CN108685948A - 一种新型医用细胞修复剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修复创伤的药剂，尤其是涉及一种新型医用细胞修复剂的制备方法。具体的制备步骤为，人羊膜间充质干细胞的分离纯化和培养，海藻酸钠复合剂的制备，细胞修复剂的制备。本发明建立了人羊膜间充质干细胞制备方法和相应的干细胞库，为较大规模生产制备人羊膜间充质干细胞修复剂及其应用做好了准备。

Description

一种新型医用细胞修复剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及修复创伤的药剂，尤其是涉及一种新型医用细胞修复剂的制备方法。
背景技术：
皮肤创伤修复是一个复杂的生物学过程，它启动一系列复杂的生物学事件,包括炎症、组织新生及组织重构。虽然许多研究采用不同的方法治疗皮肤创伤修复，但愈合质量低、附属器官不可再生等依然是皮肤创伤愈合过程中的关键问题。目前，皮肤移植是修复大面积皮肤损伤的最有效方法。近年来，人工合成皮肤已经被用来治疗皮肤损伤，但并不是一种完美的皮肤替代物，也存在着一系列的问题：目前使用的人工合成皮肤种子细胞是自体或异体的表皮细胞。自体表皮细胞数量不足，异体表皮细胞则存在着排异反应；目前使用的人工合成皮肤中存在着活细胞，但是保存是个问题，若临时制备需要时间较长，而皮肤损伤需要在尽快的时间内使用人工合成皮肤；目前使用的人工合成皮肤不具有创面新生皮形成血管的能力，容易坏死。而间充质干细胞已经被证实是皮肤创伤修复的有效种子细胞。
已有诸多实验研究结果证实BMSCs在促进创面愈合方面起到积极的作用。Badiavas将骨髓间充质干细胞移植到深II度烧伤创面,发现其明显促进创面的愈合。付小兵等将BMSCs移植至猪深度烧伤创面，发现创面愈合速度明显加快，表皮增厚，真皮神经纤维增多，大大改善了创面愈合质量。文献报道BMSCs还参与表皮、汗腺及创面血管的重建。这些研究结果表明BMSCs是非常好的皮肤组织工程种子细胞。创伤愈合的各个阶段都有生长因子的参与和调控，生长因子对治疗慢性难愈合皮肤创口和大面积烧伤创面有着广阔的应用前景。但是作为临床应用，获得骨髓间充质干细胞时手续比较复杂，提供者比较痛苦。此外，骨髓来源的间充质干细胞是随着提供者年龄的增加，其数量会减少，相应的分化能力也会变弱。近年来，发现胎盘附属组织来源的干细胞，尤其是羊膜间充质干细胞，是骨髓间充质干细胞很好的替代品。2004年，In t Anker等从羊膜培养出的人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)，其免疫表型与骨髓间充质干细胞(BMSCs)相似，且其比BMSCs具有更强的扩增能力。hAMSCs不但具有干细胞特征，而且表现出低免疫源性和免疫抑制作用，是较为理想的免疫赦免细胞，是皮肤创伤修复的有效种子细胞。它不仅更原始，生长能力强，而且排异反应也较小。羊膜组织本是医疗废弃物，来源广泛而且易得。
申请号为200810136415.6的发明专利公开了一种使用甲基纤维素作为细胞基质的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，但是该发明含有抗生素庆大霉素，不适用于抗生素过敏人群；人脐带间充干细胞的使用没有配型，可能会有排异反应，而且涂抹剂快速配制中含有动物源成分胎牛血清，有可能造成过敏以及具有动物源性安全隐患。
发明内容：
本发明正是针对上述问题，提供了一种新型医用细胞修复剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，具体的制备步骤为，
1、海藻酸钠复合剂的制备
称取5g无水海藻酸钠，加入到100ml玻璃瓶中，接着加入40ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入20ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀；再往玻璃瓶中添加表皮生长因子EGF 1mg、碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2mg、血管生长因子VEGF2mg，搅拌均匀后得到海藻酸钠复合剂；
2、细胞修复剂的制备
向1ml步骤1制得的海藻糖复合剂中加入1.0×106细胞/ml人羊膜间充质干细胞悬液1ml，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得细胞修复剂。
人羊膜间充质干细胞的制备步骤为，
(1)分离纯化
取无菌采集羊膜组织，生物安全柜内置于预冷的PBS中冲洗，若胎盘连带绒毛膜，需先分离绒毛膜和羊膜，取出羊膜，丢弃绒毛膜；剪羊膜组织为2cm×2cm的羊膜小条，等体积加入2U/ml中性蛋白酶消化30min，再加两倍半羊膜体积的5.5mg/ml V型胶原酶和2U/ml透明质酸酶1：1混合液消化3.5h；收集消化完毕的细胞悬液，加入无钙镁离子的平衡液多次清洗，冰醋酸稀释后计数单个核细胞，得出细胞总量；
调整细胞浓度至于1.0×105个/ml，加入无血清间充质干细胞培养基，置于37℃，浓度为5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养,每2d换液1次，一周后得到原代羊膜间充质干细胞；待细胞生长至培养容器底面积的80-90％时,大量细胞团连成片时，以浓度0.05％g/L胰蛋白酶消化后传代，将细胞置于铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的羊膜间充质干细胞；
2、冻存前对细胞进行质量检测
(1)对细胞收集前的培养液进行传染病病原体检测，包括乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体；
(2)在细胞冻存的同时，取细胞进行微生物培养，进行微生物检测；
3、选取商品化无血清细胞冻存液，将5×106个/ml的人羊膜间充质干细胞加到1ml冻存液中，放入冻存管中，先置于冰箱中，4℃下保存8min，再调至-80℃下保存12-18h，然后放入配有液氮罐的人羊膜间充质干细胞库中；
4、根据新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。
具体使用时，根据需要可采用培养期的细胞快速配置法或冻存期的细胞快速配置法。
1、培养期的细胞快速配置法
根据细胞生长速度提前培养细胞，收集细胞，使用20ml磷酸缓冲液(PBS)洗涤后离心，离心力为400g，离心5min，除去杂质和细胞碎片成分；计数细胞，经过细胞活率检测合格后，立即与海藻酸钠复合剂及质量浓度为1％的透明质酸钠液等体积混合，装于无菌玻璃瓶，即可使用；
2、冻存期的细胞快速配置
冻存期的细胞采用快速复苏方法，从液氮中取出冻存管于37℃水浴锅复苏细胞，将其加入含10ml间充质干细胞培养基的离心管中混匀离心，离心力为400g，离心5min，重复2次，计数细胞；经过细胞活率检测合格后，立即与海藻酸钠复合剂及质量浓度为1％的透明质酸钠液等体积混合，装于无菌玻璃瓶，即可使用。
本发明的有益效果：
1、改进了人羊膜间充质干细胞制备方法，细胞修复剂采用人羊膜间充质干细胞。
2、根据新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。同时，由于间充质干细胞本身抗原性较弱并具有免疫抑制作用，在组织和器官移植过程中可抑制或预防移植物抗宿主病(GVHD)，因此排异反应较小。
3、用海藻酸钠溶液作母液和间充质细胞培养基充分混和作为为基质，再添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生长因子，青霉素素100U/ml，链霉素0.1mg/ml，得到海藻酸钠复合剂。最后再和人羊膜间充质干细胞悬液和透明质酸溶液按照一定比例形成一种膏状物。可均匀涂抹于皮肤创面而形成一种覆盖物。使用本细胞修复剂，可诱导形成新生的表皮和真皮，并促进创面边缘的自身皮向创面内生长。
附图说明：
图1为羊膜间充质干细胞培养中的细胞形态图。A为原代细胞得到的部分上皮样细胞形态，B为第二代培养时得到的成纤维细胞形态。
图2为流式分析细胞表面分子CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD326、HLA-DR。
图3为免疫荧光细胞染色分析细胞质里Vimentin成分。
图4为细胞向成骨细胞定向诱导分化。
图5为细胞向成脂肪细胞定向诱导分化。
具体实施方式：
实施例1
1、人羊膜间充质干细胞的制备
取无菌采集羊膜组织，生物安全柜内置于预冷的PBS中冲洗，若胎盘连带绒毛膜，需先分离绒毛膜和羊膜，取出羊膜，丢弃绒毛膜；剪羊膜组织为2cm×2cm的羊膜小条，等体积加入2U/ml中性蛋白酶消化30min，再加两倍半羊膜体积的5.5mg/ml V型胶原酶和2U/ml透明质酸酶1：1混合液消化3.5h；收集消化完毕的细胞悬液，加入无钙镁离子的平衡液多次清洗，冰醋酸稀释后计数单个核细胞，得出细胞总量；调整细胞浓度至于1.0×105个/ml，加入无血清间充质干细胞培养基，置于37℃，浓度为5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养,每2d换液1次，一周后得到原代羊膜间充质干细胞；待细胞生长至培养容器底面积的80-90％时,大量细胞团连成片时，以浓度0.05％g/L胰蛋白酶消化后传代，将细胞置于铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的羊膜间充质干细胞。冻存前对细胞进行质量检测：对细胞收集前的培养液进行传染病病原体检测：如乙肝、丙肝、梅毒、艾滋；在细胞冻存的同时，取少量细胞进行微生物培养，进行微生物检测。选取商品化无血清细胞冻存液，将5×106个/ml的人羊膜间充质干细胞加到1ml冻存液中，放入冻存管中，先置于冰箱中，4℃下保存8min，再调至-80℃下保存12-18h，然后放入配有液氮罐的人羊膜间充质干细胞库中；根据新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。
2、海藻酸钠复合剂的制备
称取3g无水海藻酸钠，加入到100ml玻璃瓶中，接着加入40ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入20ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀；再往玻璃瓶中添加表皮生长因子EGF 1mg、碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2mg、血管生长因子VEGF2mg，搅拌均匀后得到海藻酸钠复合剂；
3、细胞修复剂的制备
向1ml步骤1制得的海藻糖复合剂中加入1.0×106细胞/ml人羊膜间充质干细胞悬液1ml，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得细胞修复剂。
针对急性皮肤损伤或大面积皮肤损伤的客户，使用冻存期的细胞快速配置，根据用户的性别和ABO/Rh分型及HLA分型从羊膜间充质细胞库中选择合适的细胞种子。从液氮中取出冻存管于37℃水浴锅复苏细胞，将其加入含10ml间充质干细胞培养基的离心管中混匀离心，离心力为400g，离心5min，重复2次，计数细胞；经过细胞活率检测合格后，立即与海藻酸钠复合剂及质量浓度为1％的透明质酸钠液等体积混合，装于无菌玻璃瓶，即可使用。
实施例2
1、人羊膜间充质干细胞的制备
取无菌采集羊膜组织，生物安全柜内置于预冷的PBS中冲洗，若胎盘连带绒毛膜，需先分离绒毛膜和羊膜，取出羊膜，丢弃绒毛膜；剪羊膜组织为2cm×2cm的羊膜小条，等体积加入2U/ml中性蛋白酶消化30min，再加两倍半羊膜体积的5.5mg/ml V型胶原酶和2U/ml透明质酸酶1：1混合液消化3.5h；收集消化完毕的细胞悬液，加入无钙镁离子的平衡液多次清洗，冰醋酸稀释后计数单个核细胞，得出细胞总量；调整细胞浓度至于1.0×105个/ml，加入无血清间充质干细胞培养基，置于37℃，浓度为5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养,每2d换液1次，一周后得到原代羊膜间充质干细胞；待细胞生长至培养容器底面积的80-90％时,大量细胞团连成片时，以浓度0.05％g/L胰蛋白酶消化后传代，将细胞置于铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的羊膜间充质干细胞。冻存前对细胞进行质量检测：对细胞收集前的培养液进行传染病病原体检测：如乙肝、丙肝、梅毒、艾滋；在细胞冻存的同时，取少量细胞进行微生物培养，进行微生物检测。选取商品化无血清细胞冻存液，将5×106个/ml的人羊膜间充质干细胞加到1ml冻存液中，放入冻存管中，先置于冰箱中，4℃下保存8min，再调至-80℃下保存12-18h，然后放入配有液氮罐的人羊膜间充质干细胞库中；根据新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。
2、海藻酸钠复合剂的制备
称取3g无水海藻酸钠，加入到100ml玻璃瓶中，接着加入40ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入20ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀；再往玻璃瓶中添加表皮生长因子EGF 1mg、碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2mg、血管生长因子VEGF2mg，搅拌均匀后得到海藻酸钠复合剂；
3、细胞修复剂的制备
向1ml步骤1制得的海藻糖复合剂中加入1.0×106细胞/ml人羊膜间充质干细胞悬液1ml，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得细胞修复剂。
针对慢性皮肤损伤或小面积皮肤损伤的客户，使用培养期细胞快速配置，根据用户的性别和ABO/Rh分型及HLA分型从羊膜间充质细胞库中选择合适的细胞种子。根据细胞生长速度提前培养细胞，待密度80％时收集细胞。先使用20ml磷酸缓冲液(PBS)洗涤，400g，5min离心，除去杂质和细胞碎片成分。计数细胞，经过细胞活率检测合格后，立即与海藻酸钠复合剂混合，装于无菌玻璃瓶，送给客户使用。
实施例3应用效果检测
1、实施例1制得的人羊膜间充质干细胞生物学特征：
a.流式细胞仪细胞分子表面标记鉴定：
取生长状态良好的第3代羊膜间充质干细胞做流式细胞分析，看其是否表达CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD326、HLA-DR等表面分子。
b.细胞免疫荧光染色实验：
取生长状态良好的第3代羊膜间充质干细胞，调整细胞浓度，做细胞爬片，细胞长满后用4％多聚甲醛固定，做细胞免疫荧光染色，荧光显微镜下观察检测细胞内是否含Vimentin。
c.体外多向分化实验：
传代培养后人羊膜间充质干细胞在***，β-磷脂甘油、抗坏血酸盐等成骨诱导体系中培养向成骨细胞分化，用茜素红和碱性磷酸酶染色鉴定；传代培养后人羊膜间充质干细胞在含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚镁锌的成脂诱导体系中培养向成脂肪细胞分化，用油红O染色鉴定。
2、创面涂抹剂应用效果的检测方法：
a体内移植实验
在18只裸鼠背部手术切除1.5cmX1.5cm全层皮肤创面，裸鼠随机分成3组，每组6只：一组涂抹细胞修复剂；一组仅涂抹海藻酸钠复合剂；一组仅涂抹生理盐水。在0,7,14,21,28天，分别处死一只。取创口组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片进行伊红苏木素染色、免疫组化和免疫荧光鉴定，进行创口组织组织学检查：
创口愈合时间，瘢痕形成和皮肤柔韧度；
受体创口组织中供者细胞的检测：
绿色荧光蛋白的鉴定：为了研究人羊膜间充质干细胞是否参与创面修复，用绿色荧光蛋白质粒转染人羊膜间充质干细胞，2周后受者小鼠创口新生组织用4％多聚甲醛固定，用冰冻切片包埋剂，-20℃恒冷箱切片机切片，用荧光显微镜检测人羊膜间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达。
细胞角蛋白和胶原蛋白的检测：为了研究人羊膜间充质干细胞是否在体内分化上皮细胞、形成胶原，受体小鼠新生切片分别做兔抗人角蛋白(pan-CK)和兔子抗人1型胶原蛋白多克隆抗体共同孵育，而后用荧光藻红素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育，在在0，7，14，21，28天用荧光显微镜检测。
结果发现：
1、取第3代羊膜间充质干细胞用流式细胞分析仪检测。结果显示：表达***表面标志CD44、CD73、CD90、CD105，不表达造血细胞标志CD34、CD45，不表达上皮细胞标志CD326，不表达与移植免疫排斥发生反应密切相关的表面标志HLA-DR。
2、取第3代羊膜间充质干细胞做免疫荧光染色。结果显示，细胞表达细胞骨架蛋白Vimentin。
3、人羊膜间充质干细胞可分化为成骨细胞和成脂细胞。
4、细胞修复剂可以很好地贴附于创面组织，并参与表皮和真皮的修复：
(1)在使用细胞修复剂后14天，伤口愈合，柔韧性较好；而对照组的创口则需要21天才能愈合，且有广泛的瘢痕收缩。
(2)在使用细胞修复剂后7天，创口组织伊红苏木素染色可见4～6层新皮，21天后达到8～10层；真皮中胶原排列规则，而对照组创口需要21天才能上皮化。
(3)在使用细胞修复剂后14天后，发现受者小鼠创口组织中有含绿色荧光蛋白的供者细胞存在，而对照组则为阴性。证明供者细胞已经在受者体内移植成功。
(4)在使用细胞修复剂后14天后，发现1型胶原在真皮内表达明显增高，而角蛋白在表皮内表达明显增高，证明供者细胞可以分化为上皮并分泌胶原蛋白。
由图2可知，羊膜间充质干细胞高表达***表面标志CD44、CD73、CD90、CD105，不表达造血细胞标志CD34、CD45，不表达上皮细胞标志CD326，不表达与移植免疫排斥发生反应密切相关的表面标志HLA-DR。
由图3可知，羊膜间充质干细胞细胞质中含有大量的细胞骨架蛋白Vimentin。
由图4可知，经茜素红染色呈红色结节。这说明羊膜间充质干细胞具有成骨分化的潜能。
由图5可知，羊膜间充质干细胞细胞内有大量红色脂滴，这说明具有向脂肪细胞分化的潜能。

Claims (2)

1.一种新型医用细胞修复剂的制备方法，其特征在于，具体的制备步骤为，
(1)海藻酸钠复合剂的制备
称取1～10g无水海藻酸钠，加入到100ml玻璃瓶中，接着加入40ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入20ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀；再往玻璃瓶中添加表皮生长因子EGF 1mg、碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2mg、血管生长因子VEGF2mg，搅拌均匀后得到海藻酸钠复合剂；
(2)细胞修复剂的制备
向1ml步骤1制得的海藻糖复合剂中加入1.0×106细胞/ml人羊膜间充质干细胞悬液1ml，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得细胞修复剂。
2.根据权利要求1所述的细胞修复剂的制备方法，其特征在于，人羊膜间充质干细胞的制备步骤为，
(1)分离纯化
取无菌采集羊膜组织，生物安全柜内置于预冷的PBS中冲洗，若胎盘连带绒毛膜，需先分离绒毛膜和羊膜，取出羊膜，丢弃绒毛膜；剪羊膜组织为2cm×2cm的羊膜小条，等体积加入2U/ml中性蛋白酶消化30min，再加两倍半羊膜体积的5.5mg/mlV型胶原酶和2U/ml透明质酸酶1：1混合液消化3.5h；收集消化完毕的细胞悬液，加入无钙镁离子的平衡液多次清洗，冰醋酸稀释后计数单个核细胞，得出细胞总量；
调整细胞浓度至于1.0×105个/ml，加入无血清间充质干细胞培养基，置于37℃，浓度为5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养,每2d换液1次，一周后得到原代羊膜间充质干细胞；待细胞生长至培养容器底面积的80-90％时,大量细胞团连成片时，以浓度0.05％g/L胰蛋白酶消化后传代，将细胞置于铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的羊膜间充质干细胞；
(2)冻存前对细胞进行质量检测
a.对细胞收集前的培养液进行传染病病原体检测，包括乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体；
b.在细胞冻存的同时，取细胞进行微生物培养，进行微生物检测；
(3)选取商品化无血清细胞冻存液，将5×106个/ml的人羊膜间充质干细胞加到1ml冻存液中，放入冻存管中，先置于冰箱中，4℃下保存8min，再调至-80℃下保存12-18h，然后放入配有液氮罐的人羊膜间充质干细胞库中；
(4)根据新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。
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