一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇化苯并吲哚菁近红外荧光染料,该染料具有良好的水溶性以及光学稳定性,可用于水溶性光热转换试剂以及生物荧光成像领域,特别是一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料及其制备方法和应用。
背景技术
吲哚菁作为染料,其分子内部含有由甲川基(CH)n组成的共轭链,共轭链两端吲哚衍生物与共轭链组成一个大的共轭体系,聚次甲基桥键越长其吸光度越高且发射波长可达到近红外区。目前研究较多的是吲哚菁绿(ICG),其分子结构为含有磺酸基的苯并吲哚七甲川菁染料。ICG最大发射波长在795~845nm之间,近红外光在组织中的穿透深度较大,且受生物组织背景干扰较小,由于ICG具有近红外吸收和荧光发射特性以及较低的生物毒性,广泛应用于血管造影。作为一种理想的近红外吸收剂,ICG在生物组织荧光成像、肿瘤检测及脑血管毒性评价方面也有较大的应用前景。此外,ICG也是一种理想的光热转换试剂用于肿瘤组织的光热治疗。当受到近红外激光照射时,吸收的光能也能够部分转化为热能,使周围环境温度升高,利用光热转换产生的高热量来破坏、消除癌细胞。近红外染料在注射到体内后很容易被生物清除或降解,不会带来长期的蓄积以及毒性。
然而,磺酸基化的ICG只溶于水,不溶于有机溶剂,分子极性很大,通常只能通过制备高效液相色谱提纯,导致市售产品价格很高。ICG在较高的浓度时会发生团聚,降低其在水溶液中溶解性。此外,ICG在溶液状态时七甲川容易受到单线态氧的进攻,造成染料的光解,使光学稳定性降低。以上缺点限制了它在光热治疗以及荧光成像中的应用。磺酸基的菁染料在水溶液中具有很好的溶解性。非磺化的吲哚菁染料的吸收及荧光发射性质与磺酸基化吲哚菁染料相似,可溶于有机溶剂,极性不大,可以通过硅胶柱层析大量合成,降低其生产成本。然而,非磺化的吲哚七甲川菁染料具有高度的疏水性,其生物医用受到了很大的限制,无法直接溶解在水溶液中使用,因此制备一种亲水性并且具有生物相容性以及光稳定性的吲哚菁染料具有重大意义。
发明内容
为了改善吲哚菁染料的水溶性,提高生物相容性以及光稳定性,本发明提供了一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料及其制备方法和应用,具体技术方案如下:
一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料,分子结构中含有聚乙二醇、苯并吲哚环以及七甲川链,分子结构通式:
其中,通式结构为含有无取代基的七甲川共轭链或连接有氯代环己烯桥环的七甲川链,所述氯原子可以被巯基、氨基活性基团取代用于进一步的染料修饰,所述通式结构中X-选取F-、Cl-、Br-、I-中的任意一种,n选取10~50之间包含两端的整数。
一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料的制备方法,其具体步骤如下:
(1)称取干燥的聚乙二醇单甲醚溶解至有机溶剂中,在惰性气体N2的保护下加入三乙胺碱性催化剂、温控在0~10℃甲磺酰氯,保温搅拌反应12h,过滤收集滤液,对滤液进行减压抽滤获取白色固体;加入四氢呋喃溶解该固体并将其滴加至冷***中,产生白色沉淀,过滤沉淀继续用四氢呋喃溶解、冷***沉淀重复3~4次,获得甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚,将获得的甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚加入有机溶剂,同时加入过量的卤化锂,加热回流搅拌24h,过滤除去体系中无机盐,减压除去有机溶剂,得白色固体;继续加入四氢呋喃溶解该固体,将其缓慢加入大量冷***中产生沉淀,沉淀过滤继续用四氢呋喃溶解、大量***沉淀重复3~4次,制得中间体A,即为端基卤代聚乙二醇单甲醚;
(2)将步骤(1)制备获取的中间体A与2,3,3-三甲基-4,5-苯并吲哚加入有机溶剂中,于100~110℃下反应12小时,反应完成后将反应液加入大量冷***中,产生灰色沉淀,将其过滤制得灰白色滤饼,并将滤饼烘干,之后用硅胶柱层析提纯可得中间体B,即聚乙二醇修饰苯并吲哚盐;
(3)将步骤(2)中获取的聚乙二醇修饰苯并吲哚盐真空干燥,并和醋酸钠、戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐或1-甲酰-3-羟次甲基-2-氯环己烯缩合剂加入到有机溶剂中,在N2保护的条件下于90~130℃加热反应4~8h,反应结束后减压除去部分有机溶剂,然后将反应液加入冷***中,过滤收集沉淀产物,并使用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯产物,即为聚乙二醇化苯并吲哚菁染料。
进一步的,所述步骤(1)中的有机溶剂选取自丙酮、乙醇、四氢呋喃、乙腈中任意一种,所述卤化锂选自氟化锂、溴化锂、氯化锂、碘化锂中任意一种。
进一步的,所述步骤(1)中有机溶剂的用量为聚乙二醇单甲醚质量的5~20倍,所述甲磺酰氯、三乙胺碱性催化剂与聚乙二醇单甲醚摩尔比为1:1:2~5。
进一步的,所述步骤(2)中的有机溶剂选取自是丙酮、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、1,2-邻二氯苯中任意一种。
进一步的,所述步骤(2)中的有机溶剂的用量是2,3,3-三甲基-3H吲哚质量的5~20倍,所述2,3,3-三甲基-3H吲哚与卤代聚乙二醇单甲醚摩尔比为1:1~1:2。
进一步的,所述步骤(3)中有机溶剂选取自醋酸酐、冰醋酸、吡啶、N,N-二甲酰胺任意一种。
进一步的,所述步骤(3)中有机溶剂的用量是聚乙二烯醇修饰苯并吲哚盐质量的5~25倍,所述戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐或1-甲酰-3-羟次甲基-2-氯环己烯与聚乙二醇修饰苯并吲哚盐摩尔比为2:3~2:5,所述戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐或1-甲酰-3-羟次甲基-2-氯环己烯与醋酸钠的摩尔比为1:0.5~1:5。
一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料在水溶性光热转换试剂领域的应用。
一种聚乙二醇化苯并吲哚七甲川菁染料在生物荧光成像方面的应用。
本发明与现有技术相比,有如下优点:
现有的磺化水溶性菁染料ICG极性很大,难以溶解于有机溶剂,使用传统分离方式难以进行提纯,通常使用制备高效液相色谱进行提纯,提纯成本高昂,而本发明涉及的聚乙二醇修饰的水溶性菁染料具有相对较小的极性,可以溶解于有机溶剂,通过硅胶柱层析的方式即可得到纯品,显著降低分离提纯成本;聚乙二醇键合到染料上修饰吲哚菁染料,可以使染料由疏水性转换为亲水性,在染料使用过程中无需添加有机助溶剂助溶,即可直接溶解在水中便于使用;同时聚乙二醇大分子醚链结构可以从空间上抑制单线态氧对甲川链的进攻,提高染料在溶液状态的光稳定性;和传统的水溶性磺化苯并吲哚菁染料ICG相比,本发明的染料在光热治疗应用中能够对环境持续高效加热,在相同光照条件下,能够升到更高的加热温度来破坏、热解癌细胞;由于聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物,作为修饰吲哚菁染料可以提升生物相容性,降低菁染料的生物毒性,作为生物材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1染料IR-PEG(a)在水溶液中的可见-远红外吸收、荧光发射光谱以及经过808nm激光照射后的可见-远红外吸收光谱,其中激光强度0.6W cm-2,照射时间5min。
图2为实施例2染料IR-PEG(b)在水溶液中的可见-远红外吸收、荧光发射光谱以及经过808nm激光照射后可见-远红外吸收光谱,其中激光强度0.6W cm-2,照射时间5min。
图3为实施商业化磺化菁染料ICG在水溶液中的808nm激光照射前后的可见-远红外吸收光谱,其中激光强度0.6W cm-2,照射时间5min。
图4为实施例1染料IR-PEG(a)和实施例2染料IR-PEG(b)的水溶液在808nm近红外激光照射下光热转换升温曲线图,其中ICG和水作为对比,激光波长808nm,1W cm-2,染料浓度均为50μM。
具体实施方式
为进一步揭示本发明的技术方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明的保护范围。
实施例1:
(一)端基碘代聚乙二醇单甲醚PEG16-I的制备
向500mL的圆底烧瓶中加入22.0g(0.04mol)干燥过的聚乙二醇单甲醚(Mn=550),并加入150mL无水四氢呋喃溶剂溶解,在N2惰性气体的保护下加入8.08g(0.08mol)三乙胺碱性催化剂,控温在0~5℃后缓慢加入20g(0.08mol)甲磺酰氯溶于30mL四氢呋喃的溶液,滴加后常温搅拌反应10小时,过滤除去不溶物后减压除去有机溶剂,得白色固体。加入40mL四氢呋喃溶解该固体,缓慢滴加该溶液到400mL冷***中,产生白色沉淀,倒掉***溶液后将粘在壁上的白色固体继续用四氢呋喃溶解,冷***沉淀,重复3~4次,通过反复沉淀可以除去未反应的甲磺酰氯原料,过滤后收集沉淀物并在50℃真空烘箱内干燥过夜。将干燥后的甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚加入到250mL的圆底烧瓶中,用180mL丙酮溶解,加入18gLiI,在N2惰性气体的保护下加热回流搅拌24小时,过滤除去体系中的不溶的盐类,减压除去有机溶剂,得白色固体。加入30mL四氢呋喃溶解该固体,缓慢加入该溶液到300mL冷***中,有沉淀产生,沉淀过滤后继续用四氢呋喃溶解,冷***沉淀,重复3~4次,可得端基碘代的聚乙二醇单甲醚PEG12-I。产率:78%.1H NMR(CDCl3,400MHz,):δ3.78(t,2H),3.68~3.50(m,42H),3.36(s,3H),3.24(t,2H),以上合成步骤反应式表达如下:
(二)聚乙二醇修饰苯并吲哚盐TMBI-PEG12的制备
称取9.9g(15mmol)干燥后的PEG12-I以及1.59g(10mmol)2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚加入到50mL反应瓶中,加入15mL邻二氯苯溶解,在N2保护的条件下加热到110℃反应8小时,反应停止后将反应液加入到400mL冷***中,有灰色沉淀产生,过滤可得灰白色滤饼,沉淀物用硅胶柱层析提纯,可得聚乙二醇修饰的吲哚盐TMBI-PEG12。产率:36%.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.95~8.12(m,4H),7.61~7.78(m,2H),5.22(t,2H),4.04(t,2H),3.41~3.82(m,42H),3.34(s,3H),3.14(s,3H),1.84(s,6H)。以上合成步骤反应式表达如下:
(三)聚乙二醇化苯并吲哚菁染料IR-PEG(a)的制备
称取3.47g(4mmol)干燥后的TMBI-PEG12、0.49g(6mmol)醋酸钠以及0.57g(2mmol)5-苯胺基戊二烯醛缩苯胺盐酸盐缩合剂转移到25mL反应瓶中,加入10mL醋酸酐溶解,在N2保护的条件下于110℃下反应3小时,反应停止后将反应液加入200mL冷***中,有绿色染料沉淀产生,过滤可得绿色染料滤饼并用硅胶柱层析提纯,可得聚乙二醇化苯并吲哚菁染料IR-PEG(a)。产率:30%.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.40(d,2H),8.12~7.91(m,5H),7.92~7.59(m,3H),7.50(t,2H),6.61(t,2H),6.45(d,2H),4.61(m,4H),4.00(m,4H),3.82~3.41(m,84H),3.35(s,6H),2.04(s,6H)。以上合成步骤反应式表达如下:
实施例2
(一)端基溴代聚乙二醇单甲醚PEG16-Br的制备
向500mL的圆底烧瓶中加入30.0g(0.04mol)干燥过的聚乙二醇单甲醚(Mn=750),并加入200mL无水四氢呋喃溶剂溶解,在N2惰性气体的保护下加入8.08g(0.08mol)三乙胺碱性催化剂,控温在0~5℃后缓慢滴加9.20g(0.08mol)甲磺酰氯溶于30mL无水四氢呋喃的溶液,滴加后常温搅拌反应10小时,过滤除去不溶物后减压除去有机溶剂,得白色固体。加入40mL四氢呋喃溶解该固体,缓慢滴加该溶液到400mL冷***中,有白色沉淀产生,倒掉***溶液后将粘在壁上的白色固体继续用四氢呋喃溶解,冷***沉淀,重复3~4次,通过反复沉淀可以除去未反应的甲磺酰氯原料,过滤后收集沉淀物并在50℃真空烘箱内干燥过夜。将干燥后的甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚加入到250mL的圆底烧瓶中,用180mL丙酮溶解,加入18g KBr,在N2惰性气体的保护下加热回流搅拌24小时,过滤除去体系中的不溶的盐类,减压除去有机溶剂,得白色固体。加入30mL四氢呋喃溶解该固体,缓慢加入该溶液到300mL冷***中,有沉淀产生,沉淀过滤后继续用四氢呋喃溶解,冷***沉淀,重复3~4次,可得端基溴代的聚乙二醇单甲醚PEG16-Br。产率:83%.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ3.80(2H,t),3.57~3.70(62H,m),3.54(2H,t),3.46(2H,t),3.37(3H,s)。以上合成步骤反应式表达如下:
(二)聚乙二醇修饰苯并吲哚盐TMBI-PEG16的制备
称取9.9g(15mmol)干燥后的PEG16-Br以及1.59g(10mmol)2,3,3-三甲基-3H-吲哚加入到50mL反应瓶中,加入15mL邻二氯苯溶解,在N2保护的条件下加热到110℃反应8小时,反应停止后将反应液加入到400mL冷***中,有灰色沉淀产生,过滤可得灰白色滤饼,沉淀物用硅胶柱层析提纯,可得聚乙二醇修饰的吲哚盐TMBI-PEG16。产率:41%.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.94~8.14(m,4H),7.61~7.83(m,2H),5.22(t,2H),4.14(t,2H),3.41~3.86(m,66H),3.36(s,3H),3.13(s,3H),1.86(s,6H)。以上合成步骤反应式表达如下:
(三)聚乙二醇化苯并吲哚菁染料IR-PEG(b)的制备
称取2.87g(4mmol)干燥后的TMBI-PEG12、1.0g(12mmol)醋酸钠以及1.44g(5mmol)5-苯胺基戊二烯醛缩苯胺盐酸盐缩合剂转移到25mL反应瓶中,加入5mL醋酸酐溶解,在N2保护的条件下于100℃下反应4小时,反应停止后将反应液加入200mL冷***中,有绿色染料沉淀产生,过滤可得绿色染料滤饼并用硅胶柱层析提纯,可得聚乙二醇化苯并吲哚菁染料IR-PEG(b)。产率:45%.8.38(d,2H),8.11(d,2H),7.92(m,4H),7.60(m,4H),7.45(d,2H),6.40(d,2H),4.60(m,4H),4.04(m,4H),3.40~3.859(m,120H),3.35(s,6H),2.76(m,4H),δ2.01(s,6H)。以上合成步骤反应式表达如下:
实施例3
测定实施例1和实施例2IR-PEG(a)和IR-PEG(b)水溶液的可见-近红外吸收光谱和荧光发射光谱,为了评价其光稳定性,使用激光强度为0.6W cm-2的808nm激光照射染料溶液5min,测定激光照射后的可见-近红外吸收光谱。为了与ICG的光稳定性相比较,同时测定激光照射前后的ICG水溶液的可见-近红外吸收光谱。
将IR-PEG(a)、IR-PEG(b)以及ICG配制成50μM水溶液,使用0.8W cm-2波长为808nm的激光进行照射,用热成像仪监测染料溶液的即时温度,空白的溶液作为比较。
图1和图2是实施例1和实施例2产品水溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。实施例1产品IR-PEG(a)的最大吸收波长为778nm,在805nm处有最大荧光发射峰。实施例2产品IR-PEG(b)的最大吸收波长为820nm,在878nm处有最大的荧光发射峰。近红外的荧光容易透过生物活体组织,IR-PEG(a)和IR-PEG(b)最大吸收和荧光发射波长均位于近红外区,在水中有较大的溶解度,可用作生物近红外荧光成像。
IR-PEG(a)和IR-PEG(b)水溶液经过强度0.6W cm-2的808nm激光照射染料溶液5min后,溶液的可见-近红外吸收有所衰减,说明在激光照射的过程中,IR-PEG(a)和IR-PEG(b)有所光解。而对比例中的ICG溶液经过光热之后,该溶液的可见-近红外吸收变得很弱,如图3所示,说明大部分ICG在激光照射之后已经分解。与ICG相比较,IR-PEG(a)和IR-PEG(b)的光学稳定性有明显的提升,是因为修饰聚乙二醇作为大分子醚链结构,可以从空间上抑制光照过程中产生的单线态氧对甲川链的进攻。
图4为实施例1染料IR-PEG(a)和实施例2染料IR-PEG(b)的水溶液在808nm近红外激光照射下光热转换升温曲线图,其中ICG和水作为对比,激光波长808nm,1W cm-2,染料浓度50μM。经过5min激光持续照射,IR-PEG(a)溶液的温度能够升至51℃,溶液IR-PEG(b)溶液的温度能够升至57℃。作为比较,纯水使用相同时间的相同强度的激光照射,温度变化很小,而FDA批准近红外染料ICG水溶液在2min时温度先上升至42℃然后缓慢的下降。ICG溶液在后期温度无法上升,说明此时ICG已经大部分光照分解,无法持续将光能转化为热能。相比较于商业化水溶性近红外染料ICG,实施例1和2的产品具有更好的光热转换效率以及光热稳定性。
以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。