识别序列与所述第二识别序列分别独立地选自5×UAS,7×tetO和dCas9的靶标序列至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一启动子与所述第二启动子分别独立地选自miniCMV、TATA box。
根据本发明的实施例，所述第一调控蛋白和第二调控蛋白分别独立地选自Lacl、tetR、zinc finger(锌指)、KRAB、tetR-KRAB、dCas9-KRAB至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一调控元件和所述第二调控元件分别独立地选自tetO、LacO、锌指蛋白目的序列(zinc finger target site)以及dCas9的靶标序列至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一调控蛋白是LacI，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游。LacI表达后，可特异性结合LacO序列，进而抑制第二启动子的功能。根据本发明的实施案例的LacI/LacO抑制***，通过实验表明该***可以有效地抑制启动子下游基因的表达。
根据本发明的实施例，所述第二调控蛋白是tetR-KRAB所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游。根据本发明的实施案例的tetR-KRAB/tetO抑制***，可以有效的抑制启动子下游基因的表达。
根据本发明的实施例，所述第五核酸分子和第九核酸分子的至少之一进一步包括编码目的蛋白的序列。利用根据本申请实施例的表达***，可实现目的蛋白在特异细胞微环境中的特异性表达，实现了对目的蛋白表达的双向调控。根据本发明的具体实施例，本申请所述的表达***对目的蛋白的表达调控的特异性和力度均显著提高。
根据本发明的实施例，所述第五核酸分子包括编码所述目的蛋白的序列，并且所述目的蛋白包括选自病毒复制包装蛋白、免疫效应因子的至少之一。任选地，所述病毒复制包装蛋白、免疫效应因子可以以融合蛋白的形式存在。病毒复制包装蛋白可有效保证表达***载体在宿主中的存活和复制；免疫效应因子的表达可有效激活机体的免疫***，进而促进对肿瘤细胞等特异性细胞的免疫杀伤。
根据本发明的实施例，所述病毒复制包装相关蛋白包括选自腺病毒E1基因,E1A基因，E1B基因，E2基因，E4基因至少之一。
根据本发明的实施例，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因的抑制序列、拮抗PD-L1基因的抑制序列、拮抗CTLA4基因的抑制序列、拮抗Tim-3基因的抑制序列、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15至少之一。任选地，上述的免疫效应因子可以以融合蛋白的形式存在。
根据本发明的实施例，所述目标蛋白与所述第一调控蛋白是以融合蛋白的形式表达的，并且所述目标蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的。目标蛋白与第一调控蛋白在相同启动子下被调控表达，其表达后在连接肽处被切割，目标蛋白与第一调控蛋白分开，目标蛋白和第一调控蛋白相互独立地发挥功能。
根据本发明的实施例，所述第九核酸分子与所述第十核酸分子分别独立地通过下列方式抑制所述第一调控蛋白或所述第二调控蛋白的表达：借助RNA干扰。其中，microRNA为不同细胞微环境表达的特异性microRNA，第九或第十核酸分子为microRNA的特异性靶标序列，进而通过RNA干扰(RNAi),可实现在特异性微环境中表达的microRNA对靶标序列的特异性作用，进而实现对第一调控蛋白或第二调控蛋白表达的特异性调控。根据本发明的实施例，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA，所述第二microRNA为异常细胞特异性microRNA。进而，第一调控蛋白在异常细胞中表达，在正常细胞中不表达或低表达，而第二调控蛋白在正常细胞中表达，在异常细胞中不表达或低表达。
根据本发明具体的实施例，所述第一microRNA包括选自下列的至少之一：miR199a、miR95、miR125、miR125b、Let-7、miR143、miR145以及miR200C。上述microRNA在正常肝细胞中高表达。
根据本发明的具体示例，所述第二microRNA包括选自下列的至少之一：miR21、miR223、miR224、miR221、miR18、miR214、miR146a以及miR1792。上述第二microRNA为肝癌细胞(HepG2、Huh7、PLC)特异性表达的microRNA。进而，第一调控蛋白在肝癌细胞中表达，在正常细胞中不表达或低表达，而第二调控蛋白在正常细胞中表达，在肝癌细胞中不表达或低表达。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子负载在第一表达载体上，所述第三核酸分子、所述第四核酸分子、所述第五核酸分子以及可选的所述第九核酸分子负载在第二表达载体上，所述第六核酸分子、所述第七核酸分子、所述第八核酸分子以及可选的所述第十核酸分子负载在第三表达载体上。第一、第二和第三表达载体作为表达***的负载载体，在适宜的微环境，如细胞中，实现对目的基因的特异性表达的调控。
所述表达载体的选择不受特别限制，只要能够实现表达***在适宜微环境中的功能的发挥即可。根据本发明的具体实施例，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体分别独立地选自下列的至少之一：
质粒、病毒、稳定细胞系以及其他材料载体如纳米材料，脂质体，分子耦联载体、裸露DNA、染色体载体、多聚物。
根据本发明的实施例，所述病毒包括选自腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒的至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体构建负载在同一个载体上。需要说明的是，第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体的连接顺序不受特别限制，只要不影响***的生物学功能的实现即可。根据本发明的具体实施例，负载在同一表达载体上可以有效的解决多个大片段载体共转染效率极低的问题。
根据本发明的实施例，所述同一个载体为腺病毒载体。腺病毒作为基因治疗载体具有主范围广,对人致病性低、在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因、滴度高、与人类基因同源、无***致突变性、能在悬浮培养液中扩增、能同时表达多个基因的优点。
根据本发明的具体实施例，所述第一表达载体包括：从5’端到3’端依次为BsaI，AFP III，Gal4VP16以及BsaI(BsaI-AFP III-Gal4VP16-BsaI)。
根据本发明的实施例，所述第一表达载体携带具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸。
GGTCTCTGCTCCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAAGGATCCGGCCACCATGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGTCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGACGCGTATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCGGAGAAAGAGGTAATTTAATTAAGTCGATGAGACC(SEQ ID NO：1)。
根据本发明的具体实施例，所述第二表达载体包括：从5’到3’依次为BsaI，5×UAS，tetO，miniCMV，tetO，E1A，2A，免疫效应因子(Effector)，LacI，microRNA199a特异识别序列(target site)以及BsaI(BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-Effector-LacI-miR199a target site-BsaI)。根据本发明的具体示例，effector具体指IL-2、hGM-CSF、mGM-CSF、anti-PD-1scFv、anti-PD-L1scFv、IL-2融合anti-PD-1scfv、hGM-CSF融合anti-PD-1scfv、mGM-CSF融合anti-PD-1scfv、IL-2融合anti-PD-L1scfv、hGM-CSF融合anti-PD-L1scfv、mGM-CSF融合anti-PD-L1scfv。
根据本发明的实施例，所述第二表达载体携带具有SEQ ID NO：2～7任一项所示核苷酸序列的核酸。
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGGGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGAGCCACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCGTCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACATCTATATCATGGCCGTCAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACGTGGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAGCCACTACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCCGCACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO：2)。
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCACCGGTCACCATGGATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCGCGATGCTCACAGCTAAGTTTGCCATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGCACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO：3)。
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCACCATGGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO：4)。
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCACCATGGATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO：5)。
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCTCGCTGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGGAGCCTGAGGCTGGACTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAACAGCGGCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAAGAGGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGGGCCACCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAGCAACTGGCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ IDNO：6)。
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCTCGCTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACAGCTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTGGATCAGCCCCTACGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCACTGGCCCGGCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACCTGTACCACCCCGCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO：7)。
其中，SEQ ID NO：2BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-EBFP-2A-LacI-miR199a target site-BsaI的序列；
SEQ ID NO：3是BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-hIL-2-2A-LacI-miR199a target site-BsaI的序列；
SEQ ID NO：4是BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-hGM-CSF-2A-LacI-miR199a target site-BsaI的序列；
SEQ ID NO：5是BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-mGM-CSF-2A-LacI-miR199a target site-BsaI的序列；
SEQ ID NO：6是BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-anti-PD-1scFv-2A-LacI-miR199a target site-BsaI的序列；
SEQ ID NO：7是BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-anti-PD-L1scFv-2A-LacI-miR199a target site-BsaI的序列。
根据本发明的具体实施例，所述第三表达载体包括：从5’到3’依次为BsaI，5×UAS，LacO，miniCMV，LacO，tetR-KRAB，microRNA21特异识别序列(target site)以及BsaI，(BsaI-5×UAS-LacO-miniCMV-LacO-tetR-KRAB,-microRNA21target site-BsaI)。
根据本发明的实施例，所述第三表达载体携带具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的核酸。
GGTCTCCGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCAGCTCTGAGACC(SEQ ID NO：8)
根据本发明的具体实施例，所述腺病毒包括：从5’到3’依次是第一反向末端重复序列(inverted terminal repeat ITR)，包装信号(package signal)，AFPIII，Gal4VP16，5×UAS，tetO，miniCMV，tetO，E1A，2A，Effector，2A，LacI，miR199a target site，5×UAS，LacO，miniCMV，LacO，tetR-KRAB，miR21target site,腺病毒E2基因区，E3基因区(去除了28922-30801区域)，E4基因区，第二反向末端重复序列(ITR)。发明人将上述腺病毒注入肿瘤小鼠模型，可显著抑制小鼠肿瘤的生长。上述腺病毒可作为一种安全有效的溶瘤病毒疫苗，实现对相关肿瘤的安全有效地特异性杀伤。
根据本发明的实施例，所述腺病毒载体携带具有SEQ ID NO：9～14所示核苷酸序列的核酸。
GTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGGGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGAGCCACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCGTCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACATCTATATCATGGCCGTCAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACGTGGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAGCCACTACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCCGCACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGT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ID NO：9)。
GTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCGCGATGCTCACAGCTAAGTTTGCCATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGCACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCAGCTCCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTAC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ID NO：12)。
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IDNO：13)。
GTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCTCGCTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACAGCTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTGGATCAGCCCCTACGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCACTGGCCCGGCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACCTGTACCACCCCGCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTG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ID NO：14)。
其中，SEQ ID NO：9是腺病毒载体携带的带有EBFP的核酸的序列；
SEQ ID NO：10是腺病毒载体携带的带有hIL-2的核酸的序列；
SEQ ID NO：11是腺病毒载体携带的带有hGMCSF的核酸的序列；
SEQ ID NO：12是腺病毒载体携带的带有mGMCSF的核酸的序列；
SEQ ID NO：13是腺病毒载体携带的带有anti-PD-1scFv的核酸的序列；
SEQ ID NO：14是腺病毒载体携带的带有anti-PD-L1scFv的核酸的序列。
根据本发明的实施例，所述腺病毒是通过如下方式获得的：所述的腺病毒载体去除了与腺病毒复制包装相关的E1基因和部分E3基因，E1A基因通过逐级Golden Gate的方法构建到基因线路中，最终通过Gateway或Gibson的方式将逻辑线路***到腺病毒载体中。上述获得腺病毒的方式实现了复杂、大片段溶瘤腺病毒载体的快速改造。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组病毒。根据本发明的实施例，所述重组病毒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子含有肿瘤细胞特异性启动子，所述肿瘤细胞特异性启动子为甲胎蛋白特异性启动子；第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子，所述转录激活因子为Gal4VP16；第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列，所述第一识别序列为5×UAS；第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件，所述第一启动子为miniCMV，所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游；第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白，所述第一调控蛋白为LacI，所述第五核酸分子进一步包括编码所述目的蛋白的序列，并且所述目的蛋白包括病毒复制蛋白、免疫效应因子，所述免疫效应因子是以单独或融合蛋白的形式表达的，并且所述复制蛋白与效应因子之间通过可切割的连接肽连接的，所述目标蛋白与所述第一调控蛋白是以融合蛋白的形式表达的，并且所述目标蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的；第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列，所述第二识别序列为5×UAS；第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件，所述第二启动子为miniCMV，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游；第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白,所述第二调控蛋白为tetR-KRAB；第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA；以及第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，所述第二microRNA为肿瘤细胞特异性microRNA，其中，所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能。利用根据本申请实施例的重组病毒，在甲胎蛋白特异性启动子和第九核酸分子、第十核酸分子的共同调控下，第一调控蛋白LacI、目标蛋白在肿瘤细胞中特异性表达，第二调控蛋白tetR-KRAB在肿瘤细胞中特异性不表达或低表达，进而tetR-KRAB介导的第一启动子miniCMV的抑制机制解除，第一调控蛋白LacI、目标蛋白在第一启动子miniCMV的启动调控下有效表达，LacI介导的抑制机制有效抑制了第二启动子miniCMV的功能，tetR-KRAB的表达进一步受到抑制。进而，利用根据本发明实施例的重组病毒，可实现蛋白在肿瘤细胞中更加特异性的表达(如目标蛋白LacI)或不表达(如tetR-KRAB)，在肿瘤细胞中的表达或不表达效率和特异性高。
根据本发明的实施例，上述重组病毒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组病毒为选自逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒的至少之一。
根据本发明的实施例，所述重组病毒为腺病毒。如前所述，腺病毒作为基因治疗载体具有宿主范围广,对人致病性低、在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因、滴度高、与人类基因同源、无***致突变性、能在悬浮培养液中扩增、能同时表达多个基因的优点。
根据本发明的实施例，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因的抑制序列、拮抗PD-L1基因的抑制序列、拮抗CTLA4基因的抑制序列、拮抗Tim-3基因的抑制序列、IL-2、IL-15、IL-12、GM-CSF至少之一。任选地，所述免疫效应因子可以以融合蛋白的形式存在。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前面所述的表达***。根据本发明实施例的重组细胞可有效激活人体的***性的免疫反应，攻击异种细胞，如肿瘤细胞，安全性高，特异性强。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达***的至少一部分整合于所述重组细胞的基因组中。表达***随着重组细胞基因组的复制而复制，表达***对目的蛋白的表达调控持续而有效。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的表达***、前面所述的重组病毒、前面所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。本申请所述的表达***能够实现目的蛋白在肿瘤细胞中特异性表达，根据本申请实施例的药物对癌症的治疗效果更加有效、特异性更强、安全性更高。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述癌症包括肝癌、肺癌、结直肠癌，黑色素瘤、乳腺癌或***癌。发明人发现，根据本发明实施例的药物对肝癌、肺癌、结直肠癌，黑色素瘤、乳腺癌或***癌的治疗效果更加显著。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种利用表达***表达目的蛋白的方法，所述表达***为前面所述的表达***。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)使所述第五核酸分子包含编码所述目的蛋白的核酸序列；(2)使所述第十核酸分子抑制所述第二调控蛋白的表达，以便表达所述目的蛋白。利用根据本发明实施例的上述表达目的蛋白的方法，第二调控蛋白介导的对第一启动子的抑制机制解除，目的蛋白在细胞特异性启动子和第一启动子的共同作用下，在特异细胞中高效表达。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达是在细胞中进行的。细胞可以提供目的蛋白表达的微环境，目的蛋白在细胞中的表达更加高效。
根据本发明的实施例，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，在步骤(2)中包括使所述第二microRNA与所述第十核酸分子接触。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种利用表达***表达目的蛋白的方法，所述表达***为前面所述的表达***。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)使所述第八核酸分子包含编码第一目的蛋白的核酸序列，使所述第五核酸分子包含编码第二目的蛋白的核酸序列；(2)通过下列之一表达所述第一目的蛋白或所述第二目的蛋白：使所述第九核酸分子抑制所述第一调控蛋白的表达，以便表达所述第一目的蛋白；使所述第十核酸分子抑制所述第二调控蛋白的表达，以便表达所述第二目的蛋白。利用根据本发明实施例的上述表达目的蛋白的方法，第二调控蛋白介导的对第一启动子的抑制机制解除，第二目的蛋白在细胞特异性启动子和第一启动子的共同作用下，在特异细胞中高效表达或第一调控蛋白介导的对第二启动子的抑制机制解除，第一目的蛋白在细胞特异性启动子和第二启动子的共同作用下，在特异细胞中高效表达。
需要说明的是，本申请所述的融合蛋白是指在同一启动子调控下共转录的蛋白，包括蛋白间无连接的融合蛋白，或以其他连接肽(如GGGS或2A序列)连接的融合蛋白。
附图说明
图1Gateway***腺病毒原始结构示意图；
图2Golden Gate***腺病毒原始结构示意图；
图3是根据本发明实施例的双抑制型开关***；
图4是根据本发明实施例的利用荧光定量PCR的方法检测hAFP基因在细胞系Chang、HepG2、Huh7、Hep3B、PLC和Hepa1-6中的表达水平；
图5是根据本发明实施例的改造人的AFP基因的启动子；
图6是根据本发明实施例的将改造后的AFP启动子的报告***瞬转到Chang和HepG2；
图7是根据本发明实施例的microRNA检测***示意图；
图8是根据本发明实施例的microRNA标志物在不同细胞系中存在显著地差异表达；
图9是根据本发明实施例的基于LacI和tetR-KRAB基因的双抑制开关示意图；
图10是根据本发明实施例的双抑制开关响应人工合成的shRNA信号实现有效翻转；
图11A～图11D是根据本发明实施例的双抑制型开关有效响应各种激活因子；
图12是根据本发明实施例的CGGA(Cascade Golden-Gate and Gateway/GibsonAssemble method)第一步；
图13是根据本发明实施例的CGGA(Cascade Golden-Gate and Gateway/GibsonAssemble method)第二步；
图14是根据本发明实施例的CGGA(Cascade Golden-Gate and Gateway/GibsonAssemble method)第三步；
图15a～图15c是根据本发明实施例的细胞水平检测病毒作用；
图16是根据本发明实施例的体外检测细胞因子活性(质粒载体表达细胞因子)；
图17a～图17c是根据本发明实施例的体外检测细胞因子活性(病毒载体表达细胞因子)；
图18a～图18d是根据本发明实施例的利用溶瘤腺病毒治疗荷载HepG2，Huh7和Hepa1-6的裸鼠模型；
图19a～图19i是根据本发明实施例的利用溶瘤腺病毒治疗荷载Hepa1-6的C57小鼠模型；
图20a～图20b是根据本发明实施例的溶瘤病毒治疗促进肿瘤浸润的T细胞γ干扰素和Ki67标志物的表达；
图21是根据本发明实施例的小鼠肝癌细胞Hepa1-6对治疗后小鼠再接种的挑战实验；
图22是根据本发明实施例的肿瘤-病毒-免疫***模型；
图23是根据本发明实施例的肿瘤-病毒***仿真不同初始肿瘤大小、初始病毒滴度与病毒复制速度条件下最小肿瘤体积在不同的初始病毒滴度与初始肿瘤大小条件下，病毒复制速度较低与较高时，肿瘤-病毒***随时间变化至终状态的过程中，肿瘤体积的最小值的变化情况；以及
图24是根据本发明实施例的肿瘤-病毒-免疫***仿真免疫细胞对肿瘤与病毒不同的抑制作用强度影响下终状态肿瘤体积。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
表达***
在本发明的第一方面，本发明提出了一种表达***。根据本发明的实施例，所述表达***包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子含有细胞特异性启动子；第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子；第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列；第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件；第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白；第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件；第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白；以及选自下列的至少之一：第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达；第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，其中，所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能。利用根据本申请实施例的表达***，能够实现目的基因在特定细胞环境中的特异性表达，对目的基因的特异性表达实现了双向调控，调控力度大而有效，且特异性强。
根据本发明的实施例，所述细胞特异性启动子为肿瘤细胞特异性启动子，所述肿瘤细胞特异性启动子为选自甲胎蛋白特异性启动子(AFP)，Survivin基因启动子(SUR),人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子,胆囊收缩素A受体基因启动子(CCKAR promoter)，癌胚抗原启动子(CEA promoter)，原癌基因人类表皮生长因子受体2启动子(humanepidermal growth factor receptor-2,HER2)，***素内氧化酶还原酶2启动子(Cyclooxygenase2,COX2)，趋化因子受体-4(chemokine receptor-4,CXCR4)，E2F-1基因启动子(E2F-1promoter)，黏蛋白启动子(Mucin1MUC1)，***特异抗原(Prostate-specificantigen PSA)，人酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosine related protein1TRP1)，酪氨酸酶启动子(tyrosinase Tyr promoter)至少之一。在上述肿瘤细胞特异性启动子的调控下，本申请实施例的表达***能够在特异肿瘤细胞的微环境中启动，表达***对基因表达调控的特异性进一步增强。
根据本发明的实施例，所述转录激活因子为选自Gal4VP16、Gal4esn、Gal4VP64、dCas9-VP16、dCas9-VP64、dCas9-VPR、dCas9-VTR以及rtTA至少之一。酵母Gal4-UAS基因表达***是目前了解最透彻的真核细胞转录调节***之一，Gal4基因在酵母(Saccharomycescerevisiae)中编码转录激活蛋白。Gal4能识别基因启动子的上游激活序列(UAS)的17bp长的一段序列：5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'(R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示任意脱氧核苷酸)。Gal4与Gal80作用，GAL80可结合半乳糖代谢产物。Gal4具有两个结构域：DNA结合结构域(N末端结构域)和激活结构域(C末端结构域)。其具有一个锌簇结构域(Zinc cluster)，具体为Zn(2)-Cys(6)双核簇结构域。其起作用的形式常为同源二聚体。UAS序列中与GAL4蛋白结合的核心序列是一段4个拷贝串联的重复序列，每个拷贝包含17个碱基对，序列5‘-CGGAGTACTGTCGTGGG-3’。Gal4存在于哺乳动物细胞内，并且只有在识别UAS时才能激活目标基因，启动下游基因转录，具有良好的特异性和可诱导性。Gal4的蛋白激活域可以替换为单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域或者4个拷贝的VP16即VP64，这样形成的融合转录因子在保持Gal4蛋白结合特异性的同时增加了Gal4蛋白的转录激活活性。四环素诱导***是源于细菌的用于真核细胞转录激活***。包括四环素响应元件和四环素诱导蛋白。四环素响应元件(Tet Response Element TRE)包含7个重复的19个核苷酸的四环素操纵子序列5’-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3’，可以被四环素诱导蛋白识别。四环素诱导***包括四环素诱导抑制***和四环素诱导激活***。四环素诱导抑制***包含四环素响应元件和四环素抑制子(tetracycline repressor tetR),当没有四环素不存在时，抑制子与响应元件结合激活下有基因的表达；当有四环素存在时，抑制子与四环素结合，下游基因的表达被抑制。四环素诱导激活***包含四环素响应元件和反向四环素调控的顺式激活子(reversetetracycline-controlled trans a ctivator rtTA)。当四环素不存在时，rtTA无法与TRE元件结合，无法激活下游基因表达；当有四环素存在时，rtTA与TRE在四环素的作用结合，激活下游基因的表达。
dCas9(nuclease deactivated Cas9)是Cas9的突变体形式，可以在gRNA介导下识别靶标序列，但dCas9没有对靶标序列的切割活性，只有特异识别结合DNA的活性。dCas9可以与多种激活元件融合表达时，可以有效激活靶标基因的表达。
根据本发明的实施例，所述第一识别序列与所述第二识别序列分别独立地选自5×UAS、7×tetO以及dCas9的靶标序列至少之一。5×UAS是5个拷贝的Gal4VP16调控***的响应元件。UAS序列中与Gal4蛋白结合的核心序列是一段4个拷贝串联的重复序列，每个拷贝包含17个碱基对，序列为5‘-CGGAGTACTGTCGTGGG-3’。7×tetO是7个拷贝的TRE是四环素调控***的响应元件的识别序列。四环素响应元件(Tet Response Element TRE)包含7个重复的19个核苷酸的四环素操纵子序列5’-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3’，可以被四环素诱导蛋白识别。
根据本发明的实施例，所述第一启动子与所述第二启动子为miniCMV。5×UAS-miniCMV是一种合成的诱导型启动子。5×UAS是Gal4蛋白的识别序列，miniCMV是巨细胞病毒(Cytomegalovirus)启动子的部分序列。TRE也是一种诱导型启动子。7×tetO-miniCMV,tetO是四环素***的响应元件的识别序列。
根据本发明的实施例，所述第一调控蛋白和第二调控蛋白分别独立地选自LacI，tetR,zinc finger(锌指),KRAB、dCas9-KRAB至少之一。乳糖抑制子(Lactose repressor，LacI)通过自身DNA结合结构域的螺旋-转角-螺旋元件识别特异序列的方式与乳糖操纵子(Lactose operon LacO)的大沟结合，同时通过对称性相关的α-螺旋残基与LacO小沟的碱基序列紧密相连。这种紧密结合使RNA聚合酶高亲和性的结合在启动子区无法进入延伸状态，从而阻止mRNA转录和下游基因的表达。四环素抑制子(tetracycline repressor tetR)TetR含有保守的螺旋-转角-螺旋DNA结合区域(形成同型二聚体)，结合在四环素操纵子(tetracycline operon tetO)上，抑制下游基因的转录表达。Zinc finger锌指蛋白，由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2+构成，形成的结构像手指状。锌指蛋白是一类，对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要分为C2H2型、C4型和C6型。锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA－RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以及胚胎发育KRAB区域(The Krüppel associated box(KRAB)domain)是一类在人类近400锌指蛋白中存在的转录抑制区域。KRAB一般由75个氨基酸残基组成，最小的抑制有效区由45个氨基酸组成。它通过蛋白间以两亲性螺旋连接的方式发挥功能。可以被分成A、B两个区域,它们由不同的外显子编码而来,其中A box在转录抑制中起着核心作用,Bbox对A box的转录抑制功能起加强作用。
dCas9(nuclease deactivated Cas9)是Cas9的突变体形式，可以在gRNA介导下识别靶标序列，但dCas9没有对靶标序列的切割活性，只有特异识别结合DNA的活性。当dCas9与抑制型区域如何表达时可以有效地抑制靶标基因的表达。
根据本发明的实施例，所述第一调控元件和所述第二调控元件分别独立地选自tetO、LacO、锌指蛋白目的序列(zinc finger target site)、dCas9的靶标序列至少之一。tetO(tetracycline operon tetO)四环素操纵子，可以被四环素抑制子识别抑制下游基因的表达。LacO(Lactose operon LacO)乳糖操纵子，可以被乳糖抑制子(Lactose repressorLacI)识别抑制下游基因的表达。锌指蛋白目的序列(zinc finger target site)可以被锌指蛋白识别调控下游基因的表达。dCas9靶标序列可以被dCas9-KRAB在互补gRNA的协助下识别并抑制下游基因的表达。
根据本发明的实施例，所述第一调控蛋白是LacI，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游。LacI表达后，可特异性结合LacO序列，进而抑制第二启动子的功能。根据本发明的实施案例的LacI/LacO抑制***，乳糖抑制子(Lactose repressor LacI)通过自身DNA结合结构域的螺旋-转角-螺旋元件识别特异序列的方式与乳糖操纵子(Lactose operon LacO)的大沟结合，同时通过对称性相关的α-螺旋残基与LacO小沟的碱基序列紧密相连。这种紧密结合使RNA聚合酶高亲和性的结合在启动子区无法进入延伸状态，从而阻止mRNA转录和下游基因的表达。根据本发明的实施例，发明人将LacO构建在5×UAS-miniCMV启动子的miniCMV序列的两侧，通过实验表明该***可以有效地抑制启动子下游基因的表达。但在此位置发明人并不排除使用其它抑制***。
根据本发明的实施例，所述第二调控蛋白是tetR-KRAB，所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游。本发明的实施案例选用的抑制***为tetR-KRAB/tetO***，四环素抑制子(tetracyclinerepressor tetR)TetR含有保守的螺旋-转角-螺旋DNA结合区域(形成同型二聚体)，结合在四环素操纵子(tetracycline operon tetO)上，抑制下游基因的转录表达。在本实施案例中，发明人将tetO构建在5×UAS-miniCMV启动子的miniCMV序列的两侧，通过实验表明该***可以有效的抑制启动子下游基因的表达。第一调控蛋白和第二调控蛋白组成的开关***可以有效地相应输入信号，有效的区分不同细胞系。但在此处发明人并不排除使用其他抑制***。
根据本发明的实施例，所述第五核酸分子和第九核酸分子的至少之一进一步包括编码目的蛋白的序列。利用根据本申请实施例的表达***，可实现目的蛋白在特异细胞微环境中的特异性表达，实现了对目的蛋白表达的双向调控。根据本发明的具体实施例，本申请所述的表达***对目的蛋白的表达调控的特异性和力度均显著提高。
根据本发明的实施例，所述第五核酸分子包括编码所述目的蛋白的序列，并且所述目的蛋白包括选自病毒复制包装蛋白、免疫效应因子的至少之一。病毒复制包装蛋白可有效保证表达***载体在宿主中的存活和复制；免疫效应因子的表达可有效激活机体的免疫***，进而促进对肿瘤细胞等特异性细胞的免疫杀伤。
根据本发明的实施例，所述病毒复制包装相关蛋白包括选自腺病毒E1基因,E1A基因，E1B基因，E2基因，E4基因至少之一。按转录时间的先后，腺病毒基因主要分为早期表达基因(E1～4)和晚期表达基因(L1～5)。腺病毒基因组进入细胞核后，细胞转录因子首先与E1A区上游的增强子结合，表达E1A蛋白，该蛋白的作用是调节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制。E1A蛋白还可以激活其他早期基因(E1B、E2A、E2B、E3和E4)的启动子，其中E2B驱动另外三个与病毒复制有关的早期基因转录单位末端蛋白前体(pTP,precursorterminal protein)、单链DNA结合蛋白(ssDBP,single-stranded DNA binding proteins)以及DNA聚合酶(DNA pol,DNA polymerase)的表达，这三个基因的表达产物紧密地结合成一个复合物，与至少三种细胞蛋白相互作用，启动病毒基因组的复制。E1区基因表达产物分为E1A和E1B。E1A主要由两种成分构成，289R(或13S)和243R(或12S)。E1A蛋白的主要功能是调节细胞代谢，使细胞对病毒复制更易感。E1B19K与细胞Bcl-2基因的表达产物同源，可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死。E1B55K基因产物可以下调p53基因的转录水平，其他腺病毒基因(如E4或f6)也参与了这一过程。E1B55K基因产物还与病毒复制、病毒晚期mRNA的转录以及病毒RNA的转运有关。E2区基因表达产物分为E2A和E2B。其中，E2A即DNA结合蛋白(DBP，DNA Binding Protein)；E2B主要产物有两种，分别是末端蛋白前体(pTP)和病毒DNA聚合酶(pol)。三种蛋白与至少三种细胞内的因子相互作用，启动腺病毒DNA复制以及病毒晚期基因的转录和翻译过程。E4区的基因产物通常被称为orf 1～6/7，主要与病毒信使RNA的代谢有关。还有促进病毒DNA复制以及关闭宿主蛋白合成的功能。研究发现，一些E4产物可以与DNA激活的蛋白激酶结合，防止病毒DNA发生串联。由于该激酶可以激活p53基因，因此可以认为一些E4区基因产物可以抑制细胞凋亡。许多E1B和E4基因产物都与拮抗E1A蛋白功能有关。比如，E4抑制E1A对E2F启动子的激活。
根据本发明的实施例，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因的抑制序列、拮抗PD-L1基因的抑制序列、拮抗CTLA4基因的抑制序列、拮抗Tim-3基因的抑制序列、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15至少之一或者这些因子的融合表达形式。其中，PD-1(programmeddeath1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。为CD28超家族成员,其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1是T细胞表面的重要抑制分子，其胞内段含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM和一个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)。ITSM介导了蛋白酪氨酸磷酸酶家族磷酸酶的募集以及对T细胞活化信号的抑制，其配体为PD-L1和PD-L2主要在免疫***效应期的肿瘤微环境中发挥抑制T细胞活化的重要作用。细胞程式死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)也称为表面抗原分化簇274(cluster ofdifferentiation 274，CD274)或B7同源体(B7homolog 1，B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PD-L1在多种肿瘤细胞和肿瘤细胞微环境中造血细胞中有诱导性表达。其表达水平与某些肿瘤的恶性程度呈正相关。PD-1抗体与PD-L1抗体可以阻断PD-1与PD-L1的结合，组织肿瘤细胞通过PD-1/PD-L1通路进行免疫逃逸。CTLA-4的全称叫做细胞毒性T细胞相关蛋白-4(Cytotoxic T lymphocyte associate protein-4)，它是T细胞表面表达的一类共刺激分子(co-stimulatory molecule)。与CD28的功能类似，在T细胞激活过程中，CTLA-4能够与APC表面的CD80/CD86特异性结合来激活下游信号。研究发现，T细胞中主要表达CTLA-4的细胞为调节性T细胞(Treg)，一类可以负向调节细胞免疫的T细胞；在缺失CTLA-4受体时，小鼠表现出T细胞过度活化伴随严重的自身免疫病。以上结果可以得出，Treg需要通过CTLA-4行使其功能。另外，CTLA-4也在conT细胞中有表达，其作用是抑制T细胞激活的信号传递。T细胞免疫球蛋白以及黏蛋白结构与分子(T cell immunoglobulinand mucin-domain containing molecule,TIM)基因家族是Mclntire在2001年寻找小鼠哮喘病易感基因的研究时发现并通过基因组分析及克隆定位鉴定的新的基因家族，该家族基因结构含有免疫球蛋白V区和黏蛋白区。Tim-3是TIM家族中的重要成员，表达在活化的Th1细胞表面的负向调节分子。目前在CD8+T细胞、Th17细胞、Treg、NK细胞和其他淋巴细胞亚群也发现了TIM3的表达。GM-CSF(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是一种由巨噬细胞，T细胞，NK细胞等分泌的单体糖蛋白细胞因子，GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞和单核细胞)。GM-CSF也会影响免疫***中的成熟细胞如抑制中性粒细胞的转移，改变细胞表面的受体表达。该因子还可以通过激活巨噬细胞抑制真菌的感染。IL-2(interleukin 2)白细胞介素2能介导白细胞与白细胞之间以及白细胞与其他细胞之间相互作用的细胞因子。IL-2主要由活化的T细胞产生，以自分泌与旁分泌的方式作用于局部的靶细胞，是参与免疫应答的主要细胞因子，具有明显的免疫效应。可促进T细胞增殖以及产生细胞因子，促进B细胞增值和分泌Ig,激活巨噬细胞，增强NK细胞活化和增殖等。此外，IL-2亦具有负向调节作用，可诱导Ag活化的T细胞发生凋亡，限制免疫应答的强度，避免发生明显的免疫损伤。白细胞介素IL-12(interlukin-12)是一种由树突状细胞，巨噬细胞、中性粒细胞、人B淋巴母细胞(nc-37)在响应抗原刺激的条件下产生的白细胞介素。IL-12被称为T细胞刺激因子，参与了原初细胞向Th1的分化过程，刺激干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生。IL-12在调节自然杀伤细胞和T淋巴细胞的活性中起重要作用。IL-12介导NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性增强。IL-12也具有抗血管生成活性，这意味着它可以阻断新生血管的形成。它通过增加γ-干扰素的生产增加诱导蛋白10(IP-10或CXCL10)。IP-10然后介导的抗血管生成作用。由于其能够诱导免疫应答和抗血管生成活性，人们一直在测试IL-12作为一种可能的抗癌药物的。IL-15是新近发现的一种因子，可由活化的单核－巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。IL-15的分子结构与IL-2有许多相似之外，因此可以利用IL-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性。IL-15可诱导B细胞增殖和分化，是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子；IL-15能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ。
根据本发明的实施例，所述目标蛋白与所述第一调控蛋白是在同一启动子的调控下共表达的，并且所述目标蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的。目标蛋白与第一调控蛋白在相同启动子下被调控表达，其表达后在连接肽处被切割，目标蛋白与第一调控蛋白分开，目标蛋白和第一调控蛋白相互独立地发挥功能。
根据本发明的实施例，所述第九核酸分子与所述第十核酸分子分别独立地通过下列方式抑制所述第一调控蛋白或所述第二调控蛋白的表达：第九与第十核酸分子通过RNA干扰的方式抑制第一和第二调控蛋白的表达，其中，microRNA为不同细胞微环境表达的特异性microRNA，第九或第十核酸分子为microRNA的特异性靶标序列，进而通过RNA干扰的方式,可实现在特异性微环境中表达的microRNA对靶标序列的特异性作用，进而实现对第一调控蛋白或第二调控蛋白表达的特异性调控。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟miRNA。microRNA介导(RNA-induced silencing complex RISC)抑制靶标基因的表达。microRNA-RISC对靶基因mRNA的作用一直主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有三种方式。第一种是切断靶基因的mRNA分子——miRNA与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以这种方式，靶基因mRNA断裂后，无poly(A)的分子的3‘端加上多个U并很快降解，含poly(A)的分子能稳定存在一段时间(如拟南芥miR-171)。在植物中目前有一个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补，尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶，这也是第一次发现miRNA和其潜在的目标靶完全互补，也提示miRNA可能包含和siRNA类似的作用方式。第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类(如线虫lin-4)。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用。
根据本发明的实施例，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第十核酸分子含有特异性识别第二microRNA的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA，所述第二microRNA为异常细胞特异性microRNA。进而，第一调控蛋白在异常细胞中表达，在正常细胞中不表达或低表达，而第二调控蛋白在正常细胞中表达，在异常细胞中不表达或低表达。
根据本发明再一具体的实施例，所述第一microRNA包括选自下列的至少之一：miR199a、miR95、miR125、miRamir25b、Let-7、miR143、miR145以及miR200C。上述microRNA在正常肝细胞中表达。
根据本发明的再一具体示例，所述第二microRNA包括选自下列的至少之一：肝癌细胞(HepG2,Huh7,PLC)中表达的miR21、miR223、miR224、miR221、miR18、miR214、miR146a以及miR1792。上述第二microRNA为肝癌细胞特异性表达的microRNA。进而，第一调控蛋白在肝癌细胞中表达，在正常细胞中不表达或低表达，而第二调控蛋白在正常细胞中表达，在肝癌细胞中不表达或低表达。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子负载在第一表达载体上，所述第三核酸分子、所述第四核酸分子、所述第五核酸分子以及可选的所述第九核酸分子负载在第二表达载体上，所述第六核酸分子、所述第七核酸分子、所述第八核酸分子以及可选的所述第十核酸分子负载在第三表达载体上。第一、第二和第三表达载体作为表达***的负载载体，在适宜的微环境，如细胞中，实现对目的基因的特异性表达的调控。
所述表达载体的选择不受特别限制，只要能够实现表达***在适宜微环境中的功能的发挥即可。根据本发明的具体实施例，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体分别独立地选自下列的至少之一：
质粒、病毒、稳定细胞系以及其他材料载体如纳米材料，脂质体，分子耦联载体、裸露DNA、染色体载体、多聚物。脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障。分子耦联载体：分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。
根据本发明的实施例，所述病毒包括选自腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒的至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体是同一个载体。根据本发明的具体实施例，发明人通过Cascade Golden-Gate Gibson/GatewayAssemble Method技术将本申请表达***中的元件负载在同一表达载体上，负载在同一表达载体上可以有效的解决多个大片段载体共转染效率极低的问题。
根据本发明的实施例，所述同一个载体为腺病毒。腺病毒作为基因治疗载体具有如下优点：1)宿主范围广,对人致病性低。腺病毒载体***可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。另外，腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚，在人群中早已流行(70-80％成人体内都有腺病毒的中和抗体存在)。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状，且病毒唑治疗有效。2)在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因。逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳***，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3)能有效进行增殖，滴度高。腺病毒***可产生1010到1011VP/mlL，浓缩后可达1013VP/mL，这一特点使它非常适用于基因治疗。4)与人类基因同源。腺病毒载体***一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。5)不整合到染色体中，无***致突变性。逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了***以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在***中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的***。6)能在悬浮培养液中扩增。293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白。7)能同时表达多个基因。这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达***。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒***腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
根据本发明的具体实施例，发明人将上述腺病毒注入肿瘤小鼠模型，可显著抑制小鼠肿瘤的生长。上述腺病毒可作为一种安全有效的溶瘤病毒疫苗，实现对相关肿瘤的安全有效地特异性杀伤。
根据本发明的实施例，所述腺病毒是通过如下方式获得的：所述的腺病毒载体去除了与腺病毒复制包装相关的E1基因和部分E3基因，E1A基因通过逐级Golden Gate的方法构建到基因线路中，最终通过Gateway或Gibson的方式将基因线路***到腺病毒载体中。具体地，发明人通过三步将识别癌症细胞的基因线路***到腺病毒载体上。首先将区分正常细胞与癌症细胞的相关标志元件如肿瘤特异性启动子，基因线路构建相关的抑制元件，区分癌症细胞的微小RNA的识别序列构建到一级载体质粒上，构成一级元件库。元件两端设计有Esp3I的识别位点，用于通过Goldeng Gate的方式将多个一级元件构建到二级表达***上。第二步，构建表达***库，从一级库中选取多个一级元件通过Golden Gate的方式将他们组装成三个表达***，包括肿瘤特异性启动子***，第一调控元件所介导的抑制***和第二调控元件所介导的抑制***。每个表达***的两端设计有BsaI内切酶的识别位点。第三步，组装基因线路，通过Golden Gate的方式随机的将三种表达***组装起来形成完整的基因线路。基因线路两端设计有用于下一步实验的Gibson同源序列或者Gateway识别位点。最后通过Gibson或者Gateway的方式将基因线路构建到已经去除了E1和部分E3的腺病毒载体上。上述获得腺病毒的方式实现了复杂、大片段溶瘤腺病毒载体的快速改造。
重组病毒
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组病毒。根据本发明的实施例，所述重组病毒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子含有肿瘤细胞特异性启动子，所述肿瘤细胞特异性启动子为甲胎蛋白特异性启动子；第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子，所述转录激活因子为Gal4VP16；第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列，所述第一识别序列为5×UAS；第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件，所述第一启动子为miniCMV，所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游；第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白，所述第一调控蛋白为LacI，所述第五核酸分子进一步包括编码所述目的蛋白的序列，并且所述目的蛋白包括病毒复制蛋白、免疫效应因子，所述免疫效应因子是与病毒复制蛋白共表达的，并且所述效应因子之间通过可切割的连接肽连接，所述目标蛋白与所述第一调控蛋白由同一启动子调控共表达的，并且所述目标蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的；第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列，所述第二识别序列为5×UAS；第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件，所述第二启动子为miniCMV，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游；第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白,所述第二调控蛋白为tetR-KRAB；第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA；以及第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，所述第二microRNA为肿瘤细胞特异性microRNA，其中，所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能。利用根据本申请实施例的重组病毒，在甲胎蛋白特异性启动子和第九核酸分子、第十核酸分子的共同调控下，第一调控蛋白LacI、目标蛋白在肿瘤细胞中特异性表达，第二调控蛋白tetR-KRAB在肿瘤细胞中特异性不表达或低表达，进而tetR-KRAB介导的第一启动子miniCMV的抑制机制解除，第一调控蛋白LacI、目标蛋白在第一启动子miniCMV的启动调控下有效表达，LacI介导的抑制机制有效抑制了第二启动子miniCMV的功能，tetR-KRAB的表达进一步受到抑制。进而，利用根据本发明实施例的重组病毒，可实现蛋白在肿瘤细胞中更加特异性的表达(如目标蛋白E1A，第一调控蛋白LacI)或不表达(如第二调控蛋白tetR-KRAB)，在肿瘤细胞中的表达或不表达效率和特异性更高。
根据本发明的实施例，所述重组病毒为选自逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒的至少之一。⑴逆转录病毒载体的特点：结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；感染靶细胞后不扩散；假病毒感染靶细胞的效率非常高；不感染非增殖细胞。⑵腺病毒载体的特点：宿主范围广；腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件；可获得高病毒效价；重组体非常稳定；不会引起肿瘤；有较高的安全性；无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用；不整合入染色体。⑶单纯疱疹病毒载体的特点：滴度高；容量大；增殖细胞和非增殖细胞均可感染；不整合，但可长期存在并可稳定表达。
根据本发明的实施例，所述重组病毒为腺病毒。如前所述，腺病毒作为基因治疗载体具有很多优点：1.宿主范围广,对人致病性低。腺病毒载体***可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。另外，腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚，在人群中早已流行(70-80％成人体内都有腺病毒的中和抗体存在)。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状，且病毒唑治疗有效。2.在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因。逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳***，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3.能有效进行增殖，滴度高。腺病毒***可产生1010到1011VP/mL，浓缩后可达1013VP/mlL，这一特点使它非常适用于基因治疗。4.与人类基因同源。腺病毒载体***一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。5.不整合到染色体中，无***致突变性。逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了***以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在***中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的***。6.能在悬浮培养液中扩增。293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白。7.能同时表达多个基因。这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达***。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒***腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
根据本发明的实施例，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因的抑制序列、拮抗PD-L1基因的抑制序列、拮抗CTLA4基因的抑制序列、拮抗Tim-3基因的抑制序列、IL-2、IL-12、IL-15、GM-CSF至少之一或者这些因子的融合表达形式。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。为CD28超家族成员,其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1是T细胞表面的重要抑制分子，其胞内段含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM和一个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)。ITSM介导了蛋白酪氨酸磷酸酶家族磷酸酶的募集以及对T细胞活化信号的抑制，其配体为PD-L1和PD-L2主要在免疫***效应期的肿瘤微环境中发挥抑制T细胞活化的重要作用。细胞程式死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)也称为表面抗原分化簇274(cluster ofdifferentiation 274，CD274)或B7同源体(B7homolog 1，B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PD-L1在多种肿瘤细胞和肿瘤细胞微环境中造血细胞中有诱导性表达。其表达水平与某些肿瘤的恶性程度呈正相关。PD-1抗体与PD-l1抗体可以阻断PD-1与PD-L1的结合，组织肿瘤细胞通过PD-1/PD-L1通路进行免疫逃逸。CTLA-4的全称叫做细胞毒性T细胞相关蛋白-4(Cytotoxic T lymphocyte associate protein-4)，它是T细胞表面表达的一类共刺激分子(co-stimulatory molecule)。与CD28的功能类似，在T细胞激活过程中，CTLA-4能够与APC表面的CD80/CD86特异性结合来激活下游信号。研究发现，T细胞中主要表达CTLA-4的细胞为调节性T细胞(Treg)，一类可以负向调节细胞免疫的T细胞；在缺失CTLA-4受体时，小鼠表现出T细胞过度活化伴随严重的自身免疫病。以上结果可以得出，Treg需要通过CTLA-4行使其功能。另外，CTLA-4也在conT细胞中有表达，其作用是抑制T细胞激活的信号传递。T细胞免疫球蛋白以及黏蛋白结构与分子(T cell immunoglobulinand mucin-domain containing molecule,TIM)基因家族是Mclntire在2001年寻找小鼠哮喘病易感基因的研究时发现并通过基因组分析及克隆定位鉴定的新的基因家族，该家族基因结构含有免疫球蛋白V区和黏蛋白区。TIM3是TIM家族中的重要成员，表达在活化的Th1细胞表面的负向调节分子。目前在CD8+T细胞、Th17细胞、Treg、NK细胞和其他淋巴细胞亚群也发现了TIM3的表达。GM-CSF(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是一种由巨噬细胞，T细胞，NK细胞等分泌的单体糖蛋白细胞因子，GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞和单核细胞)。GM-CSF也会影响免疫***中的成熟细胞如抑制中性粒细胞的转移，改变细胞表面的受体表达。该因子还可以通过激活巨噬细胞抑制真菌的感染。IL-2(interleukin 2)白细胞介素2能介导白细胞与白细胞之间以及白细胞与其他细胞之间相互作用的细胞因子。IL-2主要由活化的T细胞产生，以自分泌与旁分泌的方式作用于局部的靶细胞，是参与免疫应答的主要细胞因子，具有明显的免疫效应。可促进T细胞增殖以及产生细胞因子，促进B细胞增值和分泌Ig,激活巨噬细胞，增强NK细胞活化和增殖等。此外，IL-2亦具有负向调节作用，可诱导Ag活化的T细胞发生凋亡，限制免疫应答的强度，避免发生明显的免疫损伤。白细胞介素IL-12(interlukin-12)是一种由树突状细胞，巨噬细胞、中性粒细胞、人B淋巴母细胞(nc-37)在响应抗原刺激的条件下产生的白细胞介素。IL-12被称为T细胞刺激因子，参与了原初细胞向Th1的分化过程，刺激干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生。IL-12在调节自然杀伤细胞和T淋巴细胞的活性中起重要作用。IL-12介导NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性增强。IL-12也具有抗血管生成活性，这意味着它可以阻断新生血管的形成。它通过增加γ-干扰素的生产增加诱导蛋白10(IP-10或CXCL10)。IP-10然后介导的抗血管生成作用。由于其能够诱导免疫应答和抗血管生成活性，人们一直在测试IL-12作为一种可能的抗癌药物的。IL-15是新近发现的一种因子，可由活化的单核－巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。IL-15的分子结构与IL-2有许多相似之外，因此可以利用IL-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性。IL-15可诱导B细胞增殖和分化，是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子；IL-15能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ。
重组细胞
在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前面所述的表达***。根据本发明实施例的重组细胞可有效激活人体的***性的免疫反应，攻击异种细胞，如肿瘤细胞，安全性高，特异性强。
根据本发明的实施例，所述表达***的至少一部分整合于所述重组细胞的基因组中。表达***随着重组细胞基因组的复制而复制，表达***对目的蛋白的表达调控持续而有效。
在制备药物中的用途
在本发明的第四方面，本方明提出了前面所述的表达***、前面所述的重组病毒、前面所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。本申请所述的表达***能够实现目的蛋白在肿瘤细胞中特异性表达，根据本申请实施例的药物对癌症的治疗效果更加有效、特异性更强、安全性更高。在本实施案例中，发明人用合成生物学的理念设计响应多靶点的基因线路调控腺病毒转录相关的关键基因E1A的表达。同时共表达可以激活***免疫反应的相关细胞因子或抗体基因。首先，与传统的溶瘤腺病毒不同，发明人设计的基因线路可以在多层次调控腺病毒的包装。第一步，发明人利用肿瘤特异性的启动子调控基因线路的总开关Gal4VP16的表达，第二步，基因线路内部microRNA靶标序列可以响应不同细胞系中microRNA的表达来区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。第三步，发明人设计的基因线路采用的双抑制***十分稳定，可以高效的响应外部输入信号如细胞特异性启动子和微小RNA信号，并且该基因线路可以进一步扩大输入信号的差异，更加高效的区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。第四步，在发明人的腺病毒载体中本***去除了腺病毒的E1B基因，E1B基因可以与正常细胞的P53基因相互作用保证腺病毒在细胞中的顺利增殖。去除E1B基因后，腺病毒无法在表达P53的正常细胞中增殖。然而，在很多肿瘤细胞中缺失P53基因的表达，不表达E1B的腺病毒仍然可以有效的扩增。所以通过多角度多水平的调控，本实施例中的腺病毒载体相较于传统的溶瘤腺病毒特异性更强，安全性也更好。另外，本实施例还利用这一腺病毒作为载体携带表达多种细胞因子和抗体基因。在腺病毒的溶瘤的同时利用这些共表达的因子激活机体***性的免疫反应，进一步提高溶瘤腺病毒的效果。
具体地，本专利利用合成生物学手段构建基因线路调控溶瘤腺病毒在肝细胞癌中的特异表达包装。除了利用腺病毒的溶瘤作用，发明人设计构建的腺病毒还装载了可以激活机体免疫反应的细胞因子，通过表达这些细胞因子，激发机体产生抑制肿瘤生长的免疫反应达到***的目的。本专利设计的***具有很大的创新性和技术优势：
高效安全：本专利设计的基因线路综合利用多层次多水平的区分正常细胞与癌细胞的生物标志物，同时利用双抑制的闭合回路基因线路调控腺病毒在不同细胞中的复制。通过这个基因线路可以更加敏感的响应不同细胞系微环境，同时减少基因表达噪音影响。
高效：本专利利用本基因线路搭载多种细胞因子和/或抗体序列，从而达到在目的细胞中引起有效的免疫反应。
模块化组建基因线路：首先将基因线路中涉及的生物标志物模块化，将每一模块建库，库中包含针对不同疾病的生物标志物。通过快速组建相关模块，搭建针对特异病症的基因线路。
精准：快速拼装的技术为发明人替换不同肿瘤标志物提供了可能，可以针对不同病人进行不同的基因线路设计，实现精准治疗
根据本发明的实施例，所述癌症包括肝癌、肺癌、结直肠癌，黑色素瘤、乳腺癌或***癌。发明人发现，根据本发明实施例的药物对肝癌、肺癌、结直肠癌，黑色素瘤、乳腺癌或***癌的治疗效果更加显著。
根据本发明的具体实施例，发明人发现microRNA在不同肿瘤细胞系中的表达情况如表1所示。向上的箭头表明与正常细胞相比在癌症细胞中高表达的microRNA，向下的箭头表明与正常细胞相比在癌症细胞中低表达的microRNA。
表1：
肝细胞癌 miR-21↑，18↑，224↑，199↓，195↓，200↓，125↓
肺癌 let-7↓，miR-17-92↑
乳腺癌 miR125b↓，145↓，21↓，155↓
颅脑肿瘤 miR-21↑，221↑，181↓，
结直肠癌 miR143↓，145↓
淋巴癌 miR155↑，miR-17-92↑
黑色素瘤 miR21↑，221↑，214↑146a↑137↓200c↓let-7↓
利用表达***表达目的蛋白的方法
在本发明的第五方面，本发明提出了一种利用表达***表达目的蛋白的方法，所述表达***为前面所述的表达***。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)使所述第五核酸分子包含编码所述目的蛋白的核酸序列；(2)使所述第十核酸分子抑制所述第二调控蛋白的表达，以便表达所述目的蛋白。利用根据本发明实施例的上述表达目的蛋白的方法，第二调控蛋白介导的对第一启动子的抑制机制解除，目的蛋白在细胞特异性启动子和第一启动子的共同作用下，在特异细胞中高效表达。
根据本发明的实施例，所述表达是在细胞中进行的。细胞可以提供目的蛋白表达的微环境，目的蛋白在细胞中的表达更加高效。
根据本发明的实施例，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性是别的核酸序列，在步骤(2)中包括使所述第二microRNA与所述第十核酸分子接触。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA。多个miRNAs也可以调节同一个基因，可以通过几个miRNAs的组合来精细调控单个基因的表达。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟miRNA。microRNA介导(RNA-induced silencing complex RISC)抑制靶标基因的表达。microRNA-RISC对靶基因mRNA的作用一直主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有三种方式。第一种是切断靶基因的mRNA分子——miRNA与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以这种方式，靶基因mRNA断裂后，无poly(A)的分子的3‘端加上多个U并很快降解，含poly(A)的分子能稳定存在一段时间(如拟南芥miR-171)。在植物中目前有一个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补，尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶，这仍是第一次发现miRNA和其潜在的目标靶完全互补，也提示miRNA可能包含和siRNA类似的作用方式。第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类(如线虫lin-4)。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用。
在本发明的第六方面，本发明又提出了一种利用表达***表达目的蛋白的方法，所述表达***为前面所述的表达***。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)使所述第八核酸分子包含编码第一目的蛋白的核酸序列，使所述第五核酸分子包含编码第二目的蛋白的核酸序列；(2)通过下列之一表达所述第一目的蛋白或所述第二目的蛋白：使所述第九核酸分子抑制所述第一调控蛋白的表达，以便表达所述第一目的蛋白；使所述第十核酸分子抑制所述第二调控蛋白的表达，以便表达所述第二目的蛋白。利用根据本发明实施例的上述表达目的蛋白的方法，第二调控蛋白介导的对第一启动子的抑制机制解除，第二目的蛋白在细胞特异性启动子和第一启动子的共同作用下，在特异细胞中高效表达或第一调控蛋白介导的对第二启动子的抑制机制解除，第一目的蛋白在细胞特异性启动子和第二启动子的共同作用下，在特异细胞中高效表达。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实验材料与方法
1、细胞培养与细胞转染
HEK293(293-H)细胞系采购自Invitrogen公司，人的肝癌细胞系HepG2，正常肝细胞Chang购买于ATCC，人肝癌细胞Huh7购买于北纳创联，Hepa1-6购买于ATCC。细胞培养在高糖DMEM完全培养基内(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)，4.5g/L葡萄糖，0.045unit/mL青霉素和0.045g/mL链霉素以及10％FBS(购自Invitrogen公司)，温度37℃，湿度100％，CO2浓度5％。
在细胞系转染实验中，取24孔板(Falcon公司)，向每孔中加入0.5mL含约7.5×104个HEK293细胞的高糖DMEM培养基培养24小时。在转染前，换液，加入新的DMEM完全培养基。使用Attractene转染试剂(Qiagen公司)或使用Lipofectamine LTX(Life technologies公司)进行转染实验。当使用Attractene时，将DNA按量混合后加入1.5μL Attractene，室温静置15分钟，之后加入到细胞内。当使用Lipofectamine LTX时，首先将DNA按量混合后加入适量Plus reagent后室温静置5分钟，之后加入1.25μL Lipofectamine LTX，室温静置25分钟，之后加入到细胞内。pDT7004(pUBI-linker-NOS)包含一个玉米泛素启动子(UBI)，下游为NOS终止子，在UBI与NOS之间没有任何编码蛋白序列，本申请用pDT7004配平不同实验组的质粒DNA。转染后培养48小时进行流式细胞术分析或进行细胞因子检测相关实验。
2、腺病毒载体
本说明中实施案例使用了两种原始腺病毒载体序列：ViraPowerTM AdenoviralGatewayTM Expression Kit(K49300Invitrogen)；Adeno-X Adenoviral System 3(632266Clontech)。载体结构如图1和图2所示。
3、质粒构建
AFP启动子截短实验相关质粒构建；AFP enhancer序列与AFP启动子序列直接通过设计PCR引物从肝癌细胞系的基因组中PCR得到。AFP启动子序列中的点突变通过overlapPCR获得。AFP enhancer与AFP启动子序列构建在入门克隆序列中，两端设计有LR酶的识别序列，通过LR将特异性启动子与激活基因Gal4VP16构建在同一载体上。microRNA的靶向序列通过引物退火酶切连接的方式***CMV-EYFP载体上(XbaI/SalI)。***一级元件库是通过Golden Gate的方式构建的。IIs型限制性内切酶(如BsaI、BbsI、BsmBI和SapI等)是一类特殊的限制性内切酶，与分子生物学最常用的II型限制性内切酶(识别位点为回文对称序列，切割位点与识别序列重叠)不同，其识别位点是一个非回文对称的序列，而切割位点位于识别位点的外侧。因此，当被IIs型限制性内切酶酶切后的两个片段相连时，原来的识别位点将不复存在，在后续的酶切连接反应中也就不会再次被切割，也达到“焊死”的效果。Golden Gate克隆技术利用IIs型限制性内切酶的这一特性在这些酶的识别序列外侧人为地设计切割位点不同的序列，然后利用同一限制性内切酶产生不同的黏性末端，从而一次性组装多个片段，克服了传统多片段组装中需要同时使用多个不同限制性内切酶的不足。相对于传统酶切连接技术而言，该技术的最大特点是不会引入任何额外的“疤痕”，从而实现了DNA片段的无痕连接。本实施例中第一级元件库中使用的IIs型限制性内切酶为Esp3I。***的二级逻辑线路库也是通过Golden Gate的方式构建的，使用的IIs型限制性内切酶为BsaI。逻辑线路通过Gateway方式***到ViraPowerTM Adenoviral GatewayTM ExpressionKit的腺病毒载体序列中；通过Gibson克隆方式***到Adeno-X Adenoviral System 3的腺病毒载体序列中。Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌***点特异重组***(attB×attP→attL×attR)。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。在本实施例中发明人采用了LR反应。Gibsonassembly技术又被称为“Gibson恒温一步组装法”，是美国J.CraigVenter研究所的Gibson等创建的一种DNA组装方法，即利用T5核酸外切酶、DNA聚合酶及连接酶的协同作用在体外将多个带有末端重叠序列的DNA片段组装起来。其中，T5核酸外切酶具有5’→3’核酸外切酶活性，能够从5’端切割有重叠区的DNA片段产生3’突出末端，然后该单链DNA的重叠序列在50℃特异性退火(此时T5核酸外切酶逐渐失活)，最后DNA聚合酶和Taq连接酶修复连接而成的双链DNA，从而形成完整的DNA分子，实现无缝拼接。
4、细胞RNA提取与反转录，定量PCR
利用Trizol法提取细胞RNA：先离心沉淀5×106个细胞，加1mL Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。在室温15-30℃下放置5分钟，加0.2mL氯仿，用力震荡15秒，在室温下放置2～3分钟后，12000×g 4℃离心15分钟。取上层水相加0.5mL异丙醇，室温放置10分钟，12000×g 4℃离心10分钟。1mL 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500×g 4℃离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用RNase-free水溶解RNA沉淀。反转录实验是利用QuantiTect Rev.Transcription Kit(Cat No./ID:205310QIAGEN)进行。定量PCR引物有qAFP for：CAAAGCTGAAAATGCAGTTGAATG(SEQ ID NO：15)；qAFP rev：TTCCCCATCCTGCAGACAATCC(SEQ ID NO：16)；GAPDH for：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG(SEQ IDNO：17)；GAPDH rev：AGGGGCCATCCACAGTCTTC(SEQ ID NO：18)。荧光染料为PowerUpTM
Figure GDA0001583341530000661
Green Master Mix(A25741Thermo Fisher)。
5、腺病毒包装、纯化和滴度测定
提取高纯度无内毒素重组腺病毒质粒：PacI线性化后转染HEK293细胞，转染过夜更换为完全培养基，第一代培养一周左右，中间根据细胞生长状态添加培养基，然后收集细胞和1mL培养液置于15mL离心管后，液氮/37℃冻融三次，2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后进行病毒的大量扩增(10个15cm平板)，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。CsCl梯度的制备方法如下：加入2mL密度为1.4g/mL的CsCl溶液，然后缓慢加入3mL密度为1.3g/mL的CsCl溶液，再加入5mL的病毒悬浮液。20000rpm 4℃离心10小时。收集密度在1.3g/mL和1.4g/mL之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA-Na2煮沸10分钟)。在透析缓冲液(50g蔗糖，10mL 1M Tris-HCl，pH 8.0，2mL 1M MgCl2定容至1L)中，4℃搅拌透析过夜，中间换两次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。利用感染细胞后提取病毒DNA定量方法检测病毒滴度。将约2×106个HeLa细胞/孔接种到6孔组织培养板上。一天后细胞覆盖率达到90-100％，用500μL无血清培养基稀释5μL病毒储备液感染细胞设两个复孔。37℃孵育3至6小时。除去培养基，1mL PBS/孔洗涤两次。加入500μL新鲜制备的NP-40裂解缓冲液(0.65％NP-40替代物(Calbiochem,Billerica,MA,USA)，150mM NaCl，10mM Tris，pH 8.0)裂解细胞。室温下孵育5-10分钟，上下吹打10-15次以帮助裂解，2000×g离心3分钟使核沉淀，弃上清，加入1mL的NP-40裂解缓冲液，短暂涡旋，然后在2000×g下再进行3分钟的离心，弃上清，将细胞核悬浮于200μLPBS中。DNA分离和纯化，利用DNeasy Blood&Tissue kit(QIAgen,Valencia,CA,USA)提取DNA，用于后续定量反应。定量引物有L2Forward Primer：TTGTGGTTCTTGCAGATATGGC(SEQ ID NO：19)；L2Reverse Primer：TCGGAATCCCGGCACC(SEQ ID NO：20)。
制备标准曲线：PCR L2目的序列构建到T载体上，将质粒稀释到1×109到1×102copy/μL作为标准序列。稀释公式为[Plasmid concentration(μg/μL)×Avogadro’snumber×10-6]/[number of nucleotides×1bp molecular weight]＝plasmid copies/μL
6、细胞实验
检测腺病毒对不同细胞的识别与杀伤能力：Chang细胞1×104细胞/孔，HepG2、Huh7细胞5×104细胞/孔铺96孔板，腺病毒Ad vehicle以102到10-4十倍稀释七个梯度MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)感染这三种细胞系，持续观察六天后利用MTS方法检测细胞存活率。
7、MTS检测
MTS法检测细胞数：在96孔板培养的待测细胞中每孔加20μL MTS/PMS混合液(Promega公司)，混匀后继续37℃培养1至4小时。显色后摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。使用酶标仪检测波长490nm的吸光度(OD值)。绘制标准曲线，可以检测目的细胞的细胞数量。
8、细胞因子检测实验
细胞因子的生物活性可以通过因子依赖型细胞的增殖检测。分别使用CTLL-2，FDC-P1，TF-1细胞系检测IL-2，mGM-CSF，hGM-CSF的生物活性。收集待测因子依赖性的细胞，将1×104待测细胞加入96孔板后，随后加入含有待测细胞因子的样品，37℃恒温培养24小时或48小时之后，使用MTS方法检测细胞增殖，绘制剂量-增殖标准曲线，对比计算得出样品中对应细胞因子的活性水平。
9、免疫共沉淀实验
免疫共沉淀：收取待测细胞，使用适量蛋白裂解液(碧云天公司)裂解细胞，离心后去除细胞碎片。取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将加入10-30μL偶联相应的标签抗体的protein A/G-agarose beads(Thermo Fisher Scientific公司)加入到细胞裂解液中，4℃缓慢摇晃孵育过夜。孵育后离心去除上清，将沉降后的珠子洗三遍后，使用洗脱液将抗体和捕获的蛋白从agarose beads上洗脱后，加入SDS-PAGE上样缓冲液(上海生工公司)煮沸后通过Western blot检测相关蛋白的富集情况。
10、动物实验
实验动物采购自华阜康或维通利华公司，肿瘤模型采用6周龄的雄性或者雌性小鼠，均饲养在SPF的环境中。人源肿瘤模型使用裸鼠构建，将1×107HepG2人肝癌细胞混合基质胶(BD公司)皮下注射，接种在裸鼠右侧腹部，每三天通过游标卡尺测量皮下瘤块的大小。鼠源肿瘤模型使用C57BL/6J野生型小鼠构建，将1×106Hepa1-6小鼠肝癌细胞皮下接种在小鼠的右侧腹部，每三天通过游标卡尺测量皮下瘤块的大小。待肿瘤体积达到100mm3后，给予溶瘤腺病毒或者对照治疗。根据动物实验伦理的要求，当肿瘤大小达到直径15mm后，将荷瘤小鼠安乐处死。小鼠肿瘤的体积通过近似公式(体积＝0.5×长×宽2)计算得出。
实验结果
1、利用合成生物学手段构建双抑制型开关响应多种生物标志物区分癌症细胞和非癌症细胞。
近些年的相关研究表明，溶瘤病毒是治疗癌症的十分有效的手段，其中溶瘤腺病毒已经开展很多临床研究。根据已有的临床研究结果表明，溶瘤腺病毒存在比较高比例的泄露现象，所以如何提高溶瘤腺病毒在临床阶段的安全性是一个很重要的问题。根据对已有的溶瘤腺病毒的分析发现，多数溶瘤腺病毒的调控依赖于单一的生物标志物，例如肿瘤特异性的启动子调控腺病毒复制的关键基因E1的表达。但单一的生物标志物存在比较高的泄露机率。所以在本实施例中发明人设计了一个双抑制型开关***响应多种生物标志物，在多水平调控腺病毒E1A基因的表达，提高溶瘤腺病毒的识别特异性并进而增强安全性。
如图3所示，双抑制型开关***的特点如下：肿瘤特异性启动子(pC,cancerspecific promoter)调控调控双抑制型开关***的总激活子(Activator)。激活子作用于激活子启动子(pAct,activator response promoter)调控下游基因的表达。双抑制***的一侧表达腺病毒包装相关的E1A基因，效应因子(Effector)和抑制子a(Rep-a,repressora)以及响应非肿瘤细胞中高表达的微小RNA a(miRNA a)的靶向序列。该侧的启动子两边有另一侧表达的抑制子b的识别序列(Tb,target of repressor b)和响应肿瘤细胞中高表达的微小RNA b(miRNA b)的靶向序列。双抑制***的另一侧表达抑制子b(Rep-b,repressorb)。该侧的启动子两边有另一侧表达的抑制子a的识别序列(Ta,target of repressor a)。在肿瘤细胞中，pC启动整个***的表达，由于在肿瘤细胞中miRNA b高表达同时miRNA a低表达，抑制子b被RNA干扰作用降解，解除了抑制子b对另一侧基因表达的抑制作用。同时抑制子a高表达可以进一步抑制抑制子b的表达，使双抑制型开关***快速高效地翻转到E1A表达的状态，启动腺病毒的包装和效应因子的表达。相反地，当双抑制开关进入非肿瘤细胞内时，通过肿瘤特异性启动子，微小RNA标志物和逻辑线路的共同作用，无法表达E1A和效应因子，有效的关闭了腺病毒的包装过程，确保了该逻辑线路的特异性和安全性。所以这种开关可以响应多种输入信号在转录水平和转录后水平区分目的与非目的细胞类型。另外，在本***中发明人只表达了E1A基因，去除了E1B基因，从功能缺陷型互补的角度提高了溶瘤病毒目的细胞的区分能力。所以发明人设计的***从多水平多层次区分目的细胞，可以有效提高腺病毒的安全性。
2、验证分析区分肝癌细胞和非肝癌细胞的生物标志物
2.1构建肝癌特异性的甲胎蛋白(AFP)启动子。
甲胎蛋白(α-fetoprotein，αFP或AFP)主要在胎肝中合成，在正常的成人体内没有AFP表达，但当肝细胞发生癌变时，AFP重新表达，而且随着病情恶化AFP在血清中的含量会急剧增加。目前甲胎蛋白是诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。所以在本实施例中发明人选择了甲胎蛋白启动子作为一个区分肝癌细胞和非肝癌细胞的启动子标志物。
发明人进一步通过实验检测AFP的特异性表达。首先通过qPCR检测了人AFP基因在一系列非肝癌和肝癌细胞中的表达。如图4所示提取Chang、HepG2、Huh7、PLC、Hep3B和Hepa1-6细胞的RNA。通过定量PCR检测AFP基因在这些细胞中的表达水平。Chang是人的正常的肝细胞，HepG2、Huh7、PLC、Hep3B是人的肝癌细胞。Hepa1-6是小鼠的肝癌细胞。人的AFP基因在HepG2和Huh7细胞系中高表达，在PLC和Hep3B细胞系中表达较低。在小鼠的肝癌细胞Hepa1-6中也检测到了轻微的表达。这些结果表明，AFP特异性的表达在肝癌细胞系中，可以作为发明人的启动子标志物。
目前被广泛应用的AFP启动子由增强子(enhancer)和启动子(promoter)两部分组成。增强子中包含两段激活启动子的序列DA(domain A)和DB(domain B)。为了提高启动子的效率，发明人将启动子区的-119位的G突变为A。另外，发明人对增强子区做了不同的截断实验。如图5所示AFPI包含了AFP的1.8K的增强子序列(序列如SEQ ID NO：21所示)；AFPII包含了激活区域A(DA)，激活区域B(DB)以及两个激活区域之间的序列(序列如SEQ ID NO：22所示)；AFPIII只包含了激活区域A(DA)和激活区域B(DB)(序列如SEQ ID NO：23所示)；AFPIV只包含激活区域A(DA)(序列如SEQ ID NO：24所示)；AFPV只包含激活区域B(DB)(序列如SEQ ID NO：25所示)。将这五种AFP启动子报告***质粒瞬转入正常肝细胞Chang和肝癌细胞HepG2中检测AFP启动子的表达效率和特异性。从结果来看(如图6所示)五种AFP启动子在肝癌细胞系中都有很高的表达水平，甚至超过了常表达的CMV启动子。从特异性角度分析，在Chang中除了AFPII的报告基因有轻微表达，其它启动子都没有明显泄露。综合考虑***序列的长度，启动子的效率和特异性发明人在后续的实验中选择了AFP III启动子调控发明人的双抑制型开关。
TTTAGAAATATGGGGGTAGGGGTGGTGGTGGGGCCTGGATAAAGCTGAGTGGTATGAATGAGTTAGAAATATGGGGGTAGGGGTGGTGGTGGTAATTCTGTTTTCTCCCCATAGGTGAGATAAGCATTGGGTTAAATGTGCTTTCTCTCTCTCCCTCTCCTTTCTTAAGAATTAAGGGACAGACTATGGGCTGGAGGACTTTGAGGATGTCTGTCTCATAACACTTGGGTTGTATCTGTTCTATGGGGCTTGTTTTAAGCTTGGCAACTTGCAACAGGGTTCACTGACTTTCTCCCCAGGCCCAAGGTACTGTCCTCTTTTCATATCTGTTTTGGGGCCTCTGGGGCTTGAATATCTGAGAAAATATAAACATTTCAATAATGTTCTGTGGTGAGATGAGTATGAGAGATGTGTCATTCATTTGTATCAATGAATGAATGAGGACAATTAGTGTATAAATCCTTAGTACAACAATCTGAGGGTAGGGGTGGTACTATTCAATTTCTATTTATAAAGATACTTATTTCTATTTATTTATGCTTGTGACAAATGTTTTGTTCGGGACCACAGGAATCACAAAGATGAGTCTTTGAATTTAAGAAGTTAATGGTCCAGGAATAATTACATAGCTTACAAATGACTATGATATACCATCAAACAAGAGGTTCCATGAGAAAATAATCTGAAAGGTTTAATAAGTTGTCAAAGGTGAGAGGGCTCTTCTCTAGCTAGAGACTAATCAGAAATACATTCAGGGATAATTATTTGAATAGACCTTAAGGGTTGGGTACATTTTGTTCAAGCATTGATGGAGAAGGAGAGTGAATATTTGAAAACATTTCAACTAACCAACCACCCAATCCAACAAACAAAAAATGAAAAGAATCTCAGAAACAGTGAGATAAGAGAAGGAATTTTCTCACAACCCACACGTATAGCTCAACTGCTCTGAAGAAGTATATATCTAATATTTAACACTAACATCATGCTAATAATGATAATAATTACTGTCATTTTTTAATGTCTATAAGTACCAGGCATTTAGAAGATATTATTCCATTTATATATCAAAATAAACTTGAGGGGATAGATCATTTTCATGATATATGAGAAAAATTAAAAATCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCTCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO：21)。
CAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO：22)。
CAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO：23)。
CAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTTCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO：24)。
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2.2构建微小RNA(microRNA)荧光质粒报告***，检测不同细胞系中的表达水平。
现有的研究结果表明，随着肿瘤的发生发展，微小RNA(microRNA)的表达水平会发生很大变化。如表1所示，在不同的癌症细胞中存在很多高表达的microRNA。通过对已有的研究结果进行分析，发明人将miR199a作为表征正常肝细胞在正常肝细胞中高表达的microRNA标志物，相应地发明人将miR21和miR122作为表征肝癌细胞在肝癌细胞中高表达的microRNA标志物。首先，发明人设计构建了microRNA荧光质粒报告***，如图7所示，发明人将microRNA的靶标序列***常表达的EYFP的3’非翻译区，以另一个常表达的EBFP作为对照荧光。共转入不同的细胞系检测靶标microRNA在目标细胞系中的表达。实验结果如图8所示，与肝癌细胞系相比miR199a在正常肝细胞中高表达；而miR21在肝癌细胞系中的表达水平显著升高，在发明人设计的双抑制开关***中可以作为区分正常细胞与肝癌细胞的有效microRNA标志物。
2.3双抑制型开关可以有效的响应microRNA输入信号，在不同细胞系中稳定的实现功能。
由于溶瘤腺病毒的包装容量有限，最多只能包装8K外源基因，所以发明人再构建本实施例时尽量选取了短小有效的抑制元件。在本实施例中发明人选取了LacI和tetR-KRAB。如图9所示，发明人构建了两种逻辑线路：在tetR-KRAB边是否共表达EYFP基因。Switch I(SI)不表达EYFP，Switch II(SII)表达EYFP。发明人将两种开关分别瞬转入HEK293中，同时共转shRNA-FF4和shRNA-FF5。如图10所示，发明人的两种开关在不同的输入信号下都可以高效的翻转。但相比于SII，SI在LacI侧表达水平更高，但相应地在tetR-KRAB一侧泄露水平也会相较于SII要高一些。但综合考虑发明人的开关***可以响应多种输入信号和高效的在目的细胞中表达E1基因，在后续实验中，发明人选择了SI***作为骨架构建发明人荷载不同效应因子的溶瘤腺病毒。基于实验室之前的结果发明人检测了不同激活子对双向抑制型开关的控制效果。如图11(A)～图11(D)所示，发明人检测了Gal4VP16、Gal4esn、dCas9-VP64与rtTA的调控效率，实验结果显示基因线路可以有效地响应不同的激活子，所以这种基因线路具有良好的稳定性。
2.4利用CGGA的方法构建溶瘤腺病毒
大量的临床信息表明，肿瘤标志物在不同个体间的表达存在很大差异。所以针对于不同的个体发明人可选用的标志物很可能不同。为了实现对病人个体的精准医疗，发明人需要制备多种荷载有不同生物标志物的溶瘤腺病毒。然而利用传统的酶切连接的方法快速构建这些溶瘤病毒是一件十分困难的事。在本实施例中发明人设计构建了三级库利用CGGA(Cascade Golden-Gate Gateway/Gibson Assemble method)的方法实现了对溶瘤腺病毒的快速改装。首先如图12所示，将区分正常细胞与癌症细胞的相关标志元件如肿瘤特异性启动子，逻辑线路构建相关的抑制元件，区分癌症细胞的微小RNA的识别序列构建到一级载体质粒上，构成一级元件库。元件两端设计有EI(一种识别位点与切割位点不同的限制性内切酶例如Esp3I与BsaI)的识别位点，用于通过Golden Gate的方式将多个一级元件构建到二级表达***上。构建表达***库，从一级库中选取多个一级元件通过Golden Gate的方式将他们组装成三个表达***，包括肿瘤特异性启动子***，第一调控元件所介导的抑制***和第二调控元件所介导的抑制***。然后，如图13所示，组装逻辑线路，通过GoldenGate的方式随机的将三种表达***组装起来形成完整的逻辑线路。逻辑线路两端设计有用于下一步实验的Gibson同源序列或者Gateway识别位点(target sequence)。最后如图14所示，通过Gibson或者Gateway的方式将逻辑线路构建到已经去除了E1和部分E3的腺病毒载体上。利用PacI酶切将改造后的腺病毒载体线性化。然后转染入特定细胞系中包装腺病毒颗粒。这样发明人可以快速的替换掉一种到多种肿瘤生物标志物。
2.5在细胞水平检溶瘤腺病毒可以有效的杀伤肝癌细胞
为了检测发明人构建的双抑制型开关***在溶瘤腺病毒里是否可以有效的区分杀伤肝癌细胞。发明人设计了溶瘤腺病毒的体外细胞杀伤实验。以不同的感染复数感染不同的细胞系Chang是正常的肝细胞，Huh7和HepG2是人的肝癌细胞系。加入病毒培养六天后利用MTS方法检测细胞的存活率。如图15(a)～图15(c)所示，发现在感染复数为100，10，1的时候，肝癌细胞发生明显的细胞毒性反应大量死亡，在感染复数为0.1时有轻微的细胞死亡。相应的，在感染复数为10及以下时Chang细胞生长状态正常没有死亡现象。在感染复数为100时，细胞有轻微的细胞毒反应，同时细胞体积变大，细胞生长变慢。这一数据表明在特定的感染复数内，发明人包装的腺病毒可以有效地区分杀伤肝癌细胞，同时不影响正常肝细胞的生长与增殖。
2.6体外检测溶瘤腺病毒携带的效应因子的表达水平
由于目前临床上使用的腺病毒载体为人的Ad2或Ad5型腺病毒，在自然界中这些病毒广泛存在，所以人体内已经存在了拮抗这些腺病毒的中和抗体。所以只依靠腺病毒的溶瘤作用***，临床数据显示治疗效果并不好。所以在本实施例中发明人利用溶瘤腺病毒作为载体将效应因子基因携带到肿瘤的靶标位置引起机体***性的免疫反应。如图16所示，发明人首先将这些效应因子构建到常表达的质粒载体上，通过瞬转的方式检测这些效应因子的活性。结果表明发明人表达的效应因子基因可以有效地产生具有生物学功能的免疫因子和免疫检验点基因的抑制子。发明人将这些效应因子基因构建到溶瘤腺病毒载体上，包装纯化出荷载这些效应因子的溶瘤腺病毒。感染肝癌细胞HepG2后，发明人吸取上清检测了上清中免疫因子的活性。
同时发明人检测了腺病毒载体携带的细胞效应因子的活性，如图17(a)～图17(c)所示，病毒携带的细胞效应因子随时间有效增强。三种细胞因子的检测方法如下所述，图17a12孔板接种3×106HepG2细胞，分别用synOV-EBFP和synOV-mGM-SCF以10的感染复数感染HepG2.分别在1，2，3，4天收取上清,利用ELISA试剂盒检测上清中小鼠GM-CSF的含量。图17b 12孔板接种3×106HepG2细胞，分别用synOV-EBFP和synOV-hIL-2以10的感染复数感染HepG2.分别在1，2，3，4天收取上清,将上清加入IL-2依赖型细胞的培养基中，通过MTS检测上清中IL-2的含量。图17c 12孔板接种3×106HepG2细胞，分别用synOV-EBFP，synOV-anti-PD-1scFv和synOV-anti-PD-L1scFv以10的感染复数感染HepG2。分别在1，2，3，4天收取上清。分离小鼠脾细胞，用2ug/mL抗小鼠CD3抗体激活T细胞，同时以1：10的稀释比例将上述收取的上清加入脾细胞***。48小时后用ELISA检测脾细胞中IFN-γ的产量。
2.7利用动物实验检测溶瘤腺病毒的治疗效果
如图18(a)～18(d)所示，将1×107HepG2,Huh7，Hepa1-6肝癌细胞皮下接种在裸鼠右侧腹部，每三天测量皮下瘤块的大小。HepG2和Huh7是人的肝癌细胞，Hepa1-6是小鼠的肝癌细胞待肿瘤体积达到100mm3后，随机分为两组，治疗组瘤内注射1×109溶瘤腺病毒，以注射PBS作为对照组。持续观测治疗后肿瘤体积的变化，可以发现在溶瘤腺病毒注射后，PBS对照组的肿瘤持续生长，体积持续增大，而治疗组的肿瘤生长受到了明显的抑制，证明溶瘤腺病毒通过对肿瘤细胞的裂解作用，可以抑制体内肿瘤体积的增长，对已经成型的肿瘤有显著的治疗效果。在治疗小鼠肝癌时发明人加入了另一种对照病毒以第二代腺病毒载体负载的GFP基因病毒(Ad-GFP),这种病毒是非溶瘤性病毒，从实验结果可以发现PBS和AdGFP治疗组的肿瘤持续生长，溶瘤病毒治疗组可以在一定程度上控制肿瘤的生长，但并没有有效控制肿瘤生长，可能是因为Hepa1-6的生长速度比HepG2和Huh7快，同时在Hepa1-6中AFP的表达水平比较低等原因造成的。因此发明人在后续试验中利用负载免疫效应因子的溶瘤腺病毒继续治疗Hepa1-6肿瘤模型，取得了十分有效结果。
在荷瘤小鼠接受溶瘤腺病毒治疗2周或者一个月后，取小鼠各器官的组织样品，匀浆后提取病毒DNA。通过qPCR方法检测病毒滴度，发现在病毒感染之后，病毒仅在在肿瘤细胞里复制，并未扩散到其他组织内。这证明在体内溶瘤腺病毒有很强的特异性，对正常组织的细胞是安全的。
进一步检测发明人的溶瘤腺病毒对具有免疫***的C57小鼠模型的治疗效果。如图19(a)～19(i)所示，将1×106Hepa1-6小鼠肝癌细胞皮下接种在野生型C57BL/6J小鼠的右侧腹部，待肿瘤体积达到100mm3后，每组分别瘤内注射1×109表达不同细胞因子溶瘤腺病毒，或者注射PBS作为阴性对照。观测经过治疗后肿瘤体积的变化，并通过Kaplan-Meier法分析荷瘤小鼠的生存时间。实验结果证明，在免疫***健全的小鼠体内，溶瘤腺病毒仍然可以抑制肿瘤的生长，显著延长荷瘤小鼠的生存时间，部分荷瘤小鼠经治疗后肿瘤完全消失，达到了治愈的效果。在溶瘤腺病毒治疗一个月后，在存活的小鼠的左侧腹部再次接种1x106Hepa1-6小鼠肝癌细胞，结果发现，在同一只小鼠的不同部位接种与初次接种相同的肿瘤细胞系，无法长成瘤体。这证明经过溶瘤病毒治疗的小鼠，机体产生了对肿瘤细胞的特异性免疫力，可以抵抗同一种肿瘤细胞在机体内再次生长。
取荷瘤小鼠的肿瘤，固定、切片后通过HE染色法检测肿瘤组织的淋巴细胞浸润情况。可以发现经过溶瘤腺病毒治疗的小鼠肿瘤组织的淋巴细胞浸润比PBS对照组明显增加，证明溶瘤腺病毒的治疗在肿瘤组织中招募了更多的淋巴细胞。分离纯化肿瘤中浸润的淋巴细胞，通过流式细胞术检测小鼠肿瘤浸润T细胞的表型，发现通过溶瘤病毒治疗的小鼠肿瘤内部浸润的Ki-67+的T细胞的比例更高，证明溶瘤腺病毒治疗促进了肿瘤内部T细胞的增殖，引发了更强的免疫应答。把肿瘤浸润的淋巴细胞加入含有PMA(20ng/mL)和Ionomycin(1μg/mlL)的RPMI 1640培养基，在Brefedlin A存在的情况下，37摄氏度培养4小时。细胞固定染色后，通过流式细胞仪检测CD4+，CD8+T细胞中γ干扰素的表达情况。发现在溶瘤腺病毒治疗组的小鼠肿瘤内，T细胞的γ-干扰素的表达更高，改变了肿瘤内部的免疫微环境，促进了肿瘤细胞的清除，如图20(a，b)所示。
溶瘤腺病毒治疗引起全身性的抗肿瘤免疫应答
在C57BL/6小鼠腹部左侧和右侧的皮下都接种小鼠Hepa-1-6肿瘤，成瘤后，右侧瘤内分别注射表达细胞因子hIL-2，mGM-CSF，anti-PD-1scFv的溶瘤病毒，PBS对照和AdGFP对照，持续测量的肿瘤生长。治疗14天后，取荷瘤小鼠的两侧肿瘤。分离纯化肿瘤中浸润的淋巴细胞，通过流式细胞术检测小鼠肿瘤浸润T细胞的表型。发现不仅在右侧注射病毒的肿瘤内，在左侧未经注射病毒的肿瘤内，与对照组相比，Ki-67+的T细胞的比例更高，表达γ-干扰素的T细胞的比例更高。证明溶瘤腺病毒的治疗所引起的免疫反应不仅可以作用于注射侧的肿瘤，也作用于远端的肿瘤。这提示溶瘤腺病毒的肿瘤治疗效果不仅仅是作用于注射处的瘤体，对远端的转移灶也有一定的治疗效果。
同时为了检测溶瘤腺病毒的治疗是否是存活小鼠体内产生有效的***免疫反应。发明人重新在治疗后的小鼠皮下接种Hepa1-6，观测小鼠的生长状况发现所有小鼠的排斥率为100％，如图21所示。
2.8对溶瘤腺病毒的治疗过程进行建模分析
将溶瘤腺病毒的治疗情境抽象为肿瘤-病毒-免疫***，如图22，包含未受侵染的肿瘤细胞、受侵染的肿瘤细胞、游离病毒、受溶瘤腺病毒抗原激活的免疫细胞与受肿瘤抗原激活的免疫细胞五种组分，分别用S、I、V、ZV与ZT表示。模型假设未受侵染的肿瘤细胞生长符合广义逻辑斯蒂增长模型，其中γ为增长速率系数，K为环境容量，ε为非线性系数。未受侵染的肿瘤细胞可以被游离病毒侵染，转变为受侵染的肿瘤细胞，侵染速率为κ。受侵染的肿瘤细胞将裂解并释放更多病毒，裂解速率系数为δ，游离病毒释放速率系数为α。游离病毒在环境中会自然衰减，衰减速率系数为ω。ZV会受溶瘤腺病毒与被病毒侵染的肿瘤细胞表面抗原激活而增长，速率系数分别为cV1与cV2，而ZV会对受侵染的肿瘤细胞产生抑制作用，速率系数为pV。ZT会受肿瘤细胞裂解后释放的抗原激活而增长，速率系数为cT，而ZT会对受侵染与未受侵染的肿瘤细胞产生抑制作用，速率系数为pT。ZV与ZT在环境中会自然衰减，速率系数为β。
在不考虑免疫***的情况下，随病毒复制速度增加，***终状态将由收敛转为振荡。仿真图所示为，在不同的初始病毒滴度与初始肿瘤大小条件下，病毒复制速度较低与较高时，肿瘤-病毒***随时间变化至终状态的过程中，肿瘤体积的最小值的变化情况。从仿真结果可以看出，增加病毒初始滴度有助于控制肿瘤大小。在实际应用中，可结合初始肿瘤大小与给药剂量限制，选择合适的初始给药剂量，从而在预测的时间点将肿瘤清除或辅以其它疗法，结果如图23所示。
在免疫细胞对肿瘤与病毒不同的抑制作用强度影响下，***在仿真时间内终状态的肿瘤大小。从仿真结果可以看出，***表现出趋于完全清除肿瘤、肿瘤生长至饱和、肿瘤体积稳定及肿瘤体积出现振荡几种动态行为。总体上，免疫细胞对肿瘤的抑制作用越强，***越趋于清除肿瘤，而免疫细胞对病毒的抑制作用越强，***越趋于对肿瘤失去控制，而对于肿瘤稳定或振荡，***关于两种免疫作用的趋势表现出一些非单调变化，结果如图24所示。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学 北京合生基因科技有限公司
<120> 可编程的溶瘤病毒疫苗***及其应用
<130> PIDC1168718PACN
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2126
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第一表达载体携带的核酸的核苷酸序列
<400> 1
ggtctctgct ccagattgaa ttatttgcct gtcatacagc taataattga ccataagaca 60
attagattta aattagtttt gaatctttct aataccaaag ttcagtttac tgttccatgt 120
tgcttctgag tggcttcaca gacttatgaa aaagtaaacg gaatcagaat tacatcaatg 180
caaaagcatt gctgtgaact ctgtacttag gactaaactt tgagcaataa cacatataga 240
ttgaggattg tttgctgtta gtatacaaac tctggttcaa agctcctctt tattgcttgt 300
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caggactgtt tgggtaaact ggtcacttta tcttaaacta aatatatcca aaactgaaca 480
tgtacttagt tactaagtct ttgactttat ctcattcata ccactcagct ttatccaggc 540
cacttatttg acagtattat tgcgaaaact tcctatctag aagtttgagg agaatatttg 600
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cactgccaat aacaaaataa ctagcaagga tccggccacc atggcccccc cgaccgatgt 900
cagcctgggg gacgagctcc acttagacgg cgaggacgtg gcgatggcgc atgccgacgc 960
gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacggggat tccccgggtc cgggatttac 1020
cccccacgac tccgccccct acggcgctct ggatatggcc gacttcgagt ttgagcagat 1080
gtttaccgat gcccttggaa ttgacgagta cggtgggacg cgtatgaagc tactgtcttc 1140
tatcgaacaa gcatgcgata tttgccgact taaaaagctc aagtgctcca aagaaaaacc 1200
gaagtgcgcc aagtgtctga agaacaactg ggagtgtcgc tactctccca aaaccaaaag 1260
gtctccgctg actagggcac atctgacaga agtggaatca aggctagaaa gactggaaca 1320
gctatttcta ctgatttttc ctcgagaaga ccttgacatg attttgaaaa tggattcttt 1380
acaggatata aaagcattgt taacaggatt atttgtacaa gataatgtga ataaagatgc 1440
cgtcacagat agattggctt cagtggagac tgatatgcct ctaacattga gacagcatag 1500
aataagtgcg acatcatcat cggaagagag tagtaacaaa ggtcaaagac agttgactgt 1560
ataattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg tggccaatgc 1620
cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat 1680
gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 1740
gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa 1800
acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat 1860
gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc 1920
cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt 1980
atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct 2040
cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat cggagaaaga 2100
ggtaatttaa ttaagtcgat gagacc 2126
<210> 2
<211> 3510
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BsaI-5×UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-EBFP-2A-LacI-miR199a target
site-BsaI的序列
<400> 2
ggtctctcta tttaattaag taactataac ggtcgctccg aatttctcga gttaattaag 60
attacgccaa gctacgggcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga 120
gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt tctgtcctcc gagcggagac 180
tctagactcc ctatcagtga tagagatagg cgtgtacggt gggaggccta tataagcaga 240
gctcgtttag tgaaccgtca gatcgctccc tatcagtgat agagagaatt cgaccgccac 300
catgtcggaa ttcatgagac atattatctg ccacggaggt gttattaccg aagaaatggc 360
cgccagtctt ttggaccagc tgatcgaaga ggtactggct gataatcttc cacctcctag 420
ccattttgaa ccacctaccc ttcacgaact gtatgattta gacgtgacgg cccccgaaga 480
tcccaacgag gaggcggttt cgcagatttt tcccgactct gtaatgttgg cggtgcagga 540
agggattgac ttactcactt ttccgccggc gcccggttct ccggagccgc ctcacctttc 600
ccggcagccc gagcagccgg agcagagagc cttgggtccg gtttctatgc caaaccttgt 660
accggaggtg atcgatctta cctgccacga ggctggcttt ccacccagtg acgacgagga 720
tgaagagggt gaggagtttg tgttagatta tgtggagcac cccgggcacg gttgcaggtc 780
ttgtcattat caccggagga atacggggga cccagatatt atgtgttcgc tttgctatat 840
gaggacctgt ggcatgtttg tctacagtaa gtgaaaatta tgggcagtgg gtgatagagt 900
ggtgggtttg gtgtggtaat ttttttttta atttttacag ttttgtggtt taaagaattt 960
tgtattgtga tttttttaaa aggtcctgtg tctgaacctg agcctgagcc cgagccagaa 1020
ccggagcctg caagacctac ccgccgtcct aaaatggcgc ctgctatcct gagacgcccg 1080
acatcacctg tgtctagaga atgcaatagt agtacggata gctgtgactc cggtccttct 1140
aacacacctc ctgagataca cccggtggtc ccgctgtgcc ccattaaacc agttgccgtg 1200
agagttggtg ggcgtcgcca ggctgtggaa tgtatcgagg acttgcttaa cgagcctggg 1260
caacctttgg acttgagctg taaacgcccc aggccactcg agggtaccgg gtccggagct 1320
acaaattttt ccctcctcaa acaggctgga gatgtcgaag aaaatcctgg gcctaccggt 1380
cccatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 1440
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accctcgtga ccaccctgag ccacggcgtg cagtgcttcg cccgctaccc cgaccacatg 1620
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gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct 2580
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cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc 2940
gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac 3000
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<213> Artificial
<220>
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gagtagtgct ttctacttta tgagtagtgc tttctacttt atgagtagtg ctttctactt 3540
tatggtcgac aatactagtt aagaaatgag acc 3573
<210> 8
<211> 1594
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第三表达载体携带的核酸的核苷酸序列。
<400> 8
ggtctccgaa atcgccaagc tacgggcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc 60
cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga 120
gcggagactc tagaaattgt gagcggataa caatttaggc gtgtacggtg ggaggcctat 180
ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgccagct gacaaaattg tgagcgctca 240
caattactag aagatcttga attcgccacc atggctagat tagataaaag taaagtgatt 300
aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc 360
gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct 420
ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta gataggcacc atactcactt ttgcccttta 480
gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt aataacgcta aaagttttag atgtgcttta 540
ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat 600
gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta tgccaacaag gtttttcact agagaatgca 660
ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt actttaggtt gcgtattgga agatcaagag 720
catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca cctactactg atagtatgcc gccattatta 780
cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt 840
gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa cttaaatgtg aaagtgggtc gccaaaaaag 900
aagagaaagg tcgacggcgg tggtgctttg tctcctcagc actctgctgt cactcaagga 960
agtatcatca agaacaagga gggcatggat gctaagtcac taactgcctg gtcccggaca 1020
ctggtgacct tcaaggatgt atttgtggac ttcaccaggg aggagtggaa gctgctggac 1080
actgctcagc agatcgtgta cagaaatgtg atgctggaga actataagaa cctggtttcc 1140
ttgggttatc agcttactaa gccagatgtg atcctccggt tggagaaggg agaagagccc 1200
tggctggtgg agagagaaat tcaccaagag acccatcctg attcagagac tgcatttgaa 1260
atcaaatcat cagtttaata caaggcggcc gcaaatcaac atcagtctga taagctatca 1320
acatcagtct gataagctat caacatcagt ctgataagct atcaacatca gtctgataag 1380
ctaaagcttc gaattctgat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1440
aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 1500
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 1560
aataaagcat ttttttcact gcagctctga gacc 1594
<210> 9
<211> 7155
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 腺病毒载体携带的带有EBFP的核酸的序列
<400> 9
gtaactataa cggtcgctcc gaatttctcg agttaattaa gattacgcca agctacgggc 60
ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga 120
gtactgtcct ccgagcggag ttctgtcctc cgagcggaga ctctagactc cctatcagtg 180
atagagatag gcgtgtacgg tgggaggcct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 240
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catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg ccgccagtct tttggaccag 360
ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta gccattttga accacctacc 420
cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag atcccaacga ggaggcggtt 480
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aatacggggg acccagatat tatgtgttcg ctttgctata tgaggacctg tggcatgttt 840
gtctacagta agtgaaaatt atgggcagtg ggtgatagag tggtgggttt ggtgtggtaa 900
tttttttttt aatttttaca gttttgtggt ttaaagaatt ttgtattgtg atttttttaa 960
aaggtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga accggagcct gcaagaccta 1020
cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct gtgtctagag 1080
aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc taacacacct cctgagatac 1140
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aacaggctgg agatgtcgaa gaaaatcctg ggcctaccgg tcccatggtg agcaagggcg 1380
aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 1440
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tgtgcagact actgtgaatt ctaaccaatg tgcagactac tgttaaccaa tgtgcagact 3360
actgtaagct tcgaattgag tagtgctttc tactttatga gtagtgcttt ctactttatg 3420
agtagtgctt tctactttat gagtagtgct ttctacttta tggtcgacaa tactagttaa 3480
gaaatcgcca agctacgggc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg 3540
agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggaga 3600
ctctagaaat tgtgagcgga taacaattta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca 3660
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tagaagatct tgaattcgcc accatggcta gattagataa aagtaaagtg attaacagcg 3780
cattagagct gcttaatgag gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga 3840
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tcgaaaatca attagccttt ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg 4140
cactcagcgc tgtggggcat tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag 4200
tcgctaaaga agaaagggaa acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag 4260
ctatcgaatt atttgatcac caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga 4320
tcatatgcgg attagaaaaa caacttaaat gtgaaagtgg gtcgccaaaa aagaagagaa 4380
aggtcgacgg cggtggtgct ttgtctcctc agcactctgc tgtcactcaa ggaagtatca 4440
tcaagaacaa ggagggcatg gatgctaagt cactaactgc ctggtcccgg acactggtga 4500
ccttcaagga tgtatttgtg gacttcacca gggaggagtg gaagctgctg gacactgctc 4560
agcagatcgt gtacagaaat gtgatgctgg agaactataa gaacctggtt tccttgggtt 4620
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tggagagaga aattcaccaa gagacccatc ctgattcaga gactgcattt gaaatcaaat 4740
catcagttta atacaaggcg gccgcaaatc aacatcagtc tgataagcta tcaacatcag 4800
tctgataagc tatcaacatc agtctgataa gctatcaaca tcagtctgat aagctaaagc 4860
ttcgaattct gataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 4920
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 4980
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5040
catttttttc actgcagctc cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac 5100
cataagacaa ttagatttaa attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact 5160
gttccatgtt gcttctgagt ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt 5220
acatcaatgc aaaagcattg ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac 5280
acatatagat tgaggattgt ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt 5340
attgcttgtc ttggaaaatt tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt 5400
ttctcaacca ctcacatggc tacaaaagct tcctgattaa taattacact aagtcaatag 5460
gcatagagcc aggactgttt gggtaaactg gtcactttat cttaaactaa atatatccaa 5520
aactgaacat gtacttagtt actaagtctt tgactttatc tcattcatac cactcagctt 5580
tatccaggcc acttatttga cagtattatt gcgaaaactt cctatctaga agtttgagga 5640
gaatatttgt tatatttgca aaataaaata agtttgcaag tttttttttt ctgccccaaa 5700
gagctctgtg tccttgaaca taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat tattgacaaa 5760
tgtcccattt tcaacctaag gaaataccat aaagtaacag atataccaac aaaaggttac 5820
tagttaacag gcattgcctg aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt ttccatattg 5880
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ggattcttta caggatataa aagcattgtt aacaggatta tttgtacaag ataatgtgaa 6480
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acagcataga ataagtgcga catcatcatc ggaagagagt agtaacaaag gtcaaagaca 6600
gttgactgta taattcactc ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt 6660
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ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 6780
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tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt tagatttttt ttatattttg 7020
ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc ttacatgttt tactagccag 7080
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ggagaaagag gtaat 7155
<210> 10
<211> 6900
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 腺病毒载体携带的带有hIL-2的核酸的序列
<400> 10
gtaactataa cggtcgctcc gaatttctcg agttaattaa gattacgcca agctacgggc 60
ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga 120
gtactgtcct ccgagcggag ttctgtcctc cgagcggaga ctctagactc cctatcagtg 180
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catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg ccgccagtct tttggaccag 360
ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta gccattttga accacctacc 420
cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag atcccaacga ggaggcggtt 480
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gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg taccggaggt gatcgatctt 660
acctgccacg aggctggctt tccacccagt gacgacgagg atgaagaggg tgaggagttt 720
gtgttagatt atgtggagca ccccgggcac ggttgcaggt cttgtcatta tcaccggagg 780
aatacggggg acccagatat tatgtgttcg ctttgctata tgaggacctg tggcatgttt 840
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aaggtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga accggagcct gcaagaccta 1020
cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct gtgtctagag 1080
aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc taacacacct cctgagatac 1140
acccggtggt cccgctgtgc cccattaaac cagttgccgt gagagttggt gggcgtcgcc 1200
aggctgtgga atgtatcgag gacttgctta acgagcctgg gcaacctttg gacttgagct 1260
gtaaacgccc caggccactc gagggtaccg ggtccggagc tacaaatttt tccctcctca 1320
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tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac ttgtcacaaa cagtgcacct acttcaagtt 1440
ctacaaagaa aacacagcta caactggagc atttactgct ggatttacag atgattttga 1500
atggaattaa taattacaag aatcccaaac tcaccgcgat gctcacagct aagtttgcca 1560
tgcccaagaa ggccacagaa ctgaaacatc ttcagtgtct agaagaagca ctcaaacctc 1620
tggaggaagt gctaaattta gctcaaagca aaaactttca cttaagaccc agggacttaa 1680
tcagcaatat caacgtaata gttctggaac taaagggatc tgaaacaaca ttcatgtgtg 1740
aatatgctga tgagacagca accattgtag aatttctgaa cagatggatt accttttgtc 1800
aaagcatcat ctcaacactg acttgaagat ctgagggccg cggcagcctg ctgacctgcg 1860
gcgacgtgga ggaaaacccc ggccccggat ccatgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg 1920
cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg 1980
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cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg 2280
accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg 2340
tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg 2400
gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa 2460
gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa 2520
ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca 2580
tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg 2640
cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg 2700
tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca 2760
aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg 2820
gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc 2880
tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 2940
cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agagcagcct gaggcctcct aagaagaaga 3000
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ttgagtagtg ctttctactt tatgagtagt gctttctact ttatgagtag tgctttctac 3180
tttatgagta gtgctttcta ctttatggtc gacaatacta gttaagaaat cgccaagcta 3240
cgggcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga 3300
gcggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc ggagactcta gaaattgtga 3360
gcggataaca atttaggcgt gtacggtggg aggcctatat aagcagagct cgtttagtga 3420
accgtcagat cgccagctga caaaattgtg agcgctcaca attactagaa gatcttgaat 3480
tcgccaccat ggctagatta gataaaagta aagtgattaa cagcgcatta gagctgctta 3540
atgaggtcgg aatcgaaggt ttaacaaccc gtaaactcgc ccagaagcta ggtgtagagc 3600
agcctacatt gtattggcat gtaaaaaata agcgggcttt gctcgacgcc ttagccattg 3660
agatgttaga taggcaccat actcactttt gccctttaga aggggaaagc tggcaagatt 3720
ttttacgtaa taacgctaaa agttttagat gtgctttact aagtcatcgc gatggagcaa 3780
aagtacattt aggtacacgg cctacagaaa aacagtatga aactctcgaa aatcaattag 3840
cctttttatg ccaacaaggt ttttcactag agaatgcatt atatgcactc agcgctgtgg 3900
ggcattttac tttaggttgc gtattggaag atcaagagca tcaagtcgct aaagaagaaa 3960
gggaaacacc tactactgat agtatgccgc cattattacg acaagctatc gaattatttg 4020
atcaccaagg tgcagagcca gccttcttat tcggccttga attgatcata tgcggattag 4080
aaaaacaact taaatgtgaa agtgggtcgc caaaaaagaa gagaaaggtc gacggcggtg 4140
gtgctttgtc tcctcagcac tctgctgtca ctcaaggaag tatcatcaag aacaaggagg 4200
gcatggatgc taagtcacta actgcctggt cccggacact ggtgaccttc aaggatgtat 4260
ttgtggactt caccagggag gagtggaagc tgctggacac tgctcagcag atcgtgtaca 4320
gaaatgtgat gctggagaac tataagaacc tggtttcctt gggttatcag cttactaagc 4380
cagatgtgat cctccggttg gagaagggag aagagccctg gctggtggag agagaaattc 4440
accaagagac ccatcctgat tcagagactg catttgaaat caaatcatca gtttaataca 4500
aggcggccgc aaatcaacat cagtctgata agctatcaac atcagtctga taagctatca 4560
acatcagtct gataagctat caacatcagt ctgataagct aaagcttcga attctgataa 4620
tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 4680
tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 4740
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 4800
agctccagat tgaattattt gcctgtcata cagctaataa ttgaccataa gacaattaga 4860
tttaaattag ttttgaatct ttctaatacc aaagttcagt ttactgttcc atgttgcttc 4920
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aagcattttt ttcactgcag ctccagattg aattatttgc ctgtcataca gctaataatt 5160
gaccataaga caattagatt taaattagtt ttgaatcttt ctaataccaa agttcagttt 5220
actgttccat gttgcttctg agtggcttca cagacttatg aaaaagtaaa cggaatcaga 5280
attacatcaa tgcaaaagca ttgctgtgaa ctctgtactt aggactaaac tttgagcaat 5340
aacacatata gattgaggat tgtttgctgt tagtatacaa actctggttc aaagctcctc 5400
tttattgctt gtcttggaaa atttgctgtt cttcatggtt tctcttttca ctgctatcta 5460
tttttctcaa ccactcacat ggctacaaaa gcttcctgat taataattac actaagtcaa 5520
taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 5580
caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 5640
ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctatct agaagtttga 5700
ggagaatatt tgttatattt gcaaaataaa ataagtttgc aagttttttt tttctgcccc 5760
aaagagctct gtgtccttga acataaaata caaataaccg ctatgctgtt aattattgac 5820
aaatgtccca ttttcaacct aaggaaatac cataaagtaa cagatatacc aacaaaaggt 5880
tactagttaa caggcattgc ctgaaaagag tataaaagaa tttcagcatg attttccata 5940
ttgtgcttcc accactgcca ataacaaaat aactagcaag gatccggcca ccatggcccc 6000
cccgaccgat gtcagcctgg gggacgagct ccacttagac ggcgaggacg tggcgatggc 6060
gcatgccgac gcgctagacg atttcgatct ggacatgttg ggggacgggg attccccggg 6120
tccgggattt accccccacg actccgcccc ctacggcgct ctggatatgg ccgacttcga 6180
gtttgagcag atgtttaccg atgcccttgg aattgacgag tacggtggga cgcgtatgaa 6240
gctactgtct tctatcgaac aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc 6300
caaagaaaaa ccgaagtgcg ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc 6360
caaaaccaaa aggtctccgc tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga 6420
aagactggaa cagctatttc tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa 6480
aatggattct ttacaggata taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt 6540
gaataaagat gccgtcacag atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt 6600
gagacagcat agaataagtg cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag 6660
acagttgact gtataattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg 6720
tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta 6780
tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 6840
cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 6900
aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat 6960
gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga aacagccccc 7020
tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt tttttatatt 7080
ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg ttttactagc 7140
cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc tcttatggag 7200
atcggagaaa gaggtaat 7218
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> qAFP正向引物
<400> 15
caaagctgaa aatgcagttg aatg 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> qAFP 反向引物
<400> 16
ttccccatcc tgcagacaat cc 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH正向引物
<400> 17
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH 反向引物
<400> 18
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> L2 Forward Primer
<400> 19
ttgtggttct tgcagatatg gc 22
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> L2 Reverse Primer
<400> 20
tcggaatccc ggcacc 16
<210> 21
<211> 2203
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPI序列
<400> 21
tttagaaata tgggggtagg ggtggtggtg gggcctggat aaagctgagt ggtatgaatg 60
agttagaaat atgggggtag gggtggtggt ggtaattctg ttttctcccc ataggtgaga 120
taagcattgg gttaaatgtg ctttctctct ctccctctcc tttcttaaga attaagggac 180
agactatggg ctggaggact ttgaggatgt ctgtctcata acacttgggt tgtatctgtt 240
ctatggggct tgttttaagc ttggcaactt gcaacagggt tcactgactt tctccccagg 300
cccaaggtac tgtcctcttt tcatatctgt tttggggcct ctggggcttg aatatctgag 360
aaaatataaa catttcaata atgttctgtg gtgagatgag tatgagagat gtgtcattca 420
tttgtatcaa tgaatgaatg aggacaatta gtgtataaat ccttagtaca acaatctgag 480
ggtaggggtg gtactattca atttctattt ataaagatac ttatttctat ttatttatgc 540
ttgtgacaaa tgttttgttc gggaccacag gaatcacaaa gatgagtctt tgaatttaag 600
aagttaatgg tccaggaata attacatagc ttacaaatga ctatgatata ccatcaaaca 660
agaggttcca tgagaaaata atctgaaagg tttaataagt tgtcaaaggt gagagggctc 720
ttctctagct agagactaat cagaaataca ttcagggata attatttgaa tagaccttaa 780
gggttgggta cattttgttc aagcattgat ggagaaggag agtgaatatt tgaaaacatt 840
tcaactaacc aaccacccaa tccaacaaac aaaaaatgaa aagaatctca gaaacagtga 900
gataagagaa ggaattttct cacaacccac acgtatagct caactgctct gaagaagtat 960
atatctaata tttaacacta acatcatgct aataatgata ataattactg tcatttttta 1020
atgtctataa gtaccaggca tttagaagat attattccat ttatatatca aaataaactt 1080
gaggggatag atcattttca tgatatatga gaaaaattaa aaatcagatt gaattatttg 1140
cctgtcatac agctaataat tgaccataag acaattagat ttaaattagt tttgaatctt 1200
tctaatacca aagttcagtt tactgttcca tgttgcttct gagtggcttc acagacttat 1260
gaaaaagtaa acggaatcag aattacatca atgcaaaagc attgctgtga actctgtact 1320
taggactaaa ctttgagcaa taacacatat agattgagga ttgtttgctg ttagtataca 1380
aactctggtt caaagctcct ctttattgct tgtcttggaa aatttgctgt tcttcatggt 1440
ttctcttttc actgctatct atttttctca accactcaca tggctacaat aactgtctgc 1500
aagcttatga ttcccaaata tctatctcta gcctcaatct tgttccagaa gataaaaagt 1560
agtattcaaa tgcacatcaa cgtctccact tggagggctt aaagacgttt caacatacaa 1620
accggggagt tttgcctgga atgtttccta aaatgtgtcc tgtagcacat agggtcctct 1680
tgttccttaa aatctaatta cttttagccc agtgctcatc ccacctatgg ggagatgaga 1740
gtgaaaaggg agcctgatta ataattacac taagtcaata ggcatagagc caggactgtt 1800
tgggtaaact ggtcacttta tcttaaacta aatatatcca aaactgaaca tgtacttagt 1860
tactaagtct ttgactttat ctcattcata ccactcagct ttatccaggc ctctagaagt 1920
ttgaggagaa tatttgttat atttgcaaaa taaaataagt ttgcaagttt tttttttctg 1980
ccccaaagag ctctgtgtcc ttgaacataa aatacaaata accgctatgc tgttaattat 2040
tgacaaatgt cccattttca acctaaggaa ataccataaa gtaacagata taccaacaaa 2100
aggttactag ttaacaggca ttgcctgaaa agagtataaa agaatttcag catgattttc 2160
catattgtgc ttccaccact gccaataaca aaataactag caa 2203
<210> 22
<211> 1113
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPII序列
<400> 22
cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 60
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 120
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 180
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acatatagat tgaggattgt 240
ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 300
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 360
tacaataact gtctgcaagc ttatgattcc caaatatcta tctctagcct caatcttgtt 420
ccagaagata aaaagtagta ttcaaatgca catcaacgtc tccacttgga gggcttaaag 480
acgtttcaac atacaaaccg gggagttttg cctggaatgt ttcctaaaat gtgtcctgta 540
gcacataggg tcctcttgtt ccttaaaatc taattacttt tagcccagtg ctcatcccac 600
ctatggggag atgagagtga aaagggagcc tgattaataa ttacactaag tcaataggca 660
tagagccagg actgtttggg taaactggtc actttatctt aaactaaata tatccaaaac 720
tgaacatgta cttagttact aagtctttga ctttatctca ttcataccac tcagctttat 780
ccaggccact tatttgacag tattattgcg aaaacttcct atctagaagt ttgaggagaa 840
tatttgttat atttgcaaaa taaaataagt ttgcaagttt tttttttctg ccccaaagag 900
ctctgtgtcc ttgaacataa aatacaaata accgctatgc tgttaattat tgacaaatgt 960
cccattttca acctaaggaa ataccataaa gtaacagata taccaacaaa aggttactag 1020
ttaacaggca ttgcctgaaa agagtataaa agaatttcag catgattttc catattgtgc 1080
ttccaccact gccaataaca aaataactag caa 1113
<210> 23
<211> 856
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPIII序列
<400> 23
cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 60
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 120
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 180
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acatatagat tgaggattgt 240
ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 300
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 360
tacaaaagct tcctgattaa taattacact aagtcaatag gcatagagcc aggactgttt 420
gggtaaactg gtcactttat cttaaactaa atatatccaa aactgaacat gtacttagtt 480
actaagtctt tgactttatc tcattcatac cactcagctt tatccaggcc acttatttga 540
cagtattatt gcgaaaactt cctatctaga agtttgagga gaatatttgt tatatttgca 600
aaataaaata agtttgcaag tttttttttt ctgccccaaa gagctctgtg tccttgaaca 660
taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat tattgacaaa tgtcccattt tcaacctaag 720
gaaataccat aaagtaacag atataccaac aaaaggttac tagttaacag gcattgcctg 780
aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt ttccatattg tgcttccacc actgccaata 840
acaaaataac tagcaa 856
<210> 24
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPIV序列
<400> 24
cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 60
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 120
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 180
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acatatagat tgaggattgt 240
ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 300
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 360
tacaaaagct ttctagaagt ttgaggagaa tatttgttat atttgcaaaa taaaataagt 420
ttgcaagttt tttttttctg ccccaaagag ctctgtgtcc ttgaacataa aatacaaata 480
accgctatgc tgttaattat tgacaaatgt cccattttca acctaaggaa ataccataaa 540
gtaacagata taccaacaaa aggttactag ttaacaggca ttgcctgaaa agagtataaa 600
agaatttcag catgattttc catattgtgc ttccaccact gccaataaca aaataactag 660
caa 663
<210> 25
<211> 485
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPV序列
<400> 25
cctgattaat aattacacta agtcaatagg catagagcca ggactgtttg ggtaaactgg 60
tcactttatc ttaaactaaa tatatccaaa actgaacatg tacttagtta ctaagtcttt 120
gactttatct cattcatacc actcagcttt atccaggcca cttatttgac agtattattg 180
cgaaaacttc ctatctagaa gtttgaggag aatatttgtt atatttgcaa aataaaataa 240
gtttgcaagt tttttttttc tgccccaaag agctctgtgt ccttgaacat aaaatacaaa 300
taaccgctat gctgttaatt attgacaaat gtcccatttt caacctaagg aaataccata 360
aagtaacaga tataccaaca aaaggttact agttaacagg cattgcctga aaagagtata 420
aaagaatttc agcatgattt tccatattgt gcttccacca ctgccaataa caaaataact 480
agcaa 485

Claims (29)

1.一种表达***，其特征在于，包括:
第一核酸分子，所述第一核酸分子含有肿瘤细胞特异性启动子；
第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子；
第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列；
第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件，所述第一启动子为miniCMV，所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游；
第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白，所述第一调控蛋白为LacI；
第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列；
第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件，所述第二启动子为miniCMV，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游；
第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白，所述第二调控蛋白为tetR-KRAB；
第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA；
第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，所述第二microRNA为异常细胞特异性microRNA；
其中，
所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能；
所述第一核酸分子与所述第二核酸分子负载在第一表达载体上，所述第三核酸分子、所述第四核酸分子、所述第五核酸分子以及所述第九核酸分子负载在第二表达载体上，所述第六核酸分子、所述第七核酸分子、所述第八核酸分子以及所述第十核酸分子负载在第三表达载体上；
所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体分别选自腺病毒载体；
所述第五核酸分子进一步包括编码目的蛋白的序列，所述目的蛋白包括病毒复制包装蛋白。
2.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述肿瘤细胞特异性启动子为选自甲胎蛋白特异性启动子，Survivin基因启动子, 人端粒酶逆转录酶基因启动子, 胆囊收缩素A受体基因启动子，癌胚抗原启动子，原癌基因人类表皮生长因子受体2启动子，***素内氧化酶还原酶2启动子，E2F-1基因启动子，黏蛋白启动子，酪氨酸酶启动子至少之一。
3.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述转录激活因子为选自Gal4VP16、Gal4vp64、dCas9-VPR、dCas9-VP64、dCas9-VP16以及rtTA 至少之一。
4.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第一识别序列与所述第二识别序列分别独立地选自5×UAS, 7×tetO以及dCas9的靶标序列至少之一。
5.根据权利要求的1所述的表达***，其特征在于，所述病毒复制包装蛋白包括选自腺病毒E1基因、E1A基因、E1B基因、E2基因和E4基因至少之一。
6.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述目的蛋白进一步包括免疫效应因子。
7.根据权利要求6所述的表达***，其特征在于，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因、拮抗PD-L1基因、拮抗CTLA4基因、拮抗Tim-3基因、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15至少之一。
8.根据权利要求6所述的表达***，其特征在于，所述目的蛋白与所述第一调控蛋白是以融合蛋白的形式表达的，并且所述目的蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的。
9.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第一microRNA包括选自下列的至少之一：
miR199a、miR95、miR125、miR25b、Let-7、miR143、miR145以及miR200C。
10.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第二microRNA包括选自下列的至少之一：
miR21、miR223、miR224、miR221、miR18、miR214、miR146a以及miR1792。
11.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体负载在同一个载体上。
12.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第一表达载体包括：
从5’端到3’端依次为BsaI，AFP III，Gal4VP16以及BsaI；
其中，所述AFPIII的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
13.根据权利要求12所述的表达***，其特征在于，所述第一表达载体携带如SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的核酸。
14.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第二表达载体包括：
从5’端到3’端依次为BsaI，5×UAS，tetO，miniCMV，tetO，E1A，2A，免疫效应因子，LacI，microRNA199a 特异识别序列以及BsaI。
15.根据权利要求14所述的表达***，其特征在于，所述第二表达载体携带如SEQ IDNO：2~7任一项所示核苷酸序列的核酸。
16.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述第三表达载体包括：
从5’端到3’端依次为BsaI，5×UAS，LacO，miniCMV，LacO，tetR-KRAB，microRNA21 特异识别序列以及 BsaI。
17.根据权利要求16所述的表达***，其特征在于，所述第三表达载体携带如SEQ IDNO：8所示核苷酸序列的核酸。
18.根据权利要求1所述的表达***，其特征在于，所述腺病毒载体包括：
从5’端到3’端依次为第一反向末端重复序列, 包装信号，AFPIII，Gal4VP16，5×UAS，tetO，miniCMV，tetO，E1A，2A，免疫效应因子，2A，LacI，microRNA199a 特异性识别序列，5×UAS，LacO，miniCMV，LacO，tetR-KRAB，microRNA21 特异性识别序列, 腺病毒E2基因区，E3基因区，E4基因区以及第二反向末端重复序列，
所述腺病毒载体携带如SEQ ID NO：9~14任一项所示核苷酸序列的核酸；
其中，所述AFPIII的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
19.根据权利要求18所述的表达***，其特征在于，所述腺病毒载体是通过如下方式获得的：
所述腺病毒载体去除了E3区域全部序列或野生人5型腺病毒基因组28592-30469 bp区域，并且所述腺病毒载体还去除了与腺病毒复制包装相关的E1基因，E1A基因通过逐级Golden Gate的方法构建到基因线路中，最终通过Gateway或Gibson的方式将基因线路***到腺病毒载体中。
20.一种重组病毒，其特征在于，包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子含有肿瘤细胞特异性启动子，所述肿瘤细胞特异性启动子为甲胎蛋白特异性启动子；
第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子，所述转录激活因子为Gal4VP16；
第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列，所述第一识别序列为5×UAS；
第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件，所述第一启动子为miniCMV，所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游；
第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白和目的蛋白的序列，所述第一调控蛋白为LacI；
所述目的蛋白包括病毒复制蛋白、免疫效应因子，所述免疫效应因子是以融合蛋白的形式表达的，并且所述病毒复制蛋白和所述效应因子之间通过可切割的连接肽连接的，
所述目的蛋白与所述第一调控蛋白是以融合蛋白的形式表达的，并且所述目的蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的；
第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列，所述第二识别序列为5×UAS；
第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件，所述第二启动子为miniCMV，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游；
第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白, 所述第二调控蛋白为tetR-KRAB；
第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA；以及
第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，所述第二microRNA为肿瘤细胞特异性microRNA；
其中，
所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能，
所述重组病毒为腺病毒载体。
21.根据权利要求20所述的重组病毒，其特征在于，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因、拮抗PD-L1 基因、拮抗CTLA4基因、拮抗Tim-3基因、IL-2、IL-12、IL-15、GM-CSF至少之一。
22.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求1~19所述的表达***。
23.根据权利要求22所述的重组细胞，其特征在于，所述表达***整合于所述重组细胞的基因组中。
24.权利要求1~19任一项所述的表达***、权利要求20~21任一项所述的重组病毒、权利要求22~23任一项所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
25.根据权利要求24所述的用途，其特征在于，所述癌症包括肝癌、肺癌、结直肠癌，黑色素瘤、乳腺癌或***癌。
26.一种利用表达***表达目的蛋白的方法，所述表达***为权利要求1~19任一项所述的表达***，其特征在于，所述方法包括：
（1）使所述第五核酸分子包含编码所述目的蛋白的核酸序列；
（2）使所述第十核酸分子抑制所述第二调控蛋白的表达，以便表达所述目的蛋白。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述表达是在细胞中进行的。
28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，在步骤（2）中包括使所述第二microRNA与所述第十核酸分子接触。
29.一种利用表达***表达目的蛋白的方法，所述表达***为权利要求1~19任一项所述的表达***，其特征在于，所述方法包括：
（1）使所述第八核酸分子包含编码第一目的蛋白的核酸序列，使所述第五核酸分子包含编码第二目的蛋白的核酸序列；
（2）通过下列之一表达所述第一目的蛋白或所述第二目的蛋白：
使所述第九核酸分子抑制所述第一调控蛋白的表达，以便表达所述第一目的蛋白；
使所述第十核酸分子抑制所述第二调控蛋白的表达，以便表达所述第二目的蛋白。
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