MX2011000236A

MX2011000236A - Agentes de union a notch y antagonistas y metodos de uso de los mismos.

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Publication number: MX2011000236A
Application number: MX2011000236A
Authority: MX
Inventors: Austin L Gurney; Timothy Charles Hoey; Maureen Fitch Bruhns; Aaron Ken Sato; John A Lewicki; Edward Thein Htun Van Der Horst; Yuan Ching Liu
Original assignee: Oncomed Pharm Inc
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2011-02-24
Also published as: EP2307459A4; DK2307459T3; CA2729306A1; KR101640099B1; CO6390041A2; US8226943B2; ZA201100029B; US9499613B2; US20100111958A1; US20120288496A1; US20170183405A1; HRP20150256T1; EA201170158A1; NZ590131A; AU2009269095A1; CA2729306C; US8980260B2; AU2009269096B2; DK2307051T3; SI2307051T1

Abstract

La presente invención se refiere a agentes de unión a Notch, y antagonistas de Notch, y métodos para usar los agentes y/o antagonistas para tratar enfermedades tales como cáncer. La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a una región de no unión a ligando del dominio extracelular de uno o más receptores Notch humanos, tal como Notch2 y/o Notch3, y para inhibir el crecimiento tumoral. La invención proporciona además métodos para tratar cáncer, los métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une de manera específica a una región de no unión a ligando del dominio extracelular de una proteína de receptor Notch humano e inhibe el crecimiento tumoral.

Description

TES DE UNION A NOTCH Y ANTAGONISTAS Y METODOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a compo comprenden un agente que se une a un recept o y a métodos para usar estas composiciones miento de cáncer y otras enfermedades. De ma ífica, la presente invención proporciona, por uerpos que se unen de manera específica a una r nión a ligando del dominio extracelular de un humano y que inhiben el crecimiento tumo nte invención proporciona además métodos par er, el método que comprende administrar una éuticamente efectiva de un anticuerpo que se ra específica a una región de no unión a lig un papel importante en la determinación de ares durante las divisiones celulares asimétr a la señalización Notch no regulada con n res humanos donde puede alterar el destino de de élulas tumorales para mantenerlas en un es enciado y proliferativo (Brennan y Brown, 2003 r Res. 5:69). De esta manera, la carcinogénes guir al usurpar mecanismos homeostáticos que c esarrollo normal y reparación de tejido por pob lulas madre (Beachy et al., 2004, Nature 432:324 El receptor Notch se identificó primero en rosofila con haploinsuficiencia que da por r as (notches, en inglés) en el margen del ala, ida de función produce un fenotipo "neur iónico letal, donde las células de la epidermis estino a tejido neural (Moohr, 1919, Genet . 2 , Notch3 , y Notch4) , y las mutaciones e tores dan por resultado de manera in alidades de desarrollo y patologías humanas que s cánceres como se describe en detalle más ley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; Joutel & T rve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol . 9:619-25).

Los receptores Notch se activan por los membrana de una sola pasada de la familia da, Lag-2 (DSL) . Existen cinco ligandos Notch c os mamíferos: tipo Delta 1 (DLL1) , tipo Delta 3 Delta 4 (DLL4), Dentado 1 (JAG1) y Dentado terizados por un dominio DSL y repeticiones e EGF dentro del dominio extracelular . El acelular del receptor Notch interactúa con aque dos, típicamente en células adyacentes, que itado dos escisiones proteolíticas de Notch, una ia de peludo y mejorador de división [E(spl)] (A 1. , 1999, Science 284:770; Brennan y Brown, 2003 r Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler . . Biol. 23:543). Las rutas intracelulares alte comprenden el dominio citoplásmico Deltex ident osofila también pueden existir en mamíferos (Mar 2002, Curr. Opin. Genet . Dev. 12:524-33), y e diente de Deltex puede actuar para suprimir la e os genes objetivo Wnt (Brennan et al., 1999, Cur 7-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375- Los receptores Notch mamíferos expe sión para formar el receptor maduro y también de nión al ligando para activar la señalización erior. Una proteasa tipo furina escinde los re h durante la maduración para generar heterodí amembrana que comprenden una subunidad extrace ma de membrana.

Las células madres hematopoyéticas (HSC) as madre mejor entendidas en el cuerpo, ización Notch está implicada en su mantenimient como en la transformación leucémica (Kopper Pathol. Oncol. Res. 10:69-73). Las HSC ción rara de células que reside en un nicho del o de la médula ósea de adulto. Estas cél terizan tanto por un perfil único de expresió como la capacidad para dar lugar en forma co ias progenitoras más diferenciadas para reconst rna hematopoyético completo. La activación cons a señalización Notchl en las HSC y en las nitores establece líneas celulares inmortaliz ran células tanto linfoides como mieloides in vi os de reconstitución de largo plazo (Varnum-F La ruta' de señalización Notch también j central en el mantenimiento de células madre ne implicada en su mantenimiento normal así res de cerebro (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol . 10:69-73; Purow et al . , 2005, Cáncer Res. 65: han et al., 2004, Cáncer Res. 64:7794-800). Las neurales dan lugar a todas las células neur es en el sistema nervios mamífero durante el des s recientemente se han identificado en el ce o (Gage, 2000, Science 287:1433-8). Los ientes de Notchl; los genes objetivos de Notch y un regulador de la señalización Notch, la pre ) muestran números disminuidos de células madre iónicas. Adicionalmente , las células madre neú o se reducen en los cerebros de ratones heteroci (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; a por resultado la activación de la ruta Notch . , 1991, Cell 66:649-61). La activación constit eñalización Notchl en células T en modelos a de manera similar linfomas de células T que apel causante (Robey et al., 1996, Cell 87:483-l., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al. 98:3793-9; Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3 en, se ha encontrado que las mutaciones, ins ales Notchl que producen señalización Notchl frecuentemente presentes tanto en blástica/linforna , agudo, de células T, en os (Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol . 11: La inserción frecuente del virus de tumor atón tanto en el locus Notchl como el Notch4 en íos y los fragmentos resultantes activados de , implicaron primero a la señalización Notch e Cáncer Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995, Cel r. 6:563-77; Soriano et al., 2000, Int. J. 2- 9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol . 196 i et al., 2004, Semin. Cáncer Biol. 14:341 rciona evidencia para un papel para Notch en c de humano por los datos que muestra la expr tores Notch en carcinomas de mama y su correla tado clínico (Weijzen et al., 2002, Nat . Med. 8 et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14 : onalmente, la sobreexpresión de la ruta Notc vado en cánceres cervicales (Zagouras et al., 19 14-8), carcinomas de células renales (Rae et al J. Cáncer 88:726-32), carcinomas de células esca a y cuello (Leethanakul et al., 2000, Oncogene cánceres endometriales (Suzuki et al., 2000, . 17:1131-9) , y neuroblastomas (van Limpt et al enciación arterial -venosa (Iso et al., ioscler. Thromb. Vasc. Biol . 23:543). Por ejem iones nulas homocigotas en Notchl/4 y Dentadol érdida heterocigota de DLL4 da por resultado os hasta variables en el desarrollo art larización del saco vitelino. Adicionalmente , e atón, hipomórficos de Notch2 y deficientes DLLl ragia que probablemente resulta el pobre desar estructuras vasculares (Gale et al., 2004 5949-54; Krebs et al.,, 2000, Genes Dev. 14:1343 l., 1999, Hum. Mel . Genet . 8:723-30; Hrabe de An 1997, Nature 386:717-21; McCright et al., 20 91-502). En humanos, se asocian las mutaci dol con el síndrome de Alagille, un trast rrollo que incluye defectos vasculares, y las mu otch3 son responsables de demencia vascular os Estados Unidos Nos. 2008/0226621, 2008/Oll 0131908.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona nuevos ag a Notch y nuevos antagonistas de uno o más re humanos, así como métodos para usar estos a jonistas. La presente invención proporciona ademá éptidos, tal como anticuerpos que se unen a u tores Notch humanos, fragmentos de estos anticu s polipéptidos relacionados a estos anticuer as modalidades, la invención proporciona antagon 2 humano y/o Notch3 humano, incluyendo, pero no nticuerpos que se unen de manera específica o y/o Notch3 humano. Como se usa en la pres e "Notch2 y/o Notch3" significa "Notch2", "No to Notch2 como Notch3". En ciertas modalida ican para los polipéptidos, como son vecto enden los polinucleótidos . Además se prop as que comprenden los polipéptidos y/o polinuc a invención. También se proporcionan composició lo, composiciones farmacéuticas) que compren s antagonistas Notch. También se proporcionan usar los agentes y antagonistas, tal como méto los antagonistas Notch para inhibir el cre al, para reducir la tumorigenicidad de tumor ir la angiogénesis y/o para tratar cáncer medades asociadas con la angiogénesis.

En un aspecto, la invención proporciona u ejemplo, un anticuerpo) que se une de manera es dominio EGF10 (o un equivalente de un dominio E o más receptores Notch humanos. En ciertas moda ente es un anticuerpo. En ciertas modalidades, e modalidades, el agente se une a al menos part ncía HKGAL (SEQ ID NO: 28) dentro de EGF10 de No as modalidades, el agente se une a al menos par ncía HEDAI (SEQ ID NO: 29) dentro de EGF9 de Notc En ciertas modalidades de cada uno de los dalidades mencionadas anteriormente, así com tos y/o modalidades descritas en otra parte nte, el agente inhibe la unión de un ligando Notch3 humano- En algunas modalidades, el agent unión de un ligando a Notch2 humano. En idades, el agente inhibe la unión de un ligando tch3. En otras modalidades, el agente inhibe la igando a Notch3. En ciertas modalidades, el li , JAG1 o JAG2. En otras modalidades, el agente i ización de Notch2 y/o Notch3 humano. En idades, el agente inhibe la señalización de miento de cáncer.

En un aspecto adicional, la invención pro ticuerpo que se une de manera específica a No 3 humano, en donde el anticuerpo comprende (a) dena pesada que comprende SSSGMS (SEQ BD NO: 5), adena pesada que comprende VIASSGSNTYYADSVKG , y/o una CDR3 de cadena pesada que comprend ID N0:51); y/o (b) una CDR1 de cadena lig ende RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO: 8), una CDR2 d a que comprende GASSRAT (SEQ ID NO: 9), y/o una a ligera que comprende QQYSNFPI (SEQ ID " NO : as modalidades, el anticuerpo comprende (a) una a pesada que comprende SSSGMS (SEQ ID NO: 5) nte de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 susti rvadoras de aminoácido; una CDR2 de cadena pe rende VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 6), o una var ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido; y/o una CDR3 de cadena ligera que c FPI (SEQ ID NO: 10), o una variante de la m ende 1# 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido. También se proporcionan compo céuticas que comprenden el anticuerpo y méto el anticuerpo para usos para inhibir la angio ir el crecimiento tumoral, reducir la tumorigeni mor, y/o tratar cáncer. En un aspecto ad nvención proporciona anticuerpo que se une d ífica a Notch2 y/o Notch3 humano, en donde el an ende (a) una CDRl de cadena pesada que comprend ID NO: 5), una CDR2 de cadena pesada que c GSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 6), y/o una CDR3 de a que comprende GIFFAI (SEQ ID NO:7) y/o (b) adena ligera que comprende RASQSVRSNYLA (SEQ I comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conserva ácido; y/o una CDR3 de cadena pesada que c I (SEQ ID N0:7), o una variante de la mi ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que c VRSNYLA (SEQ ID N0:8) , o una variante de la m ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido; una CDR2 de cadena ligera que comprende ID NO: 9), o una variante de la misma que compren 4 sustituciones conservadoras de aminoácido; de cadena ligera que comprende QQYSNFPI (SEQ ID a variante de la misma que comprende 1, 2, ituciones conservadoras de aminoácido. Tam orcionan composiciones farmacéuticas que compr cuerpo y métodos para usar el anticuerpo para inhibir la angiogénesis , inhibir el crecimiento , una CDR2 de cadena ligera que comprende GASS O: 9), y/o una CDR3 de cadena ligera que c FPI (SEQ ID NO: 10) . En algunas modalida uerpo comprende una CDR3 de cadena pesada que c T (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el an ende una CDR3 de cadena pesada que comprende ID NO: 23) . En otras modalidades, el anticuerpo c CDR3 de cadena pesada que comprende SSFYAS ) . En ciertas modalidades, el anticuerpo compr de cadena pesada que comprende . SSFFAT (SEQ ID NO as modalidades, el anticuerpo comprende una a pesada que comprende SIFYPS (SEQ ID NO: 26) . modalidades, el anticuerpo comprende una CDR3 d a que comprende SSFFAN (SEQ ID NO: 27) . Ta rcionan composiciones farmacéuticas que compr uerpo y métodos para usar el anticuerpo para n variable de cadena ligera) que tiene al meno idad de secuencia a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: O:39 (con o sin secuencia de señal). En idades, el polipéptido es un anticuerpo. En idades, el polipéptido se une de manera espe 2 y/o Notch3 humano. En algunas modalida éptido se une de manera específica a Notch2 hur as modalidades, el polipéptido se une a Notch2 y lgunas modalidades, el polipéptido se une a No as modalidades, el polipéptido un polipéptido q enos aproximadamente 85%, al menos aproximadame eños aproximadamente 95%, al menos aproximadament imadamente 100% de identidad de secuencia a SE SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 50. También se prop siciones farmacéuticas que comprenden el polip os para usar el polipéptido para usos tal como idad de secuencia a SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: secuencia de señal. En ciertas modalida éptido comprende un polipéptido que tiene a imadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, imadamente 95%, al menos aproximadamente imadamente 100% de identidad de secuencia a SEQ EQ ID NO:40. También se proporcionan compo céuticas que comprenden los anticuerpos y méto r cáncer que comprenden administrar ca éuticamente efectivas de los anticuerpos.

En otro aspecto, la invención proporc éptido (por ejemplo, un anticuerpo o una cadena a ligera de anticuerpo) que comprende: éptido que tiene al menos aproximadamente tidad de secuencia a SEQ ID NO: 50; y/o (b) un pol tiene al menos aproximadamente 80% de ident enden administrar cantidades terapéuticamente e s anticuerpos.

En otro aspecto, la invención proporc uerpo que comprende, consiste, o consiste esenc anticuerpo IgG2 59R1 que comprende la cadena a ligera de SEQ ID NOs : 16 y 18 (con o sin secu ) , respectivamente, o como se codifica por itado con la American Type Culture Collection l University Boulevard, Manassas, VA, EUA, h iciones del tratado de Budapest el 15 de Oct , y el número de designación PTA-9547 asignado. roporcionan composiciones farmacéuticas que compr uerpo y métodos para usar el anticuerpo para inhibir la angiogénesis , inhibir el crecimiento cir la tumorigenicidad de un tumor, y/o tratar cá En un aspecto adicional, la invención pro ir la tumorigenicidad de un tumor, y/o tratar cá En otro aspecto, la invención proporc uerpo que compite para la unión específica a No 3 humano con un anticuerpo que comprende un ble de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: n variable de cadena ligera que comprende SEQ ID iertas modalidades, el anticuerpo compite para ífica con un anticuerpo IgG2 59R1 que comp a pesada y cadena ligera de SEQ ID NOs : 16 y 1 secuencia de señal) , respectivamente, o como se l ADN depositado con la ATCC el 15 de Octubre de el número de asignación PTA-9547, asignado. En lidades, el anticuerpo compite para la unión o. En algunas modalidades, el anticuerpo compite a Notch2 y Notch3 humano. En otras modalid cuerpo compite para la unión a Notch3 humano. Ta a que comprende SEQ ID NO: 13. En algunas moda nticuerpo compite para la unión específica uerpo 59R5 que comprende la cadena pesada a de SEQ ID NOs : 49 y 18, respectivamente, o ica por el ADN depositado con la ATCC el 6 de J y el número de designación asignado [...]. En idades, el anticuerpo compite para la unión o. En algunas modalidades, el anticuerpo comp a Notch2 y Notch3 humano. En otras modalid uerpo compite para la unión a Notch3 humano. Ta rcionan composiciones farmacéuticas que compr cuerpo y métodos para usar el anticuerpo para inhibir la angiogénesis , inhibir el crecimiento cir la tumorigenicidad de un tumor y/o tratar cán En ciertos aspectos diferentes, la i orciona un polipéptido (con o sin una secuencia d 2 humano y/o Notch3 humano. En ciertas modal id uerpo se une de manera específica a Notch2 hu as modalidades, el anticuerpo se une de ífica a Notch2 humano y Notch3. En ciertas moda ticuerpo se une de manera específica a Notch3 hu aspecto, la invención proporciona un polinucleó ende una secuencia seleccionada del grupo que EQ ID N0:1, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID D NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: :60.

En otro aspecto, la invención proporciona u modular la función de pericitos y/o células del vascular en un sujeto (por ejemplo, en el sit u otra angiogénesis anormal en el sujeto) . En Üdades, el método comprende administrar una iva de un agente que se une de manera espe itos y/o células del músculo liso vascular tado la inhibición de la angiogénesis y/o el cre al .

En aún otro aspecto, la invención propor o para inhibir la angiogénesis (por génesis tumoral) en un sujeto. En ciertas moda étodo comprende administrar al sujeto una iva de un agente que se une de manera espe 2 humano y/o Notch3 humano. En ciertas modalid e es un antagonista. En algunas modalidades, e e de manera específica a y es un antagonista d o. En ciertas modalidades, el agente se une d cífica a y es un antagonista de Notch3 humano. En lidades, el agente es un antagonista tanto de 3. En algunas modalidades, el antagonista cuerpo. En ciertas modalidades, el agente o para inhibir la angiogénesis al modular la fu ericitos y/o células del músculo liso vascular.

En un aspecto adicional, la invención pro étodo para inhibir el crecimiento de un tumo o. En ciertas modalidades, el método c istrar al sujeto una cantidad terapéuticamente n antagonista de Notch2 humano y/o Notch3 hu as modalidades, el antagonista es un anticuerp de ' manera específica a Notch2 humano. En lidades, el antagonista es un anticuerpo que se a específica tanto a,Notch2 humano como a Notch3 iertas modalidades, el antagonista es un anticu e de manera específica a Notch3. En algunas moda tagonista es un anticuerpo descrito en cualquier ctos y/o modalidades mencionadas anteriormente, s aspectos y/o modalidades descritas en la pres cionar el sujeto para tratamiento con un antago 2 y/o Notch3 si el tumor comprende la supr ión. En algunas modalidades, el sujeto se trat onista de Notch2. En algunas modalidades, el s con un antagonista de Notch2 y Notch3. En idades, el sujeto se trata con un antagonista de lgunas modalidades el antagonista es un anticu as modalidades, el tumor es un tumor de mama.

En otro aspecto, la invención proporc uerpo que se une de manera específica a una regi a ligando de un dominio extracelular de al tor Notch humano (por ejemplo, 1, 2, 3, o 4 re ) . En ciertas modalidades, la región de no do comprende o consiste de la repetición 10 de E tor Notch humano (o un equivalente de EGF10, de Notch3 humano) . En algunas modalidades, el a idades, el receptor Notch adicional es Notch3. roporcionan composiciones farmacéuticas que co nticuerpos y métodos para tratar cáncer, que co istrar cantidades terapéuticamente efectivas uerpos .

En un aspecto adicional, la presente i rciona un anticuerpo que se une de manera espe o más (es decir al menos dos, tres o cuatro) re humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo s a específica a una región de no unión a ligan io extracelular de dos o más receptores Notch iertas modalidades, si los dos o más receptor os comprenden Notchl, Notch2, o Notch4, en antic a EGF10 de Notchl, Notch2 , o Notch4, y si los d tores Notch humanos comprenden Notch3 , anticuerp F de Notch3. En ciertas modalidades, la regió uerpos y métodos para tratar cáncer, que co istrar cantidades terapéuticamente efectivas uerpos .

En aún otro aspecto, la invención propor uerpo aislado que se une de manera específic n de no unión a ligando de un dominio extracelul tor Notch2 humano e inhibe el crecimiento tum la región de no unión a ligando comprende o con epetición 10 de EGF del receptor Notch2 huma lo, SEQ ID NO:36). En algunas modalidades, el an e une a ninguna región de Notch2 humano fuer ición 10 de EGF. En ciertas modalidades, el an én se une de manera específica a la repetición 1 equivalente) de al menos un receptor Notch ional (por ejemplo, EGF9 de Notch3) . En idades, el anticuerpo se une a EGF10 de Notch2 repetición 9 de EGF del receptor Notch3 valente a EGF10 en los otros receptores Not as modalidades, el anticuerpo no se une a ningun tch3 humano fuera de la repetición 9 de EGF. En idades, el anticuerpo también se une de ífica a la repetición 10 de EGF de al menos un humano adicional. En algunas modalidades, el an e a EGF9 de Notch3 humano y a EGF10 de Notch2. roporcionan composiciones farmacéuticas que co anticuerpos y métodos para tratar cáncer que co istrar cantidades terapéuticamente efectivas uerpos .

En un aspecto aún adicional, la i rciona un anticuerpo que se une a una región de gando de un dominio extracelular de un recept o y comprende: (a) una CD 1 de cadena pes tor Notch3 humano. En un aspecto adicional, la i rciona un anticuerpo que compite con este an la unión específica a una región de no unión a n dominio extracelular de Notch2 en un ensayo titiva. También se proporcionan compo céuticas que comprenden los anticuerpos y méto r cáncer que comprenden administrar ca éuticamente efectivas de los anticuerpos. Ta rcionan métodos para inhibir la angiogéne enden administrar las composiciones.

En otro aspecto, la invención proporc uerpo que se une a una región de no unión a li ominio extracelular de un receptor Notch h rende : (a) una CDRl de cadena pesada que comprend ID NO: 5), una CDR2 de cadena pesada que c SGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO : 6 ) , y/o una CDR3 d modalidad, la invención proporciona un anticu te con este anticuerpo para la unión específic n de no unión a ligando de un dominio extrace 2 es un ensayo de unión competitiva. Tam rcionan composiciones farmacéuticas que compre uerpos y métodos para tratar . cáncer que co istrar cantidades terapéuticamente efectivas uerpos. También se proporcionan métodos para in génesis que comprenden administrar las composici En ciertas modalidades de cada uno de los odalidades mencionadas anteriormente, así com ctos y/o modalidades descritas en otra parte enté, el anticuerpo se une de manera específica h2 humano como a Notch3 humano.

En ciertas modalidades de cada uno de los odalidades mencionadas anteriormente, así com specífico . En ciertas modalidades, un sitio in nión al antígeno del anticuerpo se une (o es e) a una región de no unión a ligando del celular de más de un receptor Notch humano (por 2 y Notch3) . En ciertas modalidades alternat uerpo es un anticuerpo biespecífico . En lidades, el anticuerpo es un anticuerpo tipo as modalidades, el anticuerpo es un anticue . En ciertas modalidades, el anticuerpo se conju ión citotóxica. En ciertas modalidades, el an aislado. En aún modalidades adicionales, el an stancialmente puro.

En ciertas modalidades de cada uno de los odalidades mencionadas anteriormente, así com ctos y/o modalidades descritas en otra part enté, el cáncer o tumor tratado con el anticuer dalidades mencionadas anteriormente, así com tos y/o modalidades descritas en otra parte nte, . los métodos para tratar cáncer comprenden recimiento tumoral . En ciertas modalidades, los tratar cáncer comprender reducir la tumorigeni tumores (por ejemplo, al reducir la frecuencia I as madre de cáncer en el tumor) .

En ciertas modalidades de cada uno de los dalidades mencionadas anteriormente, así com tos y/o modalidades descritas en otra parte nte, el antagonista o anticuerpo se administ o en combinación con un tratamiento adicion r. En ciertas modalidades, el tratamiento adicio r comprende terapia de radiación, quimioterapia cto terapéutico de anticuerpo adicional. En idades, el tratamiento adicional para cáncer c nativas, el producto terapéutico de anticuerpo a anticuerpo que se une de manera específica al f miento de células endoteliales vasculares (VE as modalidades, el producto terapéutico adiciona ceptor de VEGF .

En ciertas modalidades de cada uno de los dalidades adicionales, así como otros aspec idades descritas en otra parte de la prese uerpo se administra a un sujeto en combinació do agente terapéutico que es un agente anti-angi Adicionalmente , mediante la invenci rcionan líneas celulares (por ejemplo, líneas de ibridoma) que comprende o que producen los antic polipéptidos descritos en la presente. Tam rcionan polinucleót idos (por ejemplo, vector enden los polinucleótidos descritos en al p uerpo que se une a un receptor Notch. En un asp cular, la presente invención proporciona un mét r cáncer, en donde el cáncer comprende células m san uno o más miembros de la familia de receptor comprende administrar al sujeto una éuticamente efectiva de un anticuerpo que se une ros de la familia de receptores Notch. La ción proporciona anticuerpos que se unen a un do nión a ligando del domino extracelular de un humano receptor y son terapéuticamente efectivo r. De esta manera, en ciertas modalidades, la ción proporciona un anticuerpo que se une d ífica a una región de no unión a ligando el celular de un receptor Notch humano y que i imiento tumoral . En ciertas modalidades, la ción proporciona además un método para tratar cá se expresan altamente en ciertos tumores sóli ío, mama y colon, y esto proporciona una cavidad có activo donde el fármaco se une al receptor N ipa que los anticuerpos que se unen a receptor expresados tienen un mejor perfil de seguridad cos quimioterapéuticos actualmente disponibles.

La invención proporciona además un méto r cáncer en un humano, en donde el cánce ende células madre de cáncer no está caracteri bre-expresión por la célula madre de cáncer de u tores Noten, que comprende administrar al hu dad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo a un receptor Notch y bloquea la activación por receptor Notch.

La invención proporciona además un méto r cáncer en un humano que comprende admini ende administrar una cantidad terapéuticamente anticuerpo que se une a Notch. La invención rciona otro método para tratar cáncer, en d r se selecciona del grupo que consiste de c , de colon, pancreático, de próstata, de pulmón, rectal, que comprende administrar una éuticamente efectiva de un anticuerpo que bl ación por ligando de un receptor Notch. La i én proporciona aún otro método para tratar cá el cáncer se selecciona del grupo que con r de maman, de colon, pancreático, de próst n, rectal y colorrectal, que comprende adminis idad terapéuticamente efectiva en un anticuerpo a Notch y un anticuerpo que bloquea la activa do de un receptor Notch.

En modalidades adicionales, la i íente y una composición contenida en el mismo, mposición comprende un anticuerpo que se une a 3 ende además una inserción de envase que indic sición se puede usar para tratar cáncer que c as madre de cáncer que expresan uno o más re .

En ciertas modalidades, la invención se ionalmente a un artículo de manufactura que comp íente y una composición contenida en el mismo, omposición comprende un anticuerpo que se u tor Notch y bloquea la activación por ligand tor Notch, y comprende además una inserción d indica que la composición se puede usar par er, en donde el cáncer comprende células madre d no se caracterizan por la sobreexpresión del tor Notch.

En algunas modalidades, se proporciona un onal de manufactura que comprende un recipient sición contenida en el mismo, en donde la com ende un anticuerpo que se une a Notch y bl ación por ligando de un receptor Notch, y c s una inserción de envase que indica que la com uede usar para tratar un cáncer seleccionado d onsiste de cáncer de colon, pancreático, de prós n, rectal y colorrectal .

La invención proporciona adicionalmen uerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano o un an izado) que se une a Notch y bloquea la activa do de un receptor Notch; una composición que c ticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptab conjugado que comprende el anticuerpo conjugad modalidades, un proceso para producir el an ende cultivar una célula hospedera que compr ucleótido de modo que se exprese al polinucle nalmente, comprende además recuperar el anticu vo de células hospederas (por ejemplo, el m vo de células hospederas) .

Además, la invención proporciona un polinu do que codifica para un anticuerpo humano o hu se describe en las modalidades o aspectos men iormente, así como se describe en otra part nte; un vector que comprende el polinucleóti a hospedera que comprende el polinucleótido o el omo un proceso para producir el anticuerpo que c var una célula hospedera que comprende el polinu odo que se exprese el polinucleótido, y opcion ende además recuperar el anticuerpo del cul iben en términos de un grupo Markush u otro agru lternativas, incluyendo, pero no limitado a, g nativas separadas por "y/o" u uo," la presente i a no solo el grupo completo listado como una to cada miembro del grupo individualmente y t les subgrupos del grupo principal, pero también ipal ausente uno o más de los miembros del g nte invención también contempla la exclusión e no o más de cualquiera de los miembros del gru ción reivindicada. Por ejemplo, la redacción tal Y" expresa "X" de manera individual, "Y" d idual, así como "X" e "Y" conjuntamente.

Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1F: Anticuerpos 59R1 y variantes tch2 humano y bloquean la unión a ligando. F isis por FACS de la unión por Fab 59R1 a Notch2 a ligando en el ensayo. Figura 1C análisis por ión del anticuerpo IgG2 59R1 a Notch2 humano en 3 establemente transfectadas . El anticuerpo IgG2 ó que se une a Notch2 humano en células lemente transfectadas . Figura ID análisis por eo de unión a ligado (DLL4) por anticuerpo IgG2 ó que el anticuerpo IgG2 59R1 bloquea la unió n hDLL4 ECD-Fc a Notch2 humano en células lemente transfectadas . Figura 1E estrate ación por afinidad para CDR3 de cadena pesada ecuencia parental de la CDR3 de cadena pesada de ra en cuadro. Los cambios de residuo permitidos ndica más adelante de la secuencia parentera a. Figura 1F examen de las secuencias de 59R1 m afinidad para la capacidad de bloqueo de J ntes mejoradas se indican con flechas. nadante de células HEK 293 que expresan prot n de Notch2-Fc recombinantes con las repeticione adas de Notch2 entre 1 y 12 (eje x) se usaron c anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3. El OD (eje y) i a anticuerpo (barras plumeadas) solo a prot n de Notch2 que comprende la repetición 10 de a muestra datos obtenidos de dos experimentos s e muestran de manera separada en las gráficas su ondo) . (Figura 3B) las repeticiones 11 y 12 de comprendidas en el anticuerpo 59R1 anti-Notch2/ a hNotch2 de longitud completa. Análisis por as HEK 293 transfectadas con proteína fluorescen ) (eje x) sola (parte superior izquierda) fectadas con GFP y ya sea Notch2 intacto de leta o con Notch 2 de longitud completa con la re e EGF suprimida (AEGFll) o la repetición 12 e la señalización de Notch2 en ensayos de indi erasa. (Figura 4A) 59R1 bloquea actividad de i otch2 inducida por hDLL4. (Figura 4B) 59R1 idad de indicador de Notch2 inducida por hJAGl . 59R1 bloquea la actividad de indicador de Notch2 JAG2 Figura 5A-5F: Anticuerpo 59R1 de receptor e la formación y crecimiento tumoral in vivo. Anti-Notch2/3 (59R1) Inhibe la formación de tu PE13. Se trataron ratones NOD/SCID inyecta ias de tumor de mama PE13 con el anticuerpo de drado) o el anticuerpo 59R1 anti -Notch2 /3 (tr rtos) dos días después de la inyección de las c idio el volumen tumoral (eje y, mm3) a través de x, días después de la inyección de las célu amiento con los anticuerpos 59R1 inhibió de significativa la formación tumoral en compar ol. (p < 0.001). (Figura 5C) Anti-Notch2/3 (59R1 recimiento de Tumores de Colon Colo-205. Ratone XID inmunodeficíentes de 6-8 semanas de edente Swiss CD-1 inyectados con células de Colo-205 se trataron con el anticuerpo de rados) o el 59R1 anti-Notch2/3 (diamantes) des olumen tumoral alcanzó un tamaño entre 65 a 200 el volumen tumoral medio (eje y, mm ) a tr o (eje x, días después de inyección de célu miento con anticuerpo 59R1 el crecimiento tu ración al control (*** p < 0.001 después del ra 5D) Anti-Notch2/3 (59R1) Inhibe el Crecim res Pancreáticos PN4. Ratones NOD/SCID inyect las tumorales pancreáticas PN4 se trataron con an control (cuadrados) o anticuerpo 59R1 anti- anti-Notch2/3 (diamantes) después de que el al alcanzó un tamaño entre 65 a 200 mm3. Se en tumoral medio (eje y, mm3) a través del tie ías después de la inyección celular) . El tratami uerpo 59R1 inhibió el crecimiento tumoral en com ntrol (* p < 0.05 después del día 57) . (Figura 5 2/3 (59R1) Inhibe el Crecimiento de Tumores de I es NOD/SCID inyectados con células de tumor de rataron con anticuerpo de control (barras so uerpo 59R1 anti-Notch2/3 (barras abiertas) de el volumen tumoral alcanzó un tamaño entre 65 a olumen tumoral medio se midió en los días 18, 2 spués de la inyección de las células. El tratami uerpo 59R1 inhibió el crecimiento tumoral en com ntrol (*** p < 0.001 en el día 42) .

Figura 6: Anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 re miento tumoral en un modelo de xenoinjerto de t Figura 10: Anticuerpo 59R1 anti -Notch2/3 i miento de tumores de colon C28 solo y en combina tecano .

Figuras 11A-11H: Anticuerpo 59R1 tipo IgG rma significativa el crecimiento tumoral de xeno lecidos de tumor humano in vivo. Los lecidos de Colo-205 (Figura 11A) , C8 (Figura 1 ra 11C) , B34 (Figura 11D) , B39 (Figura 11E) , B44 , PE-13 (Figura 11G) y TI (Figura 11H) (s.c, ) se trataron a 15 mg/kg una vez a la semana uerpos indicados (1B711, anticuerpo de contr os negros; 59R1, triángulos negros; AVASTIN, S; AVASTIN + 5 R1, diamantes negros) . El volumen x) se gráfico con respecto al tiempo (eje y) miento con 59R1 en varios modelos de t njerto. Los niveles de expresión de HEYL (Figu 3 (Figura 12B) , RGS5 (Figura 12C) , ANGPT1 (Figur 2 (Figura 12E) se probaron de manera indivi sis TaqManMR de modelos de xenoinjerto anter dos . De forma notable, la carencia de estróg el efecto de 59R1 al reducir la expresión de 2 en el estroma hospedero de ratones que tienen los abiertos corresponden a tumores zados. Línea horizontal, media.

Figura 13 : El gen PTEN supresor tumoral se uchos de los tumores de mama en los cuales 59R encia anti-tumor. Se muestran el exón P ibución de la sonda Affymetrix, y las supresion PTEN en el cromosoma 10. Las barras gruesas y eadas en gris indican las supresiones homoci eños parte del epítopo 59R1 como se define por CS del anticuerpo IgG2 59R1 a un mutante hNotc -89 SN (Figura 14B) y a una construcción hNotc se ha mutado aa 382-386 para corresponder a la s otch2 (Figura 14C) . (Figura 14B) el anticuerpo I e a hNotch2, pero no a hNotch2 mutante en el cua o ciertos residuos de EGF 10 a résiduos de N AL 388-89 SN) . (Figura 14C¾ el anticuerpo IgG2 e a hNotchl, sino que se une a un hNotchl mutan se han mutado ciertos residuos de EGF 10 (aa corresponder a los residuos 385-389 de hNotcti2.

• Figuras 15A-15B. Caracterización in vi tro ra 15A) la Figura 15A muestra que el anticuerpo Z de bloquear la señalización inducida por li 2 y Notch3. Se transfectaron de manera tra las tumorales PC3 con el receptor Notch humano o os a los residuos correspondientes de Notch2 én se co-transfectaron células con un plásm ica para la proteína fluorescente verde (GF r aquellas células que recibieron el fectado. Las células se incubaron con 59R1 o uerpo secundario fluorescente luego se examin Las regiones resaltadas por los cuadros sugi células transfectadas con el vector de expresi ado fueron capaces de unirse a 59R1 o 59R5.

Figuras 16A-16C. El anticuerpo 59R5 de inhiben la formación y crecimiento tumoral in a 16A muestra el tratamiento in vivo de células ma de PE13 con el anticuerpo 59R5. La Figura 16B ratamiento in vivo en células de colón C28 uerpo 59R5. La Figura 16C muestra el tratamiento lulas de colón Colo205 con el anticuerpo 59R5. ama PE13 los tumores se dejaron crecer durante de que se iniciaran los tratamientos. Los ani ron con TAXOL a 15 mg/kg dos veces por semana d as, más ya sea el anticuerpo de control (cuad (círculos) . Después de 5 semanas, se detuvie mientos con TAXOL y los tratamientos con antic nuaron .

Figura 18. Regulación de la expresión g es después de tratamiento con anticuerpo 59R5. L estra los niveles de expresión de genes seleccio as del estroma y genes humanos seleccionados en ales PE 13 después del tratamiento con 59R1, uerpo de control .

Figuras 19A-19D. Reducción de frecuencia de de cáncer de mama PE13 por 59R1. (Figura ron tumores establecidos con el anticuerpo de ologies, Inc.). (Figura 19B) Frecuencia de célul áncer en tumores de mama PE 13 después del tra 9R1 y/o taxol. (Figura 19C) Frecuencia de célul ncer en tumores pancreáticos PN4 después de tra 9R1 y/o gemcitabina. (Figura 19D) Frecuencia de de cáncer en tumores de mama PE13 desp miento con 59R5 y/o taxol. Un asterisco in a una diferencia estadísticamente significati ) versus el grupo tratado con anticuerpo de cont asterisco indica una diferencia significativa v tratado con taxol y el anticuerpo de control.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona nuevos yendo pero no limitado a polipéptidos t uerpos, que se unen a uno o más receptore os, tal como Notch2 y/o Notch3. Los agentes que La presente invención identifica además m ejemplo, anticuerpos) que se unen de manera espe egión de no unión a ligando del domino extrace ceptor Notch humano e inhiben el crecimiento tu . La región de unió a ligando de Notch, que es n iciente para la unión a ligando, se ha identific iciones 11 y 12 de EGF, sugiriendo que esta re tor Notch es importante en la señalización Notch igénesis (Rebay et al., 1991, Cell 67:687; Leí Dev. 130:6411; Hambleton et al., 2004, S 73) . De manera inesperada, se ha encontrado uerpos que se unen fuera del dominio de unión a dominio extracelular de receptor Notch humano in miento de células tumorales in vivo (ver Public te de los Estados Unidos No. 2008/0131434, inc a presente como referencia en su totalidad) . gando a Notch2 (Ejemplo 1 y Figuras 1A-1D) e i ización de Notch2 inducida por ligando (Ejem as 4A-4C) , a pesar de unirse a Notch2 en un de la región de unión a ligando. 59R1 también s a específica a Notch3 humano (Ejemplo 2 y Figur ncontrado que el anticuerpo previene o in miento de células tumorales in vivo en una var entes modelos de xenoinjerto, ya sea sol nación con un segundo agente anti-cáncer (Ejempl 9 y Figuras 5A-F, 6, 8- 10, y 11A-H) . Tambié ado que el anticuerpo reduce la tumorogenecida in vivo en múltiples modelos de xenoinjerto al recuencia de células madre de cáncer (Ejemplos as 7 y 19A-C) . Además, se encontró que el tra 59R1 reduce la expresión de RGS5 (un marca itos y/o células del músculo liso y/o célu las rutas de los genes del ciclo celular, l adores de myc y varios conjuntos de genes de se reducen en expresión por 59R1 (Ejemplo 22) .

También se ha desarrollado un anticuerp onal 59R5. 59R5 tiene propiedades que son sim , tal como afinidad similar de unión a Notch2 y J itudes o traslapes en sus epítopos (Ejemplo 13 . Se ha mostrado que el anticuerpo 59R5 tiene a ar como 59R1 al bloquear la señalización de 3 (Ejemplo 13 y Figura 15A) . El anticuerpo 59R5 a mostrado que inhibe el crecimiento tumoral in s modelos en injerto, ya sea solos o en combina gundo agente anti -cáncer.

Ejemplos 14 y 15 Figuras 16A-16C y 1 ás, se encontró que el tratamiento con 59R5, al i , reduce la expresión de RGS5, Notch3 , y Hey aliza de manera parcial o completa una a gica de la ruta Notch. Las moléculas anta adas incluyen de manera específica ant onistas o fragmentos de anticuerpo.

El término "anticuerpo" se usa para quer molécula de inmunoglobulina que reconoce y se a específica a un objetivo o diana, tal c ína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinuc o o combinaciones de lo anterior, etcétera, a t enos un sitio de reconocimiento de antígeno dent n variable de la molécula de inmunoglobulina. en la presente, el término abarca ant lónales intactos, anticuerpos monoclonales i entos de anticuerpos (tal como fragmentos Fa ')2, y Fv) , mutantes de Fv de cadena individual cuerpos multiespecíficos tal como ant ios constantes de cadena pesada referidos co , epsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las di s de inmunoglobulinas tienen diferentes y bien c cturas de subunidad y configuraciones tridimens anticuerpos pueden estar expuestos o estar conj moléculas tal como toxinas, radioisótopos, etcé Como se usa en la presente, el término uf nticuerpo" se refiere a una porción de un an to y se refiere a las regiones variables deter énicas de un anticuerpo intacto. Los ejem éritos de anticuerpos incluyen, pero no se l entos Fab, Fab' , F(ab')2, y Fv, anticuerpos 1 uerpos de cadena individual, y ant iespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo Un "anticuerpo de Fv" se refiere al frag uerpo mínimo que contiene un sitio completo de definir la especificidad de unión a antígeno de v. De manera alternativa, se puede usar un ble individual (o la mitad de un Fv) para rec e al antígeno, aunque en general con menor afini Un "anticuerpo monoclonal" como se usa nte se refiere a una población homogénea de ant endida en el reconocimiento altamente específico de un determinante antigénico individual, o es en contraste a anticuerpos policlonales que amente diferentes anticuerpos dirigidos entes determinantes antigénicos. El término "an lonal" abarca anticuerpos monoclonales tanto de longitud completa así como fragmentos de an como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , mutantes de idual (scFv) , proteínas de fusión, que compre ión de porción de anticuerpo, y cualquier otra oglobulina, inmunoglobulinas quiméricas, o fragm mismos que contiene secuencias no humanas amente, los anticuerpos humanizados son inmunogl as en las cuales se reemplazan residuos de l minante de complementariedad (CDR) por residuo de una especie no humana (por ejemplo ratón o, hámster, etcétera) que tiene la especi dad y capacidad, deseadas. En algunos cas úos de la región menos variable (FR) de Fv oglobulina humana se reemplazan con los spondientes en un anticuerpo de una especie n iene la especificidad, afinidad y capacidad dese uerpo humanizado se puede modificar adicionalm ustitución del residuo adicional ya sea en l s variable de Fv y/o dentro de los residuos no lazados para refinar y optimizar la especi oglobulina, típicamente aquella de una inmunog a. Los ejemplos de métodos usados para uerpos humanizados se describen en la Patente os Unidos No. 5,225,539, incorporada en la prese encia .

Una "región variable" de un anticuerpo se r región variable de la cadena ligera de anticue n variable de la cadena pesada de anticuerpo, o en combinación. Las regiones variables de l a y ligera consisten en cada una de cuatro variables (FR) conectadas por tres minantes de complementariedad (CDR) también co nes hipervariables . Las CDR en cada cadena se m ntamente en proximidad cercana por las FR y con a otra cadena, contribuyen a la formación del a antígeno de los anticuerpos. Hay al me El término "anticuerpos humanos" como se u nte, significa un anticuerpo producido por un nticuerpo que tiene una secuencia de aminoáci sponde a un anticuerpo producido por un humano p o cualquiera de las técnicas conocidas. Esta de anticuerpo humano incluye anticuerpos de intac tud completa, fragmentos de los mismos, y/o ant comprenden al menos un polipéptido humano de a y/o ligera, tal como, por ejemplo, un anticu ende polipéptidos murinos de cadena ligera y hut 1 a pesada .

"Anticuerpos híbridos" son molécul oglobulina en las cuales se montan conjuntamen adenas pesadas y ligeras de anticuerpos con di nes determinantes antígenas de modo que se ocer dos diferentes epítopos o dos diferentes a ogas a las secuencias en los anticuerpos deri (usualmente humano) para evitar producir una r itaria en esa especie.

El término "epítopo" o "determinante antigé de manera indistinta en la presente y se re ia porción de un antígeno capaz de ser reconoci e específicamente por un anticuerpo particular ntígeno es un polipéptido, se pueden formar de aminoácidos contiguos como de aminoác guos yuxtapuestos por plegado terciario de una p amente, los epítopos formados de aminoácidos c etienen en la desnaturalización de la proteína, los epítopes formados por plegado terciario típ pierden en la desnaturalización de la p camente, un epítopo incluye al menos 3, y más usu enos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación ds in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina- to, de fase sólida (ver Kirkland et al., J. , 137:3614-3619); ensayo marcado, directo, a, ensayo de intercalación, marcado, directo, a (ver Harlow y Lañe, 1988, Antibodies, A La l, Cold Spring Harbor Press) ; RIA de marca o marca 1-125 (ver Morel et al., 1988, Molec . ):7-15); EIA de biotina-avidina , directo de fas ng et al., 1990, Virology 176:546-552); y RIA to (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol Típicamente, este ensayo comprende el uso de ficado, unido a una superficie sólida o cél en cualquiera de estos, una inmunoglob lina de p ada y una inmunoglobulina de referencia marc ición competitiva se mide al determinar la can a unida a la superficie sólida o a célula o, inhibirá la unión específica de un anticu encia a un antígeno común por menos 50 o 75 %.

Que un anticuerpo "se une de forma selectiv e manera específica" a un epítopo o receptor s el anticuerpo reacciona o se asocia más frecuen rápidamente, con mayor duración, con mayor afí lguna combinación de lo anterior al epítopo rece sustancias alternativas, incluyendo proteí ionadas. "Se une de manera selectiva" o "se a específica" significa, por ejemplo, que un an e a una proteína con un KD de aproximadamente , más usualmente aproximadamente 1 µ? o menos, anera selectiva" o "se une de manera esp fica en momentos que un anticuerpo se une a una una KD de aproximadamente 0.1 mM o menos , imadamente 1 µ? o menos, a veces aproximadament ntiende que, en ciertas modalidades, un antie on de unión que se une de manera específica a u ivo o diana puede unirse o no de manera específ do objetivo. Como tal, la wunión específica" no ariamente (aunque puede incluir) unión exclus , unión a un objetivo o diana individual. a, un anticuerpo, en ciertas modalidades, pued rma específica a más de un objetivo (por ejemplo tch3 humano) . En ciertas modalidades, los m ivos o diana se pueden unir por el mismo sitio ntígeno en el anticuerpo. Por ejemplo, un an comprender, en ciertos casos, dos sitios idén al antígeno, cada uno ' de los cuales se une d ífica a dos o más receptores Notch humanos (por 2 y Notch3 humano) . En ciertas modalidades alte nticuerpo puede ser biespecífico y comprender Como se usa en la presente, los términos " ífica" y "unión de fondo" cuando se usa en refe teracción de un anticuerpo y una proteína o pé re a una interacción que no es dependiente ncía de una estructura particular (es de uerpo se está uniendo a proteínas en general, a estructura particular, tal como un epítopo) .

Los términos "aislado" o "purificado" se re ial que está sustancial o esencialmente libre nentes que normalmente lo acompañan en su estado amente, la pureza y homogeneidad se determina icas de química analítica, tal como electroforesi oliacrilamida o cromatografía líquida de alto de proteína (por ejemplo, un anticuerpo) o ácido es la especie predominante presente en una prepar fica de manera sustancial purificada. En partic Como se usa en la presente, los términos "c eroso" se refieren a, y describen la c lógica en mamíferos en la cual una población de aracterizan por crecimiento celular desregula los de cáncer incluyen, pero no se limitan a, ca rna, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemp culares de estos cánceres incluyen cáncer de osas, cáncer de pulmón de células pequeñas, c n de células no pequeñas, adenocarcinoma del inoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo ocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer panc lastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cá o, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, c , cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o inoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, c do, cáncer de próstata, cáncer vulval , cá ancerosas .

"Metástasis" como se usa en la presente se roceso por el cual un cáncer se extiende o tr el sitio origen a otras regiones del cuerpo rollo de una lesión cancerosa similar en l ción. Una célula "metastática" o "metastatizante pierde contactos adhesivos con las células v mediante la corriente sanguínea o linfas desde rio de enfermedad para invadir estructuras co as .

Como se usa en la presente, el término "su re a cualquier animal (por ejemplo, un ma yendo, pero no limitado a humanos, primates no res, y similares, que va a ser el recepto miento particular. Típicamente, los términos ws iente" se usan de manera indistinta en la pre ricas para auto-renovación o auto-mantenimient edades de las "células madre de cán las madre de tumor" o "células madre de tumor eren a estas células madre de cáncer la capa r tumores palpables que el trasplante en seri inmunocomprometido en comparación a la may as tumorales que fallan en formar tumores. Las de cáncer experimentan auto-renovación enciación de una manera caótica para formar turn celulares anormales que pueden cambiar con el o conforme se presenten las mutaciones.

Los términos "célula de cáncer" o "célula uivalentes gramaticales se refieren a la poblaci élulas derivadas de un tumor incluyendo tanto cé rigénicas, que comprenden el volumen de la pobl ias tumorales y células madre tumorigénicas .

Como se usa en la presente, la "tumorigenic umor se refiere a la capacidad de una muestra a élulas del tumor para formar tumores palpable lante en serie en ratones inmunocomprometidos .

Como se usa en la presente, los términos " áncer de células madre" o "marcador de células r" o "marcador de células madre de tumor" o "mar as madre de tumor sólido" se refieren a un gen o proteína, polipéptido, o péptido expresado por cuyo nivel de expresión, solo o en combina s genes, se correlaciona con la presencia de igénicas de cáncer en comparación a cél rigénicas. La correlación puede referirse ya se esión incrementa o disminuida del gen (por les incrementados o disminuidos ARNm o el as madre de cáncer comprenden genes diferenc sados en células madre de cáncer versus epiteli ama por un cambio en veces, por ejemplo, sión dos veces reducida y/o elevada, y además el uso de un análisis estadístico, tal como por lor P de una prueba t a través de múltiples mues modalidad, los genes diferencialmente expres as madre de cáncer se dividen en signaturas d as madre de cáncer en base a la correlació sión con un gen elegido en combinación con su po ces de cambio de expresión. Las signaturas de de cáncer son predictivas* tanto de forma retro de manera prospectiva de un aspecto de vari ica, incluyendo pero no limitado a metástasis y m El término "prueba genética" como se us enté, se refiere a procedimientos por los c as modalidades, el tejido o fluido de biopsia se o a que se sospecha que un sujeto tiene cán o o fluido de biopsia entonces se examina para p encia de cáncer.

Como se usa en la presente un ?? céuticamente aceptable" se refiere a cualquier cuando se combina con un ingrediente activo sición farmacéutica tal como un anticuerpo, per ticuerpo, por ejemplo, retenga su actividad bi s, un "portador farmacéuticamente aceptable" n espuesta inmunitaria en un sujeto receptor. Los yen, pero no se limitan a, cualquiera de los po céuticos normales, tal como solución salina amo fosfato, agua, y varias emulsiones de aceit os diluyentes para administración parentera ol son solución salina amortiguada con fo éricos; inhibir y detener la metástasis tumoral; ener el crecimiento tumoral, aliviar en algún g s de los síntomas asociados con el cáncer, nación de estos efectos en las células de cánce al que el fármaco impide el crecimiento y/o células existentes de cáncer, se puede refer tático o citotóxico.

Los términos tal como "para tratar" o "trat ratar" o "para aliviar" o "aliviar" se refieren edidas terapéuticas que curan, desaceleran, di síntomas de, y/o detiene el progreso de una con orno patológico diagnosticado y 2) medidas profi eventivas que impiden o desaceleran el desarroll ición o trastorno patológico seleccionado, obje manera, aquellos sin necesidad de tratamiento ilos ya con el trastorno; aquellos propensos a tasis tumoral ; inhibición o una ausencia de cre al; alivio de uno o más síntomas asociados con e ífico; morbilidad y mortalidad reducida; y mejo ad de vida. De esta manera, en ciertas modalid miento del cáncer comprende inhibición de cre al en un sujeto.

Como se usa en la presente, los nucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a un esto de una multiplicidad de unidades de nuc nucleótido o desoxirribonucleótido o v cturales relacionadas) enlazadas mediante enl diéster, incluyendo pero no limitado a, ADN o ino abarca secuencias que incluyen cualquiera gos base conocidos de ADN y RNA, incluyendo, tado a, 4 -acetilcitosina , 8-hidroxi-N6-metilad idinilcitosina , pseudoisoc iuracilo, 2 -metiltio-N6 - isopenteniladenina, ico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido u ético, oxibutoxosina , pseudouracilo, queosi tosina, 5-metil -2 -tiouracilo, 2-tiouracil acilo, 5 -metiluracilo, éster metílico de ácido N acético, ácido uracil-5-oxiacético y 2,6-diamino El término "gen" se refiere a una secue nucleico (por ejemplo, ADN) que compre ncias codificantes necesarias para la producci éptido, precursor, o RNA (por ejemplo, ARNr, A éptido se puede codificar por una secuencia codi ongitud completa o por una porción de la s icadora en tanto que se retenga la actividad d edades funcionales deseadas (por ejemplo, a ática, unión a ligando, transducción de ogenicidad, etc.) del polipéptido de longitud co Nm se refieren como secuencias no traducidas no "gen" abarca tanto ADNc como formas genómic Una forma genómica o clon de un gen contiene l icadora interrumpida con secuencias no codif das "intrones" o "regiones interpuestas" o "se puestas" . Los intrones son secuencias de un ge criben en RNA nuclear (ARNhn) ; los intrones ner elementos reguladores tal como intensificado nes se remueven o "cortan" del transcripto n rio; por lo tanto, los intrones están ausente cripto de RNA mensajero (ARNm) . El ARNm funciona raducción para especificar la secuencia u O ácidos en un polipéptido naciente. Además de ñes, las formas genómicas de un gen tambié ir secuencias localizadas tanto en el extremo 5' s secuencias que están presentes en el transc denilación .

El término "recombinante" cuando se encia a una célula, ácido nucleico, proteína a que la célula, ácido nucleico, proteína o vect icado mediante la introducción de una proteína ico heterólogo, la alteración de una proteína ico nativo, o que la célul ada de una células modificada de este modora, por ejemplo, las células recombinantes expres no se encuentran dentro de la forma nat ibinante) de la célula o expresan genes nativo eexpresan o expresan de otro modo de forma anor , por ejemplo, expresan como fragmentos o vari lme, que no se presentan de forma natural. Por el do nucleico recombinante" se quiere decir en la o nucleico, originalmente formado in vitro, en duce en una célula hospedera u organismo, se r anera no recombinante , es decir, usando la ma ar in vivo de la célula hospedera en l ulaciones in vitro; sin embargo, estos ácidos nu ez producidos de manera recombinante., aunque se anera subsiguiente de forma no recombinante, deran recombinantes para los propósitos de la i manera similar, una "proteína recombinante" ína producida usando técnicas recombinantes, es s de la expresión de un ácido nucleico recombina presenta anteriormente.

Como se usa en la presente, el término "ve en referencia a moléculas de ácido nucle sfieren segmentos de ADN de una célula a otra. El ículo" se usa algunas veces de manera indist tor" . Los vectores frecuentemente se der 7,8 avorecimiento de la expresión" o "activación" se regulación que incrementa la producción de prod sión génica (por ejemplo, R A o proteínas) , en t educción de la expresión", o "represión" se refi ación que disminuye la producción. Las molécu ío, factores de transcripción) que están compren vorecimiento de la expresión o reducción de la e entemente se llaman "activadores" y "repr ctivamente .

Los términos "polipéptido" o "péptido" o "p ragmento de proteína" se usan de manera indistin nte para referirse a un polímero de resi ácido. Los términos aplican a polímeros de amino cuales uno o más residuos de aminoácido son m cos artificiales de un correspondiente aminoácid nta de forma natural, así como a polím nte, por ejemplo, hidroxiprolina , gamma- mato, y 0-fosfoserina . Los análogos de aminoá ren a compuestos que tienen la misma estructura a como un aminoácido que se presenta de forma ejemplo, un carbono alfa que se une a un hidró carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por erina, norleucina, sulfóxido de metionina, m -sulfonio. Estos análogos pueden tener g icados (por ejemplo, norleucina) o est dicas modificadas, que retienen la misma es ea básica como un aminoácido que se presenta al . Los miméticos de aminoácidos se ref estos químicos que tienen una estructura ente de la estructura química general de un ami que funciona de manera similar a un aminoácid nta de forma natural . icas o asociados (por ejemplo, naturalmente con o a la degeneración del código genético, un gra eídos nucleicos funcionalmente idénticos codifi ayoría de las proteínas. Por ejemplo, los codo GCG y GCU codifican todos para el aminoácido ala manera, en cada posición donde se especifi na por un codón, el codón se puede alterar a otr es correspondientes descritos sin alterar el pol icado. Estas variaciones de ácidos nuclei aciones imperceptibles" , que son una esp ciones conservadoramente modificadas. Cada secu nucleico en la presente que codifica éptido también describe variaciones impercepti nucleico. Se reconoce que en ciertos contex en un ácido nucleico (excepto AUG, ariamente el único codón para metionina, y TGG, éptido, o secuencia de proteína que altere, ad ma un aminoácido individual o un pequeño porce ácidos en la secuencia codificada es una " rvadoramenté modificada" que incluye donde la al or resultado la sustitución de un aminoácido ácido químicamente similar. Estas var rvadoramente modificadas son, además y no ntes polimórficas , homólogos inter-especie , y a invención. Las tablas que proporcionan ami onalmente similares útiles para susti rvadoras de aminoácido, son bien conocidos ea. Las sustituciones conservadoras típicas incl ina (A) , Glicina (G) , 2) Ácido aspártico (D) mico (E) , 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) , 4) Lisina (K) , 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , M Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosi én se proporcionan modalidades análogas de ot itas en los términos de "que consiste de" ste esencialmente de" . as Modalidades de la Presente Invención La presente invención proporciona composi os para estudiar, diagnosticar, caracterizar r. En particular, en ciertas modalidades, la ción proporciona agentes, incluyendo antagonis en a receptores Notch y métodos para usar los a onistas para inhibir el crecimiento tumoral r cáncer u otra enfermedad en pacientes hum as modalidades, los antagonistas son anticue ocen de manera específica uno o más receptor os .

En un aspecto, la presente invención propor cuerpo que se une de manera específica a una regi eños dos miembros de la familia de receptores N as modalidades, el anticuerpo se une a una regi I a ligando del dominio extracelular del recepto Notch3. En algunas modalidades, el anticuerpo s región de no unión a ligando del Notch2 hu as modalidades, el anticuerpo se une a una regi a ligando del dominio extracelular de Notch2 y lgunas modalidades, el anticuerpo se une a una r ión a ligando del Notch3 humano. En algunas moda ticuerpo se une a Notchl y/o Notch4.

En ciertas modalidades, el anticuerpo que s a específica a una región de no unión a lig io extracelular de un receptor Notch humano e i imiento tumoral es un anticuerpo monoclonal . En lidades, el anticuerpo que se une de manera espe región de no unión a ligando del dominio extrace idades, el anticuerpo que se une de manera espe egión de no unión a ligando del dominio extrace eceptor Notch humano e inhibe el crecimiento tu nticuerpo monoespecífico . En ciertas modalida uerpo que se une de manera específica a una regi I a ligando del dominio extracelular de un recept o e inhibe el crecimiento tumoral es un an ecífico. En ciertas modalidades, la presente i rciona un hibridoma que produce un anticuerpo qu anera específica a una región de no unión a lig io extracelular de un receptor Notch humano e i miento tumoral.

En ciertas modalidades la presente i rciona un anticuerpo que se une de manera espe región de no unión a ligando que compre iciones 1-10 de EGF del dominio extracelula celular de un receptor Notch humano e in miento tumoral . Ciertas modalidades proporci uerpo que se une de manera específica a una regi a ligando que comprende la repetición 4 de io extracelular de un receptor Notch humano e i miento tumoral. Ciertas modalidades proporci uerpo que se une de manera específica a una regi a ligando que comprende la repetición 13 de io extracelular de un receptor Notch humano e i imiento tumoral. En ciertas modalidades, el antic de manera específica a una región de no unión a comprende el dominio LNR-HD e inhibe el cre ral .

En ciertas modalidades, la presente i orciona un método para tratar cáncer en un s sidad del mismo, que comprende administrar al su r cáncer en un sujeto en necesidad del mismo c istrar al sujeto una cantidad terapéuticamente anticuerpo que se une a una región de no do del dominio extracelular del receptor Not 3 e inhibe el crecimiento tumoral .

En ciertas modalidades, el método para r comprende administrar una cantidad terapéut iva de un anticuerpo monoclonal que se une d ífica a una región de no unión a ligando del celular de un receptor Notch humano e in miento tumoral. En ciertas modalidades, el mét r cáncer comprende administrar una éuticamente efectiva de un anticuerpo quiméric de manera específica a una región de no unión a ominio extracelular de un receptor Notch humano recimiento tumoral. En ciertas modalidades, e miento tumoral . En algunas modalidades, el antic nticuerpo monoespecífico . En algunas modalida uerpo es un anticuerpo biespecífico .

En ciertas modalidades, el método para r comprende administrar una cantidad terapéut iva de un anticuerpo que se une de manera espe región de no unión a ligando del dominio extrace eceptor Notch humano que comprende las repeticio EGF e inhibe el crecimiento tumoral . En idades, el método para tratar cáncer c istrar una cantidad terapéuticamente efectiv uerpo que se une de manera específica a una regi a ligando del dominio extracelular de un recept o que comprende la repetición 10 de EGF alente si es Notch3) e inhibe la crecimiento turn tas modalidades, el método para tratar cáncer c ende la repetición 4 de EGF e inhibe el cre al. En ciertas modalidades, el método para trata ende administrar una cantidad terapéuticamente anticuerpo que se une de manera específica a un unión a ligando del dominio extracelular de un humano que comprende la repetición 4 de EGF e i miento tumoral . En ciertas modalidades difere uerpo que se administra de manera específica al D de un receptor Notch humano.

En ciertas modalidades, el método para r comprende administrar una cantidad terapéut iva de un anticuerpo conjugado a una porción ci se une de manera específica a una región de no do del dominio extracelular de un receptor Notc hibe el crecimiento tumoral. En ciertas modalid o para tratar cáncer comprende administrar una quimioterapia. En ciertas modalidades, el mét r cáncer comprende administrar una éuticamente efectiva de un anticuerpo que se a específica a una región de no unión a lig io extracelular de un receptor Notch humano e i miento tumoral que son de un tumor de mama rectal, tumor de pulmón, tumor pancreático, ata, o tumor de cabeza y cuello.

En ciertas modalidades, el método para r comprende identificar pacientes para el tra el anticuerpo que se une de manera específic n de no unión a ligando del dominio extracelul tor Notch humano usando una prueba gené istrar una cantidad terapéuticamente efectiv cuerpo que se une de manera específica a una regi a ligando del dominio extracelular de un recept io extracelular de un receptor Notch humano e i miento tumoral.

En ciertas modalidades, la presente i rciona un método para identificar una molécula a una región de no unión a ligando de un celular de un receptor Notch humano e in imiento tumoral, el método que comprende: i) in olécula con el dominio de no unión a ligando del celular de un receptor Notch humano, ii) deteri olécula se une a la región de no unión a lig io extracelular del receptor Notch humano; rminar si la molécula inhibe el crecimiento turn tas modalidades, la invención proporciona un mét tificar una molécula que se une a una región de gando de un dominio extracelular de un recept o e inhibe el crecimiento tumoral, el met gando de un dominio extracelular de un recept o e inhibe el crecimiento tumoral, el mét ende: i) incubar la molécula con el dominio de gando del dominio extracelular de un recepto o que comprende la repetición 10 de EGF (o equ S Notch3) ; ii) determinar si la molécula se u n de no unión a ligando del dominio extracel tor Notch humano que comprende la repetición 1 quivalente si es Nótch3) ; y iii) determinar ula inhibe el crecimiento tumoral . En idades, la invención proporciona un méto ificar una molécula que se une a una región de gando de un dominio extracelular de un recept o e inhibe el crecimiento tumoral, el mét ende: i) incubar la molécula con el dominio de gando del dominio extracelular de un recept o e inhibe el crecimiento tumoral .

En ciertas modalidades, la presente i rciona un método para producir un anticuerpo qu nera específica a una región de no unión a lig io extracelular de un receptor Notch humano e i miento tumoral .

En ciertas modalidades, la presente i rciona un ácido nucleico aislado que codifica uerpo que se une de manera específica a una regi a ligando del dominio extracelular de un recept o e inhibe el crecimiento tumoral.

En algunas modalidades, la invención propor e (por ejemplo, un anticuerpo) que se une d ífica a un dominio EGF10 (o un equivalente de un si es Notch3) de uno o más receptores Notch hum as modalidades, el agente es un anticuerpo. En o .

En un aspecto, la invención proporc uerpo 59R1 que comprende las secuencias de caden cadena ligera provistas en SEQ ID NO: 16 y 18 (c ecuencia de señal) , respectivamente, o como se l ADN depositado con la ATCC el 15 de Octubre de designación asignada número PTA-9547. La i rciona además polipéptidos o anticuerpos que co egión variable de cadena pesada (por ejemplo, SE /o la región variable de cadena ligera (por ejem 0: 13) de este anticuerpo 59R1. La invención pro s polipéptidos o anticuerpos que comprenden u ejemplo, 1, 2, o 3) de las CDR de cadena pesada, S de las CDR de cadena ligera del anticuerpo 59R1 lidades adicionales, la invención proporciona ant se unen al mismo epítopo como el anticuerpo secuencias SEQ ID NO: 50 y/o SEQ ID NO: 13 d ble de cadena pesada y/o de región variable d a. La invención proporciona además polipép uerpos que comprenden una o más (por ejemplo, 1, as CDR de cadena pesada y/o una o más de las a ligera el anticuerpo 59R5. En aún mod onales, la invención proporciona anticuerpos que ismo epítopo como el anticuerpo 59R5 o anticue ten para la unión específica a Notch2 y/o Notch l anticuerpo 59R5.

En ciertas modalidades adicionales, la i rciona un anticuerpo que se une de manera espe o más (es decir, al menos dos o dos, tres, o tores Notch humanos. En ciertas modalida uerpo se une de manera específica a una regió a ligando de un dominio extracelular de do enden Notch2 y/o Notch3. En ciertas modalidades, receptores Notch humanos comprenden Notch2 y No as modalidades, el anticuerpo es un antagonist más receptores Notch humanos.

La invención proporciona además un méto ar la función de pericitos y/o células del músc lar en un sujeto, en donde el método c istrar al sujeto una cantidad efectiva de un ag ne de manera específica a Notch2 humano y/ o. En ciertas modalidades, el agente es un ant iertas modalidades, el agente es un antagonista.

La invención proporciona además un méto ir la angiogénesis en un sujeto, que comprende dministrar al sujeto una cantidad efectiva de u se une de manera específica a Notch2 humano y/ o. En ciertas modalidades, el agente es un ant En ciertas modalidades, el agente de unión n antagonista de los receptores Notch humano s se une de forma específica. En algunas mod nativas el agente de unión a Notch es un agonist tores Notch humanos a los cuales se une d ífica.

En ciertas modalidades, el agente que se a específica a uno o más receptores Notch onista de uno o más receptores Notch que inhi s aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente s aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente s aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente imadamente 100 % de una o más actividades tores Notch humanos .

En ciertas modalidades, el antagonista de u ptores Notch humanos (por ejemplo, Notch2 y/o En ciertas modalidades, el antagonista tie e los siguientes efectos: interfiere con la expr eceptor Notch; interfiere con la activación de ransducción de señales de receptores Notch, por nhibir de manera estérica las interacciones tor Notch y uno o más de sus ligandos, o la un tor Notch humano de activación de la muerte celu ición de la proliferación celular.

En ciertas modalidades, los antagonistas c tor Notch, tal como Notch humano2 o Notch3, a a extracelular para actuar en o inhibir la fun tor Notch. En ciertas modalidades, un antagonist ula pequeña que se une al dominio extracelula tor Notch. En ciertas modalidades, un antagonis tor Notch es proteináceo. En algunas modalida onistas proteináceos de un receptor Not sión en la superficie celular de un receptor No por ejemplo, por internalización de un recept al disminuir el tráfico en superficie celula tor Notch.

En ciertas modalidades, el agente¦ de unión ntagonista (por ejemplo, anticuerpo) se une d ífica a una región de no unión a ligando de un celular de al menos un receptor Notch humano, gión de no unión a ligando comprende la repetici (o el equivalente si es Notch3) . En ciertas moda ente o antagonista se une de manera específica a iertas modalidades, el agente o antagonista se a específica a Notch3. En ciertas modalidades, e agonista se une de manera específica tanto Notch a Notch3 humano.

En ciertas modalidades, el agente de unión onista cae dentro de EGF10. En ciertas mod entes, el epítopo del agente o antagonista que 2 humano se traslapa parcialmente con EGF10. En idades, el agente o antagonista se une a al men a secuencia HKGAL (SEQ ID NO: 28) dentro del 2 humano. En ciertas modalidades, el a onista también se une a otros aminoácidos de de Notch2 humano (por ejemplo, el epítopo com nticuerpo anti-Notch2 necesariamente no está c etamente dentro de la secuencia HKGAL) . En idades, el agente de unión a Notch o antagonista orma adicionalmente específica a al menos un humano adicional (por ejemplo, Notchl, No 4) . En ciertas modalidades, el agente de unión a onista, que se une a EGF10 de Notch2 humano ionalmente, a un dominio de EGF10 de Notchl hu as modalidades, el agente de unión a onista, no se une a ninguna región del Notch3 de EGF . En ciertas modalidades, el a onista se une a al menos parte de la secuenc ID NO: 29) dentro del dominio de EGF9 de Notch3 (SEQ ID NO: 29) es la secuencia dentro del do de Notch3 corresponde a la secuencia HKGAL ) dentro de EGF10 Notch2 humano. En ciertas moda gente o antagonista también se une a otros ami o de EGF9 de Notch3 humano. En ciertas modalid e de unión a Notch o antagonista, se une a un do de al menos un receptor Notch humano adició lo, Notchl, Notch2, y/o Notch4) . En ciertas moda eceptor Notch humano adicional es Notch2 tal e o antagonista que se une a un dominio de 2 humano. En ciertas modalidades, el agente de a Notch, o antagonista, se une a una porció n de no unión a ligando de un dominio extracelul tor Notchl, Notch2, o Notch4 en una región dife o un receptor Notch3 en una región diferente ejemplo, en ciertas modalidades, el agente o ant e al dominio de LNR-HD de uno o más receptores N as modalidades, el agente o antagonista se une , EGF3, EGF4, EGF5 , EGF6 , EGF7, EGF9 , EGF10, , EGF15, EGF16, EGF17, EGF18, EGF19, EGF20, , EGF23, EGF24, EGF25 , EGF26, EGF27, EGF28, 0, EGF31, EGF32 , EGF33, EGF34, EGF35, y/o EGF3 io extracelular de uno o más receptores Notch.

En ciertas modalidades, el agente de unión tagonista, se une a la región de unión a ligan io extracelular de uno o más receptores Notch sta manera, en ciertas modalidades, el agente de idades, el agente o anticuerpo se une a al m tores Notch humanos (es decir, dos, tres, o tores Notch humano) . Se abarcan agentes o ant se unen de manera específica a dos receptore ia Notch, humanos, (por. ejemplo, Notch2 y Notch3 ch2, Notchl y Notch3 , Notchl y Notch4, Notch2 y otch3 y Notch4) . También se contemplan ag uerpos que se unen de manera específica a tres a familia de receptores Notch humanos (por es y anticuerpos que se unen de manera espe l, Notch2, y Notch3 , Notchl, Notch2, y Notch4, o 3 , y Notch4), como son agentes y anticuerpos que anera específica a cuatro miembros de la fa tores Notch humano (por ejemplo, agentes y ant se unen de manera específica a Notchl, Notch2 , I 4) . En ciertas modalidades, el agente o antic En ciertas modalidades, el agente de unión tagonista, se une a un receptor Notch (por 2 y/o Notch3) con una constante de disocia imadamente 1 µ? o menos, aproximadamente 100 nM imadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM roximadamente 10 nM o menos. En ciertas modalid e o antagonista se une a uno o más receptor os, tal como Notch2 humano y/o Notch3 humano, c nM o menos. En algunas modalidades, el agente de es un anticuerpo que se une a Notch2 con u imadamente 1 nM o menos. En algunas modalid te de unión a Notch es un anticuerpo que se une una KD de aproximadamente 1 nM o menos . En lidades, la constante de disociación para el onista con respecto a un receptor Notch particul tantes de disociación determinada usando una prot I JAG1, y/o JAG2) a Notch2 humanos y/o in ización de Notch2 humanos. En ciertas modalid onista inhibe la señalización de Notch2 indu En ciertas modalidades, el antagonista in ización de Notch3 inducida por DLL4. En idades, el antagonista inhibe la señalización d ída por JAG2. En ciertas modalidades, el ant e la señalización de Notch3 inducida por J as modalidades, la señalización por Notch2 y/o N e por al menos aproximadamente 10 %, por imadamente 25 %, por al menos aproximadamente 5 enos aproximadamente 75 %, por al menos aproxim , o por al menos aproximadamente 95 %. En lidades, la unión de uno o más ligandos a No 3 se reduce por al menos aproximadamente 10 %, s aproximadamente 25 %, por al menos aproximada oterapéutico, radioisótopo, u otro agente por el ejemplo, un antagonista contra un receptor N ga una toxina que se activa en células tumor san el receptor Notch por la internalizació ína. En otras modalidades, los antagonistas tor Notch median la muerte celular de una cé sa el receptor Notch mediante la citotoxicidad diente de anticuerpo (ADCC) . La ADCC comprende ar por células efectoras que reconocen la porci nticuerpo. Muchos linfocitos, monocitos, macró o, granulocitos y eosinofilos por ejemplo, tores de Fe y pueden mediar la citólisis (Dillma Clin. Oncol . 12:1497). En algunas modalida onista de un receptor Notch es un anticuerpo qu ierte celular de células que expresan un recept tivar la citotoxicidad dependiente de complement ren a este respecto, como lo hacen los anticuerp subclase pero de diferente especie. De los ant os, IgM es la clase más eficiente de anticuer e al complemento, seguido por IgGl, IgG3 , e que IgG4 parece bastante deficiente en act da de complemento (Dillman, 1994, J. Clin. 97; Jefferis et al., 1998, Immunol . Rev. 163:59 do a la presente invención, se preparan anticu clases que tienen actividad biológica deseada.

Se puede valorar la capacidad de c uerpo particular contra un receptor Notch para m de la célula objetivo por activación de complem . Las células de interés se cultivan y marcan i nticuerpo se adiciona al cultivo celular en com a sea células inmunitarias o de complemento en ueden activar por complejos de antígeno-anticu tagonista es un anticuerpo que no tiene una ones efectoras . En algunas modalidades, el antic actividad de citotoxicidad celular dependi uerpo (ADCC) y/o no tiene actividad de citót diente de complemento (CDC) . En ciertas modalid uerpo no se une al receptor de Fe y/o emento. En ciertas modalidades, el anticuerpo on efectora.

En otras modalidades, los antagonistas tor Notch pueden activar la muerte celular dire hibir la angiogénesis . La angiogénesis es el pro ual se forman nuevos vasos sanguíneos de l istentes y es un proceso fundamental requerido imiento normal, por ejemplo, durante el de iónico, curación de heridas, y en la respues ación. El crecimiento de tumores sólidos, mayore ivo pericitos y/o células del músculo liso vasc modalidades, un antagonista de un receptor Notc eñalización de factor de crecimiento requerida tamiento, montaje, mantenimiento o supervive as vasculares. En ciertas modalidades, el ant a la función de pericitos y/o células del músc lar.

En ciertas modalidades los agentes de unión tagonistas (por ejemplo, anticuerpos) , ya sea so nación con un segundo agente terapéutico, son ca ir el crecimiento tumoral . En ciertas modalida es de unión a Notch o antagonistas son cap ir el crecimiento tumoral in vivo (por ejempl o de xenoinjerto de ratón y/o en un humano q r. En ciertas modalidades, los agentes de unión tagonistas, son capaces de inhibir el crecimiento iertas modalidades, el agente o anticuerpo es ir la tumorigenicidad de un tumor que comprende de cáncer en un modelo animal, tal como m njerto de ratón. En ciertas modalidades, el encia de células madre de cáncer en un tumor s al menos aproximadamente dos veces, aproximadame , aproximadamente cinco veces, aproximadamen , aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 imadamente 1000 veces (por ejemplo, en un m njerto) . En ciertas modalidades, la reducció encia de células madre de cáncer se determina po ilución limitante usando un modelo animal. Un ej ensayo de dilución limitante usado para pr iencia de un anticuerpo anti-Notch se proporció lo 8, posterior. Los ejemplos adicionales y la ecto al uso de los ensayos de dilución limitan éptido está aislado. En ciertas mod nativas, el polipéptido está sustancialmente pur En ciertas modalidades, los polipéptidos nte invención pueden ser polipéptidos recomb éptidos naturales, o polipéptidos sintéti enden la secuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 13, 14, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, o 57 (c secuencias de señal, indicadas) , así c éptidos que comprenden los polipéptidos codific polinucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 15, 17, 47, 60 (con o sin las secuencias de señal, indicada La invención proporciona un polipépt rende la cadena pesada y/o la cadena ligera orcionada en SEQ ID NO: 16 y/o SEQ ID ctivamente . En ciertas modalidades, el polipépti cuerpo. En ciertas modalidades, el polipéptido s idades, el polipéptido se une de manera espe 2 y Notch3.

La invención proporciona además un polipép ende SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 14. En idades, el polipéptido comprende una secuencia d a variable que comprende SEQ ID NO: 13 y/o una s adena pesada variable que comprende SEQ ID NO: as modalidades, el polipéptido comprende una s adena ligera variable que comprende SEQ ID NO: ncía de cadena pesada variable que comprende SE En ciertas modalidades, el polipéptido compre ncía de cadena ligera variable que comprende SE /o una secuencia de cadena pesada variable que c ID NO: 50. En algunas modalidades, el pol ende una secuencia de cadena ligera varia ende SEQ ID NO: 13 y una secuencia de caden ncía de cadena pesada variable que comprende . En ciertas modalidades, el polipéptido compr ncía de cadena ligera variable que comprende y/o una secuencia de cadena pesada varia ende SEQ ID NO: 55. En ciertas modalida éptido comprende una secuencia de cadena ligera comprende SEQ ID NO: 13 y/o una secuencia d a variable que comprende SEQ ID NO: 56. En idades, el polipéptido comprende una secuencia d a variable que comprende SEQ ID NO: 13 y/o una s adena pesada variable que comprende SEQ ID N as modalidades, el polipéptido es un anticue tas modalidades, el polipéptido se une de cífica Notch2 y/o Notch3. En algunas modalid éptido se une de manera específica a Notch2 o. En algunas modalidades, el polipéptido se ncial . Estos mutantes incluyen supresiones, inse siones, repeticiones y sustituciones tipo. G cto a que cambios de aminoácidos se van a s mente de forma fenotípica se puede encontrar en Deciphering the Message in Protein Sequences: T ino Acid Substitutions , 1990, Science 247:1306-1 De esta manera, los fragmentos, deriv gos del polipéptido de la invención pueden ser: l cual se sustituyan uno o más de los resi ácido con un residuo de aminoácido conserva rvado (frecuentemente un residuo conserv ácidos) y este residuo de aminoácido sustituido icar o no por el código genético; o (ii) uno en o más de los residuos de aminoácido incluye a ituyentes,* o (iii) uno en el cual el polipéptid usione con otro compuesto, tal como un compue ácido neutral o negativamente cargado. Esto ú esultado proteínas con carga positiva reducida. iva reducida en una proteína puede conducir ción en la agregación de proteínas y es a ble la prevención de la agregación. La agreg ínas no solo puede dar por resultado pérdid idad sino también puede ser problemática cu ran formulaciones farmacéuticas, debido a ados pueden ser inmunogénicos (Pinckard et al. . Exp. Immunol. 2:331-340; Robbins et al . , 1987, 8-845; Cleland et al., 1993,· Crit. Rev. Therapeu ier Systems 10:307-377) .

Como se índica, los cambios de aminoáci amente de naturaleza menor tal como susti rvadoras de aminoácido que no afectan d ificativa el plegado o la actividad de la prote minoácido Sustituciones conservadoras de ej original o aspártico Ácido glutámico, Asparagina eína Serina, Alanina, Metionina amina Asparagina o glutámico Ácido aspártico, Glutamina iña Prolina Alanina idina Asparagina, Glutamina, Lisina, Argi eucina Leucina, Valina, Metionina, Alanina Fenilalanina, Norleucina iña Norleucina, Isoleucina, Valina, Metionina, Alanina, Fenilalanina na Arginina, Glutamina, Asparagina, Histidina onina Leucina, Fenilalanina, Isol minoácido Sustituciones conservadoras de ej original na Isoleucina, Metionina, Leucina, Fenilalanina, Alanina, Norleucina Por su puesto, el número de sustituci ácido hechas depende de muchos factores, que íos descritos anteriormente. En ciertas modalid o de sustituciones para cualquier pol minado no será más de 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 En ciertas modalidades, los polipépt ucleótidos de la presente invención se proporc orma aislada, y a veces se purifican a homogenei Los polipéptidos de la presente invención olipéptidos de SEQ ID NOs : 2, 4, 13, 14, 16, 18, 0, 49, 50, 52, 53 54, 55, 56, o 57 así como poli idad de secuencia) a los polipéptidos de SEQ ID , 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53 54, . Como se conoce en la técnica, "similitud" e éptidos se determina al comparar la secue ácidos y sus sustitutos conservados de aminoácid éptido a la secuencia de un segundo polipéptido.

Se pueden emplear fragmentos o porciones éptidos de la presente invención para prod espondiente polipéptido de longitud completa por ídica; por lo tanto, los fragmentos se pueden compuestos intermedios para producir los polipép itud completa. Los fragmentos o porciones nucleótidos de la presente invención se pueden u etizar los polinucleótidos de longitud complet enté invención.

En ciertas modalidades, un fragmento imadamente 1CT11 a 10"12 M, aunque la afinida r considerablemente con fragmentos de di os, que varía desde 10"7 a 10"13 M. En idades, el fragmento es de aproximadamente ácidos de longitud y comprende el dominio de del agente polipeptídico, o antagonista, enlaz parte de una región constante de una inmunoglob Los polipéptidos y análogos se pueden modi onalmente para contener porciones químicas adi lmente no parte de la proteína. Estas p atizadas pueden mejorar la solubilidad, la vi gica o la obstrucción de la proteína. Las p ién pueden reducir o eliminar cualquier efecto se seable de las proteínas y similares. Se puede e pista general de estas porciones en Rem aceutical Sciences, 20th ed. , Mack Publishi secuencia de ADN que codifica para una proteí stre y de interés. Opcionalmente , la secuencia enizar por mutagénesis específica del sit rcionar análogos funcionales de los mismos. ío, Zoeller et al., 1984, Proc. Nat Acad. 62-5066 y Patente de los Estados Unidos No. 4, método para construir una secuencia de ADN que un polipéptido de interés será por síntesis o un sintetizador de oligonucleótidos . nucleótidos se pueden diseñar en base a la secu ácidos del polipéptido deseado y seleccionando es que se favorecen en la célula hospedera en la cirá el polipéptido recombinante de interés.

Se pueden aplicar métodos normales para si secuencia aislada de polinucleótido que codifica éptido aislado de interés. Por ejemplo, se pu Una vez montadas (por síntesis, por mut ida al sitio, o por otro método) , las se tes de ADN que codifican para un polipéptido cular de interés se insertarán en un vector de e enlazarán de manera operativa a una secuencia de presión apropiada para la expresión de la proteí dero deseado. Se puede confirmar el montaje a ecuenciación de nucleótidos, correlación de rest presión de un polipéptido biológicamente activ dero adecuado. Como es bien conocido en la té de obtener altos niveles de expresión de fectado en un hospedero, el gen se enlaza d tiva a secuencias de control de ex scripcionales y transduccionales que son funció spedero de expresión elegido.

Se pueden usar vectores recombinantes de e n un papel regulador en la expresión géni lo, promotores o intensificadores transcripciona ecuencia estructural o codificadora que se trans y se traduce en proteína, y (3) secuencias aprop o y terminación de transcripción y traducción, ibe en detalle más adelante. Estos elementos reg n incluir una secuencia operadora para cont cripción. Un origen de replicación que us iere la capacidad para replicarse en un hosped de selección para facilitar el reconocimiento sformantes se pueden incorporar de manera adicio nes de ADN se enlazan de manera operativa cuan ionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, e éptido de señal (guía secretoria) se enlaza d ativa al ADN para un polipéptido si se expresa ursor que participa en la secreción del polipép celular de la proteína traducida por una dera. De manera alternativa, donde la binante se expresa sin una secuencia guí porte, pueden incluir un residuo N-termi nina. Este residuo se puede escindir opcional a subsiguiente de la proteína recombinante e proporcionar un producto final.

La elección de la secuencia de control de e vector de expresión dependerá de la elecc dero. Se puede emplear una amplia vari naciones de hospedero/vector de expresión. Los s de expresión para células eucarióticas , inclu lo, vectores que comprenden secuencias de co sion para SV40, virus de papiloma bobino, aden egalovirus . Los vectores útiles de expresi deroes bacterianos incluyen plásmidos bac li. Las células eucarióticas superiores incluye lulas estabilizadas de origen mamífero como se d a presente. También se pueden emplear sist cción libres de células. Los vectores apropi ción y expresión para el uso con hospederoes c rianos, fungoideos, de levadura y mamíferos se d Pouwels et al. (Cloning Vectors : A Laboratory ier, N. Y., 1985), la descripción pertinente de corpora en la presente como referencia de este m También se emplean de manera ventajosa mas de cultivo de células mamíferas o insecti sar la proteína recombinante . La expresión de p binantes en células mamíferas se puede realizar estas proteínas en general se pliegan de forma c modifican de manera apropiada y son funcio letas. Los ejemplos de líneas adecuadas de critas de flanqueo 5' o 3' y las secuen cidas 5' o 3' tal como sitios de unión a arios, un sitio de poliadenilación sitios don adores de empalme, y secuencias de ter cripcional. Los sistemas de baculovirus cción de proteínas heterólogas en células insec an por Luckow y Summers, 1988, Bio/Technology 6: Las proteínas producidas por un h formado se pueden purificar de acuerdo a c o adecuado. Estos métodos normales tografía (por ejemplo, intercambio iónico, af tografía en columna de exclusión de ifugación, solubilidad diferencial, por cualqu ca normal para la purificación de proteínas. S , a la proteína, marcas de afinidad t istidina, dominio de unión a maltosa, secue ína, comercialmente disponible, por ejemplo, un iltración Amicon o Millipore Pellicon. Después oncentración, el concentrado se puede aplica z adecuada de purificación. De manera alterna emplear una resina de intercambio anióni ío, una matriz o substrato que tiene grupos colg laminoetilo (DEAE) . Las matrices pueden ser acr sa, dextrano, celulosa u otros tipos co ados en purificación de proteínas. De nativa, se puede emplear un paso de interca nes. Los intercambiadores de cationes adecuados s matrices insolubles que comprenden grupos sulf rboximetilo . Finalmente, se pueden emplear un de cromatografía líquida de alto desempeño tida (RP-HPLC) empleando medios hidrófobos de ejemplo, gel de sílice que tiene grupos colg o acuoso o de exclusión de tamaño. Se puede tografía líquida de alto desempeño (HPLC) par es de purificación. Las células microbianas empl expresión de una proteína recombinante se tabilizar por cualquier método¦ conveniente, in s de congelación-descongelación, tratamien soriido, desestabilización mecánica, o uso de ag celular.

En ciertas modalidades, el agente de unión ntagonista, comprende un anticuerpo. En idades, el anticuerpo está aislado. En idades, el anticuerpo está sustancialmente puro.

La presente invención proporciona anticue iten para la unión específica a Notch2 y/o Notch3 n anticuerpo que comprende una región variable d a que comprende SEQ ID NO: 14 una región var La invención proporciona además anticuerpo de manera específica a uno o más receptores No enden uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis CD .5-10, 22-27, 30 o 51 con hasta cuatro (es deci , o 4) sustituciones conservadoras de aminoáci ejemplo, Tabla 1) por CDR. La invención rciona anticuerpos que se unen de manera espe o más receptores Noten, que comprenden una, do o, cinco y/o seis CDR de 59R1 (es decir, SEQ con hasta cuatro sustituciones conservad ácido por CDR. De esta manera, la invención pro uerpos que se unen de manera específica a un tores Notch humanos que comprenden una, dos ro, cinco y/o seis de la CDR de 59R1. En lidades, los anticuerpos comprenden la CDR3 d da de 59R1, con hasta cuatro sustituciones conse comprende GIFFAI (SEQ ID NO: 7), o una variant que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conse minoácido; y/o (b) una CDR1 de cadena lig ende RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO: 8), o una variant que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conse minoácido; una CDR2 de cadena ligera que c AT (SEQ ID N0:9), o una variante de la mi ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido; y/o una CDR3 de cadena ligera que c FPI (SEQ ID NO: 10) , o una variante de la m ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido .

La invención también proporciona anticuerpo de manera específica a uno o más receptores No enden una, dos, tres, cuatro, y/o seis CDR de , SEQ ID NO: 5, 6, 8-10, 51), con hasta GSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 6), o una variante de comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conserva ácido; y/o una CDR3 de cadena pesada que c T (SEQ ID N0:51), o una variante de la mi ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que c VRSNYLA (SEQ ID NO: 8), o una variante de la m ende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservad ácido; una CDR2 de cadena ligera que comprende ID NO: 9), o una variante de la misma que compren 4 sustituciones conservadoras de aminoácido; de cadena ligera que comprende QQYSNFPI (SEQ ID a variante de la misma que comprende 1, 2, ituciones conservadoras de* aminoácido. En lidades, el anticuerpo comprende una CDR1 de da que comprende SSSGMS (SEQ ID NO: 5), una CDR2 d ciona del grupo que consiste de SIFYPT (SEQ ID S (SEQ ID NO:23), SSFYAS (SEQ ID NO:24), SSFFAT ), SIFYPS (SEQ ID NO:26), y SSFFA (SEQ ID NO as modalidades, el anticuerpo comprende una a pesada que comprende SSSGMS (SEQ ID NO: 5), una a pesada que comprende VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ I una CDR3 de cadena pesada que comprende GIFFAI ) . En ciertas modalidades, las CDR de cadena pesá nidas dentro de una región variable de una caden anticuerpo. En ciertas modalidades, el an ende además una CDR1 de cadena ligera que c VRSNYLA (SEQ ID NO: 8), una CDR2 de cadena li rende GASSRAT (SEQ ID NO: 9), y/o una CDR3 d ra que comprende QQYSNFPI (SEQ ID NO : 10) . En lidades, las CDR de cadena ligera están contenida a región variable de una cadena ligera de anticu omprende VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 6), y una a pesada que comprende GIFFAI (SEQ ID N0:7); y/o de cadena ligera que comprende RASQSVRSNYLA , una CDR2 de cadena ligera que comprende GASS :9), y una CDR3 de cadena ligera que comprende ID NO: 10) . En algunas modalidades, el an ende tanto las CDR de cadena ligera como adas .

En algunas modalidades, la invención propor uerpo que se une de manera específica a Not 3 humano, en donde el anticuerpo comprende: (a) dena pesada que comprende SSSGMS (SEQ ID NO: 5), adena pesada que comprende VIASSGSNTYYADSVKG ) , y una CDR3 de cadena pesada que comprende SIF O:51); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que c SVRSNYLA (SEQ ID NO: 8), una CDR2 de cadena li a ligera que comprende QQYSNFPI (SEQ ID NO: 10) .

La invención también proporciona un anticu ne de manera específica a Notch2 y/o Notch3 hu el anticuerpo comprende: (a) un polipéptido q ños aproximadamente 80 %, al menos aproximadamen eños aproximadamente 90 %, al menos aproximadamen menos aproximadamente 98 % de identidad de sec ID NO: 14 o SEQ ID NO:20; y/o (b) un polipép e al menos aproximadamente 80 %, al menos aproxim , al menos aproximadamente 90 %, al menos aproxim , o al menos aproximadamente 98 % de iden encia a SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 19. Por consí iertas modalidades, el anticuerpo comprende ón variable de cadena pesada que tiene a imadamente 95 % de identidad de secuencia a SE y/o (b) una región variable de cadena ligera que imadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, imadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 aproximadamente 98 % de identidad de secuencia ; y/o (b) un polipéptido que tiene al imadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, imadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 aproximadamente 98 % de identidad de secuencia 13. Por consiguiente, en ciertas modalida uerpo comprende (a) una región variable de caden tiene al menos aproximadamente 95 % de ident ncia a SEQ ID NO: 50; y/o (b) una región var a ligera que tiene al menos aproximadamente idad de secuencia a SEQ ID NO: 13. En idades, el anticuerpo comprende: (a) un polipépt lo, una región variable de cadena pesada) que c ID NO: 50; y/o (b) a polipéptido (por ejemplo, un a neo-vascularización, y en ciertas modalidad uerpos tienen un efecto anti-angiogénico .

La presente invención proporciona ant dos contra un receptor Notch2 y/o Notch3 hum uerpo, o fragmento de anticuerpo, puede ser ? uerpo monoclonal o policlonal que reconozca ífica el receptor Notch descrito. En idades, la presente invención proporciona ant lonales, o fragmentos de los mismos, que se a específica a un receptor Notch descrito nte. En algunas modalidades, los ant lónales, o fragmentos de los mismos, son ant ricos o humanizados que se une de manera específ io extracelular de un receptor Notch descrit nte. En otras modalidades, los anticuerpos monoc agmentos de los mismos, son anticuerpos humanos nte, efusión pleural, o muestra sanguínea. Las jido se pueden seccionar y detectar la proteína ejemplo, inmunofluorescencia o inmunohistoqui a alternativa, las células individuales de una islan, y se detecta la expresión de la prot as fijas o vivas por análisis de FACS . Adicion anticuerpos se pueden usar en ensayos de prote tar la expresión de un receptor Noten, por ejét ias tumorales, en lisados celulares, o en otras roteína. En otras modalidades, los anticuerpo nte invención se usan para inhibir el crecim las tumorales al poner en contacto las células t los anticuerpos ya sea en ensayos basados en cél o o en modelos animales in vivo. En aú lidades, los anticuerpos se usan para tratar cánc ente humano al administrar una cantidad terapéut do en solución salina estéril y combinado ante (por ejemplo Adyuvante Completo o Incom d) para formar una emulsión estable. El an lonal entonces se recupera de la sangre, as ares de un animal inmunizado de este modo. L ectada se coagula, y el suero se decanta, se c entrifugación, y se valora para el título de ant anticuerpos policlonales se pueden purificar is de acuerdo a los métodos normales de la téc yen cromatografía de afinidad, cromatogra cambio iónico, electroforesis en ge, diálisis, e Se pueden preparar anticuerpos monoclonale os de hibridoma, tal como aquellos descritos po ilstein, 1975, Nature 256:495. Usando el mé idoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro edero apropiado como se describe anteriormen íficamente contra un antígeno elegido como se d nmunoprecipitación, inmunotransferencia, o por u ión in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) osorbente enlazado a enzimas (ELISA) entonces s gar ya sea en cultivo in vitro usando métodos ng, Monoclonal Anticuerpos: Principies and P mic Press, 1986) o in vivo como tumores de ascit l . Los anticuerpos monoclonales entonces se icar del medio de cultivo o fluido de ascitis ibe para los anticuerpos monoclonales anteriores De manera alternativa, también se pueden uerpos monoclonales usando métodos de ADN reco se describe en la patente de los Estados Un ,567. Los polinucleótidos que codifican uerpo monoclonales se aislan de células B m ias de hibridoma, tal como por RT-PCR usando ceba munoglobulina, expresan los anticuerpos monoclo élulas hospederas. También, se pueden aislar ant lonales recombinantes o fragmentos de los mismo ié deseada de bibliotecas de visualización de fa lo, como se describe en la presente .

Los polinucleótidos que codifican ? uerpo monoclonal se pueden modificar adicional s maneras diferentes usando tecnología binante para generar anticuerpos alternati as modalidades, los dominios constantes de las ra y pesada por ejemplo, de un anticuerpo monoc se pueden sustituir 1) por aquellas regiones lo, un anticuerpo humano para generar un an érico o 2) por un polipéptido no de inmunoglobul rar un anticuerpo de fusión. En otras modalida ónes constantes se truncan o remueven para ge os, humanos, quiméricos, humanizados, prim os o primatizador . En otras modalidades, los ant icados de la presente invención pueden co rucciones de anticuerpo de cadena individual ( íos descritos en la patente de los Estados Un ,019, que se incorpora en la presente como ref tienen dominios constantes alterados como se des resente. En consecuencia, cualquiera de estos uerpos modificados de acuerdo con las enseñanz nte son compatibles con esta invención.

De acuerdo a la presente invención, se ar técnicas para la producción de anticuerpos d idual específicos a un polipéptido de la invenci te de los Estados Unidos No. 4,946,778). Ad n adaptar métodos para la construcción de biblio sión de Fab (Huse et al., 1989, Science 246:12 entó Fab generado para el tratamiento de la mol uerpo con papaína y un agente reductor, (d) fr Los anticuerpos biespecíficos también está alcance de la invención. Los anticuerpos biesp anticuerpos monoclonales , preferentemente hu izados que tienen especificidades de unión para antígenos diferentes (o, en ciertas modalida pos diferentes en el mismo antígeno) . En el , una de las especificidades de unión es éptido antigénico de la invención (Noten, o un f ismo) , en tanto que el segundo objetivo o diana ualquier otro antígeno, y de manera ventajosa ína de superficie celular, o receptor o subu tor. Se proporcionan anticuerpos biespecífi renden un sitio de unión al antígeno que se une d n diferentes especificidades ( ilstein y Cuell e 305:537-539). Debido a la clasificación alea cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina domas (cuadromas) producen una mezcla potencial ulas diferentes de anticuerpo, de las cales una ctura biespecífica correcta. La purificación ula correcta usualmente se logra por cromatog dad.

De manera alternativa, en ciertas modalida uerpos descritos en la presente pued specíficos . Por ejemplo, en ciertas modalidad de uno o más sitios de unión al antígeno uerpo contiene es capaz de unirse (o unirse s o más receptores Notch humano (por ejemplo, 3 , o epítopos homólogos tanto en Notch2 como Not as modalidades, un sitio de unión al antígen ene el sitio necesario para la unión de la caden estar presente en al menos una de las ' fusiones codifica¦ para las fusiones de cadena pe oglobulina, y si se desea, la cadena li ogloblina, se inserta en vectores separ sión, y se co-transíectan en un organismo h ado . Los detalles adicionales para generar ant ecíficos se pueden encontrar en Suresh et al. ds in Enzymology 121:210.

Se pueden preparar anticuerpos biespecífi uerpos de longitud completa o fragmentos de ant a literatura se han descrito técnicas para cuerpos biespecíficos de fragmento de anticue lo, se pueden preparar anticuerpos biespecífico ce químico. Además, Brennan et al., 1985, Scienc riben un procedimiento en donde los anticuerpos cias. Por ejemplo, se pueden preparar ant pecíficos (Tutt et al., 1991, J. Immunol . 147:60) Los anticuerpos biespecífieos de ejemplo e a dos diferentes epítopos, al menos uno de lo rigina en un polipéptido de la invención. D nativa, un brazo anti-antigénico de una molé oglobulina se puede combinar con un brazo que molécula de activación en un leucocito tal cula receptora de células T (por ejemplo CD2 , CD 7) , o receptores de Fe para IgG para enfo ismos de defensa celular a la célula que ex eno particular. También se pueden usar ant ecífieos . para dirigir los agentes citotóxicos a expresan un antígeno particular. Estos anticuerpo razo de unión al antígeno y un brazo que se te citotóxico o un quelador de radionúclido, yendo aquellas que comprenden agentes reticulado ío se pueden construir inmunotoxinas usando una tercambio de sulfuro o al formar un enlace de t ejemplos de reactivos adecuados para este p yen iminotiolato y metil -mercapto butiramirato .

Para los propósitos de la presente inven apreciar que los anticuerpos modificados enden cualquier tipo de región variable, que pro sociación del anticuerpo con los polipéptidos d ste respecto, la región variable puede compren a de cualquier tipo de mamífero que se puede montar una respuesta humoral y para oglobulinas contra el antígeno deseado asociado tal, la región variable de los anticuerpos mod ser, por ejemplo, de origen humano, murino, pr IO (por ejemplo monos cynomolgus, macacos, tadas de aminoácidos.

En algunas modalidades, de la presente nticuerpo monoclonal contra un receptor Notc uerpo humanizado. Los anticuerpos humaniza uerpos que contienen secuencias mínimas de ant umanos (por ejemplo, murino) dentro de las bles. Estos anticuerpos se usan terapéuticame ir la antigenicidad y respuesta de HAMA (an -ratón de humano) cuando se administran a u o. En la práctica, típicamente, los ant izados son anticuerpos humanos con un mínimo o neia no humana. Un anticuerpo humano es un an cido por un humano o un anticuerpo que ti ncia de aminoácidos que corresponde a un an cido por un humano.

Se pueden producir anticuerpos humanizado ble de Fv y/o dentro de los residuos no lazados para refinar y optimizar la especi dad y/o capacidad del anticuerpo .

Como una alternativa a la humanización, s ar anticuerpos humanos. Se pueden preparar ant os usando varias técnicas bien conocidas, inclu les transgénicos , bibliotecas de fagos, y ce as activadas in vitro.

Por ejemplo, ahora es posible producir génicos (por ejemplo, ratones) que contienen oglobulina humana que son capaces, en la inmun roducir un repertorio completo de anticuerpos hu usencia de producción endógena de inmunoglobul lo, se ha descrito que la supresión homocigota a región de unión (JH) de cadena pesada de antic es mutantes quiméricos y de línea germinal ,807; 5,545,807; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,0 852.

De manera alternativa, se puede usar tecno lización de fagos para producir anticuerpos h entos de anticuerpos in vitro, de repertorios ominio variable (V) de inmunoglobulina de dona izados. De acuerdo a esta técnica, los genes de anticuerpo se clonan en cuadro ya sea en un ína de cubierta principal o menos de un bact entoso, tal como M13 o fd, y se visualiz entos funcionales de anticuerpo en la superfic ícula de fago. Debido a que la partícula fil iene una copia de ADN de hebra individual del g , las selecciones basadas en las propiedades fun anticuerpo también dan por resultado la selección codifica para el anticuerpo que exhibe estas prop so de antígenos (incluyendo auto-antígenos) . ca son bien conocidos los métodos para sel uerpos humanos de una biblioteca de fagos, d oteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Va 1996, tature Biotechnology 14:309-314; Sheets , PNAS 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, . 227:381; McCafferty et al., 1990, Nature 348: son et al., 1991, Nature 352:624-628; y arks J. Mol. Biol, 222:581-597). También se d icas para la generación y uso de bibliotecas de uerpo de las Patentes de los Estados Unid 9,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6, 5,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6, 6,484; y 7,264,963; y Rothe et al., 2008, J. M 1182-1200 (cada uno de los cuales se incorpor ente como referencia en su totalidad) . En la té uerpo dirigido contra un antígeno objetivo. ( ío, Colé et al., 1985, Monoclonal Anticuerpos an py, Alan R. Liss, p. 77; Boemer et al., l ol, 147 (l):86-95 Patente de los Estados Uni ,373; 5,567,610; y 5,229,275).

Se apreciará que el injerto de los bles no humanos completos en regiones constantes cirá anticuerpos quiméricos "clásicos" . En el a presente solicitud, el término "anticuerpos qui antendrá para querer decir cualquier anticuerpo egión o sitio inmunoreactivo se obtiene o se d primera especie la región constante (que pue Cta, ser parcial o estar modificada de acuerdo ción) se obtiene de una segunda especie. En lidades, la región o sitio de unión al antígeno fuente no humana (por ejemplo, de ratón) y l e la CDR se pueden derivar de un anticuerpo de o aún sub-clase como el anticuerpo del cual s s regiones menores variables, se contempla que rivarán de un anticuerpo de clase diferente y d rente un anticuerpo de una especie diferente, izar que puede no ser necesario reemplazar todas las CDR completas de la región variable donad ferir la capacidad de unión al antígeno de un ble a otro. En cambio, solo puede ser n ferir estos residuos que son necesarios para man idad del sitio de unión a antígeno. D caciones expuestas en las patentes de los estado 5,585,089; 5,693,761; y 5,693,762, estará bien d écnica, ya sea al llevar a cabo la experiment a o por prueba de ensayo y error para obt uerpo funcional con inmunogenicidad reducida. isma inmunogenicidad que comprende una región c a o no alterada. En algunas modalidades, la ante de los anticuerpos modificados comprend n constante humana. Las modificaciones a la ante compatibles con esta invención co ones, supresiones o sustituciones de uno ácidos en uno o más dominios. Es decir, los ant icados descritos en la presente pueden co aciones o modificaciones a uno o más de l ios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3 io constante (CL) de cadena ligera. En lidades de la invención, se contemplan antes modificadas en donde se suprimen pa letamente uno o más dominios. En otras modalida cuerpos modificados comprenderán construcci antes suprimidos de dominio en donde el dom uerpos se activa el sistema de complemer ación del complemento es importante en la opsoni a lisis de patógenos celulares. La activac emento también estimula la respuesta inflama én puede estar comprendida en la hipersens nmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a nte la región Fe, con un sitio de receptor de n Fe de anticuerpo que se une a un receptor de una célula. Hay varios receptores de Fe íficos para diferentes clases de anticuerpo, in (receptores gamma) , IgE (receptores epsilo ptores alfa) e IgM (receptores mu) . La un uerpo a receptores de Fe en las superficies c a varias respuestas biológicas importantes y incluyen absorción y destrucción de partículas re ticuerpo, depuración de complejos inmunitarios , ción, se cree que los anticuerpos que co nes constantes modificadas como se describe nte proporcionan funciones efectoras alteradas q afecta el perfil biológico del anticuerpo admin ejemplo, la supresión o inactivación (a tr iones puntuales u otros medios) de un dominio d ante puede reducir la unión del receptor uerpo modificado en circulación, incrementando la localización tumoral . En otros casos, puede modificaciones de la región constante, consiste invención, moderen la unión a complemento y a reduzcan la vida media en suero y la asoci ifica de una citotoxina conjugada. Se pueden modificaciones de la región constante para es de disulfuro o porciones de oligosacár iten la localización mejorada debido a la espec rcionar un separador peptídico entre la re ela y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ueden expresar construcciones compatibles en suprimido el dominio CH2 y el dominio CH3 ficado o no modificado) se una a la región de un espaciador de 5-20 aminoácidos. Este sepa adicionar, por ejemplo, para asegurar que los e adores del dominio constante permanezcan l ibles o que la región la charnela permanezca f embargo, se debe señalar que los separad ácido pueden probar en algunos casos, ser inmun oducir una respuesta inmunitaria indeseada co rucción. Por consiguiente, cualquier s ionado a la construcción debe ser relativam ogénico, o aún, se debe omitir conjuntamente si ner las calidades bioquímicas y/o biológicas dés ble suprimir simplemente esa parte de uno o más n constante que controlan la función efecto ío, unión de Clq de complemento) que se modul siones parciales de las regiones constantes ar las características seleccionadas del an media en suero) , en tanto que dejan intact ones deseable asociadas con el presente dom n constante. Además, como se alude anteriorme nes constantes de los anticuerpos descritos s icar a través de la mutación o sustitución de u ácidos lo que mejora el perfil de la cons tante. A este respecto, puede ser posible interr idad proporcionada por un sitio conservado de un lo, unión de Fe) , en tanto que mantiene sustanc configuración y perfil inmunogénico del an ficado. Aún otras modalidades pueden compre es de reconocer y unirse de forma específica a pítopos diferentes. Los diferentes epítopos pued ea dentro de la misma molécula (por ejemplo, éptido de receptor Notch) o en diferentes molécu lo, los anticuerpos pueden reconocer y unirse d ífica a un receptor Notch, también, por ejemplo ula efectora en un leucocito tal como un rec ias T (por ejemplo, CD3) o un receptor de lo, CD64, CD32 o CD16) o 2) un agente citotóxico ribe en detalle en la presente. Los ant ecíficos pueden ser anticuerpos intactos o fragm cuerpo. Son comunes las técnicas para cuerpos biespecífieos ( illstein et al., 1983, 537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; S 1986, Methods in Enzymol . 121:120; Traunecker , EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, ticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al al of Biochemical and Biophysical Methods 24:1 an et al., 1985, Science, 229:81). Sin embarg fragmentos se producen típicamente de forma dir as hospederas recombinantes como se describe nte. De esta manera, los fragmentos de anticue scFv se pueden expresar todos en y segregar de E células hospederas, permitiendo de este i cción de grandes cantidades de estos fragme a alternativa, estos fragmentos de anticuerpos s r de las bibliotecas de fagos de anticuerpo, an a presente. Los fragmentos de anticuerpo tambié anticuerpos lineales como se describe en patent os Unidos No. 5,641,870, por ejemplo, y pu específicos o biespecífieos . Serán evidente icas para la producción de los fragmentos de anti ptidos o ADN) .

La presente invención abarca además varí alentes que son sustancialmente homólogos uerpos quiméricos, humanizados y humanos, o fr ticuerpo de los mismos, expuestos en la present n contener, por ejemplo, mutaciones conserva tución, es decir, la sustitución de uno ácidos por aminoácidos similares. Por ejem tución conservadora se refiere a la sustitució ácido con otro dentro de la misma clase general ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácid aminoácido básico con otro aminoácido básic ácido neutral por otro aminoácido neutral. Lo ne por una sustitución conservadora de amino conocido en la técnica.

La invención también se refiere a inmunoco icina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros caladores. Las toxinas enzimáticamente act entos de las mismas que se pueden usar incluye ifteria A, fragmentos activos no de unión de t ria, cadena de exotoxina A, cadena de ricino A brina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, p leurites fordii, proteínas de diantina, prote laca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhi dica charantia, curcina, crotina, inhibi naria officinalis, gelonina, mitogelina, restri icina, enomicina, y tricotecenos . Los conjug uerpo y agente citotóxico se producen usa dad de agentes acopladoras de proteína bifunci N-succinimidilo-3 - (2-piridiiditiol) propionato tiolano (IT) , derivados de bifuncionales de imid como dimetil adipimidato-HCL) , ésteres activos ( toxinas que tienen actividad de toxina.

Los anticuerpos conjugados se componen uerpos covalentemente unidos. Estos anticuerpos esto, por ejemplo, para dirigir células inmun as indeseadas (patente de los Estados Uni ,980). Se contempla que los anticuerpos se rar in vitro usando métodos conocidos en qu ína de síntesis, incluyendo aquellos que co es reticuladores . Por ejemplo, se pueden c otoxinas usando una reacción de intercambio de d formar un enlacfe de tioéter. Los ejemplos de r ados para este propósito incluyen iminotiolato rcaptobutirimidato .

En algunas modalidades, el anticuerpo ción contiene regiones Fe humanas que se modifi rar la función efectora, por ejemplo, citót . Shopes, 1992, Immunol 148:2918-2922). Tam n preparar anticuerpos homodiméricos con activid mejorada usando reticuladores heterobifunciona scribe en olff et al., 1993, Cáncer Research De manera alternativa, se puede manejar un an iene regiones Fe duales (Stevenson et al., 198 r Drug Design 3:219-230) .

A pesar de como se obtienen cantidades úti uerpos de la presente invención se pueden uiera de varias formas conjugadas (es de oconjugado) o formas no conjugadas. Los anticu invención se pueden usar en forma no conj uda" para implementar los mecanismos de defensa sujeto incluyendo la citotoxicidad dependi emento (CDC) y toxicidad celular dependi uerpo (ADCC) para eliminar las células malig nte invención comprenden el uso de ant gados a biotoxinas específicas, tal como ricino difteria. En aún otras modalidades los ant icados se pueden volver complejos con otros ológicamente activos (por ejemplo, anticu nentos de los mismos) en donde la molécula resul anto a la célula neoplásica como una célula efec una célula T. La selección de que anticuerpo mod gado o no conjugado, se usará, dependerá del a de cáncer, el uso de tratamiento adjunto (por ioterapia o radiación externa) y condición del p preciará que uno puede hacer fácilmente esta s vista de las enseñanzas de la p La preparación y caracterización de ant -Notch también se enseña, por ejemplo, en la pub solicitud de patente de los Estados Uni Curr. Opin. Biotechnol . , 17:653-658; Nygren, 20 275:2668-76, y Skerra, 2008, FEBS J. , 275:2677- e los cuales se incorpora como referencia en la totalidad. En ciertas modalidades, se usa la te isualización de fagos para identificar y/o pro éptido de unión a Noten. En ciertas modalida éptido comprende un núcleo de proteína de cionado del grupo que consiste de proteína alina, un dominio de fibronectina, un dom ición de consenso de anquirina, y tiorredoxina .

En algunas modalidades, el agente es una e proteína. En ciertas modalidades, el agente ula pequeña. Son bien conocidos por los expert ca las bibliotecas de química combinatoria eas útiles en la identificación de agentes de no de proteína. Ver, por ejemplo, Kennedy et al enizadas) en base a su capacidad para unirse ula. En algunas modalidades, el aptámero compr ucleótido de ADN. En ciertas modalidades alter ptámero comprende un polinucleótido de RNA. En idades, el aptámero comprende uno o más icados de ácido nucleico. Son bien conocidos ca los métodos para generar y examinar aptánt nucleico para la unión a proteínas. Ver, por tes de los Estados Unidos Nos. 5,270,163, 5, ,595, 6,344,321, 7,368,236, 5,582,981, 5, ,867, 7,312,325 y 7,329,742, publicaciones de nacional Nos. WO 02/077262; WO 03/070984; publi solicitud de os Estados Unidos Nos. 2005/0239134, 2005/01 0227735, cada una de los cuales se incorpor nte como referencia en su totalidad. ión de precipitina por difusión en gel, en odifusión, ensayo de aglutinación, ensayo de fi emento, ensayo inmunorradiométrico, inmu escente e inmunoensayo de proteína A. Estos ens utina y son bien conocidos en la técnica ( lo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Prot ular Biology, Volumen 1, John iley & Sons, Inc , que se incorpora en la presente como referenc idad) .

En algunas modalidades de la presente inven oespecificidad de un anticuerpo contra un recept etermina usando ELISA. Un ensayo ELISA comprende antígeno, revestir concavidades de una p título de 96 concavidades con antígeno, adic cuerpo contra el receptor Notch conjugado a un c ctable tal como un sustrato enzimático (por egundo anticuerpo conjugado a un compuesto de és de la adición del antígeno a la concavidad re parámetros que se pueden modificar para increm detectada, así como otras variaciones de los E conocidos en la técnica (ver, por ejemplo Au Eds, 1994, Current Protocols in Molecular m 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York a 11.2.

La afinidad de unión de un anticuerpo a un y la constante de disociación de la int uerpo-antígeno se puede determinar por ensayos titiva. Un ejemplo de un ensayo de unión compet adioinmunoensayo que comprende la incubación del ado {por ejemplo, 3H o 125I) , o fragmento o vari O, con el anticuerpo de interés en la pres idades crecientes de antígeno son marcados segu etección del anticuerpo unido al antígeno mar La invención proporciona polinucleótidos omprenden los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 , 4, 8, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56 o los polinucleótidos de SEQ ID NO : 1, 3, 15, 17, olinucleótidos de la invención puede está en la o la forma de ADN, en donde ADN incluye ADNc, ico, y ADN sintético. El ADN puede ser d idual o de doble hebra, y si es de habrá in ser la hebra codificadora o la hebra no codi -sentido) . De esta manera, el término polinu codifica para un polipéptido" abarca un polinu incluye solo secuencias codificadoras p éptido, así como un polinucleótido que ncias codificadoras y/o no codificadoras adicion as modalidades, la invención proporci ucleótido que hibridiza un polinucleótido que molécula solo a una secuencia particular de nuc condiciones de hibridación severa cuando esa s presente en una mezcla compleja (por ejemp oteca de ADN o RNA) . Ver, por ejemplo, Anderse ic Acid Hybridization Springer-Verlag, Ross (e ic Acid Hybridization iley.

Como se usa en la presente, la frase "con ibridación severa" se refiere a condiciones s una sonda u otro polinucleótido hibridiza cuencia objetivo u otra secuencia complen camente en una mezcla compleja de ácido nucleico, ral no a otras secuencias. Las condiciones sev dientes de la secuencia y serán diferentes en di nstancias. Secuencias más largas hi cíficamente a mayores temperaturas. Una guía ex idación de ácidos nucleicos se encuentra en dizan a la secuencia objetivo en equilibrio (pu ecuencias objetivó están presentes en exceso, a as sondas se ocupan en el equilibrio) . Las con as serán aquellas en las cuales la concentració enor que aproximadamente 1.0 M de ion de amente una concentración den ion de sodio de 0. otras sales) a pH de 7.0 a 8.3 y la temperatu aproximadamente 30°C para sondas cortas (por 0 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 6 s largas (por ejemplo, mayor que 50 nucle ién se pueden lograr condiciones severas con la agentes desestabilizadores tal como formamid idación de alta severidad, una señal positiva es veces el fondo, o 10 veces la hibridación de fo iciones de hibridación severa o de alta seve lo incluyen: 50 % de formamida, 5x SSC, 1 % imadamente 50 °C a aproximadamente 65 °C, depend longitud especificidad del cebador. Las con as del ciclo, tanto para ampliaciones de alta severidad incluyen una fase de desnaturalización C durante 30-120 segundos, una fase de fijación 0 segundos, y una fase de extensión de aproxim durante 1-2 min.

La presente invención se refiere además a v linucleótidos descritos anteriormente en la pres ican para los fragmentos, análogos y deriva nte del polinucleótido puede ser una variante se presenta de forma natural del polinucleótid nte que no se presenta de manera natu ucleótido .

Como se indica anteriormente en la pres ucleótido puede tener una secuencia codificador éptido maduro se puede fusionar en el mismo c ra a un polinucleótido que ayuda en la expr ción de un polipéptido de una célula hospede ío, una secuencia guía que funciona como una s toria para controlar el transporte de un pol la célula. El polipéptido que tiene una secuen preproteína y puede tener la secuencia guía e la célula hospedera para formar la forma ma éptido. Los polinucleótidos también pueden c un proproteína que es la proteína madura, o más minoácido de 5' adicionales. Una proteína ma una prosecuencia es un proproteína y es u iva de la proteína. Una vez que se esc cuencia permanece una proteína madura activa.

De esta manera, por ejemplo, el polinucle resente invención puede codificar para una icación del polipéptido maduro fusionado al mar aso de un hospedero bacteriano. 0 , por ejer ncia marcadora puede ser una marca de hemaglutin o se usa un hospedero mamífero, por ejemplo, . La marca de HA corresponde a un epítopo deriva ína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al 37 : 767 ) .

Las modalidades adicionales de la i yen moléculas aisladas de ácido nucleico que co olinucleótido que tiene una secuencia de nucleó 90 % idéntica, 95 % idéntica y en algunas moda eños 96 % , 97 I, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID N 17 , 47 , 48 , 58 , 59 o 60 . En algunas modalida ucleótidos que comprenden una secuencia de nuc enos 90 % idéntica, 95 % idéntica, y en lidades, al menos 96 % , 97 % , 98 % o 99 % O : 58 , 59 o 60 bajo condiciones de hibridación n polinucleótido que tiene una secuencia de nuc enos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una secu ótidos de referencia se propone que la secue ótidos del polinucleótido sea idéntica a la secu encia, excepto que la secuencia de polinuc n incluir hasta cinco mutaciones puntuales por ótidos de la secuencia de nucleótidos de refere palabras, para obtener un polinucleótido que t ncia de nucleótidos al menos 95 % idéntica ncia de nucleótidos de referencia, se pueden su ituir hasta 5 % de los nucleótidos de la secu rencia con otro nucleótido, o en las secuen rencias se pueden insertar varios nucleótidos h os nucleótidos totales en la secuencia de ref s mutaciones de la secuencia de referencia ío, tiene al menos aproximadamente 80 %, a imadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 aproximadamente 97 % de identidad de secuenci ncia de referencia es 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ica a la secuencia de referencia, se puede deter a convencional usando programas conocidos de com como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence ge, Versión 8 for Unix, Genetics Computer rsity Research Park, 575 Science Drive, Madi ) . Bestfit usa el algoritmo local de homología terman, 1981, Advances in Applied Mathematics 2: encontrar el mejor segmento de homología e ncías. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro lineación de secuencias para determinar si una s articular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una s referencia de acuerdo a la presente invenci tuciones, adiciones o supresión imperceptibles, an las propiedades o actividades del pol icado. En algunas modalidades, se producen vari ótidos por sustituciones imperceptibles debi eración del código genético. Se pueden ntes de polinucleótido por una variedad de razo lo, para optimizar la expresión de codones dero particular, tal como el cambio de codone humano aquellos preferidos por un hospedero ba como E. coli.

La presente invención proporciona osiciones farmacéuticas que comprenden antagonis ?1?, anticuerpos) que tienen como objetivo o tor Notch. Estas composiciones farmacéuticas en en la inhibición del crecimiento de células turn 1 tratamiento de cáncer en pacientes humanos. to y otros ácidos orgánicos, sales tal como cí , antioxidantes tal como ácido ascórbico y me rvantes, tal como cloruro de octadecil lamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benz ro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o be l -parabenos , tal como metil- o propil-parabeno, cinol ciclohexanol , , 3-pentanol y m-cresol, poli ajo peso molecular (de menos de aproximadam úos de aminoácido) ; proteínas tal como albúmina ina e inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos inilpirrolidona, aminoácidos tal como mina, asparagina, histidina, arginina y hidratos tal como monosacáridos , disacáridos, sa y dextrina; agentes queladores tal como EDTA, como sacarosa, manitol, trehalosa y sorbitol; s formadores de sales tal como sodio; complejos m ío, por inhalación o insuflación de polvos o ae yendo por nebulizador; intratraqueal , int rmica y transdérmlca) ; oral; o parenteral in ción o infusión intravenosa, intraarterial , sub peritoneal, intratumoral o intramuscul istración intracraneal (por ejemplo intrat ventricular) .

La formulación terapéutica puede estar en osis unitaria. Estas formulaciones incluyen t ras, cápsulas, polvos, granulas, soluci nsiones en agua o medios no acuosos, o supositor istración oral, parenteral o rectal istración por inhalación. En composiciones sól tabletas el ingrediente activo principal se me ortador farmacéutico. Los ingredientes convencio ación de tabletas incluyen almidón de maíz, n revestir o combinar de otro modo para proporci de dosis que da la ventaja de acción prolong ío, la tableta o pildora puede comprend sición interior cubierta por un componente e onalmente, los dos componentes se pueden separar entérica que sirve para resistir la desinteg te que el componente interior pase intacto a tr ago o se retrase en la liberación. Se pueden dad de materiales para estas capas o revest icos, estos materiales que incluyen varios éricos y mezclas de ácidos poliméricos con ma omo goma laca, alcohol cetílico y acetato de cel Las formulaciones farmacéuticas onistas (por ejemplo, anticuerpos) de la ción, vueltos complejo con liposomas (Epstein, , Proc. Nati. Acad. Sci . EUA . 82:3688; Hwang, do .

El antagonista (por ejemplo, anticuerpos) uede atrapar en microcápsulas . Estas microcáp ran, por ejemplo, por técnicas de coacervació erización interfacial, por ejemplo, hidro osa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas ilmetacilato) , respectivamente, en sistem istración coloidal de fármacos (por ejemplo, li esferas de albúmina, microemulsiones , nanopart ápsulas) o en macroemulsiones como se desc gton's, The Science and Practice of Pharm ión, Mack Publishing (2000) .

Además, se pueden preparar preparaci ración sostenida. Los ejemplos adecuados de prepa iberación sostenida incluyen matrices semiperme eros hidrófobos sólidos que contiene el ant imero de ácido láctico-ácido glicólico y ace olido) , isobutirato de acetato de sacarosa, -D(-) -3 -hidroxibutírico .

En ciertas modalidades, las compo céuticas comprenden tanto el agente de unión a onista y un segundo agente terapéutico. En Üdades, el segundo agente terapéutico es un agen r y/o un agente anti-angiogénico .

La presente invención proporciona métod ir el crecimiento o proliferación de rigénicas que expresan un receptor Notch onistas del receptor Notch, descritos en la pres nas modalidades, los métodos comprenden inh imiento de células tumorigénicas que expresan un 2 y/o Notch3 usando cualquiera, de los antic péptidos descritos en la presente. En aciente , tal como, por ejemplo, una biopsia de on pleural, o muestra sanguínea o se cultivan ual se adiciona un anticuerpo que se une de ífica a Notch2 y/o Notch3 e inhibe el cre ar. En algunas modalidades, el antagonista uerpo que reconoce de manera específica un epíto tor Notch2 y/o Notch3.

En algunas modalidades, el método para in miento o proliferación de células tumorigéni san un receptor Notch comprende poner en con a con un antagonista contra un receptor Not lo, un antagonista de Notch2 y/o Notch3) in as modalidades, ponerse en contacto con una igénica con un antagonista a un receptor N nde en un modelo de animal. Por ejemp injertos que expresan un receptor Notch se cul as tumorales . En algunas modalidades, el antago eceptor Notch se administra al mismo tiempo és de la introducción de células tumorigénica l para impedir el crecimiento tumoral . E idades, el antagonista de un receptor N istra como un producto terapéutico después de ias tumorigénicas se han cultivado a un ificado. En algunas modalidades, el antagonist n de proteína de receptor Notch que se une d ífica a un receptor Notch. En algunas modalid onista es un anticuerpo que reconoce de cífica un epítopo de un receptor Notch. En lidades, el anticuerpo es cualquiera de los antic éptidos descritos en la presente.

En ciertas modalidades, la puesta en con célula tumorigénica con un antagonista o un as modalidades, el antagonista es un anticuerp a Notch2. En algunas modalidades, el antagonist uerpo 'que se une a Notch3. En algunas modalid onista es un anticuerpo que se une a Notch2 y No as modalidades, el antagonista es un anticuer éptido como se describe en cualquiera de los onados anteriormente o en las modalidades men iormente, así como cualquier otro aspecto o mod itas en la presente. En ciertas modalidades, ende una supresión o mutación inactivadora en e tasa y homólogo de tensina (PTEN) .

La invención proporciona además métod ir la señalización de Notch (por ejemplo No 3) en una célula, que comprende poner en con la con una cantidad efectiva del antagonista d s métodos pueden ser in vivo o in vi tro. En ización de Notch3 en una célula en los cuales co en contacto la célula con una cantidad efe uiera de los anticuerpos o polipéptidos de los dalidades mencionadas anteriormente, así como c aspecto o modalidad descrita en la presente.

La invención proporciona además un méto ar la función de pericitos y/o células del músc lar, el cual comprende administrar una cantidad n antagonista de Notch3 humano al sujeto. En idades, el método inhibe la angiogénesis al mo on de pericitos y/o células del músculo liso v lgunas modalidades, el antagonista es un anticue éptido como se describe en cualquiera de los as idades mencionadas anteriormente, así como C aspecto o modalidad descrita en la presente. En idades, el desarrollo vascular que se in idades, el antagonista de Notch es un antago 2. En ciertas modalidades, el antagonista onista de Notch2 y/o 3. En algunas modalida onista es un anticuerpo Notch2/3. En idades, los métodos para inhibir la angi enden administrar un anticuerpo o polipép uiera de los aspectos o modalidades men iormente, así como cualquier otra modalidad o entes descritos en la presente. En ciertas moda angiogénesis es angiogénesis tumoral. En idades, el desarrollo vascular está en el siti . En ciertas modalidades alternativas, la angi s angiogénesis tumoral. En ciertas modalida ición de la angiogénesis o desarrollo vascula , al menos en parte, la modulación de la funció itos y/o células del músculo liso vasculares. En as modalidades, el antagonista de Notch es un an se une a Notch2. En ciertas modalidades, el ant oten es un anticuerpo que se une a Notch3. En idades, el antagonista de Notch es un anticuerp Notch2 y Notch3. En ciertas modalidades, el ant tch es un anticuerpo o polipéptido de cualquier tos o modalidades mencionadas anteriormente, uier otra modalidad o aspectos descritos en ot la presente. En ciertas modalidades, se re encia de células madre de cáncer en el tumor med istración del anticuerpo. En algunas modalid es un tumor colorrectal, tumor de mama eático o melanoma.

Además se contempla que los agentes y anta a presente invención se pueden usar para trata iciones caracterizadas por la expresión enfermedad relacionada a Notch. En ciertas moda nfermedad se caracteriza por el favorecimient sión o reducción de la expresión de la señaliz (por ejemplo, señalización de Notch2 y/o Not as modalidades, la enfermedad o tumor es depend 2 y/o Notch3 De manera particular, se contempla onistas (por ejemplo, anticuerpos) contra un se usarán para tratar trastornos proliferat yen, pero no se limitan a, tumores benignos y riñon, hígado, vejiga, mama, estómago, ovario, , próstata, pulmón, vulva, tiroides, cabeza y ro (glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, re y linfas (leucemias y linfornas) . En lidades, el trastorno proliferativo para el cua agente de unión a Notch o antagonista, es osarcoma, sarcoma osteogénico, cordoraa, angio eliosarcoma, linfangio ngioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, , leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma d r pancreático, cáncer de mama, cáncer ovárico, c ata, carcinoma de células escamosas, carci ias básales, adenocarcinoma, carcinoma de rípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma carcinomas papilares, cistadenocarcinoma, c lar, carcinoma broncogénico, carcinoma de ies, hepatoma, carcinoma de conductos b ocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, t s, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma p inoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma de inoma epitelial, glioma, astrocitoma, medulob eofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangliob r con el agente de unión a Noten, o antagonista, medad asociada con angiogénesis . En ciertas moda fermedad es cáncer. En ciertas modalidades dif fermedad no es una condición cancerosa. Por eje medad puede ser degeneración macular eración macular o relacionada a la edad, ret tica, una hemangioma, artritis reumatoide, ps oma neovascular, enfermedad de ovario poliq etriosis y trastornos inflamatorios del intestin En ciertas modalidades, el tumor exp tor o receptores Notch a los cuales se dirige e ión a Notch, o antagonista. En ciertas modalid expresa Notch2 y/o Notch3. En ciertas modalid sobre-expresa Notch2 y/o Notch3. En idades, el tumor es dependiente de uno o más re a los cuales, se une de manera específica el an En ciertas modalidades, el tumor es homoci rocigótico para una supresión o mutación inactiv en que codifica para el supresor tumoral, hom atasa y tensina (PTEN) . En ciertas modalidades, comprende la supresión o mutación es un tumor de Los antagonistas se administran co osición farmacéutica apropiada a un paciente h rdo con métodos conocidos. Los métodos adec istración incluyen administración intravenosa o por infusión continua durante un periodo de rutas intramuscular, intraperitoneal , intr atumoral, intraarterial , intracerebroespinal , sub a-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tóp lación .

En ciertas modalidades, además de admini gonista Noten, el método o tratamiento comprend concurrente. En modalidades seleccionada onistas Notch se administrarán a pacientes imentado anteriormente el tratamiento con el e anti-cáncer. En ciertas modalidades difere onista de Notch y el segundo agente terapéu istrar n de manera sustancialmente simult rrente. Por ejemplo, se le puede dar a un s onista de Notch en tanto que se somete a un tras miento con el segundo agente terapéutico (por ioterapia) . En ciertas modalidades, el antago se administrará en el espacio de 1 año del tra segundo agente terapéutico. En ciertas mod rnativas, el antagonista de Notch se administrar 0, 8, 6, 4 o 2 meses de cualquier tratamiento do agente terapéutico. En ciertas mod rentes, el antagonista de Notch se administrar jemplo, agentes antitubulina , auristatinas , aglu anura menor de ADN, inhibidores de replicación es alquiladores (por ejemplo, complejo de pla cisplatina, mono (platino) , bis (platino) y comp no tri-nucleares y carboplatina) , antrac ióticos, antifoliatos , antimetabolitos , sensibil quimioterapia, duocarmicinas , etopósidos, pir adas, ionóforos, lexitropsinas, nitro noles, compuestos de desempeño, antimetabol a, puromicinas, sensibilizadores de ra oides, taxanos, inhibidores de tomoisomerasa, al inca per vinca, o similares. En ciertas modalid do agente anti-cáncer es un antimetabolito, un i poisomerasa , o un inhibidor de angiogénesis .

Los agentes anticáncer que se pueden admini inación con los antagonistas de Notch incluyen comercialmente disponibles, tal como doxorrubi ouracilo, citosina-arabinósido (Ara-C) , ciclofo pa, busulfano, citocina, taxol, metotrexato, cis lano, binblastina y carboplatina . La admini inada puede incluir la co-administración, ya se lación farmacéutica individual o usando formu adas, por la administración consecutiva en c pero en general dentro de un periodo de tiempo s los agentes activos puedan ejercer simultáneam idades biológicas. Los programas de dosific ración para estos agentes quimioterapéuticos s de acuerdo a las instrucciones del fabricante o rmine de forma empírica. La preparación y prog ficación para esta quimioterapia también se desc otherapy Service Ed. , M. C. Perry, Williams & imore, Md. (1992) . mbucil, clornafazina, clolofosfamida , estra amida, mecloretamina, clorhidrato de óx retamina, melfalano, novembiquina, fena imustina, trofosfamida , mostaza de uracilo nit como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lo tina, ranimustina ; antibióticos tal inomisinas , actinomicina , autramicina, az icinas, cactinomicina, caliqueamicin, car omicina, carzinofilina , cromomicinas, dactin rubicina, detorubicina, 6 -diazo-5 -oxo-L-nor ubiciná, epirubicina, esorubicina, ida lomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogal micinas, peplomicina, potfiromicina, pur amicina, rodorubicina, estreptonigrina, estrept rcidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; olitos tal como metotrexato y 5 -fluorouracilo fólico tal como frolínico; aceglatona; aldofo sido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestr trena; edatraxato; defofamina; demecolcina; día mitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nit ; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mito antrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina ; rubicina; ácido podofilínico; 2-etilhi arbazina; PSK; razoxano; sizofuran; espirogermani azónico; triaziquona; 2 , 2 ', 2 ' ' -triclorotriet ano; vindesina; dacarbazina; mannomustina ; mitob lactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ophosfamida ; tiotepa; taxoides tal como pa OL) y doxetaxel (TAXOTERE, Rhone) ; clora itabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; meto ogos de platino tal como cisplatina y carbo lastina; platino; etopósido (VP-16) ; if lo, tamoxifeno, raloxifeno, 4 { 5 ) - imidazoles inh romatasa, 4 -hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ce 018, onapristona, y toremifeno (Farest ndrógenos tal como flutamida, nilutamida, bical ólido, y goserelina; y sales, ácidos o d céuticamente aceptables de cualquiera de los ant En ciertas modalidades, el agente quimioter un inhibidor de topoisomerasa . Los inhibid somerasa son agentes de quimioterapia que int la acción de una enzima de topoisomerasa (por isomerasa I o II) . Los inhibidores de topoi yen, pero no se limitan a, doxorrubicina—HCL, ci rubicina, mitoxantrona-HCL, actinomicina D, et ecano-HCL, tenipósido (VM-26), e irinotecano. En lidades, el segundo agente anticáncer es irinote tas modalidades, el tumor que se va a tratar es tabina, fluorouracilo capecitabina, metotrexato rexed, pemetrexed, tegafur, citocina-arab anina, 5 -azacitidina , 6 -mercaptopurina, azatiop anina, pentostatina, fosfato de fludarab ibina, así como sales, ácidos o d céut icamente aceptables de cualquiera de los ant iertas modalidades, el segundo agente anti-cá tabina. En ciertas modalidades anticáncer, el t a a tratar es un tumor pancreático y el segund áncer es un anti-metabolito (por ejemplo, gemcit En otras modalidades, el tratamiento comp istración combinada de un antagonista de la ción y terapia de radiación. El tratamiento onistas puede presentarse antes de, concurre o subsiguiente a la administración de la te ción. Se puede usar cualquier programa de dosi idades alternativas, el Segundo agente ant ende un anticuerpo que se une de manera espe humano u otro ligando de un receptor Note uerpo que se une de manera específica a un humano adicional. Los anticuerpos anti-DLL4 de escriben, por ejemplo, en la Publicación de Soli te de los Estados Unidos No. US 2008/ porada en la presente como referencia en su to anticuerpos anti-DLL4 adicionales se describ lo, en las Publicaciones de Patente Internació 2008/091222 y WO 2008/0793326, y Publicaci itudes de Patente de los Estados Unidos /0014196, US 2008/0175847; US 2008/0181899; /0107648, cada una de las cuales se incorpor nte como referencia en su totalidad. Los ant -Noten de ejemplo, se describen, por ejemplo, do agente terapéutico es AVASTIN (bevac PTIN (trastuzumab) , VECTIBIX (panitumumab) , o ximab) . La administración combinada puede inclui istración, ya sea en una formulación farm idual o usando formulaciones separadas, istración consecutiva en cualquier orden pero en o de un periodo de tiempo tal que todos los os pueden ejercer simultáneamente sus act gicas .

Adicionalmente , el tratamiento puede inc istración de una o más citocinas (por cinas, interleucinas , factor de necrosis tumo res de crecimiento) o se puede acompañar por rgica de células de cáncer o cualquier otra ter zgue necesaria por un facultativo que trate.

Para el tratamiento de la enfermedad, 1 úa una curación o se logra una disminución del e medad (por ejemplo, reducción en el tamaño del ueden calcular programas óptimos de dosificació iones de la acumulación de fármaco en el anticu nte y variarán dependiendo de la potencia relati onista individual. El facultativo que administ rminar fácilmente dosis óptimas, metodologías óp ficación y proporciones de repetición. En gen s es de 0.01 µg a 100 mg por kg de peso corpor e dar una vez o más de una vez al día, de manera nsualmente o anualmente, el facultativo que tra ar las proporciones de repetición para la dosi ase a los tiempos medidos de residencia y en ba entraciones del fármaco en los fluidos o orales .

En ciertas modalidades, los paciente que codifica para el supresor tumoral, homo tasa y tensina (PTEN) . En ciertas modalidades, e va a probar es un tumor de mama.

Por ejemplo, la invención proporciona u seleccionar un sujeto para el tratamiento onista de Notch2 y/o Notch3 , en donde el sujeto o se le ha removido un tumor. En ciertas moda étodo comprende (a) determinar si el tumor compr sión o mutación en el gen de PTEN, y (b) selecc o para el tratamiento con el antagonista de Notc r comprende la supresión o mutación.

En ciertas modalidades alternativas de la ción, los pacientes examinados para la pres omas de colon o pólipos, se prueban para pérdida taciones somáticas mediante una prueba genét as modalidades, la prueba genética examina la p comprende un epítopo que es específ orreactivo con el anticuerpo o anticuerpos incl quipo, un anticuerpo de control que no reaccion tor Notch, y/o un medio para detectar la unió uerpo a un receptor Noch (tal como por eje foro fluorescente, un sustrato enzimático, un c activo o un compuesto luminiscente conju uerpo contra un receptor Notch o a un segundo an reconoce el anticuerpo contra un receptor No S modalidades, un equipo comprende reactivos esp la detección de ARNm o ADNc (por ejemplo, ores de oligonucleótidos) de uno o más receptore lgunas modalidades, los equipos contienen to onentes necesarios y/o suficientes para real o de detección, incluyendo todos los co rucciones para realizar los ensayos, y cualquier íente se pueden adicionar de una manera cuantit ompartimiento a otro. Estos recipientes inclu íente que aceptará la muestra de prueba, un re ontiene los anticuerpos o sondas usadas en los ientes que contienen agentes de lavado (t ión salina amortiguada con fosfato, amortiguador , y recipientes que contienen los reactivos usa tar el anticuerpo o sonda unida. Se re mente que los polinucleótidos , polipépt uerpos descritos de la presente invención se porar fácilmente en uno de los formatos estable o que son bien conocidos en la técnica.

En algunas modalidades, la invención pro s un equipo que comprende un agente de unión a onista, y un segundo agente terapéutico. En lidades, el agente de unión a Noten, o antagonist tor Notch humano e inhibe el crecimiento tum o que comprende: i) incubar la molécula con el 0 unión a ligando del dominio extracelular del humano; ii) determinar si la molécula se u n de no unión a ligando del dominio extracel tor Notch humano; y iii) determinar si la e el crecimiento tumoral . Las moléculas que se a específica a una región de no unión a ligan io extracelular de un receptor Notch humano i no se limitan a, moléculas orgánicas p éptidos, y anticuerpos.

Se puede realizar el examen usando cualquie ado conocido en la técnica. En ciertas modalid n se realiza in vi tro. En algunas modalida ias que expresan una región de no unión a lig io extracelular de un receptor Notch humano se ulas que se unen de manera específica a una regi a ligando de un receptor Notch humano incluyen, imitan a, ELISA, transferencia Western (o inmuno dos de levadura.

Las moléculas que se unen de manera espe región de no unión a ligando de un dominio extr n receptor Notch humano entonces se prueban ición del crecimiento de células tumorales . izar la prueba usando cualquier método adecuado a técnica. En ciertas modalidades, las molécula de manera específica a una región de no unión a dominio extracelular de un receptor Notch h an para la capacidad para inhibir el crecimiento itro. En algunas modalidades, las moléculas que anera específica a una región de no unión a lig io extracelular de un receptor Notch humano se miento tumoral in vivo. En ciertas modalidad ulas que se unen de manera específica a una regi a ligando del dominio extracelular de un recept o se inyectan en un modelo de xenoinjerto de ani mina el crecimiento de los tumores en animales oléculas que se unen de manera específica a la r ión a ligando del dominio extracelular de un humano y se comparan a animales tratados ula de control de no unión. los Se va a entender que los ejemplos y mod itas en la presente son para propósitos ilus menté y que se sugerirán varias modificaciones y ista de lo mismo a las personas expertas en la t cluyen dentro del espíritu y alcance de esta sol de visualización de Fab con una proteína de f 2-Fc recombinante , pasivamente inmovilizada ) que comprende el sitio extracelular de unión a tch2 y que se circunda las repeticiones EGF (EGF onda uno. Los fagos no específicos se lavaron, agos específicos se eluyeron con DTT. La salida para infectar bacterias F+ TG1, se rescataron c iares, y luego la visualización de Fab se in (0.25 m ) . Este proceso se repitió durante do ionales y luego la ronda tres se examinó en ELIS n de Notch2 (EGF1-12 ) -Fe recombinante pas ilizada (5 µg/ml) .

Se identificó un Fab particular (59R1) qu eceptor Notch2 humano y se bloqueo la unión de De 2 humano. Se verificó la unión del Fab 59R1 o por ensayo de FACS usando una línea de células entadol (ECD) fusionado a la región constante F las células y los Fab seleccionados de la bibli y usando anticuerpos específicos Fe gama anti-h conjugados con PE (Jackson Immunochemical ción.

Las secuencias de la VH y VL del Fab rcionan en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (in ncias de señal bacteriana de N-término que se a secreción), respectivamente. La CDR del Fab se indica en la Tabla 2 a continuación.

CDR de anticuerpos Fab e IgG humanos 59R1 cadena pesada cadena ligera CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 SSSGMS VIASSGSNTYYADSVKG GIFFAI RASQSVRSNYLA GASSRAT (SEQ ID (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 5) NO: 7} NO: 8) NO: 9) uerpo IgG 59R1 (incluyendo secuencias de se rcionan como SEQ ID NO: 16 y SEQ ID ctivamente . La secuencia de señal en el N-térmi ncia de aminoácidos de cada una de las cad de en la secreción. Las secuencias de ácido nucl ican para las cadenas pesada y ligera del anticu se proporcionan como SEq ID NO : 1 y SEQ I ctivamente. Se usó purificación por proteína icar los anticuerpos. El ADN de plásmido bacter ene una inserción de ADN sintético que codifica a pesada y ligera del ADN del anticuerpo IgG2 itó como "59R1" con la ATCC, 10801 University BO sas, VA EUA, según las condiciones del Tra est el 15 de octubre de 2008, y designación o PTA-9547.

Además, el anticuerpo IgG2 59R1 se valoró dad de concentraciones, y luego se detectó el h uerpo anti -conejo de asno conjugado con PE. a se confirmó la unión de hNotch2 y la a eadora de ligando para el anticuerpo IgG2 59R1.

También se expresó una variante de línea 9R1 (referida en la presente como "59RGV") y se p ? y VL del anticuerpo 59RGV se proporcionan com 9 y SEQ ID NO: 20, respectivamente. La secue ácidos de la cadena pesada y cadena lig uerpo 59RGV (incluyendo secuencias de se rcionan como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO : 4 , respect ecuencia de señal en el N-término de la secu oácidos de cada una de las cadenas se escind eción. Las secuencias de ácido nucleico que c las cadenas pesada y ligera del anticuerpo orcionan como SEQ ID NO: 15 y SEQ ID ingidos de la secuencia parenteral (GIFFAI; SEQ se muestra en la Figura 1E . Los aminoácidos pe ada posición se permitieron cambiar de los res n a los residuos indicados en la Figura 1E. Se ntes mejoradas al examinarlas para la capacidad loqueo de JAGl como se muestra en la Figura 1F ( lechas) . De forma breve, se mezclaron Fab (1 y 1 hJAGl-rc Fe (pre-agrupado 5 ug/ml a 2 ug/ml o de asno conjugado a PE) y luego se adici as 293 establemente . transfectadas con hNotch2. aloró la unión a hJAGl usando citometría de f ron seis variantes mejoradas (versus Fab 59 1 ncias de HC CDR3 fueron como sigue: SIFYPT ), SSFFAS (SEQ ID NO:23), SSFYAS (SEQ ID NO:24) ID NO:25), SIFYPS (SEQ ID NO:26), y SSFFA 7) . Las secuencias de las regiones variables d a transiente con el plásmido de expresión de 2 , Notch3 o Notch4 humano y proteína fluorescen como un control de transíección . Las células p P indicaron la expresión del transgen. La IgG2 onó a las células a 2 µg/ml y se detectó por ífica anti -humano de cabra conjugada con PE ochemicals ) . Todas las construcciones Noten f tud completa. Los resultados se muestran en la F se muestra en la Figura 2, el anticuerpo IgG2 de manera específica tanto a Notch3 humano como IO, pero no se une de manera significativa o o Notch4 humano de longitud completa.

Mediante un instrumento Biacore 2 minaron las afinidades para Notchl, Notch2, 4 de humano y ratón. De forma breve, las prot recombinantes de humano y ratón (EGF10-15 para 3 constantes de disociación (KD) de igG 59R1 GF1-12) GF 10-155) lo 3 lación de Epítopos de Anticuerpo 59R1 anti-Notch Para identificar anticuerpos que reconocen íficas de no unión a ligando de los celulares del receptor Noten, se realizó la co ítopos .

La unión de los anticuerpos anti-Notc nadante de células HEK 293 transfectadas con se codifican ara roteínas de fusión de Notch2-Fc nadantes se recolectaron 48 horas más tard rar las proteínas de hN2-hfc, primero se rev s de 96 concavidades con IgG específica de Fe g o de cabra (Jackson Immunochemicals , #109-0026 g por concavidad en amortiguador de bicarbonato te la noche a 4o. Las placas se lavaron y bloqu bovino al 5 %/PBS-Tween 20. Se adi nadantes a las placas y se incubaron a tem nte durante 1 hora. Las placas se lavaron en P onó Fab 59R1 a 10 ug/ml en suero al 5 %/PBS ó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las p on con PBS-T. Se detectó la unión de Fab por an ifico de Fab anti-humano de cabra conjugado a pe ábano (Thermo, # 31414) diluida 1:5000 en sue -T durante 1 hora a temperatura ambiente. Las p on y revelaron con 1 Step Ultra TMB (Thermo, # hN2 1-5 1-221 h 2 1-6 1-263 hN2 1-7 1-301 hN2 1-8 1-341 h 2 1-9 1-378 hN2 1-10 1-417 hN2 1-11 1-456 hN2 1-12 1-493 h 2 8-12 296-493 h 2 9-12 326-493 h 2 10-12 375-493 hN2 11-12 413-493 h 2 12-12 454-493 Adicionalmente, el análisis de FACS muestr n del anticuerpos Fab 59R1 se retuvo cu imieron EGF11 o EGF12 de la proteína recombi gado con PE (Jackson Immunochemicals) .

Para verificar que la pérdida de repetici o interfiera con la unión a ligando, se ge h2 mutante que carece de los aminoácidos 375-4 para la unión a 59R1, 59M70 monoclonal de ido contra EGF 1-4, y la unión al ligando humano ra 3C) . El análisis de FACS de células fectadas de manera transciente con el plásmido presion de Notch y GFP como un control de trans células positivas a GFP indican la expres gen. Se adicionó Anti-Notch2 (59M70) a 20 ug/ tó por anti-ratón de cabra conjugado con PE (C -4 ) . Se adicionó 59R1 (IgG2) a las células a 2 etectó por Fe gamma específica anti -humano gada con PE (Jackson Immunochemicals) . Se dete a ligando por incubación de las células con el s de unión para 59R1 (Figura 14A) . Como resul sis, se crearon varios mutantes puntuales de 2 de longitud completa, convirtiendo los residuo F10 a los correspondientes aminoácidos en Notchl én, por el contrario, se hicieron mutaciones p os residuos convertidores de EGF 10 de hNotch spondientes residuos de hN2. Se generaron mut secuencias de Notch de longitud completa por mut hangeMR (Stratagene) y se verificaron por secuen eterminó la unión a los mutantes por análisis ras 14B y 14C) . Se detectó 59R1 por an ífico de Fe gamma anti -humano de cabra conjugad son Immunochemicals , #109-116-170) . Los ami arios para la unión de 59R1 a hNotch2 se determi manera, que son histidina 385, alanina 388 y leu duos dentro de la secuencia hNotch2 en cuadro 2 humano se transfectaron de manera transcie erasa de luciérnaga, con un promotor 8X CBS s et al., 2006, J. of Biological Chemistry, 2 ) , pSP0RT6 MAML-1 , y luciferasa de Renilla-C V ol de transfección. Las células se incubaron co DLL4 inmovilizado (R&D systems) con los ant ados durante 16 horas y luego se valoraron usan (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fab nticuerpo de control estuvo a una concentració l . El anticuerpo IgG2 59R1 se tituló, iniciando 4 ego se diluyó por un cuatro. El inhibidor d etasa (GSI) dibenzazepina (DBZ) se usó como un c . Como se muestra en la Figura 4A, el anticuerpo tró que inhibe la actividad de indicador de eída por hDLL4.

Las células Hela que sobreexpresan de omo un control en 1 µ?. Como se muestra en las 4C, se encontró que el anticuerpo 59R1 in idad de indicador de Notch2 tanto inducida co hJAG2 , respectivamente. lQ 5 uerpo 59R1 anti -Notch2/3 Impide el Crecimiento o Este ejemplo describe el uso de un an ) anti-receptor Notch2/3 que se une a la regió a ligando de los receptores Notch (EGF10 de de Notch3) para impedir el crecimiento tumora 0 de xenoinjerto.

En ciertas modalidades, ratones NOD/SCID in 0,000 células de tumor de mama PE13 o T3 se trat nticuerpo 59R1 anti -Notch2 /3 o el anticuerpo de 1 dos días después de las inyecciones celula En un experimento, se inyectaron un lxlO7 es de tumor de colon Coló- 205 a ratones hembra b odeficientes de 6-8 semanas de edad en un ant CD-1. Los tumores se dejaron crecer a un t 65 a 200 mm3 después de lo cual se aleatoriz es (n = 10 por grupo experimental) , y se e istración de los anticuerpos. Los animales se 15 mg/kg de ya sea anticuerpos 1B7.11 de contr uerpos 59R1 ant i-Notch2/3 una vez por semana. D idió el tamaño del tumor, y el volumen del ló como se describe (ver ichieli et al., 2004 , 6:61-73) . El anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 r ra significativa el crecimiento del tumor Col aración al control (Figura 5C) .

En otro experimento, se probaron anticuerp h2/3 para un efecto en el crecimiento d ol (Figura 5D) .

En un experimento adicional, se probar uerpos anti -Notch2/3 para un efecto en el crecim de mama. Ratones NOD/SCID se inyectaron co as de tumor de mana PE13 o T3 y los tumores se r a un tamaño de entre 65 a 200 mm3 después de leatorizaron los ratones (n = 10 por grupo experi e empezó la administración de los anticuerp les se trataron con 15 mg/kg de ya sea los an 11 de control o anticuerpos 59R1 anti- Notch2/3 d semana. Se midió el tamaño del tumor dos v a; y se calculó el volumen tumoral como se descr ieli et al., 2004). El anticuerpo 59R1 anti-jo de forma significativa el crecimiento tanto de (Figura 5E) como de TE (Figura 5F) en compar rol . 0 µp? sobre portaobjetos de vidrio. De manera alte porción de cada tumor se fija en fo ncrusta en parafina, y se corta en un microt iones de 10 p?µ sobre sobre-portaobj etos de vid iones se post- final y se incuban con anticuerpos cromóforo que reconocen de manera específ uerpos inyectados para detectar el anticuerp 2/3 o anticuerpos de control presentes en la ral . Adicionalmente , los anticuerpos que rentes tipos de células tumorales y células re tumor, tal como, por ejemplo, anticuerpos erina (CD144) o anti-PECAM-1 (CD31) para detectar teliales vasculares, anticuerpos alfa-actina de detectan células del músculo liso vascular, ant -Ki67 para detectar células proliferantes, ensay detectar células moribundas, y anticuerpo T-PCR cuantitativa. Se analizan los niv sión de Notch2/3, de los componentes de la ización de Notch2 y/o Notch3 , así como de los ma lulas madre de cáncer, que incluyen, por ejempl relación al gen GAPDH de mantenimiento como un no. De esta manera se determinan los cambio sión del gen de células tumorales en el tratami ticuerpo de Notch2/3.

Además, se puede valorar el efecto del tra anticuerpo con anti-Notch2/3 en la presencia de de cáncer en un tumor. Muestras de tumor de dos con anticuerpo de Notch2/3 versus anticu ol se cortan en piezas pequeñas, se etamente usando cuchillas estériles, y se nsiones celulares individuales por digestión ituración mecánica. Las células tumorales di , CD44+, CD24-/bajo, Lin- de ratones tratados uerpo de Notch2/3 versus tratados con anticu ol en las almohadillas grasas mamarias de CID. De esta manera se determina la tumorigeni as madre de cáncer en base al número de tadas requeridas para formación tumoral consiste ío 7 uerpo 59R1 anti-Notch2/3 Retrasa la Recurren in vivo Después del Tratamiento con Paclitaxel Se inyectaron células de tumor de mama B51 as por ratón) de forma subcutánea en la alm mamaria de ratones NOD-SCID. Los tumores se r durante 50 días hasta que han alcanzado un dio - 100 mm3. Se aleatorizaron los animal upo) y se iniciaron los tratamientos. Un grupo nticuerpo de control (1B711) a 10 mg/kg dos v Los resultados se muestran en la Figur vó que los tumores recurren más rápidamente en ol en comparación al grupo tratado con 59R1. lo 8 uerpos 59R1 anti-Notch2/3 Disminuye la Frecu as Madre de Cáncer en un Tumor in vivo Se pueden usar los ensayos de dilución I ) para valorar el efecto de un agente de unión a ias madre de cáncer de tumor sólido y rigenicidad de un tumor que comprende las célul áncer. Los ensayos se pueden entablar para deter encia de células madre de cáncer en tumores de ados con el agente de unión a Notch u otro arar esa frecuencia a la frecuencia de las célul áncer en tumores de animales de control .

Se usó un LDA para valorar el efecto se describe en el Ejemplo 7 , anterior para lo grupos de tratamiento. Después de tres d cuerpos y/o paclitaxel, los tumores se recole rocesaron y se disociaron en células indivi células tumorales humanas se aislaron de las rales de xenoinjerto por incubación con anti atón biotinilados (dilución de -CD45 de ina 1:200 y dilución de a- H2Kd de ratón-0, BioLegend, San Diego, CA) sobre hielo dur tos, seguido por la adición de cuentas ma adas con estreptavidina y la remoción de las ratón con la ayuda de un imán. Las células a suspensión se recolectaron y contaron.

Una titulación en serie de células (30, 0 células) de cada uno de los cuatro gr amiento se inyectó en una mezcla 1:1 (v uencia de las células madre de cáncer en el t ratones tratados con control ( "Contro rminó que es 1:66. La frecuencia de las e de cáncer en el tumor en los ratones trata itaxel ("Taxol" ) se mostró que es de 1:25, i el tratamiento con paclitaxel ha incre mente la frecuencia de las células madre de el tumor por más de dos veces con rela rol. Por otra parte, el tratamiento con ant , ya sea solo ("59R1") o en combinaci itaxel ( "Taxol+59Rl" ) , redujo la frecuen ias madre de cáncer en los tumores. El an también redujo la frecuencia de células m er en los tumores de mama por más de dos ve ción al control . El tratamiento con la com anticuerpo 59R1 y paclitaxel redujo la frecu itaxel, aunque el tratamiento con paclitax a el efecto opuesto. lo 9 miento in vivo Adicional de Tumores Usando Ant anti-Notch2/3 Se inyectaron células de tumor pancreát 00 células por ratón) de forma subcutánea en l flanco de ratones Nod-Scid. Los tumores se dejaro te 27 días hasta que han alcanzado un volumen 120 mm3. Los animales se aleatorizaron en cuatr tratamiento (n = 10/grupo) y se inicia mientos . Un grupo recibió un anticuerpo de ll) a 10 mg/kg dos veces por semana, un grupo itabina a 40 mg/kg una vez por semana más el an ontrol a 10 mg/kg dos veces por semana, un grupo a 10 mg/kg dos veces por semana, y el cuar te 25 días hasta que han alcanzado un volumen 80 mm3. Los animales se aleatorizaron en gr miento (n = 10/grupo) y se iniciaron los trata upo recibió un anticuerpo de control (1B711) a eces por semana y un grupo recibió 59R1 a 10 m por semana. Los volúmenes tumorales se midiero indicados. Los resultados se muestran en la Figu miento del tumor se encontró que se inhibe p Se inyectaron de forma subcutánea células ???? C28 (10,000 células por ratón) en la re o de ratones NOD-SCID. Los tumores se dejaro te 24 días hasta que han alcanzado un volumen 130 mm3. Los animales se aleatorizaron en cuatr tratamiento (n = 10/grupo) y se inicia mientos. Un grupo recibió un anticuerpo de 1) a 10 mg/kg dos veces por semana, un grupo notecano con relación al grupo de irinotecano.

El anticuerpo IgG2 59R1 también se probó in líneas de xenoinjerto de tumor de mama O P-B34, 44, PE13 y UM-T1, la línea de xenoinjerto de eas 0MP-PN8, y la línea de xenoinjerto de el OMP-C8. Estas líneas de xenoinjerto de t lecieron al adherirse a los procedimientos desc jj et al., 2003, Proc . Nati . Acad. Sci, EUA 1 . Se usaron ratones NOD/SCID hembras inmunocompr 0-10 semanas de edad para el establecimiento injertos de tumor de mama y se usaron ratones s para los modelos de tumores OMP-Pn8 y OMP-C8 anápolis, Indiana) . El anticuerpo IgG2 59R1 ta in vivo a un modelo de xenoinjerto de tumor -205. Ratones bg/un XID hembras inmunodeficient cedente de Swiss CD-1 se usaron para el modelo los ratones se aleatorizaron . Los anticue istraron de manera semanal y los tumores se midi por semana. Se uso LZ1 (un anticuerpo hum oce lizozima) o 1B711 (un anticuerpo IgGl mu oce el hapteno trinitrofenol) como un anticu ol para el tratamiento de cada tipo de tumor. Se olumen tumoral como se describe por Al-Ha j ) . Los datos se expresan como la media y la . Las medias de los grupos se compararon us a t, no apareada, bilateral de Student . Los va bilidad (P) de <0.05 se interpretaro f icativamente diferentes. Todos los ísticos se realizaron usando Microsoft EXCEL y G .

Los resultados de los experimentos ionales en o de los xenoinjerto Colo205, C8, P ostró igualmente que inhibe el crecimiento tum ión al anticuerpo de control LZl (Figura 11B) . D ar, se encontró que 59R1 inhibe el crecimiento eático (con relación al anticuerpo de control o de xenoinjerto PN8 (Figura 11C) . También se mo inhibe el crecimiento de tumor de mama con relac uerpo de control en cada uno de los cinco mo njerto de cáncer de mama B34 (Figura 11D) , B39 , B44 (Figura 11F) y PE13 (Figura 11G) . Igual tró que anticuerpo 59R1 es efectivo en inh imiento tumoral en el modelo de cáncer de mama TI , aunque solo fue efectivo en la presencia de es sar de que TI es un tumor negativo a rece ógeno . lo 10 to de Tratamiento con Anticuerpos 59R1 anti-Not s instrucciones del fabricante. Se realizó el a de arreglo escaneado y la normalización sidad de la señal con el algoritmo GCRMA en el nductor de fuente abierta (www.bioconductor.0 de expresión de cada gen se normal i formación con puntuación z a través de las mué grupos de control (CTRL) y de tratamiento (59 diferencialmente expresados (p<0.05 y cambio ) entre los dos grupos se identificaron con la ayesian (Baldi et al., 2001, Bioinformatics, 17 : patrones de expresión de los genes diferenc iados, asociados, seleccionados en los cionados de xenoinjerto de tumor (Colo205, B44, se muestran en la Tabla 5 posterior. El valor P ( gen es la probabilidad de regulación significa or 59R1 por probabilidad usando la prueba t de B as de los tumores) . 5. Genes diferencialmente expresados en est es tratados con 59 1 Los niveles de expresión en el estroma Los resultados del análisis TaqManMR confi 3 y rgs5 son reducen en expresión en el estroma de los varios tipos de tumor en respuesta al tra 59R1 (con relación al control) (Figuras 12B y C) . arcador bien conocido de pericitos y células del vascular (Berger et al., 2005, Blood, 105:10 halí et al-, 2007, Int. J. Dev. Biol . , 51:715-l., 2003, FASEB J. , 17:440-2). Se ha identificad que se coexpresa con RGS5 en pericitos du génesis y que juega un papel importante en la re destino de los pericitos y células del músc lar (Lovschall et al., 2007, Int. J. Dev. Biol., Domenga et al., 2004, Genes & Dev., 18:27 ney et al., 2004, FASEB J.f 18:1421-3; Morrow , Am. J. Physiol. Cell Physiol . , 289 : C1188-C1196 ) Además, también se confirmó que heyl se r 1 estroraa de varios modelos de cáncer de mama E) . ANGPT1 y 2 (angiopoyetina 1 y 2) son ligan receptores TIE 1 y 2. Los receptores TIE, al i , son moléculas cruciales señalización en el pr giogénesis (Jones et al., 2001, ATature Reviews, De manera notable, sin embargo, angptl y a eron en expresión en el estroma del modelo TI c tratamiento con estrógeno (MT1 e"), condiciones s fue efectivo el tratamiento con 59R1 co imiento tumoral, pero no en el estroma del mismo a ausencia de tratamiento con estrógeno ("TI n iciones bajo las cuales el tratamiento con 5 ctivo contra el crecimiento tumoral (ver Eje riormente) . De esta manera, el efecto de 59R cción de la expresión de angiopoyetina 1 y angio , Cáncer Res. 66:3667-3672). Una posible explic datos es que el estrogeno conduce a una depende a la señalización de A GPT2 , que entonces c ibilidad al tratamiento con 59R1. lo 11 uerpo 59R1 anti -Motch2/3 Induce de Forma Signi ia en Tumores de Colon y Mama Se realizó la tinción para regiones hipó res de colon Coló-205 y tumores de mama PE- 13 qu do con ya sea con el anticuerpo IgG2 59R1 o cuerpo de control 1B711. La tinción se realizó ribe en Ridgway et al., 2006, Nature 444:1083-a breve, para medir la hipoxia, una hora a ificio a 60 mg/kg se inyectó de manera intrape idazol-clorhidrato (HypoxyProbe , NPI , Burlingt forma aductos de proteína de larga vida a presión ivamente uniforme y densa (datos no mostrad o de células positivas CD31 también permane io, sugiriendo que el número de células endotel fecto por el tratamiento con 59R1. Sin embargo, es Colo-205 y PE13 tratados con 59R1, las icas (como se detecta por el anticuerp idazol) fueron significativamente más pronunci os tumores tratados con 1B711 (datos no mostra F(ab' )2 anti-rata de cabra conjugado con AF5 tar el anticuerpo anti-CD31 y se uso el anticuer jo de cabra conjugado con FITC para dete cuerpo anti -pimonidazol . lo 12 res de Mama que Comprende Supresiones en el esor Tumoral PTEN, son Sensibles al Tratamie ucciones del fabricante. Los cambios del es o de copia se estimaron por el modelo de Hidde y sus variaciones (CNV) de cada muestra se ob análisis de segmentación de rango usando Hapmap base. Debido al ruido inherente del arreglo, s iones -0.5 y -1.0 log2 como los cortes de la s ocigota y la supresión homocigota bajo el u ficancia <1.0xl0~6 y número mínimo de sondas por La Figura 13 muestra el exón, la distribuci Affymetrix, y las supresiones en el gen del al, homólogo de fosfatasa-tensina (PTEN) en el c Los tumores de mama B29, B34, B37, B40, B51, T2 , ncontraron que tienen intacto el gen de PTEN as. El gen de PTEN se determinó que tiene sup cigóticas en el tumor B39, en tanto que los tumo lo 13 terización de Anticuerpos 59R5 Se identificó un anticuerpo humano adició se une de manera específica a Notch2 humano o. Las secuencias de la cadena pesada y de l a se proporcionan en SEQ ID NO: 49 y SEQ ID ctivamente. La región variable de cadena pe rciona en SEQ ID NO: 50 y la región variable d a se proporciona en SEQ ID NO: 13. La secuencia adena pesada de 59R5 comprende SIFYTT, SEQ ID NO: S secuencias de CDR de 59R5 son idénticas a isis de Biacore de las afinidades de unión de 59R carón que 59R5 tiene propiedades similares de uni para Notch2 como para Notch3 como 59R1 cuerpos se unen a los receptores Notch2 y N o y ratón con afinidad sub-nanomolar (ver Tabla ciente con un receptor Notch humano o de ratón o, Notch2 murino, Notch3 humano o Notch3 muri trucción de indicador inducible GFP. Se incubaron sfectadas con diferentes concentraciones del an o 59R5 en la presencia de proteína DLL4 - Fe pas ilizada. Se determinó la activación del recept edir la actividad de luciferasa. Como se muest ra 15A, 59R5 bloqueó la activación inducida por a señalización del receptor Notch2 humano, Notch2 h3 humano y Notch3 murino a niveles similares com Se terminó el epítopo de unión de 59R5. ribió en el Ejemplo 3 para el análisis del an , se crearon varios mutantes puntuales dentro d ongitud completa, convirtiendo los residuos d O a los correspondientes aminoácidos en Notch2 hu raron mutantes en las secuencias de Notch de arón con 59R1 o 59R5 y anticuerpo se escente y luego se examinaron por FACS . Se de y 59R5 por anticuerpo específico de Fc-gamma ant bra conjugado con PE (Jackson Immunochemicals , # Como se muestra en la Figura 15B, 59R5 se unió unió a Notchl . Sin embargo, cuando los aminoác sponden a los aminoácidos 385-389 de No tuyeron en Notchl, 59R5 fue capaz de unirse o. Esto sugirió que al menos uno o más ami arios para la unión de 59R5 a Notch2 humano ados dentro de los aminoácidos 385-389 (resi ncia de hNotch2 en cuadro mostrado en la Figur ren que 59R5 se une al mismo epítopo como 59 po similar a, o que se traslapa con, el epítopo lo 14 miento in vivo para Tumores que Usan el Anticue %, similar a los efectos vistos en 59R1.

En otra modalidad, los ratones NOD/ taron con células de tumor de colon C28. Los ra ron con el anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 , an anti-Notch2/3 o anticuerpo de control. Los ant osificaron a 15 mg/kg una vez por semana en entivo" donde la dosificación se inició dos días inyección celular. La Figura 16B muestra que ta 59R5 inhibieron el crecimiento de tumores de col En otra modalidad, se inyectaron ratones células de tumor de colon con Colo205. Los ra ron con el anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 , an anti-Notch2/3 o anticuerpo de control. Los ant osificaron a 15 mg/kg una vez por semana despué an establecido los tumores. La Figura 16C mué 59R1 como 59R5 inhibieron el crecimiento de tu te cuatro semanas en combinación con el antic ol, anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 , o anticuer Notch2/3. Como se muestra en la Figura uerpo 59R5 inhibió el crecimiento tumoral a ar como el anticuerpo 59R1 y que el tratami nación prolongó la recurrencia del tumor más ti tabina sola.

En una modalidad, para evaluar el efecto de as madre de cáncer, se llevó a cabo un est rencia de tumor en el modelo de tumor de mama taron ratones NOD/SCID con células de tumor . Los tumores se dejaron crecer durante 40 días se iniciaran los tratamientos. Los ratones se taxol a 15 mg/kg dos veces por semana durante 5 ombinación con ya sea el anticuerpo de contr uerpo 59R5 anti-Notch 2/3. Después de 5 sem experimento se muestran con relación al grupo studios con PE13, C28 y Colo205 se llevaron a c scribe en el Ejemplo 14. Se llevaron a cabo estu como se describe anteriormente. Para el experi . el control es gemcitabina sola y valores para son las combinaciones con gemcitabina. Los ant osificaron una vez por semana a 15 mg/kg para t imentos . 7 lo 16 lación de la Expresión Génica en Tumores Des murinos en células del estroma a un grado simila erdo) . Se observó el mismo patrón de regula es C28 (datos no mostrados) . De esta man iismo de acción identificado anteriormente 59R ación de genes en el tumor de estroma crítico ión de la vasculatura tumoral y los pericitos s 59R5. De manera similar, 59R5 y 59R1 regul sión de los genes humanos ID4 , EDNRA y EGLN3 ias tumorales al mismo grado (panel d Diferentes de otros miembros de esta ca, ID4 se sub- expresa en general en tumores, rado que ID4 es un supresor tumoral en cáncer de entemente se silencia por metilación. La pérdi esión ID4 se correlaciona con una peor prog entes con cáncer de mama (Noetzel et al., 2 er 8:154) . De esta manera, el favorecimient s tumores tratados . Estos datos indicaron que fu lares las actividades biológicas y el mecanismo d 9R1 y 59R5.

La Tabla 8 muestra los resultados de un aná arreglo de tumores PE13 tratados con 59R1 y 5 ros son los valores medios de expresión diferenc ales tratados versus animales de control, con 3 a 8 59R1 59R5 ea pVal Veces pVal Símbolo Título de Gen 10 3.21 £-05 -3.00 1.10E-03 Foxc2 cabeza bifurcada cuadro C 0 1.26E-05 -2.46 7.45E-04 He 2 peludo/me j orador de divi relacioando a motivo 2 de 32 8.03E-06 -2.14 1.00E-04 Rss5 regulador de señalización 5 de p 33 5.59E-04 -2.79 3.18E-03 Heyl peludo/me jorador de divis relacionado con motivo ti 71 4.80E-04 -2.90 1.02E-04 Rgs4 regulador de señalización 4 de 10 2.17É-04 -1.86 4.33E-05 Notch3 homólogo 3 de gen Noten {Dr 92 3.16E-02 -2.35 3.43E-03 Mmp9 metalopeptidasa 5 de matr 6 3.06E-02 4.97 3.35E-02 Pdcdllg2 ligando 2 de muerte celular p 2 6.25E-07 2.80 2.07E-03 Gzma granzima A elado de tejido asociado tumor (MMP-9) entre Estos datos sugirieron que son muy simila idades biológicas y el mecanismo de acción de lo 17 cción de Anticuerpos Adicionales de Notch2 y/ cción de Antígeno En ciertas modalidades, para la produc uerpos se generaron como antígenos fragme éptido recombinante del dominio extracelular d o o Notch3 humano. Por ejemplo, se puede usar te DN recombinante normal para aislar un polinucleó fica para los aminoácidos 1-493 de Notch2 (SEQ que abarca EGF 1-12. Este polinucleótido se pue uadro N-terminal a ya sea una marca Fe humana o idina y clonar en un vector de plásmido de trans ión SignalP3.0, sin embargo, el punto de esci real puede diferir por un par de aminoác uier dirección. La escisión prevista de Notc los aminoácidos 1 y 26, de esta manera la pro eno de Notch2 comprende aproximadamente el amino el aminoácido 493. Se puede purificar la pro eno de medio acondicionado de células de insect tografía de afinidad de proteína A y Ni++-que ína purificada de antígeno entonces se dializ (pH = 7) , se concentra a aproximadamente 1 mg/ a estéril en preparación para inmun ización Se pueden inmunizar ratones con prot eno de Notch2 o Notch3, purificada usando les. La sangre de ratones individuales se puede imadamente 70 días después de la inmunización o alto de anticuerpo y se aumentan en escal vo estático de matraz. Los anticuerpos se purif nadante de hibridoma usando cromatografía de pr oteína G-agarosa y los anticuerpos se prueban se describe más adelante. sis de FACS Para seleccionar anticuerpos mono cidos por hibridomas, clones que reconocen la otch2 (y/o Notch3) nativa, de superficie celular isis de FAC. Se co-transíectan células HE res de expresión que codifican para un clon de itud completa de Notch2 y el marcador de la tran Veinticuatro a cuarenta y ocho horas despué sfección, las células se recolectan en suspensi an en hielo con anticuerpos anti-Notch2 (o anti--Notch2/3) o IgG de control para detectar la lónales que reconocen de manera específica un do ión a ligando de un receptor Notch estos anticu ican para superar la inmunorespuesta de anticuer de humano (HAMA) cuando se usan anticuerpos d agentes terapéuticos. Las regiones variables a pesada y cadena ligera del anticuerpo mo cionado se aislan por RT-PCR de células de hib igan en cuadro a las regiones constantes de a kappa y cadena pesadas de IgGl ctivamente, en vectores de expresión de mamí a alternativa, se usa un vector de expresión o tal como TCAE 5.3 que contiene los genes nes constantes de cadena ligera kappa y cadena p de humano en el mismo plásmido (Preston et al ction Se Immunity 66:4137-42) . Los vectores de e codifican para las cadenas pesada y ligera qu tor Notch2 o Notch3 puede requerir huma onal . Para generar anticuerpos humanizados, 1 ncías cortas hipervariables o regiones determin ementariedad (CDR) , de los dominios variables d a y ligera del anticuerpo quimérico, d iormente, se manejan usando tecnología binante en la región menos variable de dominio secuencias de cadena pesada y ligera de ctivamente, y luego se clonan en un vector de e mamífero para la expresión en células orreactividad y afinidad de los anticuerpos hum ompara a anticuerpos quiméricos parentales por . Adicionalmente , se puede usar mutagénesis dir o de alta densidad de la región variable para o specificidad, afinidad, etc., del anticuerpo huma lo 18 usando un ensayo basado en BrdU. Se cultivan cé de mama agotadas de Lin- , recién disociadas, no durante entre 2-5 días. Las células ento van a 20,000 células/concavidad con 2.5 ug/m de anticuerpo anti-Notch, IgG murina no espec ol, o sin anticuerpos durante tres días, seg ción BrdU de 18 horas. Todos los experime zan con múltiples replica. Entonces se dete idad de los anticuerpos anti-Notch para inh feración celular en comparación a los anticu ol . o de Citotoxicidad Dependiente de Complemento Se usan líneas de células de cáncer que exp tor Notch2 y/o un receptor Notch3 , o de rnativa, células madre de cáncer aisladas de una aciente que se hace pasar como un xenoinjerto en Las células tratadas entonces se recolec penden en 100 µ? de anexina V marcadas con FITC edio de cultivo y se incuban a temperatura te 10 min. Cien µ? de solución de yoduro de prop ) diluida en HBSS se adiciona y se incuba duran emperatura ambiente. Las células se recolec penden en medio de cultivo y se analizan por ci lujo. La citometría de flujo de las células teñ proporciona cuentas celulares totales, y la capt o de propidio por células muertas como un porce números celulares totales se usa para medir l lar en la presencia de suero y anticuerpos c tor Notch2 y/o Notch3 en comparación a suero in calor y anticuerpos de control. De esta ma rmina la capacidad de los anticuerpos anti-Notch r la citotoxicidad dependiente de complemento. vo RPMI 1640 libre de rojo fenol, complemen ióticos y 5 % de FBS a 106 células/ml. Se aislan ucleares de sangre periférica (PBMC) de férica heparinizada por centrifugación con grad idad de Ficoll-Paque para el uso como células ef ces se mezclan las células objetivo (T) con las oras PBMC (E) a relaciones de E/T de 25:1, 10:1 s de 96 concavidades en la presencia de un 2 o Notch3 o anticuerpos de control. Los c yen incubación de células objetivo solas y toras solas en la presencia de anticuerpo. Las lares se incuban durante 1 a 6 horas a 37°C en e La lactato-deshidrogenasa (LDH) liberada, un sólica estable liberada en la lisis celular, ent por un ensayo colorimétrico (por ejemplo, e toxicidad no radioactivo CytoTox96; Promega, 3 para mediar la citotoxicidad celular dep uerpo . lo 19 cción de Anticuerpos Contra EGF10 (o EGF Equival tores Notch La identificación de un anticuerpo que se a específica a diez repeticiones de EGF de Notch ición correspondiente EGF de Notch3 (la ición de EGF) que reduce el crecimiento tum les sugiere la importancia del dominio de no do, y la décima repetición de EGF (o su equivale icular, para terapias efectivas de cánce cionar como objetivo la repetición 10 de EGF alente) en los miembros de la familia de re , se producen y analizan anticuerpos contra l, Notch2 o Notch4 o contra EGF9 de Notch3. D econocen la décima repetición de EGF (o EGF os miembros de la familia de receptores N mplan (por ejemplo anticuerpos que reconocen la l y la EGF10 de Notch2 ; la EGF10 de Notchl y la 3; la EGF10 de Notchl y la EGF10 de Notch4 ; la 2 y la EGF9 de Notch3; la EGF10 de Notch2 y la 4, o la EGF9 de Notch3 y la EGF10 de Notc uerpos que reconocen la décima repetición de EG alente) de tres miembros de la familia de re igualmente se contemplan (por ejemplo, anticue ocen la EGF10 de Notchl, EGF10 de Notch2 y 3; la EGF10 de Notchl, la EGF10 de Notch2 , y la 4, o la EGF10 de Notch2, la EGF9 de Notch3 y la 4) . Y se contemplan los anticuerpos que reco a repetición de EGF (o EGF equivalente) de ros de la familia de receptores Notch (por etectado la expresión del receptor Notch.

La presencia de la expresión de marc las madre de cáncer se puede determinar pri biopsia de tumor. Bajo condiciones estér even células tumorales de una biopsia de un p nosticado con cáncer. En algunas modalida sia de tejido entonces se congela fre ógeno líquido, se incrusta en O.C.T., y se c riostato como secciones de 10 µt? sobre port idrio. De manera alternativa, la biopsia de ija en formalina, se incrusta en parafina a en un microtomo como sección de 10 µp? s aobjetos de vidrio. Las secciones se incu cuerpos contra un receptor Notch para dete esión de la proteína. Adic ionalmente , se rminar la presencia de células madre de cánc metría de flujo como se describe en riorment e .

Los pacientes con cáncer cuyos tumo nostican como que expresan un receptor N an con anticuerpos ant i - receptor Note cuerpos monoclonales humanos y humanizado ptor Noten, generados como se d riormente se purifican y formulan con un p acéutico adecuado en PBS para inyecció entes se tratan con los anticuerpos Notch semana durante al menos 10 semanas, p tos casos una vez a la semana durante a ximadament e 14 semanas. Cada administraci cuerpo debe ser una dosis farmacéuti tiva de aproximadamente 2 a aproximadame i y en ciertos casos entre aproximadamen esión tumoral, en base a la reducción dencias de nuevos tumores, menor exprés geno de tumor, números disminuidos de e de cáncer, u otros medios para eval nosis de la enfermedad. plo 21 ucción de Anticuerpos Contra Repetición 4 otchl, Notch2, Notch3 y/o Notch4 Para seleccionar como objetivo la rep EGF en los miembros de la familia de rec h, se analizan y producen anticuerpos co tición 4 de EGF de Notchl, Notch2, Not h4. De manera específica, se inmunizan ra antígenos que comprenden la cuarta rep GF de Notchl (SEC ED NO: 41) , Notch2 (SEC Notch3 (SEC ID NO: 43) , o Notch4 ( SEQ ID N nocen la cuarta repetición de EGF de N h2 ; Notchl y Notch3 ; Notchl y Notch4 ; N h3; Notch2 y Notch4, o Notch3 y Notch emplan los anticuerpos que reconocen la tición de EGF de tres miembros de la fam ptores Notch (por ejemplo, anticuerp nocen la cuarta repetición de EGF de h2 y Notch3; Notchl, Notch2 y Notch4, o h3 y Notch4) . Y se contemplan anticuer nocen la cuarta repetición de EGF de faros de la familia de receptores Notc plo anticuerpos que reconocen la cuarta rep EGF de Notchl, Notch2, Notch3 y N Una descripción de la producc cterización de ejemplo de un ant clonal, 13M57, que se une EGF4 de Notchl s Se identificaron (Tabla 9) varios co utas/genes que se regulan por el anticuer células tumorales usando el anális quecimiento de conjuntos de genes ( ootha , Nature Genetics 34:267-73; Subramanian , Proc. Nati, Acad, Sci. EUA 102:15545-50) res de mama en TI, PE13 , y B51. De ble, las rutas de los genes del ciclo c genes de activación de Myc y varios conju S de células madre se reducen en expres en este análisis. Se ha mostrado que cMy tivo directo de la ruta Notch (Weng et al. s Dev. 20:2096-109) . Los conjuntos de e reducidos en expresión por 59R1 se deriv signatura molecular derivada de cinco pobl intas: células madre °hematopoyé t i cas 9 Tamaño FDR Descripción KE ATO UP 27 0.0774 Genes concomitantemente modulados activado en queratinocitos primari de humano y ratón CLEPATHWAY 22 0.0798 Ciclinas interactúan con dependientes de ciclina par complejos activos de cinasa que progreso thr YC UP 28 0.0884 Genes activados por Myc THSC FETAL 27 0.0885 Favorecido en expresión en célu hematopoyéticas funcionales de c de ratón de hígado fetal (ST-HSC C THSC SHARED 27 0.0907 Favorecido en expresión en cél hematopoyéticas funcionales de c de ratón de médula ósea de adulto 15% ío 23 ción de frecuencia de células madre de cán uerpos de Notch2/3 Usando un estudio experimental similar ibe en el Ejemplo 8, un análisis de la frecu as madre de cáncer por análisis de dilución limi a cabo en células de cáncer de mama PE13. Se les que tienen tumores de mama PE13 con el antic ol, con taxol mas anticuerpo de control, 59R1, 9R1 durante tres semanas. Los tumores se reco és de tres semanas, y se analizó la frecuencia d es tratados. Titulaciones en serie de células hu uno de los cuatro grupos de tratamiento se trasp nuevo conjunto de ratones (n =10 por dosis de c ó la velocidad de crecimiento tumoral después de ísticamente significativa (p < 0.05) versus do con el anticuerpo de control y un doble a a una diferencia significativa versus el grupo taxol y anticuerpo de control. Este experiment l tratamiento con 59R1 de tumores de mama PE13 r encia de CSC como un agente individual y de ma tica, en combinación con el tratamiento con t aste, el tratamiento con taxol los, en tanto ivo en reducir el volumen tumoral, increm encia de CSC de tumores tratados indicando las iniciadoras de tumor son preferenc stentes a los efectos de este agente quimiotera Además de investigar los efectos de 59R1 en efecto en la frecuencia de CSC, se estudi ios génicos después del tratamiento con inación con taxol. El experimento se realizó en laron valores de expresión diferencial media les tratados con taxol versus control y trat más taxol versus taxol (3 animales por endentemente , en los datos del microarreglo de e a, se encontró que 59R1 en combinación c ó la apoptosis, hipoxia, diferenciación, y cionados a células madre en la dirección op to que los cambios génicos observados después (Tabla 10) consistente con los efectos de estos en la frecuencia de CSC. a 10 Ol VS . 59R1 Taxol vs . ntrol Taxol pval Veces pval Símbolo Nombre 6.8E-03 -4.3 2.3E-01 BMPR1B Receptor de proteína morfogenéti 2. OE-06 6.4 1.8E-05 NDRG1 Gen 1 regulado en expresión de N-myc 6.9?-06 -2.2 7.4E-03 RARRES1 Respondedor 1 de receptor de ácido bajo 3.5E-04 -1.7 1.1E-03 RARRES1 Respondedor 3 de receptor de ácido bajo 3.9E-05 -2.2 1.6E-02 RBP2 Proteína 2 de unión a retinol, celu 1.3E-10 -1.5 5.9E-02 XAFl Factor l asociado a XIAP Los genes relacionados a apoptosis en este atos incluyen BNIP3, NDRG1 HSPB6, y XAFl. BNIP3 ( ractuante de 19 kDa de Bcl-2/???) es un miem tótico de la familia de Bel -2 que se expresa en xicas de tumores (Kothari et al., 2003, Oncogene BNIP3 se reducen en expresión por taxol so rece en expresión por la terapia de com riendo que 59R1 más taxol puede promover la a sor putativo de metástasis de cáncer colorre sión incrementada se asocia con supervivencia ncer de próstata y mama (Shah et al., 2005, Clin 11:3296-302). Adicionalmente , NDRG1 está compre romoción de la diferenciación. Se ha mostrado sión de NDRG1 es altamente expresado en r pancreático bien diferenciadas, y no se expres as tumorales menos diferenciadas (Angst et al. J. Cáncer 95:307-13) . También se observó que otr ionados a células madre tal como BMPR1B y el iene el homeocuadro, LHX8, se favorecieron en e taxol solo, y entonces se redujeron en expré miento con 59R1 en combinación con taxol.

Varios genes comprendidos en el metabolism oides (RARRES1, RARRES3, RBP2), que con funcio lares al marcador putativo de células madre ALD miento con la terapia de combinación de 59R1 y t En otra modalidad, se usó un modelo d eático PN4 para probar la reducción en la frecu as madre de cáncer después del tratamiento con ron tumores pancreáticos PN4 con el anticu ol, 59R1 anti -Notch2/3 , gemcitabina, o una com R1 y gemcitabina durante un período de tres sema uerpos se dosificaron a 10 mg/kg, dos veces por sificó gemcitabina a 50 mg/kg, dos veces por sem es de cada grupo se recolectaron y procesar er suspensiones celulares individuales. Las ales humanas en el xenoinjerto se aislaron y c titulación de células {30, 90 o 210 células) taron en ratones NOD-SCID (n=10 por gru imiento tumoral se evalúo en el día 84 y se ca encia de células iniciadoras de tumor de las vel uerpo de control y un doble asterisco ind encia significativa versus el grupo trat tabina y el anticuerpo de control.

En otra modalidad, se usó un modelo de PE13 para probar la reducción en la frecue as madre de cáncer después del tratamiento con ron tumores de mama PE13 con el anticuerpo de anti-Notch2/3 , taxol , o una combinación de 59R5 te un período de tres semanas. Los anticue icaron a 20 mg/kg, una vez por semana, y el ficó a 15 mg/kg, dos veces por semana. Los tu grupo se recolectaron y procesaron para nsiones celulares individuales. Las células t as en el xenoinjerto se aislaron y contar lación de células (50, 150 o 450 células) se re ratones NOD-SCID (n=10 por grupo) . Se va encia estadísticamente significativa (p < 0.05) rupo tratado con el anticuerpo de control y isco indica una diferencia significativa versus do con taxol y el anticuerpo de control.

Como se observa en otros experimentos tados indicaron que el tratamiento con 59R1 de eáticos PN4 y el tratamiento con 59R5 de tumores , redujo la frecuencia de CSC como un agente indi dramáticamente, en combinación con el tratami itabina o taxol, respectivamente. En contra miento con taxol o gemcitabina solos, en tant ivo en reducir el volumen tumoral, increm encia de CSC de tumores tratados indicando las iniciadoras de tumor son preferenc stentes a los efectos de estos ioterapéuticos . dentro del alcance de las siguientes reivindic s modificaciones de los modos descritos para la invención que son obvias para los expertos s pertinentes. ncias ncias de anticuerpo humano anti-Notch2/3 SEQ ID N0:1: Secuencia de nucleótidos que dena pesada de IgG2 59R1 anti -Notch2/3 , más secu 1. La secuencia que codifica para la secuencia subrayada .

ACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCT ATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCG GGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTCTGGTATGTCTTGGGTGCGCCA GGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTTATCGCTTCTTCTGGTAGCAATACCTA CGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCT TGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG AAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGT GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA AGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT CAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG CAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC SEQ ID NO: 16: Secuencia prevista de pro a pesada de IgG2 59R1 anti -Notch2/3 , más secu . La secuencia de señal está subrayada.

FFLLLVAAPRWVLSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSG VSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYY TLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW AVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC CGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACG CTGCAGAGCGAGCCAGTCTGTTCGTTCTAATTATCTGGCTTGGTACCA TCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCTTCTTCTCGTGCAACTGG TTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAG AGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTAATTTTCCTATTAC TACGAAAGTTGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCAT TGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAA CAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGG GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCAC GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO : 18: Secuencia prevista de proteí a ligera 59R1 anti-Notch2/3 , más secuencia de s encia de señal está subrayada.

QVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNY RLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTL ISSLEPEDFAVYYCQQYSN VRSNYLA SEQ ID NO: 9: CDR2 de Cadena ligera de 59R1 AT SEQ ID NO: 10: CDR3 de Cadena ligera de 59R FPI SEQ ID NO: 11: Cadena ligera VL de 59R1 d más secuencia de señal. La secuencia de se ayada .

AIAIAVALAGFATVAQADIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSN PRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYS EIKR SEQ ID NO: 12: Cadena pesada VH de 59R1 d más secuencia de señal . La secuencia de se ayada .

TIALALLPLLFTPVTKAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSS LEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV SEQ ID NO: 39: Cadena ligera VL de 5 ncía de señal mamífera (subrayada) QVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNY RLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYS EIKR SEQ ID NO: 40: Cadena pesada VH de 5 ncía de señal mamífera (subrayada) FFLLLVAAPRWVLSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGiyi WVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY QGTLVTVSSA SEQ ID NO: 15: Secuencia de nucleóti fica para la cadena pesada de anticuerpo IgG2 59R 2/3 (variante de línea germinal de 59R1) , más s eñal. La secuencia que codifica para la secu 1 está subrayada.

GCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTCGCCGCTCCTAGATGGGTGCT GGTGACAGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAA GCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGT TTGCCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCC CACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGA GGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA CAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGT GCAC AGGACTGGCTGAACGGCA AGGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAA TGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGA CACCCTGCCTCCATCCAGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGG CAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT GCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTG CGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCC SEQ ID N0:2: Secuencia prevista de proteí a pesada de 59RGV anti-Notch2/3 (variante VFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 17: Secuencia de nucleóti uerpo 59RGV anti -Notch2/3 (variante de línea ger , más secuencia de señal. La secuencia que codif cuencia de señal está subrayada.

GCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGC CGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACACTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAG CTGCAGGCGGGCCTCCCAGTCCGTGCGGTCCAACTACCTGGCTTGGTA CGGACAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCCCGGGCTAC CCGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTC TGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTCCAACTTCCCTAT GGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTT TTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCT CCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTC GGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGT SEQ ID NO: 19: Cadena ligera de VL de uerpo 59RGV (variante de línea germinal de 59R1) QSPATLSLSPGERATLSCRRASQSVRSNYIiAWYQQKPGQAPRLLIYG GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 20: Cadena pesada VH de uerpo de 59RGV (variante de línea germinal de 59 ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIAS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVS SEQ ID NO: 22 (CDR3 de cadena pesada alterna T SEQ ID NO: 23 (CDR3 de cadena pesada alterna S SEQ ID NO: 24 (CDR3 de cadena pesada alterna S SEQ ID NO: 25 (CDR3 de cadena pesada alterna T CTGTCGGGCCTCCCAGTCCGTGCGGTCCAACTACCTGGCCTGGTATCA CCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCCAGGGCTACCGG GTTCTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAG GGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTCCAACTTCCCTATCAC CACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCAT CCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAA CTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGG GTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTC TGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGAC TGTCCTCTCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 48: Secuencia de nucleótidos d da de 59R5 (sin secuencia de señal) TGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCT GCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCAGCGGCATGTCCTGGGTGCG GCAAAGGACTCGAGTGGGTGTCCGTGATCGCCTCCTCCGGCTCCAACAC ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACAC CGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTC GGTGCACCAGGACTGGCTGAACG CAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTC GCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCG CTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTC GGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAA GAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTC GCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTC SEQ ID NO:49: cadena pesada de 59R5 ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIAS KGRFTISRDNSKNTLYLQM SLRAEDTAVYYCARSIFYTTWGQGTLVTV LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPS LMISRTPEVTCV DVSHEDPEVQFNWYVDGVE\mNA TKPREEQFNSTF SEQ ID NO: 52: Región variable de cadena p variante ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWRQAPGKGLEWVSVIAS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYPTWGQGTLVTVS SEQ ID NO: 53: Región variable de cadena p variante ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIAS RFTIS RDNS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFAS GQGTLVTV SEQ ID NO: 54: Región Variable de cadena p variante ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIAS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFYASWGQGTLVTVS SEQ ID NO: 55: Región variable de cadena p variante ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSG S VRQAPGKGLEWVSVIAS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFATWGQGTLVTVS ble de cadena pesada de 59R5 (sin secuencia de s GCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCT CGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCAGCGGCATGTCCTGGGTGCG CAAAGGACTCGAGTGGGTGTCCGTGATCGCCTCCTCCGGCTCCAACAC CTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACAC GATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCG CACCACCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCAC SEQ ID NO: 59: Secuencia de nucleótidos d ble de cadena ligera de 59R1 (sin secuencia de s CGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACG CTGCAGAGCGAGCCAGTCTGTTCGTTCTAATTATCTGGCTTGGTACCA TCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCTTCTTCTCGTGCAACTGG TTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAG AGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTAATTTTCCTATTAC TACGAAAGTTGAAATTAAACGT SEQ ID NO: 60: Secuencia de nucleótidos d sión Fe de Notch2 (EGF1-12) PALLWALLAL LCCAAPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKC PCEKNRCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRP TYECTCQVGFTGKECQWTDACLSHPCA GSTCTTVA QFSC CLTGFT PGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCPQGFTGQYCDSLYVPCAPSPCVNGGTC PGFEGSTCER IDDCPNHRCQNGGVCVDGV TY CRCPPQWTGQFCTE NGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPGSTCIDRVA LCHLDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVDEC CVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTC GRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPEN SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 28 (componente potencial de s de 59R1 dentro de EGF10 de Notch2 humano) : PCKNAGTCHWDRRGVADYACSCALGFSGPLCLTPLADNCLTNPCR G RCPPGWSGKSCQQADPCASNPCA GGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTC CRHGGTCHNEVGSYRCVCRATHTGPNCERPYVPCSPSPCQNGGTCRPT TGQNCEENIDDCPGN CKNGGACVDGVNTY CRCPPEWTGQYCTEDVD TCHNTHGGYNCVCVNGWTGEDCS E I DDCAS AACFHGATCHDRVAS F Y HLNDACISNPCNEGSNCDTNP GKAICTCPSGYTGPACSQDVDECSL TLGSFECQCLQGYTGPRCEIDWECVSNPCQNDATCLDQIGEFQCICM ECAS SPCLHNGRCLDKINEFQCECPTGFTGHLCQYDVDECASTPCKNG CTEGYTGTHCEVDIDECDPDPCHYGSCKDGVATFTCLCRPGYTGHHCE GGTCQDRADNYLCFCLKGTTGPNCEGFSGPNCQTNINECASNPCLNQG LLPYTGATCEWLAPCAPSPCRNGGECRQSEDYESFSCVCPTG QGQTC HGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGR CETDIDDCRPNPCHNGGSCTDGIN FCEEDINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCE NTPDCT INSFTCLCPPGFTGSYCQHDVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQ CDSSPCK GGKC QTHTQYRCECPSGWTGLYCDVPSVSCEVAAQRQGV DAGNTHHCRCQAGYTGSYCEDLVDECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKC MYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQHGQLWFPEGFKVSEASKKKRR K ASDGALMDDNQNEWGDEDLETKKFRFEEPWLPDLDDQTDHRQWTQQ PTPPQGEVDADCMDV VRGPDGFTPLMIASCSGGGLETGNSEEEEDAP HNQTDRTGETALHLAARYSRSDAAKRLLEASADANIQDNMGRTPLHAA IRNRATDLDARMHDGTTPLILAARLAVEGMLEDLINSHADVAVDDLGK AAWLLKNGAM DMQNNREETPLFLAAREGSYETAKVLLDHFAJSTRDITD MHHDIVRLLDEYNLVRSPQLHGAPLGGTPTLSPPLCSPNGYLGSLKPG LACGSKEAKDLKARRK SQDGKGCLLDSSGMLSPVDSLESPHGYLSDV SPSVPLNHLPGMPDTHLGIGHLNVAAKPEMAALGGGGRLAFETGPPRLS SSSGGALNFTVGGSTSLNGQCEWLSRLQSGMVPNQY PLRGSVAPGPL GPLHSSLAASALSQMMSYQGLPSTRLATQPHLVQTQQVQPQNLQ QQQN QPPPPPPQPHLGVSSAASGHLGRSFLSGEPSQADVQPLGPSSLAVHTIL SSLVPPVTAAQFLTPPSQHSYSSPVDNTPSHQLQVPEHPFLTPSPESPD DWSEGVSSPPTSMQSQIARIPEAFK SEQ ID N0:31: Notch2 humano oácidos 1-1677: dominio extracelular (subrayado) CVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTC EINECQSNPCVNNGQCVD V RFQCLCPPGFTGPVCQIDIDDCSSTPC ECQCATGFTGVLCEENIDNCDPDPCHHGQCQDGIDSYTCICNPGYMGA CLNDGRCIDLV GYQCNCQPGTSGWCEINFDDCASNPCIHGICMDGI QRCNIDIDECASNPCRKGATCINGVNGFRCICPEGPHHPSCYSQVNEC LSGYKCLCDAGWVGINCEVDK ECLSNPCQNGGTCDNLVNGYRCTCKK CASNPCLNQGTCFDDISGYTCHCVLPYTG NCQTVLAPCSPNPCENAA LCAPGWQGQRCTIDIDECISKPCMNHGLCHNTQGSYMCECPPGFSGMD QNGGSCMDGVNTFSCLCLPGFTGDKCQTDMNECLSEPCK GGTCSDYV VHCENNINECTESSCFNGGTCVDGINSFSCLCPVGFTGSFCLHEINEC IGLGTYRCSCPLGYTGK CQTLVNLCSRSPCK KGTCVQKKAESQCLCP SCDIAASRRGVLVEHLCQHSGVCINAGNTHYCQ YTGSYCEEQLDECASNPCQHGATCSDFIGGYRCECVPGYQGVNCEYEVD CIDLVMHFKCSCPPGTRGLLCEENIDDCARGPHCLNGGQCMDRIGGYSC GDINECLSNPCSSEGSLDCIQLTNDYLCVCRSAFTGRHCETFVDVCPQM MPDGFICRCPPGFSGARCQSSCGQVKCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPR VTDLDARMNDGTTPLILAARLAVEGMVAELINCQADVNAVDDHGKSAL LLLKNGANRDMQDNKEETPLFLAAREGSYEAAKILLDHFANRDITDHM HDIVRLLDEYNVTPSPPGTVLTSALSPVICGPNRSFLSLKHTPMGKKS PNLAKEAKDAKGSRRKKSLSEKVQLSESSVTLSPVDSLESPHTYVSDT ASPNPMLATAAPPAPVHAQHALSFSNLHEMQPLAHGASTVLPSVSQLL GSLSRLHPVPVPADWMNRMEVNETQYNEMFGMVL THPGIAPQSRPPEGKHITTPREPLPPIVTFQLIPKGSIAQPAGAPQPQ MYQIPEMARLPSVAFPTAMMPQQDGQVAQTILPAYHPFPASVGKYPTP RTPSHSGHLQGEHPYLTPSPESPDQWSSSSPHSASDWSDVTTSPTPGG EPPHNNMQVYA SEQ ID NO: 32: Notch3 humano ácidos 1-1640: Dominio extracelular (subrayado) ácidos 351-393: repetición 9 de EGF (doble sub rsivas) RGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGG CPPGWVGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSWAGTARFSCRCPRGFRGP GFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGI CYDAPGGFRCVCEPGWS ESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCEHGGRC QGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCD GGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASF EQDLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSR GFRCTCLESFTGPQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSG AAQIGVRLEQLCQAGGQCVDEDSSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQ GYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGSECRSGACHAAHTRDCL GFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCAQPFWGP CPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCL FRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECN SVGDPWRQCEALQCWRLF SRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTC DGRCDQGCNTEECGWDGLDGASEVPALI iARGVLVLTVLLPPEELLRS TS LRFRLDAHGQAMVFP YHRPS PGS E PRARRE LAPE VI GS WMLE I DNR DAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEPLEPPEPSVPLLPLLVAG VARR REHSTLWFPEGFSLHKDVASGHKGRREPVGQDALGIVIK MAKGE VPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSD SESTPSPATATGAMATTTG SLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA SEQ ID NO: 6: hNotch4 ácidos 1-1444 Dominio extracelular (subrayada) ácidos 392-434 repetición 10 de EGF 10 (doble s cursivas) LLLLLLLLLLLCVS RPRGLLCGSFPEPCANGGTCLSLSLGQGTCQCA CQNAQLCQNGGSCQALLPAPLGLPSSPSPLTPSFLCTCLPGFTGERCQ RGRCHIQASGRPQCSCMPG TGEQCQLRDFCSANPCVNGGVCLATYP ACERDVNECFQDPGPCPKGTSCHNTLGSFQCLCPVGQEGPRCELRAGP LMPEKDSTFHLCLCPPGFIGPDCEVNPDNCVSHQCQNGGTCQDGLDTY SEDVDECETQGPPHCRNGGTCQNSAG5FHCVCVSG GGTSCEENLDDC RVGSFSCLCPPGRTGLLCHLEDMCLSOPCHGDAOCSTNPLTGSTLCLC LDECLMAQQGPSPCEHGGSCLNTPGSFNCLCPPGYTGSRCEADHNECLS LATFHCLCPPGLEGQLCEVETNECASAPCLNHADCHDLLNGFQCICLPG CRSSPCANGGQCQDQPGAFHCKCLPGFEGPRCQTEVDECLSDPCPVGAS GGPGFRCSCPHSSPGPRCQKPGAKGCEGRSGDGACDAGCSGPGGNWDG CPSHSRCWLLFRDGQCHPQCDSEECLFDGYDCETPPACTPAYDQYCHD AECGWDGGDCRPEDGDPEWGPSLALLWLSPPALDQQLFALARVLSLTL D VYPYPGARAEEKLGGTRDPTYQERAAPQTQPLGKETDSLSAGFVWM SRCPWDPGLLLRFLAAMAAVGALEPLLPGPLLAVHPHAGTAPPA QLP LALGALLVLQLIRRRRREHGALWLPPGFTRRPRTQSAPHRRRPPLGED DEDGWMCSGPEEGEEVGQAEETGPPSTCQLWSLSGGCGALP TPPQESEMEAPDLDTRGPDGVTPLMSAVCCGEVQSGTFQGAWLGCPEP HTVGTGETPLHLAARFSRPTAARRLLEAGA PNQPDRAGRTPLHAAVA RQTAVDARTEDGTTPLMLAARLAVEDLVEELIAAQADVGARDKWGKTA RSLLQAGADKDAQDNREQTPLFLAAREGAVEVAQLLLGLGAARELRDQ TH DLLTLLEGAGPPEARHKATPGREAGPFPRARTVSVSVPPHGGGALP GGACLQARTWSVDLAARGGGAYSHCRSLSGVGAGGGPTPRGRRFSAGM YGVAAGRGGRVSTDDWPCDWVALGACGSASNIPIPPPCLTPSPERGSP PINQGGEGKK SEQ ID NO:33: Secuencia de polinucleóti CCAATGGACGGATGCCTGCCTGTCTCATCCCTGTGCAAATGGAAGTAC GGCC'AACCAGTTCTCCTGCAAATGCCTCACAGGCTTCACAGGGCAGAA TGTCAATGAGTGTGACATTCCAGGACACTGCCAGCATGGTGGCACCTG TGGTTCCTACCAGTGCCAGTGCCCTCAGGGCTTCACAGGCCAGTACTG TGTGCCCTGTGCACCCTCACCTTGTGTCAATGGAGGCACCTGTCGGCA CACTTTTGAGTGCAACTGCCTTCCAGGTTTTGAAGGGAGCACCTGTGA TGACTGCCCTAACCACAGGTGTCAGAATGGAGGGGTTTGTGTGGATGG CAACTGCCGCTGTCCCCCACAATGGACAGGACAGTTCTGCACAGAGGA CCTGCTGCAGCCC? TGCCTGTCAAAATGGGGGCACCTGTGCCAACCG TGGCTGTGTATGTGTCAACGGCTGGAGTGGAGATGACTGCAGTGAGAA TGCCTTCGCCTCCTGTACTCCAGGCTCCACCTGCATCGACCGTGTGGC CATGTGCCCAGAGGGGAAGGCAGGTCTCCTGTGTCATCTGGATGATGC TCCTTGCCACA AGGGGGCACTGTGTGACACCAACCCCCTAAATGGGCA CTGCCCACAAGGCTACAAAGGGGCTGACTGCACAGAAGATGTGGATGA CAATAGCAATCCTTGTGAGCATGCAGGAAAATGTGTGAACACGGATGG TGAGTGTCTGAAGGGTTATGCAGGACCTCGTTGTGAGATGGACATCAA PNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPG PEGKAGLLCHLDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGA PCEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDAT GFKGVHCEL SEQ ID NO: 35: EGF10 de Notchl humano CISNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVD SEQ ID NO: 36: EGF10 de Notch2 humano CISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVD SEQ ID NO: 37: EGF9 de Notch3 humano (EGF de Notch3 humano que corresponde a EGF10 de l ptores Notch incluyendo CVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVD SEQ ID NO: 38: EGF10 de Notch4 humano Se hace constar que con relación a esta ejor método conocido por la solicitante para 1 ráctica la presente invención, es el que o a partir de la presente descripción nción .

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Un anticuerpo aislado que se une de ífica a una región de no unión a ligando de un celular de Notch2 y/o Notch3 humano, carac e comprende : (a) una CDRl de cadena pesada que comprend ID NO: 5), una CDR2 de cadena pesada que c GSNTYYADSVKG (SEQ ID NO : 6 ) , y una CDR3 de caden omprende SIFYTT (SEQ ID N0:51); y (b) una CDRl de cadena ligera que c VRSNYLA (SEQ ID NO : 8), una CDR2 de cadena li ende GASSRAT (SEQ ID NO: 9), y una CDR3 de caden (b) una CDR1 de cadena ligera que c VRSNYLA (SEQ ID NO: 8), una CDR2 de cadena li ende GASSRAT (SEQ ID NO: 9), y una CDR3 de caden omprende QQYSNFPI (SEQ ID NO: 10) . 3. Un anticuerpo aisaldo que se une d ífica a una región de no unión a ligando de un celular de Notch2 y/o Notch3 humano, el anticue terizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada eños aproximadamente 90% de identidad de secuenc :50, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 20; y/o (b) una región variable de cadena pesada q enos aproximadamente 90% de identidad de secuenc : 13 O SEQ ID NO: 19. 4. Un anticuerpo aislado que se une d cífica a una región de no unión a ligando de un ífica a una región de no unión a ligando de un celular de Notch2 y/o Notch3 humano, carac e comprende : (a) una región variable de cadena pes ende SEQ ID NO: 50; y/o (b) una región de cadena ligera que compr : 13. 6. El anticuerpo de conformidad con cualq reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque uerpo recombinante , un anticuerpo monoclo uerpo quimérico, un anticuerpo biespecífi uerpo humanizado, un anticuerpo humano, o un f ticuerpo . 7. Un anticuerpo monoclonal aislado, carac e se codifica por el polinucléot ido deposit nación de depósito de patente de ATCC No. PTA 10. Una molécula aislada de polinuc terizada porque comprende un polinucleótido que el anticuerpo de cualquiera de las reividneiadic 11. Una célula, caracterizada porque compr ula de polinucleótido de la reivindicación 1 ce el anticuerpo de cualquiera de las reividnei . 12. Uso de un anticuerpo de cualquiera ndicaciones 1 a 8, en la elaboración de un med el tratamiento de cáncer o para el tratamient medad asociada a angiogénesis .