CN108056095A - 一种脂肪间充质干细胞运输保护液及其应用 - Google Patents

一种脂肪间充质干细胞运输保护液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种干细胞运输保护液，具体地，涉及一种适合远距离运输的脂肪间充质干细胞运输保护液。本发明所述的干细胞运输保护液由10％～30％DMSO(二甲基亚砜)、50μg/mL～150μg/mL链霉素、50％～80％DMEM、8％～20％HES(羟乙基淀粉)组成。本发明的优点是能够保持细胞的稳定性和细胞活性，便于保存和远距离运输。

Description

一种脂肪间充质干细胞运输保护液及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种干细胞运输保护液，具体地，涉及一种适合远距离运输的脂肪间充质干细胞运输保护液。
背景技术
脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等，对于再生医学和细胞治疗研究均具有重要价值。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其成骨能力，已成为公认的骨种子细胞来源。但骨髓间充质干细胞因提取不易、骨髓提取量有限、提取数低等原因，致使其应用经常受限。而脂肪间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells，ADSCs)提取过程中对供体损伤小，而且可以抽脂术中丢弃的脂肪组织悬浮液为重要来源，因此对脂肪间充质干细胞的研究已成为热点。近年来通过研究发现，间充质干细胞可以通过脂肪分离大量获得，且可向成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞、心肌细胞、脂肪细胞等定向诱导转化，在组织工程和细胞治疗方面具有广泛的应用前景，吸引了越来越多研究者的关注。
2001年，Zuk等从人脂肪组织中分离获得了具有多向分化能力的细胞，根据国内外研究结果，将其统称为脂肪间充质干细胞。在体与离体研究均证明，这种细胞具有分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、血管内皮细胞和神经细胞等多种细胞的能力，具有良好的临床应用前景。然而，在临床实际的治疗应用中，脂肪间充质干细胞需在严格的GMP实验室处理后才可进入临床治疗，并不能实现即时输注，过渡期间不可避免的需采用可被临床输注的保护液进行保存。当细胞脱离适宜的培养环境进入保护液中，新的环境必然使细胞产生适应性变化，为达到理想的治疗效果，必须保证保护液中干细胞的稳定性及细胞活性，特别是在远距离运输过程中。
目前有关人脂肪间充质干细胞运输保护液的研究甚少，因此，迫切需要开发一种脂肪间充质干细胞运输保护液，实现脂肪间充质干细胞在远距离运输中能够保持细胞的稳定性及细胞活性，使得干细胞能够得到有效应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞运输保护液，可以解决现有脂肪间充质干细胞运输保护液在远距离运输中不能够保持细胞稳定性及细胞活性等缺点。
本发明的一个方面提供了一种脂肪间充质干细胞运输保护液，该脂肪间充质干细胞运输保护液由10％～30％DMSO(二甲基亚砜)、50μg/mL～150μg/mL链霉素、50％～80％DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)、8％～20％HES(羟乙基淀粉)组成。
在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞运输保护液中DMSO的浓度为10％～20％；在具体的实施方式中，所述DMSO的浓度为20％。
在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞运输保护液中链霉素的浓度为100μg/mL～150μg/mL；在具体的实施方式中，所述链霉素的浓度为100μg/mL。
在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞运输保护液中DMEM的浓度为70％～80％；在具体的实施方式中，所述DMEM的浓度为70％。
在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞运输保护液中HES的浓度为10％～20％；在具体的实施方式中，所述HES的浓度为12％。
在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脂肪间充质干细胞运输保护液中，运输保护液中人脂肪间充质干细胞的浓度为6×105～7×105个/ml。具体地，包括以下步骤：取对数生长期的第3代脂肪间充质干细胞(ADMSCs)，1000r/min离心5min，弃上清，加入4℃预冷冻存的运输保护液，吹打细胞沉淀，使细胞在保护液中均匀分布，调整活细胞浓度为6×105～7×105个/ml，分装至冻存管中保存。
优选地，本发明还包括将冻存管置于-20℃～-80℃冻存盒中保存；较佳地，置于-80℃冻存盒中保存。
在另一优选例中，所述活细胞浓度的测定方法，包括以下步骤：取少许细胞悬液按9：1与0.4％台盼蓝溶液混匀，显微镜下计数被染成蓝色的死细胞和抗染的活细胞数。
本发明在具体实施方式中，还提供了所述人脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下收集块状脂肪组织5～10g，浸泡在含有抗生素的DMEM中。清除肉眼可见的血管组织，用含有抗生素的DMEM反复冲洗3次以去除血细胞及其他杂质，无菌剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)将脂肪组织置于双倍体积的0.1％(质量浓度)I型胶原酶，37℃恒温水浴箱内振荡消化60min，1500r/min离心10min，弃上清及上层组织，加入完全培养液(含12％HES(羟乙基淀粉)、100μg/mL链霉素、70％DMEM)吹打细胞沉淀成单细胞悬液，200目细胞筛过滤，接种于T25培养瓶中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
(3)3d后首次换液，以后每隔2d换液1次。当细胞融合达70％～80％时，以0.25％(质量浓度)胰酶消化，收集细胞，1000r/min离心5min，PBS洗3次(1000r/min×10min)，离心结束，吸弃上清，获得人脂肪间充质干细胞。
本发明在具体的实施方式中，还提供了所述的脂肪间充质干细胞运输保护液在冻存人脂肪间充质干细胞以及脂肪间充质干细胞运输中的应用。
发明的有益效果
本发明不同组分的运输保护液对相同来源的人脂肪间充质干细胞进行保存试验，在相同的时间处理后统计各处理组人脂肪间充质干细胞的存活率，结果显示，本发明的运输保护液具有较高的细胞活率。由此可知，本发明提供的人脂肪间充质干细胞运输保护液能够提高细胞的稳定性和细胞活性，便于保存和远距离运输，使用更安全，具有重大的临床价值。
附图说明
图1所示为不同配方的干细胞运输保护液处理后的细胞活率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方案进行详细说明，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径或者市购获得的常规产品。
实施例1本发明所述脂肪间充质干细胞运输保护液
(1)配方
所述脂肪间充质干细胞运输保护液由10％～30％DMSO(二甲基亚砜)、50μg/mL～150μg/mL链霉素、50％～80％DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)、8％～20％HES(羟乙基淀粉)组成。
(2)配制方法
按配方中比例，用DMEM和HES将链霉素溶解并混合均匀，再加入DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近0℃。
实施例2人脂肪间充质干细胞的制备方法
所述人脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下收集块状脂肪组织5～10g，浸泡在含有抗生素的DMEM中。清除肉眼可见的血管组织，用含有抗生素的DMEM反复冲洗3次以去除血细胞及其他杂质，无菌剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)将脂肪组织置于双倍体积的0.1％(质量浓度)I型胶原酶，37℃恒温水浴箱内振荡消化60min，1500r/min离心10min，弃上清及上层组织，加入完全培养液(含12％HES(羟乙基淀粉)、100μg/mL链霉素、70％DMEM)吹打细胞沉淀成单细胞悬液，200目细胞筛过滤，接种于T25培养瓶中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
(3)3d后首次换液，以后每隔2d换液1次。当细胞融合达70％～80％时，以0.25％(质量浓度)胰酶消化，收集细胞，1000r/min离心5min，PBS洗3次(1000r/min×10min)，离心结束，吸弃上清，获得人脂肪间充质干细胞。
实施例3脂肪间充质干细胞与保护液的混合方式
所述脂肪间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脂肪间充质干细胞运输保护液中，运输保护液中人脂肪间充质干细胞的浓度为6×105～7×105个/ml。具体地，包括以下步骤：取对数生长期的第3代脂肪间充质干细胞(ADMSCs)，1000r/min离心5min，弃上清，加入4℃预冷冻存的运输保护液，吹打细胞沉淀，使细胞在保护液中均匀分布，调整活细胞浓度为6×105～7×105个/ml，分装至冻存管中保存。
实施例4人脂肪间充质干细胞保存存活性试验
(1)按表1所示的配方分组进行细胞保存存活性试验。
表1配方
A组 30％DMSO、50μg/mL链霉素、80％DMEM、8％HES
B组 10％DMSO、100μg/mL链霉素、50％DMEM、20％HES
C组 20％DMSO、100μg/mL链霉素、70％DMEM、12％HES
D组 30％DMSO、80μg/mL链霉素、50％DMEM、16％HES
(2)试验方法
取对数生长期的第3代脂肪间充质干细胞(ADMSCs)，分别加入等体积的A-D四组配方的干细胞运输保护液。轻轻吹打均匀分装后，置于-80℃冻存盒中3天，取出计算细胞活率。
细胞活率测定方法如下：取少许细胞悬液按9：1与0.4％台盼蓝溶液混匀，置于显微镜下，计算活细胞数及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数*100％。
结果如图1所示，C组配方(20％DMSO、100μg/mL链霉素、70％DMEM、12％HES)细胞活率最高，优于其他组。由此可知，本发明的人脂肪间充质干细胞具有较高的细胞活率，能保证细胞的活力和稳定性，使人脂肪间充质干细胞能够得到有效应用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对这些实施例进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，由10％～30％DMSO(二甲基亚砜)、50μg/mL～150μg/mL链霉素、50％～80％DMEM、8％～20％HES(羟乙基淀粉)组成。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脂肪间充质干细胞运输保护液中，运输保护液中人脂肪间充质干细胞的浓度为6×105～7×105个/ml。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述DMSO的浓度为10％～20％；优选地，所述DMSO的浓度为20％。
4.根据权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述链霉素的浓度为100μg/mL～150μg/mL；优选地，所述链霉素的浓度为100μg/mL。
5.根据权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述DMEM的浓度为70％～80％；优选地，所述DMEM的浓度为70％。
6.根据权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述HES的浓度为10％～20％；优选地，所述HES的浓度为12％。
7.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞是以重悬方式调整加入到脂肪间充质干细胞运输保护液中，包括以下步骤：取对数生长期的第3代脂肪间充质干细胞(ADMSCs)，1000r/min离心5min，弃上清，加入4℃预冷冻存的运输保护液，吹打细胞沉淀，使细胞在保护液中均匀分布，调整活细胞浓度为6×105～7×105个/ml，分装至冻存管中保存。
8.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，所述调整活细胞浓度包括以下步骤：取少许细胞悬液按9：1与0.4％台盼蓝溶液混匀，显微镜下计数被染成蓝色的死细胞和抗染的活细胞数。
9.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞运输保护液，其特征在于，还进一步包括将冻存管置于-20℃～-80℃冻存盒中保存；优选地，置于-80℃冻存盒中保存。
10.权利要求1-9任一项所述的脂肪间充质干细胞运输保护液在冻存人脂肪间充质干细胞以及脂肪间充质干细胞运输中的应用。
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