CN108059679B

CN108059679B - 一种人源单链抗体及其应用

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Publication number: CN108059679B
Application number: CN201711449190.5A
Authority: CN
Inventors: 李桂英; 赵良中; 郜瑞娟; 赵佳亮; 刘子钰; 琚常青
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108059679A

Abstract

本发明属于抗体药物领域公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的人源单链抗体即抗PHD2的人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER‑INP，并公开了编码所述人源单链抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体及用途。本发明所述人源单链抗体INP及ER‑INP是一种低毒、高效、特异的抑制PHD2羟化活性的活性分子，避免了异源抗体用于人体的毒副作用。同时该人源单链抗体是小分子的单链抗体，具有分子量小、免疫原性低等优点。另外，引入内质网定位信号使人源胞内单链抗体ER‑INP在细胞内高效、稳定的抑制PHD2的羟化活性，可有效提高HIF的蛋白水平，促进血管生成和肝等组织损伤修复，对组织损伤起保护作用。

Description

一种人源单链抗体及其应用

技术领域

本发明属于抗体药物领域，具体涉及一种人源单链抗体及其应用。

背景技术

氧气的动态平衡在机体的生理和发育过程中扮演着重要角色，随着环境中氧气浓度的变化，机体也会做出应答来适应缺氧。在缺氧条件下，缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)作为缺氧应激最主要的因子，能够驱动一系列基因的转录，促进缺氧适应性反应。HIF-1最初是在1992年由Semenza G L等对经缺氧处理的Hep3B和HepG2细胞株的核提取物进行凝胶迁移分析时被发现的，而且实验表明HIF-1介导了缺氧诱导的***(EPO)基因的转录。HIF-1是急性低氧应激最敏感的因子，也是机体缺氧应答的主要转录因子，目前的研究表明其下游靶基因有1000多种，这些基因大部分在急性或慢性缺氧适应性反应中都有重要作用，如调节红细胞和新血管的生成，调节细胞的代谢，调节细胞的生存力、增殖和凋亡等。在急性肝损伤中，HIF-1的上调是促进血管生成和组织损伤修复的关键。1995年Wang G.L.(J.Biol.Chem,1995,270(3):1230-1237)提出HIF是一种异二聚体，它是由HIF-α和HIF-β两个亚基组成的，其稳定性取决于HIF-1α亚基。1999年Maxwell,P.H.(Nature(London)1999,399：271–275)提出肿瘤抑制蛋白pVHL(product ofvon Hippe-llindau)靶向HIF-α的氧依赖蛋白水解过程，是调节HIF-α稳定性的关键物质。2001年Ivan,M.(Science 292,2001 464–468)提出在常氧状态下，脯氨酸羟化酶(PHD)能够羟化HIF-α的两个脯氨酸残基，被羟基化的HIF-α与VHL结合，招募E3泛素连接酶，通过泛素介导的蛋白酶体降解途径促进HIF-α的降解。2006年Tian YM(Biochem J,2006,397(1):1792186.)提出常氧状态下HIF-α通过pVHL介导的泛素-蛋白酶体途径降解，HIF-α的特定脯氨酰残基(H IF-1α的Pro-402和Pro-564)羟基化是pVHL与其结合的必要条件，二者的结合启动了HIF-α的降解过程。由此可见，HIF-α脯氨酰残基的羟基化是HIF降解的关键，而脯氨酸羟化酶(PHD)便是该催化反应的限速酶。

脯氨酰羟化酶(Prolyl hydroxylase domain，PHD)又被称为HIF脯氨酸羟化酶(HIF-prolyl hydroxylases，HPHs)，通过羟基化HIF-α氧依赖性降解区域中的2个脯氨酸残基，介导其通过泛素化途径降解，从而实现对HIF-α蛋白水平的调节，是该催化过程中的关键限速酶。1983年Trent C及其同事们(Genetics,1983,104(4):619-647.)提出他们从产卵缺陷型秀丽隐杆线虫中分离得到Egl-9基因。2001年Epstein A C R(Cell,2001,107(1):43-54)提出Egl-9基因编码的蛋白质家族能羟化HIF-α。2001年Martin S.Taylor M S(Gene,2001,275(1):125-132)将人的和鼠的EST组件与Egl-9进行比对，发现同源性较高，因此根据HUGO命名法将其命名为EglN2、EglNl和EglN3，它们所编码的蛋白质分别为PHD1、PHD2和PHD3。大量实验证明，PHD1-3都能使HIF-α脯氨酸残基发生羟基化反应，但2003年Berra E(The EMBO journal,2003,22(16):4082-4090)提出PHD2在羟基化HIF-α脯氨酸残基过程中起主要作用，PHD2是其中最重要的HIF-1α脯氨酸羟化酶。因此抑制PHD2的活性提高HIF的稳定性是疾病治疗的重要靶点。

对于PHD在缺氧、缺血、炎症及损伤中的作用已有相关报道。如2014年Campbell EL(Immunity,2014,40(1):66-77.)提出在组织缺氧时抑制PHDs活性和提高HIFs的稳定性都可以作为缺氧引起的炎症的相对平衡和恢复正常的细胞功能一种内在的适应性反应。2010年Bernhardt W M(Journal of the American Society of Nephrology，2010,21(12):2151-2156)提出临床试验证明口服的生物PHD抑制剂能够提高常氧条件下HIF的稳定性，促进EPO的表达，并且已被安全地使用于肾性贫血患者的治疗。2013年Eckle T(PLoS Biol,2013,11(9):e1001665)提出PHD抑制剂能够显著提高急性肺损伤小鼠的存活率和减少肺部炎症。2006年Natarajan R(Circ Res，2006，98(1):133-140.)研究发现通过PHD2基因沉默激活HIF-1可以减轻心肌缺血再灌注损伤。2016年Li L(Neurobiol Dis，2016，91：221-235.)研究表明神经细胞缺乏PHD2，可以通过激活HIF-VEGF通路增加内皮细胞适应性血管生成，从而提高缺血性中风组织和功能的长期恢复。这些研究成果表明抑制PHD的活性能够提高HIF的稳定性，进而促进HIF下游与血管生成相关基因的表达、促进血管生成和组织损伤修复。2008年Simon M C(Nature reviews Molecular cell biology,2008,9(4):285-296)提出常氧条件下抑制PHD2的活性足以使HIF-1α稳定。因此，PHD2可以作为促进组织损伤修复的一个有效靶点。

但上述抑制PHD活性的抑制剂在缺血、缺氧及炎症等引起的组织损伤修复的治疗研究中存在如下问题和缺点：首先，PHD小分子抑制剂缺乏亚型特异性和组织靶向性的问题，这样就会产生明显的毒副作用；其次，铁螯合剂或铁竞争剂作为PHD抑制剂，会引起机体铁代谢紊乱，具有明显的毒副作用，临床应用受限；另外，不稳定、作用范围较窄等问题，因而不能实现PHD2的靶向、高效灭活。

单链抗体是用基因工程方法制备的小分子抗体，是由弹性连接肽(一般为12-15个氨基酸)将抗体的重链可变区(V_H)与轻链可变区(V_L)连接而成的重组抗体，其分子量只相当于原天然抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最大程度的保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的小片段。由于单链抗体具有一些无可比拟的优越性，所以人们就利用现有技术对单链抗体进行了改造和修饰，以完善单链抗体的功能和发展新的用途，其中胞内抗体(intracellular antibody orintrabody)技术是近年来，随着人们对抗体工程和细胞内信号传导的深入研究，派生出一项全新的可阻断细胞内重要靶蛋白的抗体技术。胞内抗体技术可以通过添加细胞核定位信号或内质网滞留信号等方法对抗体分子进行适当修饰，使之定向分布于细胞核、细胞浆或某些细胞器中，从而特异性干扰或阻断分布于该部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌过程，引起细胞的一系列生物过程发生改变，从而达到结合和失活任一胞质结构的作用，实现重要靶分子的表型敲除。它是继反义RNA、特异性核酶、显性负突变、***基因等技术之后又一新型基因治疗途径。并且与新发展起来的RNAi技术相比，胞内抗体能够高特异性、高稳定性地作用于细胞内的蛋白质，在抗肿瘤基因治疗中具有巨大潜力和应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对上述抑制PHD2活性的小分子抑制剂存在的缺乏特异性和组织靶向性造成的毒副作用及反义技术及RNA干扰技术存在的相对不稳定、作用范围较窄等问题，提供一种低毒、高效、特异、稳定抗PHD2人源单链抗体，其可作为脯氨酸羟化酶抑制剂，实现其在细胞内有效敲除PHD2的表型功能，从而抑制PHD2对HIF-1α的羟基化，上调HIF-1的水平，促进血管生成，同时达到保护组织损伤，促进肝等组织损伤修复的目的。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

本发明通过从MCF-7细胞中克隆得到人PHD2基因，将其克隆到pET28a(+)原核表达载体中，表达和纯化重组人PHD2蛋白。以纯化的重组人PHD2蛋白为抗原，对人源噬菌体抗体库进行“吸附-洗涤-洗脱-收集-扩增”的筛选过程，富集得到抗PHD2人源单链抗体。

本发明所述特异性抗PHD2的人源单链抗体，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示，命名为INP。

本发明所述特异性抗PHD2的人源单链抗体，其氨基酸序列为经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗PHD2的人源单链抗体其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性为80％、85％、90％、95％、或97％。由于PHD2主要分布于细胞质中，并在细胞质中发挥其羟化功能，为了实现INP特异性抑制PHD2的功能，从而提高HIF的水平，发挥其促血管生成和组织损伤修复功能。本发明进一步以INP为模板，克隆入内质网定位信号，E-tag检测信号获得包括内质网定位信号肽ER、E-tag标签肽的抗PHD2人源胞内单链抗体，命名为ER-INP。

作为优选，所述人源单链抗体其氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了编码上述人源单链抗体的核苷酸。

在一些实施方案中，所述编码抗PHD2的人源单链抗体INP的核苷酸如SEQ ID NO:2所示。

在一些实施方案中，所述编码抗PHD2人源胞内单链抗体ER-INP的核苷酸如SEQ IDNO:4所示。

本发明提供了一种表达载体，包括编码上述的人源单链抗体的核苷酸。

在一些实施方案中，包括所述编码抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP的载体为pcDNA3.1-ER-INP。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述抗PHD2的人源单链抗体INP或抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP。

在一些实施方案中，本发明采用ELISA分析纯化的抗PHD2单链抗体INP与重组人PHD2的结合活性，并测定抗PHD2单链抗体INP亲和力，结果显示抗PHD2的人源单链抗体INP可以特异性结合人重组PHD2蛋白，且能够竞争性抑制抗PHD2单链抗体与重组人PHD2蛋白的结合，可以作为脯氨酰羟化酶抑制剂。因此本发明提供了所述的抗PHD2的人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP作为脯氨酰羟化酶抑制剂的应用。

在一些实施方案中，本发明将构建的真核表达载体pcDNA3.1-ER-INP转染鼠巨噬细胞Raw264.7细胞株和人胚肾细胞HER293细胞株后，对重组的内质网定位的INP基因的表达情况、定位情况及体外生物活性进行了研究，结果表明INP添加内质网定位信号后获得的内质网定位的抗人PHD2胞内抗体INP能够在鼠巨噬细胞Raw264.7细胞和人胚肾细胞HER293细胞中稳定有效表达，并实现了INP的内质网定位，显著提高细胞内HIF-1α的蛋白水平，抑制HIF-1α的羟化。

在一些实施方案中，将转染了pcDNA3.1-ER-INP真核表达载体的鼠巨噬细胞Raw264.7细胞和人胚肾细胞HER293细胞分别与人脐静脉内皮细胞HUVEC共培养，结果显示能够明显促进血管的生成。进一步的将转染了pcDNA3.1-ER-INP真核表达载体的鼠巨噬细胞Raw264.7细胞和人胚肾细胞HER293细胞的培养基上清加入8-12日龄的鸡胚卵黄囊腔中，37℃培养48h后，结果显示能够明显促进血管生成。因此本发明提供了所述的抗PHD2人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP在制备具有促血管生成作用的药物中的应用。

进一步的，本发明还提供了所述的抗PHD2的人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP在制备具有组织损伤保护作用和促进肝损伤修复作用的药物中的应用。

由上述技术方案可知，本发明公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的人源单链抗体即抗PHD2的人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP，并公开了编码所述人源单链抗体的多核苷酸、包含编码所述人源单链抗体的多核苷酸的载体及用途。

本发明所述抗PHD2的人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP是一种低毒、高效、特异的抑制PHD2羟化活性的活性分子，该人源单链抗体为人源性抗体，避免了异源抗体用于人体的毒副作用。同时该人源单链抗体是小分子的单链抗体，具有分子量小、免疫原性低等优点，克服了以往单克隆抗体分子量大、免疫原性高的缺点。另外，引入内质网定位信号，进一步重组到真核表达载体中，使人源胞内单链抗体ER-INP在细胞内高效、稳定的抑制PHD2的羟化活性，可有效提高HIF的蛋白水平，促进血管生成和肝等组织损伤修复，保护组织损伤。另外，还可以通过使用组织特异性真核表达载体，实现抗PHD2的人源单链抗体INP及抗PHD2的人源胞内单链抗体ER-INP的组织靶向性，实现基因治疗的可控性，不仅能充分发挥促血管生成作用和促进组织修复作用，而且具有组织特异性，实现靶向治疗，确保治疗安全有效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1PHD2的扩增及pET28a-PHD2原核表达载体鉴定图；其中图A为PHD2的扩增图，泳道1为BS2000DNA Marker；泳道2、3为PHD2的PCR产物；图B为pET28a-PHD2原核表达载体的鉴定图，泳道1为pET28a质粒；泳道2为pET28a/HindⅢ；泳道3为pET28a/HindⅢ+EcoRⅠ；泳道4、7为重组质粒pET28a-PHD2；泳道5、8为pET28a-PHD2/HindⅢ；泳道6、9为pET28a-PHD2/HindⅢ+EcoR Ⅰ；泳道10为PHD2PCR产物；泳道11为DNA Marker；

图2示实施例1SDS-PAGE分析PHD2蛋白的纯化图，其中泳道1为Marker；泳道2为pET28a-PHD2/BL21(DE3)IPTG诱导前细胞裂解液；泳道3为pET28a-PHD2/BL21(DE3)IPTG诱导4h细胞裂解液；泳道4为pET28a-PHD2/BL21(DE3)IPTG诱导4h细胞破碎上清；泳道5为10mM咪唑流出液；泳道6为40mM咪唑洗涤流出液；泳道7-10为500mM咪唑洗脱液；

图3示实施例1ELISA鉴定PHD2蛋白图；

图4示实施例2ELISA法检测可溶性单链抗体与PHD2蛋白的结合活性图；

图5示实施例2SDS-PAGE分析INP的可溶性表达及纯化图，泳道1为Marker；泳道2为INP/HB2151IPTG诱导前细胞裂解液；泳道3为INP/HB2151IPTG诱导后细胞裂解液；泳道4为硫酸铵沉淀；泳道5为过柱流出液；泳道6为10mM咪唑流出液；泳道7为40mM咪唑洗涤流出液；泳道8-10为500mM咪唑洗脱液；

图6示实施例2Western blot鉴定INP图，泳道1为pET28a-PHD2/BL21(DE3)IPTG诱导前细胞裂解液；泳道2为pET28a-PHD2/BL21(DE3)IPTG诱导4h细胞裂解液；泳道3为pET28a-PHD2/BL21(DE3)IPTG诱导4h细胞破碎上清；泳道4为纯化的PHD2蛋白；

图7示实施例3ELISA检测INP与PHD2的结合活性图；

图8示实施例3非竞争性ELISA检测INP的亲和力图；

图9示实施例3竞争性ELISA检测抗PHD2单链抗体与重组人PHD2蛋白结合特异性图；

图10示实施例4免疫荧光检测ER-INP在细胞中的表达及定位图；

图11示实施例4Western-blot分析ER-INP在HEK293细胞的表达图；

图12示实施例5免疫共沉淀实验检测ER-INP与PHD2在细胞内的结合图；

图13示实施例5Western blot检测胞内抗体INP对HIF-1α、HIF-2α及H IF-1α羟基化的影响图；

图14示实施例6HUVEV血管生成实验检测胞内抗体ER-INP对血管生成的影响图；

图15示实施例6鸡胚卵黄囊的血管生成实验检测胞内抗体ER-INP对血管生成的影响图；

图16示实施例7APAP对小鼠血清中ALT水平的影响图；其中图A为APAP诱导肝损伤小鼠血清ALT水平；图B为尾静脉注射ER-INP胞内抗体对APAP诱导的肝损伤小鼠血清ALT的影响；

图17示实施例7小鼠肝脏HE染色观察肝脏病理变化图；其中图A为APAP诱导肝损伤小鼠肝组织病理变化；图B为尾静脉注射ER-INP胞内抗体对APAP诱导的肝损伤小鼠肝脏病理变化，其中a为正常对照组；b为APAP模型组；c为注射空载体+APAP组；d为注射胞内抗体ER-INP+APAP组。

具体实施方式

本发明公开了一种人源单链抗体及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：重组人PHD2蛋白的制备

一、PCR所需引物

PCR扩增PHD2引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：

正向引物HumanPHD2FP为5'-CCGGAATTCATGCTGGCGCTCGAGTACATC-3'

反向引物HumanPHD2RP为5'-CCCAAGCTTCTATACTTTAGCTCGTGCTCT-3'

二、实验方法

(一)提取MCF-7细胞的总RNA，并逆转录得到cDNA

6孔板培养MCF-7细胞至汇合度达到90-100％时，收集细胞，用预冷PBS洗2次，加入0.5ml Trizol提取液，提取细胞总RNA。以提取的总RNA为起始物，按照RT-PCR试剂盒说明，分别加入逆转录反应所需的各种成分进行RT反应，其条件为：30℃10min，45℃30min，99℃5min，5℃5min；94℃2min。

(二)重组人PHD2表达载体的构建

2.1PHD2基因片段的获得

2.1.1.聚合酶链式反应(PCR)

以MCF-7细胞获得的cDNA为模板，通过HumanPHD2FP/HumanPHD2RP引物，用PCR的方法扩增PHD2基因。PCR反应程序：⑴94℃预变性2min；⑵94℃30s；⑶60℃30s；⑷72℃1min；⑸72℃延伸10min；其中⑵-⑷进行30个循环。

2.1.2.PCR扩增产物的回收

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，按照DNA回收纯化试剂盒回收并检验回收片段的纯度与浓度。

2.2PHD2重组表达载体的构建及原核表达纯化

将制备的PHD2片段正向克隆入pET28a中，构建pET28a-PHD2重组表达载体，进而通过EcoR I和Hind Ⅲ酶切分析和测序鉴定序列和读码框正确后，将其转化BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和相应条件摸索，诱导PHD2可溶性表达，通过亲和层析纯化重组人PHD2蛋白，ELISA进行鉴定分析。

三、结果与分析

1.pET28a-PHD2重组表达载体的构建与鉴定

根据PHD2的已知结构特征及酶催化区域，利用设计的引物通过PCR扩增得到具有催化结构域的人PHD2的目的片段，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，发现约在600bp左右有一条明显的DNA条带出现，与实验设计一致(图1A)。将PCR产物和pET-28a(+)质粒进行EcoRI和Hind Ⅲ双酶切，并成功回收酶切产物。用T4 DNA连接酶将酶切后的pET-28a载体片段与PHD2目的片段连接，转化大肠杆菌JM109，次日挑取单克隆，扩大培养后提取重组质粒，获得的重组质粒用EcoR I+Hind Ⅲ酶切鉴定，发现在5000bp-6000bp和500bp-1000bp处各有一条明显的DNA条带，与pET-28a载体片段和PHD2的PCR片段大小一致(图1B)。将构建的重组质粒pET-28a-PHD2委托上海生工生物工程有限公司进行DNA测序分析，结果表明，阳性重组质粒中***的序列与实验设计一致，而且读码框正确。这说明已经成功构建了pET-28a-PHD2原核表达载体。

2.重组人PHD2基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

将测序正确的重组质粒pET-28a-PHD2转化BL21(DE3)感受态细胞，通过对表达条件进行摸索，最终确定可溶性蛋白的最佳诱导条件为OD₆₀₀＝0.6，IPTG为0.5mM，37℃诱导4h。

为了获得重组人PHD2蛋白，进行相应的分析和进一步的实验，对0.5mM IPTG，37℃，诱导4h条件下pET28a-PHD2/BL21(DE3)菌体沉淀进行超声破碎，破碎悬液上清通过Ni柱亲和层析进行蛋白纯化，蛋白经500mM咪唑洗脱和15％SDS-PAGE分析发现在分子量约25kDa处出现目的蛋白条带，BandScan扫描分析，发现纯度达到98％以上(图2)。经凝胶层析柱除盐，PEG20000浓缩获得了目的蛋白。

3.重组人PHD2蛋白的ELISA鉴定

为了鉴定重组人PHD2蛋白，以10μg/ml浓度分别包被纯化的重组人PHD2蛋白和BSA，用抗PHD2鼠单克隆抗体37℃孵育2h，然后用HRP-抗鼠IgG 37℃孵育1h，OPD显色后用酶标仪检测OD₄₉₂。结果如图3所示，重组人PHD2蛋白与抗PHD2鼠单克隆抗体结合活性明显高于BSA的结合活性(P<0.01)。结果表明纯化的重组人PHD2蛋白与抗体有较好的结合活性，而且这种结合是具有特异性的。

实施例2：特异性抗PHD2人源单链抗体的制备

下述“特异性抗人PHD2人源单链抗体”简称“INP”

一、实验材料

大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、HB2151和XL1-Blue购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pUC119质粒购自大连宝生物工程有限公司；HRP/Anti-M13单克隆抗体购自Pharmacia公司。

二、试验方法

噬菌体人源单链抗体库的获得具体参照文献Sblattero D等Nat Biotechnol,2000,18:74-80及Sblattero D等1998年在Immunotechnology,1998,3:271-278的方法进行，通过滴度测定表明，最终获得库容为1×10¹¹的噬菌体人源单链抗体库。

抗体库的筛选采用固相化抗原免疫吸附筛选法，将人PHD2蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至100μg/ml，以1ml包被免疫管(NUNC公司)，参照李春英等在中国皮肤性病学杂志，2005,19:388-390中所述方法对抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选。每一轮筛选均测定次级库滴度，并计算噬菌体投入/产出比(回收率)，作为特异性噬菌体抗体富集的指标。

从第4轮筛选的菌落培养盘中随机挑取100个克隆，接种在2-YT中培养,用辅助病毒VCSM13超感染诱导培养过夜后，收集上清为噬菌体抗体。

三、结果与分析

1.抗PHD2人源噬菌体抗体的筛选

经过4轮筛选，噬菌体抗体回收率得到约70倍富集，从最后1轮挑取的100个克隆制备噬菌体抗体，用ELISA方法进行初筛，结果发现有15个可与人PHD2抗原结合的克隆，再用铁蛋白(Fer)和卵清蛋白(OA)作为对照抗原进行噬菌体ELISA鉴定，获得了一个能与人PHD2特异性结合，与无关抗原不具备结合特性的噬菌体抗体单克隆。

2.可溶性单链抗体的表达及结合活性

为了检测获得的噬菌体抗体与人PHD2的结合活性，将阳性克隆的噬菌体抗体上清侵染菌株HB2151，IPTG诱导可溶性单链抗体表达，以人PHD2包被ELISA板，以IPTG诱导后的scFv/HB2151的培养基上清、Anti-V5单克隆抗体和HRP-羊抗小鼠IgG为抗体，进行ELISA检测，结果表明该克隆与PHD2蛋白具有特异性结合活性(图4)。经测序和后续分析结果显示，该阳性克隆的基因全长759bp(序列见SEQ ID NO：2)，编码253个氨基酸，能够与PHD2特异性结合，因此将其确定为抗PHD2人源单链抗体，命名为INP。

3.抗PHD2人源单链抗体INP的可溶性表达、纯化及鉴定

将INP/HB2151的IPTG诱导上清进行40％硫酸铵沉淀，沉淀经过PBS溶解和透析后进行亲和纯化。以含10mM咪唑的结合缓冲液、含40mM咪唑的洗涤缓冲液、含500mM咪唑的洗脱缓冲液纯化，经SDS-PAGE分析，结果如图5所示，500mM咪唑洗脱下来的溶液在约27kDa处出现一条明显的蛋白条带。然后用PD-10除盐柱除去咪唑，即得到纯化的抗PHD2单链抗体蛋白。将纯化的抗PHD2单链抗体经过SDS-PAGE电泳后，以抗V5Tag单克隆抗体和抗V5Tag单克隆抗体为一抗对其进行Western blot分析。结果如图6所示，IPTG诱导的INP/HB2151上清和纯化后的INP样品泳道在27kDa处有特异性目的条带出现，而在未经诱导的INP/HB2151中未检测到目的条带。这些结果表明已成功实现了抗PHD2单链抗体INP的可溶性表达和纯化。

实施例3：抗PHD2人源单链抗体INP的活性表征

一、实验材料

试剂及材料参照实施例1和实施例2。

二、实验方法

1.ELISA分析纯化的抗PHD2单链抗体INP与重组人PHD2的结合活性。

2.非竞争性ELISA法测定抗PHD2单链抗体INP亲和力。

3.竞争ELISA实验检测抗PHD2单链抗体与PHD2的结合特异性。

三、结果与分析

1.ELISA检测INP与纯化的PHD2蛋白的结合活性

为了鉴定INP与重组人PHD2蛋白的结合活性，以10μg/ml浓度分别包被纯化的重组人PHD2蛋白和BSA，用抗PHD2鼠单克隆抗体为阳性对照，用INP和抗V5标签抗体为实验组，然后用HRP-抗鼠IgG 37℃孵育1h，OPD显色后用酶标仪检测OD492。结果如图7所示，INP与重组人PHD2蛋白的结合活性明显高于与BSA的结合活性(P<0.01)，表明纯化的INP与重组人PHD2蛋白具有良好的结合活性。

2.抗PHD2单链抗体INP亲和力的测定

应用非竞争性ELISA法，以抗体的浓度为横坐标，以抗原抗体反应的OD490值为纵坐标作标准曲线(图8)，根据曲线及计算公式(n[Ab1]-[Ab])/(n-1)来计算抗PHD2单链抗体的亲和常数，n为抗PHD2单链抗体的稀释倍数，Ab和Ab1分别表示当抗原浓度为Ag和Ag1时，1/2MaxOD₄₉₀的抗体浓度。通过计算得到亲和力的值为(2.43±0.16)×10^-7mol/L。

3.抗PHD2单链抗体INP特异性结合PHD2蛋白

为了检测抗PHD2单链抗体与PHD2的结合的特异性，用纯化的PHD2蛋白包被ELISA板，抗PHD2单链抗体预先与重组人PHD2蛋白孵育作为实验组，抗PHD2单链抗体预先与无关蛋白(Cyclin D1，PHD2，CDK4，BSA)孵育作为对照组。结果如图9所示，预先与PHD2蛋白孵育的抗PHD2单链抗体与包被的重组人PHD2蛋白的结合能力显著下降(P<0.01)，这种显著的抑制作用表明抗PHD2单链抗体与PHD2的结合是特异性的。

实施例4：抗PHD2人源胞内单链抗体ER-INP的制备

一、实验材料

1.菌株和质粒

pcDNA3.1(+)质粒购自Invitrogen公司；大肠杆菌E.coli JM109购自北京鼎国生物技术有限公司。

2.分子克隆主要相关试剂

限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRV，Taq DNA聚合酶及其相应缓冲液，dNTP购自大连宝生物工程有限公司。去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；脂质体(Lipofectamine2000)、G418、Trizol为Invitrogen公司产品；RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司；抗E-tag抗体购自Phamarcia公司；Annexin V凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；抗β-tublin鼠单克隆抗体购自Sigma公司，其余同实施例1-3。

3.引物设计

本实验所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体如下：

ER-INP-FP1:	5’-GTATCAACAGCTACAGCTGTCCACTCCGCCGAAATTGTGATGACGCAGTCT-3’
		ER-INP-RP1:	5’-TTCCGGATCCGGATACGGCACCGGCGCACCTGAGGAGACAGTGACCAGGGT-3’
ER-INP-FP2:	5’-CCCAAGCTTGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTATCAACAGCTACAGCTGTC-3’
		ER-INP-RP2:	5’-CCGGATATCTTACAGGTCGTCCTTACGCGGTTCCGGATCCGGATACGGCAC-3’

以上正向引物和反向引物引入内质网定位序列、检测标签及相应酶切位点构建胞内抗体ER-INP。

二、实验方法

(一)内质网定位的ER-INP基因片段的获得

1.聚合酶链式反应(PCR)

为了通过定向克隆的方法制备抗人PHD2胞内INP单链抗体基因，并能引入内质网定位信号，构建入真核表达载体pcDNA3.1中，设计了ER-INP-FP1/ER-INP-RP1和ER-INP-FP/ER-INP-RP两对引物。引物设计根据抗PHD2人源单链抗体基因序列及不同亚细胞区滞留型胞内抗体基因序列，并依据PCR引物设计原则引入符合阅读框的起始密码子和终止密码子以及相应的酶切位点。

以从人源噬菌体单链抗体库中筛选到的抗PHD2人源单链抗体基因INP序列为模板，用PCR的方法扩增内质网定位的ER-INP基因片段。

扩增ER-INP基因片段的第一轮PCR反应体系：

第二轮PCR反应体系：

2.PCR扩增产物的回收

(二)ER-INP重组真核表达载体的构建及鉴定

将ER-INP片段酶切回收后，正向克隆入质粒pcDNA3.1Hind III和EcoRV酶切位点之间，获得重组质粒pcDNA3.1-ER-INP。重组子转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定和由上海生工生物工程有限公司进行测序分析正确后，参照去内毒素质粒提取试剂盒说明书制备转染用质粒。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-ER-INP转染人肝癌细胞HepG2细胞，鼠巨噬细胞Raw264.7细胞和人胚肾细胞HER293细胞后，通过间接免疫荧光实验、Western-blot分析实验对重组的内质网定位的INP基因的表达和定位进行了研究。

(三)细胞培养

HepG2细胞、HEK293和Raw264.7细胞培养于含10％小牛血清的DMEM培养液中，37℃饱和湿度、5％CO2孵箱中培养。细胞贴壁生长，每2-4天胰蛋白酶消化细胞，传代培养。

(四)细胞转染实验

将生长状态良好的的HepG2细胞、HEK293和Raw264.7细胞按1×10⁶cells/孔的密度分别接种至6孔板中培养，当细胞生长达到90-95％汇合时即可以脂质体Lipofectame2000进行转染。细胞转染48h后收取细胞沉淀进行后续实验。

三、结果与分析

(一)成功克隆内质网定位型抗PHD2人源胞内单链抗体ER-INP

为了获得定位于内质网抗PHD2人源胞内单链抗体ER-INP基因，以抗PHD2人源单链抗体INP基因为模板，分别以ER-INP-FP1/ER-INP-RP1和含有内质网定位信号、Hind III和EcoR V酶切位点序列以及E-tag标签肽序列的引物，用通过PCR的方法扩增内质网定位型抗PHD2人源胞内单链抗体ER-INP基因。将PCR产物正向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1的HindIII和EcoRV之间；阳性重组质粒经限制性内切酶Hind III和EcoRV双酶切，琼脂糖凝胶电泳发现，在约5400bp和约867bp处分别出现一条明显的DNA条带。进一步通过T7和BGH通用引物正反双向测通载体pcDNA3.1-ER-INP上的目的片段，测序结果表明，***序列与实验设计一致，并且读码框完全正确，这说明通过PCR扩增成功构建了引入了内质网定位信号、E-tag检测标签的pcDNA3.1-ER-INP真核表达载体，ER-INP基因全长867bp(序列见Sequence No.4)，编码288个氨基酸。这说明已成功获得了重组胞内抗体INP基因的真核表达载体pcDNA3.1-ER-INP。

(二)ER-INP在细胞中稳定表达

为了检测ER-INP的表达情况，以脂质体Lipofectame 2000介导重组质粒pcDNA3.1-ER-INP及空对照质粒pcDNA3.1转染HepG2细胞、HER293细胞和Raw264.7细胞，48小时培养后进行如下实验。

1.间接免疫荧光实验分析

pcDNA3.1-ER-INP和内质网定位质粒pDsRed2-ER共转染的HepG2细胞和Raw264.7细胞为材料，经细胞爬片等一系列处理，以抗E-tag的鼠单克隆抗体为一抗，FITC-山羊抗兔IgG为二抗，进行间接免疫荧光实验分析。用免疫荧光显微镜观察，转染了ER-INP的细胞中，细胞质区域发出明亮的绿光，而空载体对照组没有荧光，内质网定位质粒pDsRed2-ER发出红光，红光与绿光共定位(图10)。表明ER-INP在细胞中能够有效表达，并分布在内质网区域。

2.Western-blot分析

为了进一步检测ER-INP在细胞中的表达，收集分别转染pcDNA3.1-ER-INP以及pcDNA3.1的HEK293细胞裂解液，用抗E-tag鼠单克隆抗体进行Western-blot检测，同时以各样品内β-tublin的表达水平为内参。结果如图11所示，各样品内β-tublin表达量均一。而只在pcDNA3.1-ER-INP转染的HEK293细胞中检测到大约35kDa的目的条带，在转染pcDNA3.1的细胞中并没有检测到相关目的条带。结果表明ER-INP在HEK293细胞中得到了有效表达。

实施例5：抗PHD2胞内单链抗体ER-INP抑制PHD2的活性

一、实验材料

抗HIF-α抗体购自Novus公司；Hydroxy-HIF-1α(Pro564)抗体购自CST公司；Hydroxy-HIF-1α(Pro402)抗体购自Millipore公司；其余同实施例1-4。

二、实验方法

参照去内毒素质粒提取试剂盒说明书制备转染用质粒。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-ER-INP转染鼠巨噬细胞Raw264.7细胞和人胚肾细胞HER293细胞后，通过免疫共沉淀实验分析ER-INP与细胞内靶抗原PHD2的结合活性，Western-blot检测HIF-1α的总蛋白水平及羟化水平分析ER-INP对PHD2活性影响。

三、结果与分析

(一)胞内抗体ER-INP能够结合细胞内的PHD2蛋白

为了检测细胞内表达的胞内抗体ER-INP能否与细胞内的PHD2结合，进行了免疫共沉淀实验。以转染了pcDNA3.1-ER-INP的HEK293细胞为实验组，以转染pcDNA3.1空载体的HEK293细胞为对照，将细胞进行裂解后，加入抗E-tag的鼠单克隆抗体，进行孵育，之后加入Protein G-Sepharose进行结合，然后以抗PHD2兔多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western-blot实验。结果如图12所示，转染了pcDNA3.1-ER-INP的细胞在46kDa的位置处出现一明显的条带，而转染了pcDNA3.1的细胞中却没有检测到相应条带，在Input对照中，载体组和胞内抗体组在46kDa的位置处均出现一明显的条带，该条带即为胞内的PHD2蛋白。这说明抗PHD2胞内抗体ER-INP能够与细胞内的PHD2蛋白有效结合，也就是该抗体能在细胞内有效识别并结合其靶抗原PHD2蛋白。

(二)ER-INP抑制PHD2的羟化酶活性，明显上调HIF-1α水平

为了检测ER-INP胞内抗体结合PHD2蛋白后是否可以抑制PHD2酶活性，抑制HIF-1α脯氨酸羟基化，抑制HIF-1α的降解，从而上调HIF-1α水平，用Westernblot方法检测转染了pcDNA3.1-ER-INP的HEK293细胞和Raw264.7细胞中HIF-1α总蛋白水平及羟化的HIF-1α(Pro402)和HIF-1α(Pro564)的水平。以各样品内β-Tubulin为内参，结果如图13所示，各样品内β-Tubulin蛋白水平均一。与空载体对照组细胞相比，转染pcDNA3.1-ER-INP的HEK293细胞和Raw264.7细胞的HIF-1α的蛋白水平明显升高，Hydroxy-HIF-1α(Pro402)和Hydroxy-HIF-1α(Pro564)的水平明显下调。结果表明表达的胞内抗体ER-INP通过与细胞内的PHD2结合，明显抑制了PHD2对HIF-1α的羟化作用，降低了HIF-1α的羟化水平，从而抑制HIF-1α的降解，使HIF-1α水平累积。

实施例6：抗PHD2胞内单链抗体ER-INP的促血管生成作用

一、实验材料

1.细胞培养、转染及活性检测试剂及材料参照实施例1-5。

二、实验方法

(一)Raw264.7细胞与HUVEC共培养体外分析ER-INP促血管生成作用

(二)鸡胚卵黄囊的血管生成模型在体分析ER-INP促血管生成作用

三、结果与分析

为了检测ER-INP对血管生成的影响，将转染了pcDNA3.1-ER-INP的HEK293和Raw264.7细胞与HUVEC在细胞Matrigel胶上共培养，观察其促血管生成效应，结果发现,转染pcDNA3.1-ER-INP的HEK293细胞和Raw264.7细胞与HUVEC共培养6h开始有管状形成，12h管状形成最明显，与空载体对照组相比，具有显著差异(图14)。实验结果表明ER-INP具有体外促血管生成作用。

为了进一步检测INP在体内对血管生成的影响，将pcDNA3.1和pcDNA3.1-ER-INP转染HEK293细胞和Raw264.7细胞，培养48h后，收集培养基上清。将培养基上清滴加到8-12日龄的鸡胚卵黄囊腔中，37℃培养48h后，观察其在鸡胚发育过程中对血管生成的影响，结果如图15所示。与空载体对照组细胞相比，转染了pcDNA3.1-ER-INP的HEK293和Raw264.7细胞的培养基上清均能明显促进鸡胚的血管生成，表明ER-INP具有在体促血管生成作用。

实施例7抗PHD2胞内抗体ER-INP具有保护肝损伤和促进肝损伤修复的作用

一、实验材料

APAP(对乙酰氨基酚)购自美国Sigma公司；梭华-SofastTM体内转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司；ALT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其余同实施例1-6。

实验动物：Balb/c小鼠，雄性，8周龄，SPF级，体重22-24g，购自辽宁长生生物技术有限公司。

二、实验方法

(一)APAP小鼠肝损伤动物模型的建立

选取8周龄的SPF级雄性Balb/c小鼠，腹腔注射250mg/kg和300mg/kg不同剂量的APAP，确定合适的肝损伤模型剂量。

(二)检测血清ALT水平的

APAP注射后分别在8h，24h，48h和72h眼眶后静脉采血，按照ALT检测试剂盒说明书进行操作，检测血清中ALT水平。

(三)肝组织HE病理学分析肝损伤程度

APAP注射后24h，48h和72h处死小鼠，取相同部位肝组织放入10％中性***中固定后，制备蜡块，切片后，HE染色，观察肝损伤情况。

(四)ER-INP胞内抗体在小鼠体内促肝损伤修复的作用

将Balb/c小鼠随机分为四组(正常对照组，APAP模型组，空载体对照+APAP组，胞内抗体治疗+APAP组)，前两组均尾静脉注射5％葡萄糖注射液，第三组尾静脉注射转染试剂包裹的空载体质粒，最后一组尾静脉注射转染试剂包裹的胞内抗体质粒，按说明书确定每只小鼠注射质粒DNA的量是50ug。注射质粒48h后，腹腔注射APAP，注射剂量是250mg/kg。

三、结果与分析

(一)APAP小鼠肝损伤动物模型的建立

为了确定合适的APAP肝损伤剂量，我们根据预实验选用250mg/kg和300mg/kg两个注射剂量。注射后8h，24h，48h和72h检测血清ALT的水平；观察24h，48h和72h的肝组织肝病理变化情况。

如图16A所示，ALT检测结果表明，250mg/kg和300mg/kg两个注射剂量均能导致肝损伤，而且均在24h损伤达到高峰，而48h时250mg/kg注射剂量的血清ALT下降明显，但300mg/kg注射剂量的血清ALT水平仅有轻微下降，提示仍有严重的肝损伤。如图17A所示，HE染色结果表明，两个剂量均能导致肝损伤，损伤最严重的是在24h，而48h时250mg/kg注射剂量的小鼠得到肝损伤修复，但300mg/kg注射剂量的小鼠肝还有大片的肝细胞坏死，因此，选择250mg/kgAPAP的剂量建立肝损伤模型。

(二)ER-INP胞内抗体对肝损伤保护作用和修复促进作用

Crowther M等人2001(J Leukoc Biol,2001；70:478-490)提出组织损伤时血液灌注减少导致组织中出现局部缺氧并启动葡萄糖糖酵解产生乳酸的过程，而缺氧和高乳酸水平应激因素刺激巨噬细胞在伤口处发挥促血管生成作用。2005年Murdoch C等人(JImmunol,2005,175:6257-6263)提出巨噬细胞能够大量聚集在缺血/缺氧部位，然后通过改变基因的表达迅速对缺氧做出应答，而这一过程被认为部分是由转录因子缺氧诱导因子HIF-1的上调介导的。Cynthia Ju在2013年(Biochemical pharmacology,2013,86(6):836-843.)提出肝脏巨噬细胞的敲除能明显抑制APAP处理造成的肝损伤的修复，并且发现APAP处理造成肝脏和肝脏巨噬细胞产生缺氧微环境，稳定了HIF的表达。2013年Nakayama T等(Cardiovasc Res,2013,99(4):705-715)提出巨噬细胞的HIF-1α是组织损伤血管重构的重要介导子。

为了研究ER-INP胞内抗体在体内是否对肝损伤有保护作用和修复促进作用，尾静脉注射梭华转染试剂包裹的质粒，50μg/只，体内转染48h后腹腔注射250mg/kg的APAP，注射后不同时间点检测血清中ALT的水平变化以及肝损伤病理变化。结果如图16B所示，ALT检测结果表明，除正常对照组外，各组ALT水平从8h开始有不同程度的升高，24h达到高峰，随后逐渐下降。APAP组ALT水平明显高于正常对照组，说明肝损伤模型成功。在APAP给药24h，空载体组和APAP模型组的ALT水平均较高，而胞内抗体组的ALT水平显著低于空载体组和APAP模型组。HE结果(图17B)显示，在肝损伤最严重的APAP给药24h，APAP组可见大量肝细胞坏死，空载体组的损伤程度与APAP组类似，而ER-INP胞内抗体组只有少量的肝细胞坏死，ER-INP对肝脏起到保护作用和促进肝损伤修复作用。

以上结果表明ER-INP胞内抗体在小鼠体内有明显肝保护作用，促进肝损伤修复。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种人源单链抗体及其应用

<130> MP1728112

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Ser Asp Val Tyr His Thr Lys Leu

115 120 125

Ser Ser Ser Gly Thr Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

130 135 140

Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

145 150 155 160

Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Thr Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr

180 185 190

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

195 200 205

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Gly Tyr Asn Gly Tyr Gly Val

225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 2

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gaaattgtga tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcttgca ggtctagtca gtccctcctg cattctaatg gatataacta tttggactgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgattt atttgggtag caatcgggcc 180

tctggagtcc cagacaggtt tagtggcagt gggtcaggta ctgatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgca tgcaaggtct acaaactccg 300

acgttcggcc aagggaccaa gctcaccgtc ctaggttccg gagggtcgac cataacttcg 360

tctgatgtat accatacgaa gttatcctcg agcggtaccc aggtgcagct ggtggagtct 420

gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct cctgtgcagc gtctggcttc 480

accttcagtg actacggaat gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg 540

gtggcagtta catcatatga tggatctgat aagtactacg gagactccgt gaagggccga 600

ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtacc tgcaaatgaa cagcctgaga 660

gccgaggaca tggctgtgta ctattgtgcg aagtcaggcg gatataatgg ttacggagtt 720

gactactggg gccagggaac cctggtcact gtctcctca 759

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ala Val

1 5 10 15

His Ser Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Ser Asp Val Tyr His

130 135 140

Thr Lys Leu Ser Ser Ser Gly Thr Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

165 170 175

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala

180 185 190

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Thr Ser Tyr Asp Gly Ser

195 200 205

Asp Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

210 215 220

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

225 230 235 240

Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Gly Tyr Asn Gly

245 250 255

Tyr Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Glu Pro Arg Lys Asp Asp Leu

275 280 285

<210> 4

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggatggagct gtatcatcct cttcttggta tcaacagcta cagctgtcca ctccgccgaa 60

attgtgatga cgcagtctcc actctccctg cccgtcaccc ctggagagcc ggcctccatc 120

tcttgcaggt ctagtcagtc cctcctgcat tctaatggat ataactattt ggactggtac 180

ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatttatt tgggtagcaa tcgggcctct 240

ggagtcccag acaggtttag tggcagtggg tcaggtactg atttcacact gaaaatcagc 300

agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgcatgc aaggtctaca aactccgacg 360

ttcggccaag ggaccaagct caccgtccta ggttccggag ggtcgaccat aacttcgtct 420

gatgtatacc atacgaagtt atcctcgagc ggtacccagg tgcagctggt ggagtctggg 480

ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg agactctcct gtgcagcgtc tggcttcacc 540

ttcagtgact acggaatgca ctgggtccgc caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg 600

gcagttacat catatgatgg atctgataag tactacggag actccgtgaa gggccgattc 660

accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtacctgc aaatgaacag cctgagagcc 720

gaggacatgg ctgtgtacta ttgtgcgaag tcaggcggat ataatggtta cggagttgac 780

tactggggcc agggaaccct ggtcactgtc tcctcaggtg cgccggtgcc gtatccggat 840

ccggaaccgc gtaaggacga cctgtaa 867

Claims

1.一种人源单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的人源单链抗体，还包括内质网定位信号肽、E-tag标签肽。

3.根据权利要求2所述的人源单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.编码权利要求1～3任意一项所述的人源单链抗体的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。

6.一种表达载体，包括编码权利要求1～3任意一项所述的人源单链抗体的核苷酸。

7.一种药物组合物，包括权利要求1-3任意一项所述的人源单链抗体。

8.权利要求1-3任意一项所述的人源单链抗体在制备脯氨酰羟化酶抑制剂中的应用。

9.权利要求1-3任意一项所述的人源单链抗体在制备具有促血管生成作用的药物中的应用。

10.权利要求1-3任意一项所述的人源单链抗体在制备具有保护肝损伤，促进肝损伤修复作用的药物中的应用。